Summary
Sfondo autofluorescenza dei campioni biologici complica spesso tecniche di imaging basata sulla fluorescenza, particolarmente in tessuti postmitotic umani invecchiati. Questo protocollo descrive come autofluorescence da questi campioni possa essere efficacemente rimosse utilizzando una luce disponibile in commercio che emette luce a diodi fonte a photobleach il campione prima della colorazione.
Abstract
L'immunofluorescenza è un metodo comunemente utilizzato per visualizzare compartimenti subcellulari e per determinare la localizzazione delle proteine specifiche all'interno di un campione di tessuto. Un grande ostacolo per l'acquisizione di immagini di alta qualità immunofluorescenza è endogeno autofluorescenza del tessuto causato da pigmenti di invecchiamento quali lipofuscin o da processi di preparazione del campione comuni quali fissazione dell'aldeide. Questo protocollo descrive come fluorescenza di fondo può essere notevolmente ridotto attraverso photobleaching utilizzando array di diodi (LED) prima del trattamento di luminescente fosforo bianco con sonde fluorescenti. L'emissione ad ampio spettro di fosforo bianco LED consentono per lo sbiancamento di fluorofori tutta una serie di picchi di emissione. L'apparato di photobleaching può essere costruito da componenti normalizzati a bassissimo costo e offre un'alternativa accessibile a quenchers chimici disponibili in commercio. Un photobleaching di pretrattamento del tessuto seguito da immunofluorescenza convenzionale genera immagini gratis di sfondo autofluorescence. Rispetto stabilito quenchers chimico che ha ridotto la sonda come sfondo segnali, photobleaching trattamento non ha avuto effetto sull'intensità di fluorescenza sonda mentre efficacemente ridotto fluorescenza di fondo e il lipofuscin. Anche se photobleaching richiede più tempo per il pre-trattamento, maggiore intensità LED Array può essere usato per ridurre tempo photobleaching. Questo metodo semplice potenzialmente può essere applicato ad una varietà di tessuti, tessuti particolarmente postmitotic che si accumulano lipofuscin come il cervello e i muscoli cardiaci o scheletrici.
Introduction
Microscopia di fluorescenza usando gli anticorpi proteine specifiche di targeting è abitualmente utilizzata per visualizzare le proteine di interesse nella coltura delle cellule e dei tessuti. È una complicazione importante per l'acquisizione di immagini nitide e definitive in immunofluorescenza autofluorescenza, che può essere causato in modo endogeno in tessuti di mammiferi, di età pigmento lipofuscin e di proteine come collagene ed elastina1, 2. Altre fonti di autofluorescence possono essere introdotto attraverso passaggi di preparazione del campione come aldeide fissazione3. Granelli di lipofuscin, composti principalmente da proteine oxidatively modificata e residui di degradazione dei lipidi, si accumulano nelle cellule longevi con età maggiore di2. Questo provoca difficoltà in imaging postmitotic tessuti come il cervello e muscoli cardiaci o scheletrici, come lo spettro di emissione di fluorescenza del lipofuscin è vasto e variabile, spesso in concomitanza con la lunghezza d'onda di emissione di fluorofori comune utilizzato per 4di etichettatura. Questi fattori rendono la formazione immagine del tessuto di cervello umano da casi di malattie neurodegenerative di manifestazione tardiva come degenerazione lobare frontotemporale (FTLD) particolarmente impegnativo.
Per ridurre l'autofluorescenza, abbiamo messo a punto una tecnica in cui si irradiano le sezioni di tessuto montata con una luce bianca che emettono array di diodi (LED) utilizzando una scrivania della famiglia lampada5. Questa semplice tecnica fornisce un'alternativa alle tecniche che utilizzano chimica quenchers come CuSO4 acetato di ammonio, o commercialmente disponibili tempra coloranti quali Sudan nero B e nero eriocromo T6. Ha anche un significativo risparmio di costi oltre multispettrali LED tecniche photobleaching lampada ed evita le complicazioni e gli artefatti generati da metodi di rimozione di autofluorescenza digitale come spettrale ONU-miscelazione7,8. Fosforo bianco LED hanno un ampio spettro di emissione, ad alta luminosità e basso costo di produzione, che li rende ideali come componente COTS per photobleaching una varietà di cromofori5,9.
