Summary
생물 학적 샘플의 배경 autofluorescence는 종종 형광 기반 이미징 기술을, 특히 세 인간의 postmitotic 조직에에서 복잡. 이 프로토콜에 설명 합니다이 예제에서 autofluorescence를 효과적으로 제거 될 수 있다 어떻게 photobleach immunostaining 이전 샘플 소스를 상업적으로 사용할 수 있는 발광 다이오드 빛을 사용 하 여.
Abstract
면역 형광 검사 subcellular 구획을 시각화 하 고 조직 샘플 내 특정 단백질의 지 방화를 결정 하는 데 사용 하는 일반적인 방법입니다. 면역 형광 이미지를 높은 품질의 인수에 큰 방해 lipofuscin 같은 노화 안료 또는 알데하이드 고정 등 일반적인 샘플 준비 과정에 의해 발생 하는 조직의 내 생 autofluorescence입니다. 이 프로토콜 배경 형광을 흰색 형광체 발광 다이오드 (LED) 배열 처리 이전 형광 프로브를 사용 하 여 photobleaching를 통해 크게 줄어들 수 있습니다 방법에 대해 설명 합니다. 흰색 형광체의 넓 스펙트럼 방출 Led 방출 봉우리의 범위에 걸쳐 fluorophores의 표백에 대 한 수 있습니다. Photobleaching 장치 매우 낮은 비용에 상용 구성 요소에서 생성 될 수 있습니다 고 상용 화학 quenchers에 액세스할 수 있는 대안을 제공 합니다. 뒤에 기존의 면역 형광 염색 직물의 photobleaching 전처리 배경 autofluorescence의 이미지를 생성 합니다. 비교 조사 배경 감소는 화학 quenchers 설립을 신호, photobleaching 처리 했다 프로브 형광 강도에 영향을 주지 않습니다 그것은 배경과 lipofuscin 형광을 효과적으로 감소 하는 동안. Photobleaching 전처리에 대 한 더 많은 시간을 필요로, 하지만 높은 휘도 LED 배열 photobleaching 시간을 줄이기 위해 사용할 수 있습니다. 이 간단한 방법은 잠재적으로 다양 한 조직, 두뇌 등 lipofuscin 축적 특히 postmitotic 조직 및 심장 또는 골격 근육에 적용할 수 있습니다.
Introduction
형광 현미경 검사 법 특정 단백질을 표적으로 하는 항 체를 사용 하 여 정기적으로 세포 배양과 조직에 관심사의 단백질을 시각화 하는 데 사용 됩니다. 면역 형광 검사에서 명확 하 고 확실 한 이미지의 인수를 주요 합병증이 발생할 수 있습니다 endogenously 포유류 조직에서 나이 안료 lipofuscin과 단백질 엘라 스 틴과 콜라겐1, autofluorescence 2. Autofluorescence의 다른 소스는 알데하이드 고정3샘플 준비 단계를 통해 소개 될 수 있습니다. Lipofuscin과 립, oxidatively 수정 단백질과 지질 저하 잔류물의 주로 구성 된 긴 살아있는 세포 증가 나이2에 누적 됩니다. 그러면 뇌와 심장이 나 골격 근육, postmitotic 조직 이미징에 어려움 lipofuscin의 형광 방출 스펙트럼은 광범위 하 고 가변, 자주 사용 하는 일반적인 fluorophores의 방출 파장와 동시 4라벨. 이러한 요인 특히 도전 frontotemporal lobar 변성 (FTLD) 늦은 발병 신경 퇴행 성 질병의 경우에서 인간 뇌 조직의 이미지를 확인 합니다.
Autofluorescence를 줄이기 위해, 우리는 우리와 백색 발광 다이오드 (LED) 배열 가구 책상 램프5를 사용 하 여 슬라이드 마운트 조직 단면도 비추는 기법을 고안 했다. 이 간단한 기술은 대안을 암모늄 아세테이트, 또는 냉각 하는 염료 수단 블랙 B 및 Eriochrome 블랙 T6같은 상용 CuSO4 등 화학 quenchers를 사용 하는 기법을 제공 합니다. 그것은 또한 상당한 비용 절약 이상의 multispectral 있다 램프 photobleaching 기술을 주도하 고 합병증과 스펙트럼 취소 혼합7,8같은 디지털 autofluorescence 제거 방법에서 생성 하는 유물을 피 한다. 백색 발광 Led 있다 넓은 방출 스펙트럼, 높은 광도 및 낮은 제조 비용, photobleaching chromophores5,9다양 한에 대 한 상용 부품으로 이상적.
