Summary
Fondo de Autofluorescencia de las muestras biológicas a menudo complica basada en fluorescencia las técnicas de imagen, especialmente en tejidos postmitotic humanos envejecidos. Este protocolo describe cómo autofluorescence de estas muestras puede eliminarse eficazmente usando un comercialmente disponible luz de diodo electroluminoso fuente para photobleach la muestra antes de la inmunotinción.
Abstract
La inmunofluorescencia es un método común utilizado para visualizar los compartimientos subcelulares y a determinar la localización de proteínas específicas en una muestra de tejido. Un gran obstáculo para la adquisición de imágenes de alta calidad inmunofluorescencia es endógeno autofluorescencia de los tejidos causado por pigmentos como la lipofucsina de envejecimiento o por procesos de preparación de muestra comunes tales como fijación de aldehído. Este protocolo describe cómo fluorescencia del fondo puede ser grandemente reducida por photobleaching utilizando fósforo blanco electroluminoso arreglos de diodos (LED) antes del tratamiento con sondas fluorescentes. La emisión del amplio-espectro de fósforo blanco LEDs permiten blanquear de fluoróforos en una gama de picos de emisión. El aparato de fotoblanqueo puede construir a partir de componentes estándares a muy bajo costo y ofrece una alternativa accesible para extintores químicos disponibles en el mercado. Un tratamiento previo de fotoblanqueo del tejido seguido manchando de la inmunofluorescencia convencional genera imágenes de Autofluorescencia de fondo. En comparación con extintores químicos que reducen la sonda así como fondo de establecer señales, photobleaching tratamiento no tuvo efecto sobre intensidad de fluorescencia de la sonda mientras que efectivamente redujo la fluorescencia de fondo y del lipofuscin. Aunque fotoblanqueo requiere más tiempo de tratamiento previo, pueden utilizarse matrices de LED de mayor intensidad para reducir el tiempo de fotoblanqueo. Potencialmente, este sencillo método puede aplicarse a una variedad de tejidos, los tejidos particularmente postmitotic que acumulan lipofuscina como el cerebro y los músculos cardíacos o esqueléticos.
Introduction
Microscopía de fluorescencia con anticuerpos contra proteínas específicas se utiliza habitualmente para visualizar proteínas de interés en cultivo de células y tejidos. Una complicación importante a la adquisición de imágenes claras y definitivas en la inmunofluorescencia es autofluorescencia, que puede ser causada endógeno en tejidos de mamíferos por la edad del pigmento lipofucsina y por proteínas como la elastina y el colágeno1, 2. Otras fuentes de Autofluorescencia pueden ser introducidos a través de pasos de preparación de la muestra como aldehído fijación3. Gránulos de lipofuscina, compuestos principalmente de proteínas modificadas oxidativamente y residuos de la degradación de lípidos, se acumulan en las células de larga vida con aumento de la edad2. Esto causa dificultades en la proyección de imagen postmitotic tejidos como el cerebro y los músculos esqueléticos o cardiacos, como el espectro de emisión de fluorescencia de lipofuscin es amplio y variable, a menudo coincidiendo con la longitud de onda de emisión de los fluoróforos común utilizado para etiquetado4. Estos factores hacen que la proyección de imagen del tejido de cerebro humano de casos de enfermedades neurodegenerativas de aparición tardía como degeneración lobar frontotemporal (DLFT) especialmente desafiante.
Para reducir la autofluorescencia, hemos ideado una técnica que nos irradian las secciones de tejidos montados en portaobjetos con una arreglo de diodos (LED) usando una lámpara de escritorio hogar5de emisión de luz blanca. Esta técnica simple proporciona una alternativa a las técnicas que utilizan a extintores químicos como CuSO4 en acetato de amonio, o comercialmente disponible Temple colorantes como el Sudán negro B y eriocromo negro T6. También cuenta con importante ahorro de costes sobre multiespectral técnicas de fotoblanqueo de lámpara de LED y evita complicaciones y artefactos generados a partir de métodos de extracción digital autofluorescence como espectral sin mezcla de7,8. Fósforo blanco LED tienen un amplio espectro de emisión, alta luminosidad y fabricación bajo costo, lo que es ideal como un componente estándar de fotoblanqueo diversos cromóforos5,9.