In questo protocollo, dimostriamo la costruzione di un apparato di photobleaching utilizzando componenti accessibili e photobleaching di applicare a un caso di tessuto FTLD contenente inclusioni tau-positive (FTLD-T) utilizzando un anticorpo specifico per tau fosforilata. Dimostriamo l'effetto di photobleaching su imaging con etichetta fluorescente anticorpi che impiegano due cromofori comunemente utilizzati: Alexa 488 e Texas Red. L'effetto di photobleaching contro sezioni non trattate o quelli trattati con un quencher chimico commercio sono quantificati e rispetto. Questo pretrattamento photobleaching può essere incorporato in qualsiasi protocollo di colorazione di immunofluorescenza standard per rimuovere autofluorescence in un campione biologico.
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Protocol
Nota: il lavoro presentato è stato effettuato in conformità alle norme internazionali, tra cui la conferenza internazionale sull'armonizzazione (ICH), il Consiglio per internazionale organizzazioni di Medical Sciences (CIOMS) e i principi della dichiarazione di Helsinki. Uso di tessuti umani è stato con l'approvazione della University Health Network Research Ethics Board. I campioni di cervello umano sono stati raccolti come parte della banca del tessuto cerebrale marittimo. Al momento della raccolta, il consenso informato è stato ottenuto da tutti i pazienti.
1. costruzione di photobleaching apparecchi e soluzioni
- preparare soluzioni di riserva.
- Preparare 1 L di 1 x soluzione di soluzione fisiologica tamponata stock (1 x TBS) (150 mM NaCl, 50 mM Tris-Cl, pH 7.4) sciogliendo 8,77 g di NaCl e 6,06 g di Tris base in 800 mL di ddH 2 O e regolare il pH a 7.4 utilizzo HCl. portare il volume a 1 L e autoclave. < / li >
- preparare 10% (stock x 200) sodio azide sciogliendo 1 g di sodio azide in 10 mL di ddH 2 O (10%, 200 x stock).
- Per diapositive di formato standard 1-3, utilizzare una piastra Petri singolo 100 x 100 mm trasparente, quadrato come una camera di diapositiva. Per una camera singola diapositiva, è possibile aggiungere 0,25 mL di Stock in 200 di azoturo di sodio x a 50 mL di 1 x TBS per ottenere una soluzione di TBS azide 0.05%. Pila 2-3 camere di diapositiva verticalmente per elaborare ulteriori diapositive. Preparare un ulteriore 50 mL di soluzione di azide-TBS per ogni camera.
- Creare un'impalcatura per elevare la camera diapositiva tale che una testa della lampada può andare bene sotto.
Camera di diapositiva di
- per un 100 x 100 mm, tagliare le aperture nella parte inferiore e i lati di un 100 mm x 100 mm x 30 mm plastica contenitore e invertire il contenitore. Garantire le aperture laterali sono grandi abbastanza per montare una sorgente di luce LED e garantire l'apertura inferiore è abbastanza grande, tale che la luce dalla sorgente di luce raggiunge la camera di campionamento senza impedimento.
- Applicare nastro isolante al patibolo per aumentare l'aderenza tra il patibolo e la camera/benchtop del campione. Utilizzare qualsiasi materiali alternativi per costruire l'impalcatura fintanto che si eleva in modo sicuro la camera di diapositiva senza ostacolare la luce di raggiungere il campione.
- Rimuovere qualsiasi diffusori o plastici opachi dalla lampada di scrittorio che può ostacolare la luce LED raggiungano direttamente il campione (se possibile) e orientare verso l'alto la matrice di LED. Posizionare la camera dell'impalcatura e far scorrere sopra la matrice di LED. Utilizzare una lampada con un collo flessibile per una facile manipolazione.
- Costrutto una cupola riflettente coprire per l'apparato di rivestimento interno di una scatola abbastanza grande da coprire la camera di diapositiva e il patibolo con carta stagnola. Utilizzare una casella di punta di pipetta da 1 mL per una camera singola o un 150 mm x 150 mm x 150 mm cartone per più verticalmente impilati chambers.