이 프로토콜에 액세스할 수 있는 구성 요소를 사용 하 여 photobleaching 기구 건설을 설명 하 고 FTLD 조직의 phosphorylated 타우에 대 한 항 체 관련을 사용 하 여 타우-긍정적인 포함 (FTLD-T)를 포함 하는 경우에 photobleaching를 적용. 우리 붙일 표시 된 항 체 두 통용 chromophores 채용 이미징에 photobleaching의 효과 보여줍니다: 알 렉 사 488와 텍사스 레드. 치료 섹션 대 photobleaching의 효과 또는 상업적인 화학 끄는 치료는 계량 하 고 비교. 이 photobleaching 전처리 생물학 견본에서 autofluorescence를 제거 하려면 모든 표준 면역 형광 얼룩 프로토콜에 포함 될 수 있습니다.
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Protocol
참고: 국제 회의에 조화 (ICH), 위원회에 대 한 국제 단체의 의료 과학 (CIOMS)를 포함 하 여 인식된 국제 표준에 따라 제시 하는 작업 수행 그리고 헬싱키 선언 원칙. 인간의 조직의 사용 대학 건강 네트워크 연구 윤리 위원회의 승인을 했다. 인간의 두뇌 샘플 해상 뇌 조직 은행의 일환으로 수집 되었습니다. 수집 시 동의 모든 환자에서 얻은 했다.
1. photobleaching 장치 및 솔루션의 건설
- 준비 재고 솔루션.
- 8.77 g NaCl의 그리고 트리 스의 6.06 g을 용 해 하 여 재고 Tris 버퍼 식 염 수 (1 x TBS) 솔루션 (150 m m NaCl, 50 mM Tris-Cl, pH 7.4) x 1의 준비 1 L ddH 2 O의 800 mL에서 기지 고 HCl. 1 L와 오토 클레이 브에 볼륨을 가져오기를 사용 하 여 7.4에 pH를 조정. < / 리 >
- 1 g의 나트륨 아 지 드 (10%, 200 x 재고) ddH 2 O 10 mL에 용 해 하 여 10% (200 x 주식) 나트륨 아 지 드를 준비.
- 1-3 표준 크기 슬라이드, 슬라이드 챔버로 단일 100 mm x 100 mm 투명 하 고, 광장 페 트리 접시를 사용. 단일 슬라이드 챔버에 대 한 0.05% 아 지 드-TBS 솔루션 1 x TBS의 50 mL를 200 x 나트륨 아 지 드 재고의 0.25 mL를 추가 합니다. 2-3 슬라이드 챔버 추가 슬라이드를 처리 하는 데 세로로 스택. 아 지 드 TBS 솔루션의 추가 50 mL 각 챔버에 대 한 준비.
- 그런 램프 머리 아래 들어갈 수 있는 슬라이드 chamber(s) 상승 발판을 만듭니다.
- 는 100 x 100 mm 슬라이드 챔버, 하단에는 100 x 100 mm x 30 mm 플라스틱 음식 컨테이너의 측면 구멍 고 컨테이너 반전. 측면 구멍 하는 LED 광원에 맞게 하단 오프닝 충분히 큰 광원에서 빛 장애 없이 샘플 챔버에 도달 되도록 충분히 큰 확인 하십시오.
- 비 계 발판 및 샘플 챔버/벤치탑 사이 그립을 증가 전기 테이프를 적용 됩니다. 어떤 대체 물질을 사용 하 여 너무 오랫동안 안전 하 게 샘플을 도달에서 빛을 방해 하지 않고 슬라이드 챔버를 끌어올리고 발판을 생성.
- 직접 도달 하는 샘플 (가능한 경우)에서 LED 빛을 방해 수 있는 LED 어레이 위쪽으로 방향을 책상 램프 디퓨저 또는 불투명 플라스틱을 제거. 비 계 및 슬라이드 chamber(s) LED 어레이 위에 놓습니다. 유연한 목 램프를 사용 하 여 쉬운 조작을 위한.
