Summary
Burada, boyuna vivo içinde görüntüleme kullanışlılığı lazer kaynaklı choroidal neovaskülarizasyon farelerde morfolojik değişiklikler takip içinde mevcut.
Abstract
Choroidal neovaskülarizasyon (KNV) lazer kaynaklı yaşa bağlı makula dejenerasyonu (AMD) ıslak şeklinde taklit etmek için köklü bir modeldir. Bu protokol için amacımız neovasküler süreçleri, ama oldukça multimodal boyuna elde edilebilir güçlü bilgi odaklanmak tetiklemek için değil, sadece teknik konuları lazer kaynaklı lezyonlar oluşturma üzerinden okuyucu rehberlik etmek içinde vivo takip süresi görüntüleme.
Lazer kaynaklı fare KNV modeli bir diyot lazer yönetim tarafından oluşturuldu. Multimodal vivo içinde görüntüleme teknikleri KNV indüksiyon, ilerleme ve gerileme izlemek için kullanılmıştır. İlk, spektral etki alanı optik Koherens tomografi (SD-Ekim) gerçekleştirilen hemen Bruch'ın membran bir mola doğrulamak için lasering sonra. Floresein anjiyografi (FA) kullanarak sonraki vivo içinde görüntüleme Bruch'ın membran choroidal düzeyinde alınan seri görüntüleri üzerinden başarılı hasarı doğruladı. KNV yayılması ve regresyon lasering sonra gün 5, 10 ve 14 boyuna takip SD-Ekim ve SK kullanılarak gerçekleştirildi. Basit ve güvenilir sızan KNV leasions SK görüntülerden, sınıflandırma sunulur. Otomatik bölümleme için KNV sitelerdeki retina kalınlığı ölçümü için el ile kalibre uygulama ile birlikte toplam retina kalınlık ölçüm yapılmasına izin ödem varlığı tarafsız değerlendirilmesi. Son olarak, histolojik KNV doğrulanması isolectin GS-IB4 choroidal flatmounts boyama kullanılarak gerçekleştirilir. Boyama thresholded ve isolectin-pozitif alan ImageJ ile hesaplanır.
Bu iletişim kuralı gibi hızlı, multimodal sağlar yüksek üretilen iş gibi tarama KNV patoloji gerektiren tedavi çalışmaları ve güvenilir KNV patoloji ve retina ödem sınıflandırılması özellikle yararlıdır. Buna ek olarak, yüksek çözünürlük SD-Ekim subretinal veya intraretinal sıvı birikimi gibi diğer patolojik işaretlerinden kayıt sağlayan. Ancak, bu yöntem bir olasılık el ile gerçekleştirilecek olan KNV cilt analizi SD-Ekim görüntüleri, otomatikleştirmek için sağlamaz.
Introduction
Başarılı ilk insan KNV Rodents patoloji taklit girişimi neredeyse otuz yıl önce uzun-Evans fareler1Kripton lazer ile gösterilmiştir. Bundan sonra bir Kripton lazer Bruch'ın membran en popüler fare gerginliği, C57BL/6J2,3,4kırmak için kullanıldı. KNV indüksiyon başarı oranını SK ve histolojik lekeleri ile doğrulandı. EKM gibi noninvaziv görüntüleme yöntemleri, hızlı bir gelişme alanı kemirgen Preklinik modellerin büyüme destekledi. Aynı göz içinde birden çok kez noktalarda retina morfolojik değişiklikler önemli ölçüde izleme olanağı hayvan kullanımı azaltma için katkıda bulunur ve deneysel çalışmalarda verimliliği artırır. KNV lezyonların histolojik değerlendirme oldukça basittir ve anormal damar büyüme lazer yönetim, resim alma ve alan/hacim tahmini bir görüntü analiz yazılımı kullanarak site etrafında etiketleme gerektirir. Buna ek olarak, daha karmaşık analizleri KNV patoloji ve onun yorumunu vivo içinde görüntüleme yöntemleri tanıtmak.