2. Photobleaching pre-trattamento delle sezioni del tessuto
Nota: preparazione di tessuti sezione può variare a seconda dell'origine del tessuto e la fissazione e l'incorporamento di metodi utilizzati. Qui, il tessuto cerebrale (orbitofrontal gyri) da un caso di FTLD-T è stato risolto per ~ 2 giorni in formalina, eseguire attraverso un gradiente di saccarosio, incorporata in OCT e tagliare a µm 10 sezioni spesse utilizzando un criostato.
- Freddo º c in un 4 camera, freddo armadietto o frigorifero, orientare la lampada sotto il patibolo e posizionare la camera di campione sul patibolo. Versare 50 mL di soluzione di azide-TBS nel pozzetto di misurazione.
- Submerge tessuto sezioni montate su vetrini standard nella camera di diapositiva contenente azide-TBS usando il forcipe pulito. Per più diapositive, assicurarsi che le diapositive vengono inserite nella camera di un singolo livello.
- Coprire l'apparecchio con la cupola riflettente, accendere la lampada a LED e incubare per 48 ore a 4 ° c.
3. Immunofluorescenza
- a macchiare il tessuto per tau fosforilata usando il colorante di contrasto DAPI e Alexa 488 - e anticorpi secondari coniugati Texas Red, preparare soluzioni per ricupero dell'antigene, la permeabilizzazione, il blocco e la primaria grippaggio dell'anticorpo.
- Preparare 500 mL di ricupero dell'antigene buffer (10 mM acido citrico, acido etilendiamminotetracetico di 2 mM, 0.05% Tween 20; pH 6,2) sciogliendo 0,92 g di acido citrico e 0,37 g di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) in 500 mL di ddH 2 O. regolare il pH a 6.2 con NaOH e aggiungere 0,25 mL di Tween 20.
- Preparare 500 mL di 0.025% Triton X-100 in soluzione TBS (TBS-Triton) aggiungendo 0,125 mL di Triton X-100 a 500 mL 1 x TBS.
- Preparare una soluzione di 1% albumina di siero bovino (BSA) in TBS (tampone BSA-TBS) sciogliendo 0,1 g BSA in 10 mL di TBS.
- Preparare una soluzione di blocco con l'aggiunta di 0,2 mL di siero di capra normale a 1,8 mL di 1% BSA/TBS.
- Per ogni diapositiva, preparare 150 µ l di soluzione di anticorpo primario (diluizione 1: 100) di pipettaggio 1,5 µ l di anti-phospho-PHF-tau pSer202 + Thr205 (AT8) anticorpo in 148,5 µ l di 1% BSA-TBS buffer e lasciare sul ghiaccio
- Per eseguire il ricupero dell'antigene, immergere i vetrini photobleached verticalmente in un collettore di diapositiva contenente 25 mL di tampone di ricupero dell'antigene. Fissare il collettore con nastro e/o stringhe tale che il collettore non rientra nel bagno di acqua. Scaldare il collettore in un bagno di acqua a 90 ° c per 30 min e consentire al collector raffreddare a temperatura ambiente per 30 minuti prima di rimuovere le diapositive. Non rimuovere le diapositive immediatamente come essa causerà le sezioni ad asciugarsi.
- Trasferire gli scivoli dal raccoglitore di ricupero dell'antigene in una vaschetta di colorazione riempita con 30 mL di TBS-Triton e lavare le sezioni per 5 minuti su agitatore orbitale con agitazione delicata. Ripetere il lavaggio una volta con fresco TBS-Triton. Stoppino via tampone in eccesso con un panno privo di lanugine e delineare il tessuto con una penna idrofobica. Fare attenzione a non per lasciare le diapositive asciugare.
- Per ogni diapositiva, bloccare il tessuto di pipettaggio 200 µ l di soluzione sul tessuto di blocco e porre il vetrino in una camera umidificata. Costruire la camera inserendo un portavetrini all'interno di una casella di punta della pipetta contenente un tovagliolo di carta bagnato. Incubare a temperatura ambiente per 2 h su una superficie piana. Garantire che la soluzione bloccante copre completamente il tessuto.
- Eliminare la soluzione bloccante tramite aspirazione e pipettare 100-150 µ l di soluzione di anticorpo primario sul tessuto. Assicurare un volume sufficiente di anticorpo è presente e che la sezione sia su una superficie piana per evitare la messa in comune di soluzione di anticorpo ad un lato. Incubare a 4 ° c durante la notte in una camera umidificata.