- 구문 반사 돔 줄 상자 슬라이드 챔버와 비 계 알루미늄 호 일 수의 내부 장치에 대 한 커버. 사용 하 여 1 mL 피 펫 팁 상자 단일 챔버에는 150 x 150 mm x 150 mm 골 판지 상자, 다중에 대 한 수직으로 쌓아 챔버.
2. Photobleaching 조직 단면도의 전처리
참고: 조직 섹션 준비 조직 및 고정 방법을 사용을 포함의 소스에 따라 다를 수 있습니다. 여기, FTLD T의 경우에서 뇌 조직 (orbitofrontal gyri) ~ 2 일 말린, 자당 그라디언트를 통해 실행, 10 월에 고는 cryostat를 사용 하 여 10 µ m 두꺼운 섹션을 잘라 고정.
- 는 4 º C 찬 방, 찬 장, 또는 냉장고, 발판 아래 램프 방향을 지정 하 고 발판에 샘플 챔버를 놓습니다. 시료 챔버에 아 지 드 TBS 솔루션 50 mL를 붓고.
- Submerge 조직 섹션 표준 유리 현미경 슬라이드를 포함 하는 아 지 드-TBS 청소 집게를 사용 하 여 슬라이드 챔버에 장착. 여러 슬라이드, 슬라이드는 단일 레이어에 챔버에 배치 됩니다 확인 하십시오.
- 반사 돔과 기구를 커버, LED 램프 켜고 4 º C에서 48 h에 대 한 품 어.
3. 면역 형광 검사
- 얼룩 phosphorylated 타우 DAPI counterstain와 알 렉 사 488-및 텍사스 레드 활용 된 이차 항 체를 사용 하 여에 대 한 조직, 먼저 항 원 검색, permeabilization, 차단, 그리고 기본에 대 한 솔루션을 준비 하 항 체 바인딩입니다.
- 항 원 복구의 준비 500 mL
- 버퍼 (10 m m 구 연산, 2 mM ethylenediaminetetraacetic 산, 0.05% 트윈 20, pH 6.2) 0.92 g의 연산 및 ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA) ddH 2 O. 조정 산도의 500 ml의 0.37 g을 용 해 하 여 NaOH와 6.2를 트윈 20의 0.25 mL을 추가.
- 0.025%의 500 mL를 준비 Triton X-100 Triton X-100의 0.125 mL 500 mL 1 추가 하 여 TBS 솔루션 (TBS-트리톤)에 tbs. x
- 준비에 TBS (BSA TBS 버퍼) 0.1 g 10 ml tbs. BSA를 용 해 하 여 1% 소 혈 청 알 부 민 (BSA) 솔루션
- 차단 솔루션을 준비 하는 1%의 1.8 mL를 정상 염소 혈 청의 0.2 mL를 추가 하 여 BSA/tbs.
- 각 슬라이드에 대 한 안티-인-PHF-타우 pSer202 + Thr205의 pipetting 1.5 µ L에 의해 1 차적인 항 체 솔루션 (1: 100 희석)의 150 µ L 준비 1% BSA TBS 버퍼 및 얼음에의 148.5 µ L에 항 체 (AT8)
- 각 슬라이드에 대 한 조직 pipetting 200 µ L 조직에 솔루션을 차단에 의해 차단 및 습도 챔버에 슬라이드를 배치. 젖은 종이 수건을 포함 하는 피 펫 팁 상자 안에 슬라이드 랙 배치 하 여 챔버를 구성 합니다. 2 h 평면에 대 한 실 온에서 품 어. 차단 솔루션 완전히 조직을 포함 하는 확인 하십시오.
- 각 슬라이드에 대 한 염소 반대로 마우스 알 렉 사 488의 1.5 µ L과 염소 반대로 마우스 BSA TBS의 147 µ L 텍사스 레드의 1.5 µ L을 추가 하 여 이차 항 체 혼합물 (1: 100 희석)의 150 µ L를 준비 하 고 얼음에
- 준비 0.1 µ g/mL DAPI 직렬 희석에 의해 counterstain. 재고 솔루션을 철저 하 게 혼합 하 고 재고 5 mg/mL DAPI에서 5 µ g/mL 해결책의 1 mL를 만들려고 TBS의 999의 1 µ L를 희석. 각 슬라이드에 대 한 희석 3 μ0.1 µ g/mL의 최종 농도에 TBS의 147 µ L 5 µ g/mL 해결책의 L.