En este protocolo, demostrar la construcción de un aparato de photobleaching con componentes accesibles y fotoblanqueo se aplican a un caso de tejido de DLFT con inclusiones tau-positivas (DLFT-T) utilizando un anticuerpo específico para tau fosforilada. Demostrar el efecto de fotoblanqueo en proyección de imagen anticuerpos marcados con fluorescencia empleando dos cromóforos habituales: Alexa 488 y rojo de Texas. El efecto de fotoblanqueo versus secciones no tratadas o tratados con un extintor químico comercial son cuantificados y comparados. Este tratamiento previo de photobleaching puede ser incorporado en cualquier protocolo de tinción de inmunofluorescencia estándar para quitar autofluorescencia en una muestra biológica.
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Protocol
Nota: el trabajo presentado fue realizado en cumplimiento de las normas internacionales reconocidas, incluyendo la Conferencia Internacional sobre armonización (ICH), el Consejo para internacional organizaciones de Medical Sciences (CIOMS) y los principios de la declaración de Helsinki. Uso de tejido humano fue con la aprobación de la Junta de ética de investigación de la Universidad salud red. Se recolectaron las muestras de cerebro humano como una parte del Banco de tejido cerebral marítimo. En el momento de la recogida, se obtuvo consentimiento informado de todos los pacientes.
1. construcción de aparatos de fotoblanqueo y soluciones
- preparación de soluciones madre.
- Preparar 1 L de 1 x solución stock solución salina tamponada con Tris (1 x TBS) (150 mM de NaCl, 50 mM Tris-Cl, pH 7.4) disolviendo 8,77 g de NaCl y 6,06 g de Tris base en 800 mL de ddH 2 O y ajustar el pH a 7.4 con HCl. lleve el volumen a 1 L y autoclave. < / li >
- preparar azida sódica al 10% (valores de x 200) disolviendo 1 g de azida de sodio en 10 mL de ddH 2 O (10%, bolsa 200 x).
- Para 1-3 diapositivas de tamaño estándar, utilizar un plato de petri individuales de 100 x 100 mm transparente, cuadrado como una cámara de diapositivas. Para la cámara de una sola diapositiva, agregar 0,25 mL de caldo de azida de sodio de x 200 a 50 mL de 1 x TBS para hacer una solución de 0.05% de azida-TBS. Pila 2-3 cámaras de slide vertical para proceso de diapositivas adicionales. Preparar un adicional 50 mL de solución de azida-TBS para cada cámara de.
- Crear un andamio para elevar las cámaras diapositiva que puede caber la cabeza de una lámpara debajo.
Cámara de diapositivas
- para un 100 mm x 100 mm, corte las aberturas en la parte inferior y los lados de un 100 x 100 mm x 30 mm plástico contenedor e invierta el recipiente. Las aberturas laterales sean lo suficientemente grandes para colocar una fuente de luz LED y asegurar la abertura inferior es lo suficientemente grande tal que la luz de la fuente de luz llega a la cámara de muestra sin impedimento.
- Aplique cinta aislante al andamio para aumentar la adherencia entre el andamio y la cámara de muestra/Banco. Utilizar materiales alternativos para construir el andamio mientras bien eleva el compartimiento portaobjetos sin obstaculizar la luz llegue a la muestra.
- Eliminar difusores o plástico opaco de la lámpara de escritorio que puede impedir que la luz llegue directamente a la muestra (si es posible) y orientar el arsenal del LED hacia arriba. Coloque las cámaras del andamio y deslice sobre la matriz de LED. Use una lámpara con un cuello flexible para fácil manipulación.
- Construir una cúpula reflectora tapa para aparato recubre el interior de una caja lo suficientemente grande como para cubrir la cámara de la diapositiva y andamio con papel de aluminio. Utilice una caja de punta de pipeta de 1 mL para una sola cámara o 150 mm x 150 mm x 150 mm cartón por múltiples, verticalmente apilados cámaras.
2. Fotoblanqueo pre-tratamiento de las secciones de tejido
Nota: preparación de la sección de tejido puede variar dependiendo de la fuente de tejidos y fijación y embebido de los métodos utilizados. Aquí, el tejido cerebral (orbitofrontal convoluciones del cerebro) de un caso de DLFT-T se fijó para ~ 2 días en formalina, correr a través de un gradiente de sacarosa, incrustado en OCT y corte para secciones gruesas de 10 μm con un criostato.