Burada SK, SD-Ekim, kullanarak sınıf indüksiyon, ilerleme ve gerileme KNV nispeten hızlı ve basit bir yöntem mevcut ve fare otomatik bölümleme yöntem lazer kaynaklı KNV modeli.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bütün hayvanlar göre ARVO bildirimi kullanım, onaylanmış ve Finlandiya hayvan deney Yönetim Kurulu tarafından izlenen protokolleri kullanarak hayvanlar için Ophthalmic ve vizyon araştırma ve EC Direktifi 86/609/EEC hayvan deneyleri için tedavi edildi.
1. lazer kaynaklı fare KNV modeli 5
- Hayvan macroscopically için herhangi bir anormallik gözünde bakarak kontrol edin.
- Fare tartın.
- Hesaplamak ve anestezi kullanmak için uygun bir miktarda hayvan, örneğin medetomidine (1 mg/kg), ketamin (75 mg/kg) ve distile su (% 0.9 NaCl çözüm) 1:1.5:2.5 veya ketamin (40-75 mg/kg), bir oranında karışımı ağırlık temel hazırlamak xylazine (5 mg/kg) ve 1:2. 5:1 oranında, distile su (% 0.9 NaCl çözüm); 20 g fare için 0.1 mL karışımı enjekte.
- Anestezi intraperitoneally enjekte et.
- Hayvan anestezi kadar yer fare geri içine belgili tanımlık kafes ve bekle. Fare düzgün bir pedal refleks eksikliğinden anestezi onaylayın.
- Lazer güvenlik kişisel koruyucu ekipman kullanımı olun.
- Slit lamba ve 532 nm diode lazer açın.
- Kafes ve Isıtma yastığını üzerinde yer fareyi kaldırın.
- Tropicamide bir damla Gözbebeği genişlemesi için geçerlidir. Tam (3 mm) Gözbebeği genişlemesi için 3-5 dk beklemeye.
- Fare slit lamba sahnesinde yerini.
- Bir damla göz sıvı jel bir coverslip için applanate kornea üzerine yerleştirin.
- Fare göz Merkezi görme sinirine kafasıyla gelecek şekilde yönlendirin.
- Lazer güç 100'e ayarlamak mW, süresi 100 MS ve nokta boyutu 50 µm için.
- Lazer ışını retina pigment epiteli (RPE) odaklanmak.
- Üç lazer atış bir göz retina damarları 4, 8 ve 12 yönünde konumlarını optik sinir, etrafında, ideal olarak sırasıyla kaçınarak olun. Sonra tüm çekimleri retinal kanama olmaması için lazer göz fundus inceleyin. Kontralateral göz sigara lazerle denetimi olarak hizmet vermektedir.
- Coverslip ve yer fare geri Isıtma yastığını atmak.
- PEG jel damla bir damla her iki gözde uygulanır.
2. SD-Ekim 6,7
- Fare kemirgen hizalama sahne içine yerleştirin ve baş hareketsiz.
- SD-Ekim (örneğin, Bioptigen/Leica Envisu R2200) göz yüz sistem objektif vivo içinde görüntüleme için X ve Y-seviyeli denetleyicilerini kullanarak hizalayın.
- Bruch'ın membran sonları doğrulamak için SD-Ekim taramalar: SD-Ekim bütün göz tarar kez lazerle sitelerinde başvuru satırı el ile taşımak. Bruch'ın membran sonları (bkz. şekil 1) lazerle alanlarda açıkça görünür olmalıdır.
3. floresein anjiyografi 7,8,9
- Fare ile sahibi çıkarın ve SK sisteminde (örneğin, Heidelberg Spectralis HRA2) yerleştirin.
- Lazer odak optik sinir izleme pencerenin ortasında başkanı ile kızılötesi yansıma modunu kullanarak göz fundus alanlarında yakmak.
- 0.1 mL % 5 fluoresein sodyum tuz 20 gr fare subkutan veya intraperitoneally enjekte.
- Choroidal düzeyde odak.
- Fotoðraf choroidal odak seviyesinden.