주의: DAPI 알려진된 돌연 이며 신중 하 게 처리 되어야 합니다.
- 확인 조직 항 체 혼합물에 의해 완전히 덮여 있다. 어둠의 습도 챔버에 실 온에서 2 h에 품 어.
4. 형광 현미경 검사 법
- 형광 램프, 현미경 및 컴퓨터에
- 차례 15 분 장소 얼룩진된 조직 형광 현미경 단계에서 슬라이드에 대 한 따뜻한 램프를 허용 하 고. 밝은 필드 이미지를 사용 하 여 10 배 확대에 조직 찾습니다.
- DdH 2 O의 드롭 coverslip 표면에 적용 하 고 20 x 물 침수 대물 렌즈를 사용 하 여 (나 = 1.0). 4 라인 평균 비행기 검사 설정을 선택 합니다. 1 공기 단위 ~ 3 미크론의 광학 분할을 주는 작은 구멍 크기를 설정 합니다. 최상의 신호에 대 한 별도 트랙에 각 fluorophore의 레이저 여기 및 방출 파장을 선택 합니다.
참고: 알 렉 사 488: ex λ = 488 nm (아르곤 레이저) λ em = 493-570 nm; 텍사스 레드: λ 전 561 = nm (DPSS 561 nm 레이저), λ em 601-635 nm; = DAPI: λ 전 = 405 nm (레이저 다이오드 405), λ em 410-507 nm =.- 레이저 파워를 조정 하 고 각 트랙에 대 한 신호 강도 최적화 하는 설정을 얻을. 합성 이미지를 수집 하 고 저장 합니다. 동일한 레이저 설정을 사용 하 여 다른 슬라이드에 형광 강렬을 비교.
- 각 채널에서 형광 강도의 시각화, ImageJ 10 RGB 프로 파일 도구 매크로 설치. 웹 페이지에서 텍스트 파일 (https://imagej.nih.gov/ij/macros/tools/RGBProfilesTool.txt)으로 매크로 저장 합니다. ImageJ 메뉴에서 플러그인-선택 > 매크로-> 설치; RGB 프로 파일 도구를 설치 하는 텍스트 파일을 선택 합니다.
- Confocal 이미지 파일 ImageJ 열고 다음을 수행 하 여 rgb 3 스택에서 복합 이미지 변환: 이미지-> 색상-> 채널 도구. 선택 " 복합 " 3 채널 드롭다운 메뉴 및 확인 모든. 그런 다음 이미지-선택 > 타입-> RGB 색상.
- 는 RGB 프로 파일 도구 아이콘을 선택 하 고 이미지를 프로 파일링 섹션에서 선을 그립니다. 강도 데이터를 스프레드시트로 저장.
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Representative Results
Photobleaching 전처리 단계 직전 항 원 검색 및 immunostaining (그림 1A) 표준 면역 형광 검사 프로토콜을 추가할 수 있습니다. Photobleaching 장치에의 조립 또한 수행할 수 있습니다, 다양 한을 사용 하 여 저렴 한, 상용 구성 요소 (그림 1B). 흰색 형광체의 발광 스펙트럼 Led 이전 보고서 (그림 1C)5,11동의 그들 광범위 한 범위 photobleaching를 위해 적당 한 시키는 파장의 광범위 커버. 48 h photobleaching, 후 유사한 lipofuscin 뿐만 아니라 일반적인 배경 형광 autofluorescent speckles의 강도 FTLD-T (그림 1D)의 흠 없는 섹션에 두 방출 파장에 상당히 감소 했다. Photobleaching의 효능을 증명, 우리는 hyperphosphorylated 타우 FTLD-T를 사용 하 여 두 개의 다른 이차 항 체의 경우에 병 적인 타우 포함 시각화에 대 한 스테인드. 타우 포함의 독특한 모양 및 또한 라벨에 대 한 두 개의 chromophores 사용 하 여 자신 있게 기술을 확인 하기 위해 의도 된 대상에서 autofluorescent 기능을 구별할 수 있습니다.