- Preparare la miscela di anticorpo secondario e il colorante di contrasto DAPI nucleare.
- Per ogni diapositiva, preparare 150 µ l di miscela di anticorpo secondario (diluizioni 1: 100) con l'aggiunta di 1,5 µ l di anti-topo di capra Alexa 488 e 1,5 µ l di anti-topo di capra Texas Red a 147 µ l di BSA-TBS e lasciare sul ghiaccio.
- Preparare 0,1 µ g/mL DAPI colorante di contrasto di diluizione seriale. Mescolare accuratamente la soluzione di riserva e diluire 1 µ l di stock 5 mg/mL DAPI nel 999 di TBS per fare 1 mL di soluzione di 5 µ g/mL. Per ogni diapositiva, diluire 3 µL 5 µ g/mL di soluzione con 147 µ l di TBS a una concentrazione finale di 0.1 µ g/mL.
Attenzione: DAPI è un noto agente mutageno e deve essere maneggiato con cura.
- Rimuovere l'anticorpo primario dall'aspirazione. Immergere i vetrini in un vetro colorazione barattolo contenente 30 mL di TBS-Triton e lavaggio per 5 min con miscelazione delicata su agitatore orbitale. Ripetere la fase di lavaggio con fresco TBS-Triton. Stoppino via l'eccesso TBS-Triton e pipettare 100 a 150 µ l di miscela di anticorpo secondario per ogni diapositiva.
- Assicurarsi che il tessuto è completamente coperto dalla miscela dell'anticorpo. Incubare per 2 ore a temperatura ambiente nella camera umidificata al buio.
- Eliminare la miscela di anticorpo secondario tramite aspirazione e trasferire la diapositiva in un vetro colorazione barattolo contenente 30 mL di TBS (nessun Triton). Lavare per 5 min con miscelazione delicata su agitatore orbitale. Ripetere la fase di lavaggio con TBS. fresco applicare 100 a 150 µ l di colorante di contrasto di 0,1 µ g/mL DAPI a ogni diapositiva e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente al buio.
- Trasferire i vetrini di un vetro colorazione barattolo contenente TBS e lavare 3 volte con miscelazione delicata per 5 minuti ciascuno, utilizzando freschi TBS per ogni lavaggio. Tampone in eccesso assente stoppino.
- Applicare 3 gocce di mezzo di montaggio acquoso al tessuto. Usando il forcipe, abbassare delicatamente un coprioggetto in vetro pulito sul tessuto, iniziando con un bordo e lentamente abbassando l'altro bordo per evitare l'intrappolamento di bolle d'aria. Fare attenzione a non per rimuovere il vetrino coprioggetto se imaging immediatamente. In caso contrario, consentire il mezzo di montaggio a secco prima della conservazione a 4 ° c al buio.
4. Microscopia a fluorescenza
- Disabilita la lampada a fluorescenza, il microscopio e il computer e attendere che la lampada si riscaldi per 15 min. posto il tessuto macchiato i vetrini nel tavolino del microscopio di fluorescenza. Utilizzare il campo luminoso immagine per individuare il tessuto a 10 ingrandimenti.
- Applicare una goccia di ddH 2 O sulla superficie del vetrino coprioggetto e utilizzare un obiettivo di 20 x acqua immersione (NA = 1.0). Selezionare la scansione 4-linea aereo media impostazione. Impostare la dimensione del foro stenopeico 1 unità arioso che dà una fetta ottico di ~ 3 micron. Selezionare lunghezze d'onda di eccitazione e di emissione laser per ogni fluoroforo in tracce separate per il miglior segnale.
Nota: Alexa 488: λ ex = 488 nm (laser ad argon) λ em = 493-570 nm; Texas Red: λ ex = 561 nm (laser di DPSS 561 nm), λ em = 601-635 nm; DAPI: λ ex = 405 nm (laser diodo 405), λ em = 410-507 nm.- Regolare la potenza del laser e di ottenere le impostazioni per ottimizzare l'intensità del segnale per ogni traccia. Raccogliere l'immagine composita e salvare. Utilizzare le stesse impostazioni di laser per confrontare l'intensità di fluorescenza in un'altra diapositiva.