- Frío de º c en un 4 habitación, gabinete fría o refrigerador, Oriente la lámpara bajo el andamio y coloque la cámara muestra en el andamio. Verter 50 mL de solución de azida-TBS en la cámara de muestras.
- Sumerja los cortes de tejidos montan en portaobjetos de vidrio estándar en la cámara de la diapositiva que contiene azida-TBS con unas pinzas limpias. Para varias diapositivas, asegúrese de que las diapositivas se colocan en la cámara en una sola capa.
- Cubra el aparato con la cúpula de reflexivo, encender la lámpara del LED e incubar 48 h a 4 º c.
3. La inmunofluorescencia
- teñir el tejido para tau fosforilada con contratinción DAPI y Alexa 488 y anticuerpos secundarios conjugados con rojo Texas, primero preparar soluciones para recuperación de antígeno, permeabilización, bloqueo y primaria Unión de anticuerpos.
- Preparar 500 mL de recuperación de antígeno buffer (10 mM cítrico, ácido etilendiaminotetracético de 2 mM, de 0.05% Tween 20, pH 6.2) por 0,92 g de ácido cítrico y 0,37 g de ácido etilendiaminotetracético (EDTA) en 500 mL de ddH 2 O. ajustar el pH de la disolución 6.2 con NaOH y agregar 0,25 mL de Tween 20.
- Preparar 500 mL de 0.025% Tritón X-100 en la solución TBS (TBS-Triton) añadiendo 0,125 mL de Triton X-100 y 500 mL 1 x cucharada
- Prepare una solución de 1% de albúmina sérica bovina (BSA) en TBS (BSA-TBS tampón) disolviendo 0,1 g de BSA en 10 mL de TBS.
- Preparar una solución de bloqueo mediante la adición de 0,2 mL de suero normal de cabra a 1.8 mL de 1% BSA/cucharada
- Para cada diapositiva, preparar 150 μL de solución de anticuerpo primario (dilución 1: 100) por pipeteo 1,5 μl de anti-phospho-PHF-tau pSer202 + Thr205 (AT8) anticuerpos en 148,5 μL 1% BSA-TBS tampón y dejar en hielo.
- Para realizar recuperación de antígeno, sumergir los portaobjetos photobleached verticalmente en un colector de diapositiva 25 ml de tampón de recuperación de antígeno. Asegure el colector con cinta o cadenas de tal manera que el colector no cae en el baño de agua. El colector en un baño de agua a 90 º c por 30 min de calor y permitir que el colector se enfríe a temperatura ambiente durante 30 minutos antes de retirar los portaobjetos. Hacer no quite las diapositivas inmediatamente ya que hará que las secciones a.
- Transferir las diapositivas desde el colector de la recuperación de antígeno en una jarra de tinción llenada con 30 mL de TBS-Tritón y las secciones de 5 min en un agitador orbital con agitación suave. Repita el lavado una vez con fresco TBS-Tritón. Mecha lejos exceso de tampón con una pelusa y el contorno del tejido con un lápiz hidrofóbico. Tenga cuidado de no para dejar el portaobjetos secar.
- Para cada diapositiva, bloquear el tejido por pipetear 200 μL de bloquear la solución en el tejido y colocar el portaobjetos en una cámara humidificada. Construcción de la cámara mediante la colocación de una parrilla dentro de una caja de punta de la pipeta que contiene una toalla de papel húmeda. Incubar a temperatura ambiente durante 2 h en una superficie nivelada. Asegurar que la solución de bloqueo cubre completamente el tejido.
- Retire la solución de bloqueo por la aspiración y Pipetear 100-150 μL de solución de anticuerpo primario sobre el tejido. Garantizar un volumen suficiente de anticuerpos está presente y que la sección es sobre una superficie nivelada para evitar la puesta en común de solución de anticuerpo a un lado. Incubar a 4 º c durante la noche en una cámara humidificada.
- Preparar la mezcla del anticuerpo secundario y la contratinción nuclear DAPI.
- Para cada diapositiva, preparar 150 μL de mezcla de anticuerpo secundario (diluciones 1: 100) mediante la adición de 1,5 μl de cabra anti-ratón Alexa 488 y 1,5 μl de cabra anti-ratón Texas Red a 147 μl de BSA-TBS y dejar en hielo.