낮은 확대 복합 이미지에서 타우 긍정적인 포함, 알 렉 사 488와 텍사스 레드 채널의 조합에서 노란색 스테인드의 형태학 라고도 하는 짧은 프로세스의 고리 모양의 컬렉션 구성 되어 ' astrocytic 패 ' (그림 2a-c). 이 형태학은 corticobasal 변성 (CBD)12,13,이 경우의 병 리 보고서와 함께 동의의 특징입니다. 치료 샘플에서 수많은 구조는 autofluorescence 다는 것을 제안 하는 빨강 채널에 주로 형광 고 타우 포함, 유사 하지 않은 합성 이미지에 원하는 항 체 얼룩이 지기 보다. 배경 형광의 눈에 띄는 수준 또한 시야 (그림 2a)에 걸쳐이 채널에 표시 됩니다. 이러한 autofluorescent 기능은 제거 되 고 전체 이미지가 나타납니다 훨씬 청소기 샘플 photobleaching (PB)와 화학 (그림 2b-c)을 끄는 치료 했다.
우리는 다음 각 샘플에서 작은 영역을 프로 파일링 하 여 이러한 샘플의 형광 차이 측정할. 단일 astrocytic 패 각 치료 조건 비교 (그림 2d-r)에 표시 됩니다. 치료 샘플에서 배경 형광은 모든 3 개의 채널에 존재 하지만 알 렉 사 488와 텍사스 레드 항 체에 대 한 이차 항 체 형광 상대적으로 높았다 (그림 2 h). 그러나, autofluorescent 구조 치료 샘플에 타우 (그림 2 h)에 대 한 스테인드는 텍사스 레드 이차 항 체에 비해 텍사스 레드 채널에 형광 강렬 했다. 만약 대상 단백질 타우 같은 명백한, 예측 가능한 형태로 우리의 경우, 조직에서 autofluorescence 것가지고 렌더링 이미지 경우일.
대조적으로 때 photobleaching 전처리 immunostaining, 알 렉 사 488에 배경 형광 이전 적용 된 텍사스 레드 채널은 크게 감소에 비해 치료 샘플, 그리고 immunostained의 형광 영향을 받지 남아 있었다 (그림 2i-m). 상업적인 화학 끄는 알 렉 사 488 채널에 autofluorescence를 효과적으로 photobleaching으로 침묵. 그것은 또한 48 h photobleaching 치료 (그림 2 m)에 의해 영향을 받지 했다 DAPI 배경 형광 억제. 그러나, 화학 끄는 또한 역효과 냉각 (그림 2n-r)의 특정 정도 제안 텍사스 레드 보조와 DAPI 신호 강도 감소.
그림 1 : 응용 프로그램의 표준 면역 형광 워크플로 photobleaching 사전 치료. A) 이미징 조직 수집에서 표준 면역 형광 검사 프로토콜의 간체 회로도. 기본 및 보조 형광 항 체의 응용 프로그램은 만화로 표현 됩니다. 대표 현미경 이미지를 생산. 눈금 막대 = 100 µ m. B) 대표 photobleaching 장치 (반사 뚜껑 표시 되지 않습니다.) 상용 구성 요소를 사용 하 여 구성. C) 백색 LED 어레이에의 방출 스펙트럼. 450에 좁은 방출 피크 및 광범위 한 피크 550 nm에서 관찰 된다. D) 알 렉 사 488 (493-570 nm)와 텍사스 레드 (601-635 nm) 방출 파장 FTLD T 조직의 내 생 배경 형광에 photobleaching의 효과. Autofluorescent 얼룩 lipofuscin 닮은 48 h photobleaching 후 눈에 띄게 감소 된다. 눈금 막대 = 100 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2:안티 phosphorylated 타우 immunostaining FTLD T 조직의 경우의 이미지 품질에 autofluorescence 제거의 효과 는 c) 낮은 확대, 복합 면역 형광 이미지에 대표적인 보기의 필드의 치료 (a), 48 h (b) 및 화학을 끄는 photobleached 치료 (c) 샘플. 않는다 다음 채널을 통해 그들의 각각의 광원에 의해 여기에 형광 색상: 알 렉 사 488 (녹색): λ전 488 nm (아르곤 레이저) λem = = 493-570 nm; 텍사스 레드 (red): λ전 561 = nm (DPSS 561 nm 레이저), λem 601-635 nm; = DAPI (파란색):전 λ = 405 nm (레이저 다이오드 405), λem 410-507 nm =. 