- Retina düzeyinde yeniden odaklanın ve fotoðraf.
- 30 s ve Yinele adımları için 3,4-3.6 bekleyin.
- Fare sahibinden çıkarın ve Isıtma yastığını yerleştirin.
- Ters anestezi tarafından α2-antagonisti medetomidine, atipamezole (0.5 mg/kg, IP) veya anestezi hayvan kurtarma için bekleyin.
- In vivo SD-Ekim ve SK görüntüleme imzalat hayvanlarda takip günlerini 5, 10 ve 14 üzerinde yineleyin.
4. KNV sınıflandırma
- Sınıf Bruch'ın membran OCT görüntüleri ve choroidal SK görüntüleri hemen aşağıdaki gibi gün 0 lasering sonra alınan hasar:
0 - Bruch'ın membran hasar değil
1 - Bruch'ın membran başarılı hasar - Sınıf KNV varlığı gibi bir dizi retina SK resmi olarak aşağıdaki floresein sinyal dinamikleri karşılaştırarak sızıntı vardı lazerle noktalardan:
0 - retina normal görünüm
0.5 - zayıf boyama kaçağı
1.0 - Sızıntılı KNV alanları
Not: OCT görüntüleme ek onay KNV veya şüpheli SK nerede OCT görüntülerde intraretinal sıvı varlığını KNV sınıflandırma öneririz kullanın.
5. retina kalınlığı ölçümleri
- Bir otomatik bölümleme yazılımı retina kalınlığı ölçümleri için kullanın. Toplam retina kalınlık, Sinir lifi tabakası RPE (sağlıklı ölçüm siteler) veya hayali bir çizgi RPE hasar (lazerle siteler) sitenin etrafına bağlanan tüm katmanlardan kalınlığı olarak kabul edilir sağlamak (Ayrıca bkz: Şekil 7).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kabarcık veya subretinal hemen lasering sonra kanama her zaman görünür değil. Bu nedenle, SD-Ekim Bruch'ın membran hasar doğrulamak özellikle önemlidir. Şekil 1 lazer yönetim sonra farklı zaman noktalarda OCT görüntüleme bir örneği gösterilir.
Resim 1 : OCT tr yüz göz fundus (VIP İmaj) gösteren üç lazerle alan beyaz, yeşil ve kırmızı daireler özetlenen. Ekim B-tarama görüntüleri çekildi önceden (temel), lasering hemen Bruch'ın membran bir mola doğrulamak için lasering sonra (0 gün, okları hasar siteye işaret) ve 5, 10 ve 14 gün sonra lazer yönetim. Beyaz özetlenen alandaki görüldüğü gibi (ilk sıra resimler), KNV daha sonra timepoints geliştirmek değil. Yeşil ve kırmızı özetlenen alan takip günde 5 algılandı KNV geliştirdi. Ancak, 10 ve 14 gün timepoints bu KNV lezyonlar geriledi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Rakamlar 2 ve 3 gün bir erkek 10-hafta-yaşlı C57BL/6jRj fare 0 başarılı hasar her üç noktalar Bruch'ın membran doğruladı SK kullanarak seri görüntüleme göster.
Resim 2 : Seri SK görüntüleme her 20 alınan s (Resim 1-18 arası) hemen sonra lazer yönetim choroidal düzeyinde. Resim 1 puan daha sonra timepoints (resim 18 beyaz ok) floresein sızıntı göstermek lazerle sitelere beyaz okları. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 : Seri SK görüntüleme her 20 alınan s (Resim 1-18 arası) hemen sonra lazer yönetim retina düzeyinde. Floresein kaçağı ve 1 (Sızıntılı KNV) sınıflandırma olan KNV alana resim 18 beyaz bir ok ile işaret edilmektedir. Not bir artan yoğunluk yanı sıra floresein SK (8 ve 11 görüntülerde beyaz ok) görüntüleme timecourse sırasında pozitif alan. İki alana resim 18-beyaz özetlenen (0,5 sınıflandırma) zayıf bir SK sinyal sahip olarak sınıflandırılır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
KNV patolojinin sınıflandırma yanı sıra SD-Ekim de lezyon site, örneğin, subretinal sıvı, ödem ve KNV regresyon varlığı ek bilgi ortaya çıkarmak yararlıdır. Şekil 4 lazer kaynaklı KNV ana patolojik işaretlerinden farelerde gösterir.