- Per la visualizzazione di intensità di fluorescenza in ogni canale, installare la macro di strumenti profilo RGB per ImageJ 10. Salvare la macro dalla pagina Web come file di testo (https://imagej.nih.gov/ij/macros/tools/RGBProfilesTool.txt). Selezionare il menu ImageJ plugin - > macro - > installare; Selezionare il file di testo per installare lo strumento di profili RGB.
- Aprire il file di immagine confocale in ImageJ e convertire le immagini composite da 3 pile a RGB procedendo come segue: immagine - > colore - > strumento di canale. Selezionare " composito " dal menu a discesa e controllare tutti i tre canali. Quindi, selezionare immagine - > tipo - > di colore di RGB.
- Selezionare l'icona di strumenti profilo RGB e tracciare una linea attraverso la sezione nell'immagine da profilare. Salvare i dati di intensità come un foglio di calcolo per la stampa.
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Representative Results
Il passo di pre-trattamento photobleaching può essere aggiunto per un protocollo di immunofluorescenza standard immediatamente prima di ricupero dell'antigene e immunostaining (Figura 1A). Il montaggio dell'apparecchiatura photobleaching può essere eseguito anche utilizzando vari, poco costosi, disponibile immediatamente componenti (Figura 1B). Lo spettro di emissione del fosforo bianco LED copre una vasta gamma di lunghezze d'onda che li rende adatti ad ampio spettro photobleaching, concordando con precedenti relazioni (Figura 1)5,11. Dopo 48 h photobleaching, l'intensità delle macchioline di autofluorescent che assomigliano lipofuscin, come pure la fluorescenza di fondo generale è stato ridotto notevolmente in entrambi lunghezze d'onda di emissione in una sezione non macchia di FTLD-T (Figura 1). Dimostrare l'efficacia di photobleaching, abbiamo macchiato per tau iperfosforilata visualizzare inclusioni tau patologico in un caso di FTLD-T utilizza due anticorpi secondari differenti. La forma distinta di inclusioni tau e l'uso di due cromofori per l'etichettatura anche permette di distinguere con sicurezza autofluorescent caratteristiche dagli obiettivi previsti per convalidare la tecnica.
Nelle immagini di compositi a basso ingrandimento, la morfologia delle inclusioni tau-positivi, macchiato giallo dalla combinazione di canali Alexa 488 e Texas Red, è costituito da collezioni a forma di anello di processi cellulari breve che sono indicati come ' astrocitari placche (Figura 2a-c). Questa morfologia è caratteristica di corticobasal degenerazione (CBD)12,13, che concorda con il rapporto di patologia di questo caso. Nel campione non trattato, numerose strutture sono presenti nell'immagine composita che non assomigliavano inclusioni tau e ha mostrato la fluorescenza principalmente nel canale del rosso, suggerendo che è autofluorescence piuttosto che di macchiatura dell'anticorpo desiderato. Un notevole livello di fluorescenza di fondo è anche visibile in questo canale in tutto il campo visivo (Figura 2a). Queste caratteristiche di autofluorescent vengono rimossi e l'immagine complessiva appare molto più pulito quando i campioni sono stati trattati con photobleaching (PB) e la chimica quencher (Figura 2b-c).
Abbiamo poi quantificato le differenze di fluorescenza in questi campioni mediante profilatura, una regione più piccola in ciascun campione. Una singola placca astrocytic è presentata in ciascuna condizione di trattamento per il confronto (figura 2d-r). Nel campione non trattato, fluorescenza di fondo è presente in tutti e tre i canali, ma fluorescenza di anticorpo secondario per gli anticorpi sia Alexa 488 e Texas Red era relativamente alta (Fig. 2h). Tuttavia, le strutture di autofluorescent presenti nel campione non trattato ha avuto intensità di fluorescenza nel canale Texas Red paragonabile all'anticorpo secondario di Texas Red che hanno macchiato per tau (Figura 2 h). Se la proteina dell'obiettivo non hanno una morfologia distinta, prevedibile come tau nel nostro caso, l'autofluorescenza nel tessuto avrebbe reso l'immagine non interpretabili.