눈금 막대 = 100 µ m. d-r) 치료 (d-g), photobleached (i l) 및 화학 끄는 치료 (n-q) 예제, 별도 형광 채널에서 점선 영역의 높은 확대 이미지 이미지, 병합 및 계량 형광 신호 프로필. 병합 된 채널 (g, l, q)에서 점선 라인을 프로 파일 (h, m, r) 생성 된 어떤 신호에 나타냅니다. 눈금 막대 = 50 µ m. Autofluorescent 입자 (af),immunolabeled 타우 형광 (타우) 및 핵 신호 (nuc) 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
조직의이 원고에 설명 된 photobleaching 전처리 상용 구성 요소를 사용 하 여 autofluorescence의 효과적인 제거 할 수 있습니다. 프로토콜 phosphorylated 타우 포 르 말린 고정 뇌 조직 알 렉 사 488, 핵 counterstain로 DAPI와 텍사스 적색 활용 된 이차 항 체를 사용 하 여 집계의 면역 형광 영상을 설명 합니다. 다른 조직에 메서드를 적용 하려면 시작 지점으로 샘플을 48 h photobleaching 사전 치료를 수행 하는 것이 좋습니다. Photobleaching, 후 표준 면역 형광 항 체 희석 제조업체의 권장 사항에 따라 사용 하 여 관심사의 기능에 대 한 프로토콜을 얼룩이 지를 수행 합니다. 배경 형광 여전히 있으면 photobleaching 기간 및 단계를 얼룩이 지는 항 체 또는 수정할 필요가 있다. Photobleaching의 기간 램프 기구와 샘플에서 autofluorescence의 수준 선택에 따라 달라 집니다. 각 고유 램프 기구에 대 한 최적의 표백 시간을 결정 해야 합니다. 이 할 수 있습니다 photobleaching에 의해 한 흠 없는, coverslipped 조직 섹션 TBS-아 지 드에 탑재 하 고 형광 현미경을 사용 하 여 12 h 간격 슬라이드의 내 인 성 형광 측정. 이전 보고서에서 우리는 입자 분석 lipofuscin photobleaching를 모니터링 및 피팅 지 수 감퇴 곡선 기능5, 하지만 간단 하 게, 일정 한 간격 섹션의 시각적 관찰 효과적일 수 있다 동등 하 게 판단 하는 형광의 대부분에서 기간 침묵 된다. 우리의 경우 세 뇌 조직의 lipofuscin 안료의 높은 금액을 포함 하는 800 럭 스 램프를 가진 48 h 외피 충분 했다. 경우 특정 신호 약한 photobleaching 후 백그라운드에 비해, 착 색 하는 동안 기본 및 보조 항 체의 농도 증가 하는 것이 좋습니다. 그것은 또한 배경 신호 일반적인 이차 항 체 바인딩에 의해 발생 하지 않습니다 보장 하기 위해 보조 항 체 전용 제어를 수행 하는 것이 중요. Cross-react 하지 않는 항 체를 선택 하, 여러 대상에 대 한 얼룩 때에 특히. 또한, 특정 신호 착 색 하는 과정에서 실수로 침묵 하지는 확인 합니다. 예를 들어, Nissl 얼룩 (얼룩이 뉴런) BSA에 의해 침묵 이다. 이 경우 차단 솔루션의 BSA 구성 요소 등 물고기 피부 젤라틴5대안 대체 되어야 한다.
Photobleaching에 대 한 백색 발광 Led 사용 하 여 특정 제한이 420에서 그것의 방출 스펙트럼 때문는 650 nm nm. 따라서, UV 파장에 더 중대 한 photobleaching이 가능 하다. 또한, 광범위 한 방출 스펙트럼 때문 특정 한 파장의 photobleaching chromophores 바람직하지 않은 방출 파장을 걸러 LED 어레이 위에 컬러 필터 시트를 입히는 등 수정 필요 합니다. 또한, photobleaching 직물의 다른 방법 보다 더 긴 처리 시간이 필요할 수 있습니다. 이 경우에, 뇌 조직 (에서 89 세 개인)의 나이 및 긴 알데하이드 고정 기간의 2 일 이상, 48 h photobleaching 기간 필요 했다. 활성 처리 시간이 필요 하지만, 하나는 고려 photobleaching 시간 하 고 얼룩 세션을 적절 하 게 계획 해야 합니다. 높은 광도 LED 램프 또는 여러 개의 램프를 사용 하 여 크게 광자 유동적에서 간단한 증가 의해 photobleaching 시간을 줄일 수 있습니다.