- Preparar 0.1 μg/mL DAPI contratinción por dilución seriada. Homogeneizar la solución y diluir a 1 μl de DAPI en 999 de TBS para hacer 1 mL de solución de 5 μg/mL de stock 5 mg/mL. Para cada diapositiva, diluir 3 μL de solución de 5 μg/mL con 147 μl de TBS a una concentración final de 0.1 μg/mL.
PRECAUCIÓN: DAPI es un mutágeno conocido y deben ser manejado con cuidado.
- Quitar el anticuerpo primario por aspiración. Sumerja los portaobjetos en un vaso de tinción frasco con 30 mL de TBS-Triton y lavado durante 5 minutos con suaves se mezclan en un agitador orbital. Repita el paso de lavado con TBS-Triton fresco. TBS-Triton exceso ausente del fieltro y pipeta de 100 a 150 μL de mezcla de anticuerpos secundarios a cada diapositiva.
- Asegúrese de que el tejido está totalmente cubierto por la mezcla de anticuerpos. Incubar por 2 h a temperatura ambiente en la cámara humidificada en la oscuridad.
- Retire la mezcla del anticuerpo secundario por aspiración y transferencia de la diapositiva en un vaso de tinción frasco con 30 mL de TBS (ningún Tritón). Lavar durante 5 minutos con suaves se mezclan en un agitador orbital. Repetir la etapa de lavado con TBS. fresco aplicar 100 a 150 μL de 0,1 contratinción DAPI de μg/mL a cada diapositiva e incubar 10 min a temperatura ambiente en la oscuridad.
- Transfiera los portaobjetos a un vaso jarra conteniendo TBS de tinción y lavar 3 veces con mezcla suave de 5 minutos cada uno, con TBS fresca para cada lavado. Tampón sobrante lejos mecha.
- 3 aplicar gotas de medio de montaje acuoso al tejido. Con unas pinzas, Baje suavemente un cubreobjetos de vidrio limpio sobre el tejido, a partir de un borde y bajar lentamente el otro borde para evitar atrapar burbujas de aire. Tenga cuidado de no para desalojar el cubreobjetos si imágenes inmediatamente. De lo contrario, permitir que el medio de montaje secar antes de guardar a 4 º c en la oscuridad.
4. Microscopía de fluorescencia
- a su vez en la lámpara de fluorescencia, el microscopio y el equipo y deje que la lámpara de calentamiento 15 min lugar el tejido manchado los portaobjetos en la platina del microscopio de fluorescencia. Utilizar la imagen de campo claro para localizar el tejido con 10 aumentos.
- Aplique una gota de ddH 2 O a la superficie del cubreobjetos y utilizar una lente de objetivo de inmersión de agua de 20 x (NA = 1.0). Seleccione el plano promedio 4 líneas analizar ajuste. Establezca el tamaño del agujero de alfiler en 1 unidad luminosa que le da un corte óptico de ~ 3 micras. Seleccione las excitación y emisión de longitudes de onda láser para cada fluoróforo en pistas independientes para mejor señal.
Nota: Alexa 488: λ ex = 488 nm (láser de argón) λ em = 493-570 nm; Texas Red: λ ex = 561 nm (laser de DPSS 561 nm), λ em = 601-635 nm; DAPI: λ ex = 405 nm (laser de diodo 405), λ em = 410 507 nm.- Ajustar la potencia del láser y obtener la configuración para optimizar la intensidad de la señal para cada pista. La imagen compuesta de recoger y guardar. Utilizar la misma configuración de láser para comparar intensidades de fluorescencia en un portaobjetos diferentes.
- Para la visualización de la intensidad de fluorescencia en cada canal, instalar la macro de herramientas de perfil RGB de ImageJ 10. Guarde la macro de la página web como un archivo de texto (https://imagej.nih.gov/ij/macros/tools/RGBProfilesTool.txt). En el menú de ImageJ, seleccione Plugins - > Macros - > instalar; Seleccione el archivo de texto para instalar la herramienta de perfiles RGB.
- Abra el archivo de imagen confocal en ImageJ y convertir las imágenes compuestas de las 3 pilas a RGB mediante la realización de las siguientes: imagen - > Color - > herramienta de canal. Seleccione " compuesto " desde el menú desplegable y comprobar tres canales. A continuación, seleccione imagen - > tipo - > de color RGB.