Al contrario, quando il photobleaching pre-trattamento è stato applicato prima della colorazione, fluorescenza di fondo nell'Alexa 488 e canali di Texas Red è stato ridotto significativamente rispetto al campione non trattato e la fluorescenza di immunostained tau è rimasto inalterato (Figura 2i-m). Il quencher chimica commerciale bonificato l'autofluorescenza nel canale Alexa 488 altrettanto efficacemente come photobleaching. Inoltre ha soppresso fluorescenza di fondo DAPI, che non è stata influenzata dal trattamento photobleaching 48h (Figura 2 m). Tuttavia, il quencher chimica inoltre ha ridotto l'intensità del Texas Red secondaria e segnali DAPI, suggerendo un certo grado di tempra controproducente (Figura 2n- r).
Figura 1 : Applicazione di photobleaching pre-trattamento in un flusso di lavoro standard immunofluorescenza. A) schema semplificato del protocollo standard immunofluorescenza dall'acquisizione di tessuto a imaging. Applicazione degli anticorpi fluorescenti primari e secondari è rappresentata da cartoni animati. Un'immagine rappresentativa del microscopio è prodotto. Barra della scala = 100 µm. B) un rappresentante photobleaching apparato costruito utilizzando componenti normalizzati (coperchio riflettente non viene mostrata). C) lo spettro di emissione dell'array di LED bianchi. Un picco di emissione stretta a 450 nm e un vasto picco a 550 nm sono osservati. D) effetto di photobleaching sulla fluorescenza di fondo endogeno del tessuto FTLD-T alla Alexa 488 (493-570 nm) e lunghezze d'onda emissione Texas Red (601-635 nm). Le macchioline autofluorescent lipofuscin di somiglianza sono visibilmente ridotte dopo 48h photobleaching. Barra della scala = 100 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2:effetto della rimozione di autofluorescenza sulla qualità dell'immagine di un caso di tessuto FTLD-T con anti-fosforilato tau immunostaining. a-c) basso ingrandimento, composito immunofluorescenza immagini di campi di vista rappresentativo in non trattati (a), photobleached per 48 h (b) e chimici quencher trattati (c) i campioni. I colori rappresentano nei seguenti canali tramite eccitazione da loro rispettive fonti di luce di fluorescenza: Alexa 488 (verde): λex = 488 nm (laser ad argon) λem = 493-570 nm; Texas Red (rosso): λex = 561 nm (laser di DPSS 561 nm), λem = 601-635 nm; DAPI (blu): λex = 405 nm (laser diodo 405), λem = 410-507 nm. Barra della scala = 100 µm. d-r) immagini di ingrandimento superiore delle regioni punteggiate non trattati (d-g), photobleached (i-l) e campioni chimici quencher trattati (n-q), con canali separati di fluorescenza, unire immagine e quantificato profili del segnale di fluorescenza. Linee tratteggiate nei canali Uniti (g, l, q) rappresentano la linea sulla quale segnale profili (h, m, r) sono stati generati. Barra della scala = 50 µm. Autofluorescent particelle (af),immunolabeled tau fluorescenza (tau) e segnale di nucleo (nuc) sono indicati. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Il photobleaching e pre-trattamento dei tessuti descritto in questo manoscritto permette per l'efficace eliminazione di autofluorescenza utilizzando componenti normalizzati. Il protocollo descrive la formazione immagine di immunofluorescenza degli aggregati di tau fosforilata nel tessuto formalina-fisso cervello umano usando anticorpi secondari coniugati a Alexa 488 e Texas Red, con DAPI come una colorazione nucleare. Per applicare il metodo ad altri tessuti, si consiglia di eseguire un pre-trattamento di 48 h photobleaching al campione come punto di partenza. Dopo photobleaching, eseguire il protocollo per le caratteristiche di interesse utilizzando diluizioni di anticorpo seguendo le raccomandazioni del produttore di colorazione di immunofluorescenza standard. Se fluorescenza di fondo è ancora presente, l'anticorpo che macchia procedura e/o la durata di photobleaching devono essere modificati. La durata del photobleaching variano a seconda della lampada selezionata per