기존의 방법에 비해, 우리의 기술 몇 가지 중요 한 이점을 제공 합니다. Photobleaching 형광 현미경 검사 법에서 스캐닝 레이저를 사용 하 여와 달리 LED photobleaching를 사용 하 여 우리의 샘플 사진 유도 된 손상의 흔적을 관찰 합니다. 우리의 기구의 또 다른 주요 장점은 다른 기술 비용에 있는 뜻깊은 감소를 끝났습니다. 우리의 기구 조립의 비용 약 $10 달러, 이며 기구의 어셈블리는 유연한 충분히 모든 연구소는 photobleacher의 그들의 자신의 버전을 채택할 수 있다. 비교에서는, mutispectral를 사용 하 여 다른 방법 사용자 지정 슬라이드 홀더 배열 주도 하며 냉각 챔버 최대 $1000 USD8구성 하. 또한, 상업적인 화학 quenchers 소모품 100 슬라이드 120 달러를 요하고 샘플에 잠재적으로 원치 않는 화합물을 소개 하는. 가능성이 존재 연구에서 비교에 사용 된 화학 끄는 지 단백질의 immunostaining를 방해할 수 있는 지질 바인딩 수단 블랙 염료를 포함 되어 있습니다.
전반적으로, photobleaching 전처리 및 immunostaining는 시료의 가장 중요 한 단계는 immunostaining 동안 섹션의 처리를 포함 한다. 섹션은 photobleaching 동안 리하이드레이션 된, 일단 그것은 허용 되지 않습니다 후속 단계에 밖으로 건조에 중요 하다. 슬라이드의 건조는 항 체의 고르지 못한 배급 원인과 경우일 아티팩트를 만들 것입니다. 손실을 방지 하기 위해 시간과 잠재적으로 귀중 한 샘플, 프로토콜의 여러 단계에서 배려를가지고 한다. 항 원 복구 후 TBS 트리톤 permeabilization 솔루션에 전송 하기 전에 냉각 조직을 수 있습니다. 공기 샘플은 높은 온도에 열 하는 때에 순간 노출 조직의 즉석 건조 하면 됩니다. 또한 그 항 체, 차단, 또는 counterstain 솔루션 완벽 하 게 커버 조직 응용 프로그램 동안 확인 합니다. 이 조직을 완전히 솔루션 실행을 피하기 위해 소수 펜에 의해 제시 된 하 고 모든 솔루션 레벨 표면에 습도 챔버에 적용 함으로써 얻을 수 있습니다. 이것은 하룻밤 외피 (주 항 체 바인딩) 동안 특히 중요 하다입니다.
얼룩이 지기 전에 백색 발광 Led를 사용 하 여 photobleaching의 성공적인 응용 프로그램 보관 조직 면역 형광 검사 방법의 응용 프로그램을 용이 하 게 수 있습니다. 그것은 우리가 미래에 다양 한 표본 의무가 있을 것으로 기대 하는 다양 하 고 저렴 한 치료입니다. 이 기술은 어떤 얼룩 프로토콜에 쉽게 통합 될 수 있지만 우리만 인간의 뇌 조직에이 방법을 적용, 어떤 autofluorescence에서 특히 심장 또는 골격 postmitotic 조직에에서 바람직한 결과 방지 lipofucin는 더 누적 될 근육입니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 연구는 캐나다 컨소시엄 Neurodegeneration 에이징 (CCNA)는, 캐나다 연구소의 건강 연구 (CIHR), 캐나다 (ALS 캐나다), ALS 협회와 캐나다 (ASC)의 알 츠 하이 사회에 의해 전체 또는 일부를 지원 했다. 저자 술탄 Darvesh와 해상 뇌 조직 은행에서 FTLD 뇌 조직을 제공 하기 위한 Spatio 시간적 타겟팅 및 증폭 방사선 응답 (STTARR) 프로그램와의 제휴에서 밀라노 Ganguly 앤드류 리드 감사 하 고 싶습니다. 기관 조직 포함 및 서비스, 그리고는 고급 광학 현미경 시설 (AOMF) 현미경 계기를 제공 하기 위한 단면에 대 한 자금. 케빈 해 들 리 원고의 중요 한 검토에 대 한 감사입니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trizma Base | Sigma-Aldrich | T6066 | |
| Sodium Choloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Hydrochloric Acid | Caledon Laboratory Chemicals | 1506656 | |
| Sodium Azide | BioShop Canada | SAZ001 | |
| 100 mm x 100 mm x 20 mm Pitri dish | Sarstedt | 82.9923.422 | All components of photobleacher can be substituted based on availability |
| 6 W LED Dimmable Desk Lamp | DBPower | DS501 | All components of photobleacher can be substituted based on availability |
| Citric Acid | Sigma-Aldrich | C-2404 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | BioShop Canada | EDT001 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P-7949 | |
| Sodium Hydroxide | BioShop Canada | SHY700.1 | |
| Water bath | Haake Fisons | K15 | |
| Slide collector | FisherScientific | 12-587-17B | |
| Staining Jar | FisherScientific | E94 | |
| Orbital Shaker | Bellco Glass | 7744-08115 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T7878 | |
| Bovine Serum Albumin | FisherScientific | BP1600-1 | |