- Seleccione el icono de herramientas de perfil RGB y trace una línea a través de la sección de la imagen a ser perfilados. Guardar los datos de intensidad como una hoja de cálculo para el trazado de.
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Representative Results
El paso de tratamiento previo de fotoblanqueo puede agregarse a un protocolo de la inmunofluorescencia estándar inmediatamente antes de la recuperación de antígeno y el immunostaining (figura 1A). También se puede realizar el montaje del aparato fotoblanqueo usando varias, componentes de bajo costo, estándares (figura 1B). El espectro de emisión del fósforo blanco LED cubre una amplia gama de longitudes de onda que los hace aptos para la amplia gama de fotoblanqueo, estar de acuerdo con anteriores informes (figura 1)5,11. Después de photobleaching 48 h, la intensidad de autofluorescent manchas que se asemejan a la lipofuscina, así como la fluorescencia del fondo general se redujo considerablemente en dos longitudes de onda de emisión en una sección sin manchas de DLFT-T (figura 1). Demostrado la eficacia de fotoblanqueo, nos mancharon para que el tau hiperfosforilada visualizar inclusiones tau patológicos en un caso de DLFT-T con dos anticuerpos secundarios diferentes. La forma de las inclusiones tau y el uso de dos cromóforos para el etiquetado también nos permiten distinguir con confianza autofluorescent características de los objetivos para validar la técnica.
En las imágenes compuestas de menor aumento, la morfología de las inclusiones tau-positivas, tinción amarilla de la combinación de canales Alexa 488 y Texas Red, consiste en colecciones en forma de anillo de procesos de células cortas que se denominan ' astrocytic placas (Figura 2a-c). Esta morfología es característica de corticobasal (CBD) de la degeneración12,13, que está de acuerdo con el informe de patología de este caso. En la muestra no tratada, numerosas estructuras están presentes en la imagen compuesta que no se asemejan a las inclusiones tau y demostró fluorescencia sobre todo en el canal rojo, sugiriendo que es autofluorescencia en lugar de anticuerpos previsto. Un notable nivel de fluorescencia del fondo también es visible en este canal en todo el campo visual (Figura 2a). Estas características de autofluorescent se quitan y la imagen global aparece mucho más limpia cuando las muestras fueron tratadas con photobleaching (PB) y el quencher química (figura 2b-c).
Luego cuantificamos las diferencias de fluorescencia en las muestras perfilando una región más pequeña en cada muestra. En cada condición de tratamiento para la comparación (Figura 2d-r) se presenta una sola placa astrocytic. En la muestra no tratada, la fluorescencia del fondo está presente en los tres canales, pero fue relativamente alta fluorescencia de anticuerpo secundario de anticuerpos Alexa 488 y Texas Red (Fig. 2h). Sin embargo, las estructuras de autofluorescent presentes en la muestra no tratada tuvieron intensidades de fluorescencia en el canal de Texas Red comparable al anticuerpo secundario Texas Red que mancharon para tau (figura 2 h). Si la proteína diana no tenía una morfología distinta, predecible como tau en nuestro caso, la autofluorescencia en el tejido hubiera prestado la imagen no interpretables.
Por el contrario, cuando el tratamiento previo de fotoblanqueo se aplicó antes de la inmunotinción, fluorescencia del fondo en Alexa 488 y canales rojo de Texas se redujo significativamente en comparación con la muestra sin tratar y la fluorescencia de immunostained tau seguía siendo inafectado (figura 2i-m). El extintor de químico comercial apagó la autofluorescencia en el canal de Alexa 488 tan eficazmente como el fotoblanqueo. También suprimió la fluorescencia del fondo de la DAPI, que no fue afectada por el tratamiento de fotoblanqueo de 48 h (figura 2 m). Sin embargo, el químico extintor también reduce la intensidad de las señales de la DAPI y Texas Red secundaria sugiriendo un cierto grado de contraproducente Temple (figura 2n-r).