Şekil 4 : Spektral etki alanı optik Koherens tomografi Imaging, KNV patoloji. SD-Ekim temsilcisi bu görüntülerden doku, KNV oluşumu ve sıvı birikimi yaralar üzerinde görüldüğü gibi detaylı bir KNV patoloji retina doku içinde sağlar. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Yaşa bağlı makula ödemi ıslak formunda AMD insanlar ana patolojik işaretlerinden biridir. Lazer kaynaklı KNV modelinde retina kalınlık otomatik bölümleme kullanılarak değerlendirilebilir. Seçili lazerle siteleri el ile ölçüm KNV sitesinde retina kalınlık ölçmek için gereklidir. Şekil 5 otomatik bölümleme sonra oluşturulan bir raporu örneği gösterir.
Şekil 5 : Retina kalınlığı quantification. Otomatik bölümleme göre ölçülen retina kalınlık Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Otomatik bölümleme retina kalınlığı (Tablo 1) genel bir bakış sağlamak için hızlı bir şekilde kullanmaktır. Rakamlar 6A ve 6B sırasıyla temsilcisi otomatik bölümleme sağlıklı bir retina alanı ve KNV patoloji, retina alanı örnekleri gösterir. Küçük yanlışlıklar bireysel retina katmanları, genel, ayrım bulundu rağmen yazılım güvenilir bir şekilde toplam retina kalınlık Pigmentli farelerde tanır.
Şekil 6 : Otomatik bölümleme retina katmanların. Sağlıklı retina alanı(a)ve retina alanı KNV (resim Byıldız işareti) içeren otomatik bölümleme. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Lazerle alanlarda retina kalınlık değerlendirmek için her lazerle alan aşağıda olarak el ile ölçüldü: Toplam retina kalınlık Sinir lifi tabakası hayali çizgi RPE sitenin bağlanma için katman kalınlığı olarak kabul edildi Hasar (Şekil 7 ve Tablo 1).
| Alan | Gün 5 | Gün 10 | Gün 14 |
| Toplam retina kalınlık, mikron | 218±7.8 | 220±7.2 | 221±9.8 |
| Lazerle alan 1 | 200 | 204 | 214 |
| Lazerle alanı 2 | 226 | 217 | 220 |
| Lazerle alanı 3 | 222 | 223 | 227 |
| Mean±SD sunulan verilerin | |||
Tablo 1. Toplam retina kalınlık ve inVivoDiver yazılım (v. 3.0.8) kullanarak otomatik bölümleme tarafından belirlenen bir 14 günlük takip sırasında KNV sitelerdeki retina kalınlığı.
Şekil 7 : El ile retina ve kalınlık ölçüm yapılmasına KNV patoloji ile lazer alanda. Sarı çizgi lazer yönetim yerinde Sinir lifi tabakası üzerinden toplam retina kalınlık bir hayali RPE katmanına (siyah çizgi) belirtir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Histolojik olarak, KNV lezyonlar isolectin GS-IB4 (şekil 8A) etiketleme kullanarak teyit edildi. Görüntü analiz yazılımı görüntü J KNV lezyon (şekil 8B) alanını hesaplamak için kullanıldı.