costruire l'apparato e il livello di autofluorescenza nel campione. Il tempo di candeggio ottimo per ogni apparato di lampada unica deve essere determinato. Questo può essere fatto da photobleaching un'innocente, coperti con tessuto sezione montato in TBS-azide e misurare la fluorescenza endogena della diapositiva a intervalli di 12 ore utilizzando un microscopio a fluorescenza. Nei rapporti precedenti, abbiamo monitorato lipofuscin photobleaching di analisi delle particelle e adattamento di decadimento esponenziale della curva funzioni5, ma per semplicità, osservazione visiva delle sezioni a intervalli regolari può essere altrettanto efficace per giudicare il durata a cui la maggior parte della fluorescenza diventa placata. Nel nostro caso del tessuto di cervello invecchiato contenenti elevate quantità di pigmenti di lipofuscin, 48 h di incubazione con una lampada di 800 lux era sufficiente. Se il segnale specifico rimane debole rispetto allo sfondo dopo photobleaching, prendere in considerazione l'aumento della concentrazione di anticorpi primari e secondari durante la colorazione. È anche importante eseguire un controllo di sola anticorpo secondario per garantire che il segnale di fondo non è causato dal legame non specifico anticorpo secondario. Fare attenzione a selezionare gli anticorpi che traversa-non reagiscono, soprattutto quando la macchiatura per più destinazioni. Inoltre, assicurarsi che i segnali specifici non sono inavvertitamente si spegne durante il processo di colorazione. Per esempio, di Nissl (per la macchiatura neuroni) è spenta da BSA. In questo caso, il componente di BSA della soluzione blocco dovrebbe essere sostituito con alternative come gelatina di pesce della pelle5.
L'uso del fosforo bianco LED per photobleaching ha alcune limitazioni a causa del suo spettro di emissione da 420 nm a 650 nm. Così, nessun significativo photobleaching lunghezze d'onda UV è possibile. Inoltre, a causa l'ampio spettro di emissione, photobleaching cromofori di lunghezze d'onda specifiche richiede modifiche come sovrapposizione di fogli di colore filtro sopra le matrici di LED per filtrare le lunghezze d'onda di emissione indesiderabili. Inoltre, photobleaching del tessuto possono richiedere tempi di elaborazione maggiori rispetto ad altri metodi. In questo caso, dovuto l'età del tessuto cerebrale (da un individuo di 89 anni) e il periodo di fissazione dell'aldeide lunga di più di 2 giorni, una durata di 48 h photobleaching è stato richiesta. Anche se nessun tempo di elaborazione attiva è richiesto, uno deve prendere in considerazione il tempo di photobleaching e pianificare di conseguenza la sessione di colorazione. Lampade a LED di alta luminosità o l'utilizzo di più lampade può ridurre significativamente il tempo di photobleaching tramite il semplice aumento nel cambiamento continuo del fotone.
Rispetto ai metodi esistenti, la nostra tecnica offre diversi vantaggi significativi. A differenza di photobleaching mediante scansione laser in microscopia a fluorescenza, abbiamo non osservato alcun segno di danno indotto da foto dei nostri campioni utilizzando LED photobleaching. Un altro grande vantaggio del nostro apparato è la significativa riduzione dei costi rispetto ad altre tecniche. Il costo di montaggio del nostro apparato è circa $10 USD, e il montaggio dell'apparecchiatura è flessibile abbastanza tale che ogni laboratorio può adottare la propria versione del photobleacher. In confronto, altri metodi tramite mutispectral LED matrici con titolari di diapositiva personalizzati e camere di raffreddamento richiede fino a $1000 USD per costruire8. Inoltre, commerciale chimico quenchers sono beni di consumo che costano $120 USD per 100 diapositive e introdurre il campione di composti potenzialmente indesiderati. Il quencher chimici utilizzati per il confronto nello studio presente probabilmente contiene il colorante Sudan nero del lipido-associazione, che può interferire con immunostaining delle lipoproteine.