| Normal Goat Serum | Aurion | 905.002 | |
| Hydrophobic pen | Sigma-Aldrich | Z672548-1EA | |
| Phospho-Tau (Ser202, Thr205) Monoclonal Antibody (AT8) | ThermoFisher | MN1020 | |
| Goat anti-Mouse Secondary Antibody, Texas Red-X | ThermoFisher | T862 | |
| Goat anti-Mouse Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher | A-11029 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Mounting medium | ThermoScientific | 28-600-42 | |
| Glass soverslip | |||
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM710 | |
| Imaging software ZEN 2012 Black Edition 11.0 | Zeiss | LSM710 | Software accompanies the Confocal Microscope |
| ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/download.html | |
| RGB Profile Tools macro | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/macros/tools/RGBProfilesTool.txt | |
| Commercial chemical quencher | Biotum | 23007 |
References
- Banerjee, B., Miedema, B. E., Chandrasekhar, H. R. Role of basement membrane collagen and elastin in the autofluorescence spectra of the colon. J Investig Med. 47 (6), 326-332 (1999).
- Terman, A., Brunk, U. T.
- Del Castillo, P., Llorente, A. R., Stockert, J. C. Influence of fixation, exciting light and section thickness on the primary fluorescence of samples for microfluorometric analysis. Basic Appl Histochem. 33 (3), 251-257 (1989).
- Ottis, P., Koppe, K., et al.
- Sun, Y., Chakrabartty, A. Cost-effective elimination of lipofuscin fluorescence from formalin-fixed brain tissue by white phosphor light emitting diode array. Biochem Cell Biol. 94 (6), 545-550 (2016).
- Davis, A. S., Richter, A., et al. Characterizing and Diminishing Autofluorescence in Formalin-fixed Paraffin-embedded Human Respiratory Tissue. J Histochem Cytochem. 62 (6), 405-423 (2014).
- Zimmermann, T., Rietdorf, J., Pepperkok, R. Spectral imaging and its applications in live cell microscopy. FEBS Lett. 546 (1), 87-92 (2003).
- Duong, H., Han, M. A multispectral LED array for the reduction of background autofluorescence in brain tissue. J Neurosci Methods. 220 (1), 46-54 (2013).
- Albeanu, D. F., Soucy, E., Sato, T. F., Meister, M., Murthy, V. N. LED arrays as cost effective and efficient light sources for widefield microscopy. PLoS One. 3 (5), 1-7 (2008).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Robertson, J. B., Zhang, Y., Johnson, C. H. Light-emitting diode flashlights as effective and inexpensive light sources for fluorescence microscopy. J Microsc. 236 (1), 1-4 (2009).
- Mackenzie, I. R. A., Neumann, M. Molecular neuropathology of frontotemporal dementia: insights into disease mechanisms from postmortem studies. J Neurochem. 138 (S1), 54-70 (2016).
- Kouri, N., Whitwell, J. L., Josephs, K. A., Rademakers, R., Dickson, D. W. Corticobasal degeneration: a pathologically distinct 4R tauopathy. Nat Rev Neurol. 7 (5), 263-272 (2011).