Şekil 8 : Histolojik analiz. KNV lezyon üzerinden (yeşille, A) choroidal flatmount histolojik leke eşik görüntü J (B) kullanarak sayılabilir. A ölçek çubuğu 50 mikron olduğunu. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Multimodal görüntüleme KNV patoloji değerlendirme için değerli araçlar sunar. Burada SK, oluşan bir görüntüleme Protokolü sunulan SD-Ekim ve KNV patoloji hızlı, tekrarlanabilir ve güvenilir değerlendirilmesi için otomatik bölümleme. Lazer yönetim doğrulandı sonra Bruch'ın membran bir mola. Buna ek olarak, SD-Ekim bu aşamada da sonuçları yorumu yıkmak olası intraretinal ve subretinal kanama hemen görselleştirme izin. Retina sızıntıları floresein sinyal SK görüntülerden göre kademeli. SD-Ekim KNV patoloji daha ayrıntılı bir açıklama sunulan. Ayrıca, boyuna SD-Ekim analiz takip süresi boyunca çeşitli zaman noktalarda SK yalnız güvenerek eğer zor kalacaktı patoloji içinde geçici farklar vurgulanmış.
Toplam retina kalınlık otomatik bölümleme kullanılarak ölçüldü. KNV akımıdır sitelerdeki retina kalınlık el ile ölçüldü. Choroidal flatmount histolojik değerlendirmesine doğrulanır ve neovaskülarizasyon alan görüntü analiz yazılımı görüntü J. ölçülür
Görsel eksen uygun saydamlığını sunulan Protokolü başarılı performans için kritik öneme sahiptir. Kuruluk kornea ve katarakt oluşumu gidermede dahil ana faktör vardır. Sonra fare anestezi, bu nedenle, gözleri sürekli yapay gözyaşı veya kornea uygun hidrasyon korumak için jel ile sulu. Önerilen protokol tercihen anestezi indüksiyon üzerinden 10 dakika içinde yapılmalıdır. Genişletilmiş anestezi zaman katarakt oluşumuna neden olabilir ve in vivo görüntüleme önlemek.
Açıklanan protokol gözlemsel KNV progresyon retina düzeyde vasküler sızıntı dayalı sınıflandırma sınırlıdır. Kantitatif değerlendirilmesi retina sızıntı sızıntı alanı tarif sağlar ve faiz bölge üzerinde Nicel veri sağlayan Heidelberg Spectralis yazılımını kullanarak eklenebilir. Buna ek olarak, Süleyman ve meslektaşları (2015) son zamanlarda alınan vivo içinde OCT görüntüleri10elips yöntemi kullanarak birimden KNV hesaplanması önerdi. Düzensiz bir şekil KNV çoğu durumda olduğu gibi elips modeli önyargı doğru tahmindi lezyonlar hacminin büyük olasılıkla tanıtır. Ancak, birim ölçümleri histolojik örnekleri confocal analiz ve önerilen elips miktar OCT görüntülerden arasında yüksek korelasyon yöntemi KNV birim10 kantitatif değerlendirilmesi için değerli bir araçtır kanıt sağlar .
Sonuç, farklı vivo içinde görüntüleme yöntemleri, otomatik bölümleme ve histolojik analizi, birlikte sunulan kombinasyonu inanıyoruz olarak KNV patoloji preklinik çalışmalarda tekrarlanabilir ve güvenilir bir değerlendirme sağlar. Yöntem kavramı terapötik müdahale çalışmaları kanıtı için özellikle yararlı olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazar Symantas Ragauskas, doktora bir çalışan (bilim) ve hissedar Teklifler araştırma hizmetleri bu makalede kullanılan preklinik KNV modeli istihdam sözleşme Experimentica Ltd. ' dir.
Eva Kielczewski bir çalışan (araştırma uygulamaları mühendis, OCT) Bu makalede kullanılan SD-Ekim sistemleri üretir Leica Mikrosistemlerin temelleri yazarıdır.
Yazar Joseph Vance'in bir çalışandır (NA OCT satış direktörü) Bu makalede kullanılan SD-Ekim sistemleri üretir Leica Mikrosistemlerin temelleri. Joseph Vance'in Başkan ve yönetim müdürü Spective, LLC da.