Figura 1 : Aplicación de tratamiento previo de fotoblanqueo en un flujo de trabajo estándar de la inmunofluorescencia. A) esquemático simplificado del protocolo estándar inmunofluorescencia desde adquisición de tejido para la proyección de imagen. Uso de anticuerpos fluorescentes de primarios y secundarios está representada por dibujos animados. Se produce una imagen representativa del microscopio. Barra de escala = 100 μm. B) un aparato representativo fotoblanqueo construido utilizando componentes estándares (tapa reflectante no se muestra). C) espectro de emisión de LEDs blancos. Un pico estrecho emisión a 450 nm y un pico amplio a 550 nm se observan. D) efecto de fotoblanqueo en fluorescencia del fondo endógeno del tejido fino T de DLFT en Alexa 488 (493-570 nm) y longitudes de onda de emisión roja de Texas (601-635 nm). Puntos de autofluorescent lipofuscin que se asemejan a visiblemente se reducen Tras Fotoblanqueo de 48 h. Barra de escala = 100 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2:efecto de la eliminación de Autofluorescencia en la calidad de la imagen de un caso de DLFT-T tejido con tau fosforilada anti immunostaining. -c) Ampliación baja, imágenes de inmunofluorescencia compuesto de campos representante de vista en sin tratar (a), photobleached para 48 h (b) y el quencher química tratados (c) muestras. Los colores representan la fluorescencia en los canales a través de excitación por sus respectivas fuentes de luz: Alexa 488 (verde): λex = 488 nm (láser de argón) λem = 493-570 nm; Texas (rojo): λex = 561 nm (laser de DPSS 561 nm), λem = 601-635 nm; DAPI (azul): λex = 405 nm (laser de diodo 405), λem = 410 507 nm. Barra de escala = 100 μm. d-r) más imágenes de aumento de las regiones puntos sin tratar (d-g), photobleached (i-l) y muestras de extintor químico tratada (n-q), con canales separados de la fluorescencia, combina imagen y cuantificado perfiles de señal de fluorescencia. Las líneas punteadas en los canales combinados (g, l, q) representan la línea en que señal se generaron perfiles (h, m, r). Barra de escala = 50 μm. Autofluorescent partículas (af),immunolabeled fluorescencia de tau (tau) y señal de núcleo (nuc) se indican. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El tratamiento previo de fotoblanqueo de tejidos que se describe en este manuscrito permite la eliminación efectiva de Autofluorescencia utilizando componentes estándares. El protocolo describe imágenes de inmunofluorescencia de los agregados de tau fosforilada en tejido formalina-fijo cerebro humano usando los anticuerpos secundarios conjugados a Alexa 488 y rojo de Texas, con DAPI como una contratinción nuclear. Para aplicar el método a otros tejidos, se recomienda realizar un tratamiento previo de fotoblanqueo de 48 h a la muestra como punto de partida. Después de photobleaching, realizar la inmunofluorescencia estándar protocolo para las características de interés utilizando las diluciones de anticuerpo siguiendo las recomendaciones del fabricante de tinción. Si persiste la fluorescencia del fondo, la duración de fotoblanqueo o el anticuerpo pasos de tinción debe modificarse. La duración de fotoblanqueo variará dependiendo de la lámpara seleccionada para construir el aparato y el nivel de la autofluorescencia de la muestra. Se determinará el tiempo óptimo de blanqueo para cada aparato de la lámpara. Esto puede hacerse por photobleaching una sección de tejido coverslipped sin mancha, montado en TBS-azida y medir la fluorescencia endógena de la diapositiva a intervalos de 12 h utilizando un microscopio de fluorescencia. En informes anteriores, supervisamos lipofuscin fotoblanqueo por análisis de partículas y funciones de ajuste para el decaimiento exponencial de la curva5, pero para simplificar, observación visual de las secciones a intervalos regulares puede ser igualmente eficaz para juzgar el duración en el que la mayoría de la fluorescencia se convierte apagado. En nuestro caso edad del tejido de cerebro que contienen altas cantidades de pigmentos de lipofuscina, 48 h de incubación con una lámpara de 800 lux era suficiente. Si la señal específica sigue siendo débil en comparación con el fondo Tras Fotoblanqueo, considerar aumento de la concentración de anticuerpos primarios y secundarios durante la coloración. También es importante realizar un control sólo anticuerpo secundario para asegurar que la señal de fondo no es causada por el atascamiento no específico anticuerpo secundario. Tener cuidado para seleccionar los anticuerpos que cruz-reaccionan no, sobre todo cuando la coloración para múltiples objetivos. Además, asegúrese de que las señales específicas no se apaga inadvertidamente durante el proceso de tinción. Por ejemplo, tinción de Nissl (para tinción de neuronas) se apaga por la BSA. En este caso, el componente de BSA de la solución de bloqueo debe reemplazarse con alternativas tales como la gelatina de piel de pescado,5.