Nel complesso, i passaggi più critici nel pre-trattamento photobleaching e immunostaining del campione comporta il trattamento della sezione durante immunostaining. È importante che una volta che la sezione è reidratata durante photobleaching, esso non è consentito ad asciugare in uno qualsiasi dei passaggi successivi. Essiccazione della diapositiva causerà l'irregolare distribuzione degli anticorpi e creare artefatti non interpretabili. Per evitare perdite di tempo e potenzialmente preziosi campioni, si deve prestare attenzione a diversi passi nel protocollo. Dopo ricupero dell'antigene, lasciare che il tessuto si raffreddi prima di trasferire la soluzione di permeabilizzazione TBS-Triton. Anche momentanea esposizione all'aria quando il campione viene riscaldato ad alte temperature causerà asciugatura istantanea del tessuto. Assicurarsi inoltre che l'anticorpo, blocco, o controcolorazione soluzioni coprono completamente i tessuti durante l'applicazione. Questo può essere raggiunto facendo in modo che il tessuto è completamente delineato dalla penna idrofobica per evitare lo scolo soluzione e che tutte le soluzioni vengono applicate in una camera umidificata su una superficie piana. Ciò è particolarmente importante durante le incubazioni overnight (associazione anticorpo primario).
La riuscita applicazione di photobleaching utilizzando fosforo bianco LED prima della colorazione può facilitare l'applicazione dei metodi di immunofluorescenza ai tessuti archiviati. È un trattamento versatile e poco costoso che ci aspettiamo di essere favorevoli a una vasta gamma di esemplari in futuro. Anche se abbiamo solo applicato questo metodo al tessuto cerebrale umano, questa tecnica può essere facilmente incorporata in qualsiasi protocollo di colorazione in cui autofluorescenza è prevenire risultati desiderabili, particolarmente nel tessuto postmitotic come cardiaco o scheletrico muscoli dove lipofucin è più probabile che si accumulano.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Questo studio è stato sostenuto in tutto o in parte dal consorzio canadese di neurodegenerazione e invecchiamento (CCNA), l'Istituto canadese di Health Research (CIHR), la società di ALS del Canada (Canada ALS) e la società di Alzheimer del Canada (ASC). Gli autori vorrei ringraziare Luca Sultan e Andrew Reid della Maritime cervello tessuto banca per fornire tessuti cerebrali FTLD, Giordano di Milano dal programma del Targeting spazio-temporali e amplificazione della radiazione risposta (STTARR) e suoi affiliati agenzie per il tessuto incorporamento e servizi e l'avanzata ottica microscopia Facility (AOMF) per la fornitura di strumenti di microscopia di sezionamento di finanziamento. Kevin Hadley è ringraziato per la revisione critica del manoscritto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trizma Base | Sigma-Aldrich | T6066 | |
| Sodium Choloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Hydrochloric Acid | Caledon Laboratory Chemicals | 1506656 | |
| Sodium Azide | BioShop Canada | SAZ001 | |
| 100 mm x 100 mm x 20 mm Pitri dish | Sarstedt | 82.9923.422 | All components of photobleacher can be substituted based on availability |
| 6 W LED Dimmable Desk Lamp | DBPower | DS501 | All components of photobleacher can be substituted based on availability |
| Citric Acid | Sigma-Aldrich | C-2404 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | BioShop Canada | EDT001 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P-7949 | |
| Sodium Hydroxide | BioShop Canada | SHY700.1 | |
| Water bath | Haake Fisons | K15 | |
| Slide collector | FisherScientific | 12-587-17B | |
| Staining Jar | FisherScientific | E94 | |
| Orbital Shaker | Bellco Glass | 7744-08115 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T7878 | |
| Bovine Serum Albumin | FisherScientific | BP1600-1 | |
| Normal Goat Serum | Aurion | 905.002 | |
| Hydrophobic pen | Sigma-Aldrich | Z672548-1EA | |
| Phospho-Tau (Ser202, Thr205) Monoclonal Antibody (AT8) | ThermoFisher | MN1020 | |
| Goat anti-Mouse Secondary Antibody, Texas Red-X | ThermoFisher | T862 | |
| Goat anti-Mouse Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher | A-11029 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Mounting medium | ThermoScientific | 28-600-42 | |
| Glass soverslip | |||
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM710 | |
| Imaging software ZEN 2012 Black Edition 11.0 | Zeiss | LSM710 | Software accompanies the Confocal Microscope |
| ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/download.html | |
| RGB Profile Tools macro | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/macros/tools/RGBProfilesTool.txt | |
| Commercial chemical quencher | Biotum | 23007 |
References
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