Yazar Simon Kaja, doktora Danışmanı Scientific Müdürü ve hissedar, Experimentica Ltd., teklifler araştırma hizmetleri, sözleşme preklinik sözleşme araştırma kuruluşu preklinik KNV modeli bu makalede kullanılan dahil olduğunu. Simon Kaja, doktora da CEO K & bilimsel P, LLC, danışmanlık firması, Yaşam Bilimleri ve Dr. John s. ve Therese E. Mulcahy donatılmış Profesör Chicago Loyola Üniversitesi, Stritch tıp Fak., Oftalmoloji olarak hizmet vermektedir. Bu düzenleme koşulları incelenmeli ve çıkar çatışması politikasına uygun olarak Chicago Loyola Üniversitesi tarafından onaylanmalıdır.
Yazar Giedrius Kalesnykas, doktora bir çalışan (CEO) ve teklifler araştırma hizmetleri bu makalede kullanılan preklinik KNV modeli istihdam sözleşme Experimentica Ltd. hissedarı olduğunu.
Acknowledgments
Yazarlar için mükemmel teknik ve videographic destek Yuliya Naumchuk (Chicago Loyola Üniversitesi) ve Agne Žiniauskaitė (Experimentica Ltd) teşekkür etmek istiyorum. Dr. Kaja'nın araştırma programı Dr John P. ve Therese E. Mulcahy donatılmış profesörlük Oftalmoloji, Chicago Loyola Üniversitesi tarafından desteklenir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Medetomidine (commercial name Domitor) | Orion | Vnr 01 56 02 | Anesthesia |
| Ketamine | Intervet | Vnr 51 14 85 | Anesthesia |
| 0,9% NaCl | B Braun | 357 0340 | Anesthesia |
| Xylazine (commercial name Rompun vet) | Bayer | vnr 14 89 99 | Anesthesia |
| Tropicamide | Santen | Vnr 04 12 36 | Mydriatic agent |
| Viscotears | Alcon | Vnr 44 54 81 | Lubricant |
| Systane | Alcon | - | Lubricant |
| 5% Fluorescein sodium salt | Sigma Aldrich | F6377-100G | Fluoresent agent |
| Atipamezole (commercial name Antisedan) | Orion | Vnr 47 19 53 | Anesthesia |
References
- Dobi, E. T., Puliafito, C. A., Destro, M. A new model of experimental choroidal neovascularization in the rat. Arch. Ophthalmol. Chic. Ill 1960. 107, 264-269 (1989).
- Tobe, T., et al. Evolution of neovascularization in mice with overexpression of vascular endothelial growth factor in photoreceptors. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 39, 180-188 (1998).
- Seo, M. S., et al. Dramatic inhibition of retinal and choroidal neovascularization by oral administration of a kinase inhibitor. Am. J. Pathol. 154, 1743-1753 (1999).
- Grossniklaus, H. E., Kang, S. J., Berglin, L. Animal models of choroidal and retinal neovascularization. Prog. Retin. Eye Res. 29, 500-519 (2010).
- Shah, R. S., Soetikno, B. T., Lajko, M., Fawzi, A. A. A Mouse Model for Laser-induced Choroidal Neovascularization. J Vis Exp. (106), e53502 (2015).
- Giani, A., et al. In vivo evaluation of laser-induced choroidal neovascularization using spectral-domain optical coherence tomography. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52, 3880-3887 (2011).
- Gong, Y., et al. Optimization of an Image-Guided Laser-Induced Choroidal Neovascularization Model in Mice. PloS One. 10, e0132643 (2015).
- Sheets, K. G., et al. Neuroprotectin D1 attenuates laser-induced choroidal neovascularization in mouse. Mol. Vis. 16, 320-329 (2010).
- Hoerster, R., et al. In-vivo and ex-vivo characterization of laser-induced choroidal neovascularization variability in mice. Graefes Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. Albrecht Von Graefes Arch. Klin. Exp. Ophthalmol. 250, 1579-1586 (2012).
- Sulaiman, R. S., et al. A Simple Optical Coherence Tomography Quantification Method for Choroidal Neovascularization. J. Ocul. Pharmacol. Ther. Off. J. Assoc. Ocul. Pharmacol. Ther. Off. J. Assoc. Ocul. Pharmacol. 31, 447-454 (2015).