El uso de fósforo blanco LED para fotoblanqueo tiene algunas limitaciones debido a su espectro de emisión de 420 nm a 650 nm. Así, no es posible fotoblanqueo significativa en las longitudes de onda UV. También, debido al amplio espectro de emisión, photobleaching cromóforos de longitudes de onda específicas requiere modificaciones como la superposición de hojas de filtro de color sobre las matrices de LED para filtrar las longitudes de onda de emisión indeseable. Además, photobleaching del tejido puede requerir tiempos más largos de procesamiento que otros métodos. En este caso, debido a la edad de los tejidos del cerebro (de una persona de 89 años de edad) y el período de fijación de aldehído largo de más de 2 días, una duración de 48 h fotoblanqueo necesitaba. Aunque no activo tiempo de procesamiento se requiere, uno debe tener en cuenta el tiempo de fotoblanqueo y planificar la sesión de maquillaje. Lámparas LED de mayor luminosidad o el uso de lámparas múltiples puede reducir considerablemente el tiempo de fotoblanqueo por el simple aumento en el flujo de fotones.
En comparación con los métodos existentes, nuestra técnica ofrece varias ventajas significativas. A diferencia de photobleaching con láseres análisis en microscopía de fluorescencia, no observamos signos de daño inducido por la foto de nuestras muestras usando LED fotoblanqueo. Otra gran ventaja de nuestro aparato es la significativa reducción de costos sobre otras técnicas. El costo del montaje de nuestro aparato es aproximadamente $10 USD, y el montaje del aparato es flexible lo suficiente tal que cualquier laboratorio puede adoptar su propia versión de la photobleacher. En comparación, otros métodos usando mutispectral LED matrices con los titulares de diapositiva personalizados y cámaras de enfriamiento requiere hasta $1000 USD para construir8. Además, extintores químicos comerciales son consumibles que cuestan $120 USD para 100 diapositivas e introducen compuestos potencialmente no deseados en la muestra. El extintor químico utilizado para la comparación en el presente estudio probablemente contiene el tinte negro de Sudán de unión a lípidos, que puede interferir con el immunostaining de lipoproteínas.
En general, los pasos más críticos en el fotoblanqueo pre-tratamiento y el immunostaining del espécimen consiste en el manejo de la sección durante la inmunotinción. Es importante que, una vez que la sección es rehidratarse durante el fotoblanqueo, no se permite secar en cualquiera de los siguientes pasos. Secado de la diapositiva causar distribución desigual de los anticuerpos y crear artefactos no interpretables. Para evitar pérdida de tiempo y potencialmente valiosas muestras, se debe tener cuidado en varios pasos en el protocolo. Después de la recuperación de antígeno, permite el tejido se enfríe antes de transferir a la solución de permeabilización de TBS-Triton. La exposición incluso momentánea al aire cuando la muestra se calienta a altas temperaturas causará secado instantáneo del tejido. También asegúrese de que el anticuerpo, bloqueo, o contratinción soluciones cubren totalmente los tejidos durante la aplicación. Esto puede lograrse haciendo que el tejido está completamente delineado por el lápiz hidrofóbico para evitar el escurrimiento de la solución y que todas las soluciones se aplican en una cámara humidificada sobre una superficie plana. Esto es especialmente importante durante la noche incubaciones (Unión del anticuerpo primario).
La aplicación exitosa de fotoblanqueo utilizando fósforo blanco LED antes de la tinción puede facilitar la aplicación de métodos de inmunofluorescencia en tejidos archivados. Es un tratamiento versátil y económico que esperar a ser susceptibles a una amplia gama de muestras en el futuro. Aunque sólo hemos aplicado este método al tejido del cerebro humano, esta técnica puede ser incorporada fácilmente en cualquier protocolo de tinción en que autofluorescencia es la prevención de resultados deseables, particularmente en tejido postmitotic como cardiaco o esquelético músculos donde es más probable que se acumulan lipofucin.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este estudio fue apoyado en su totalidad o en parte por el Consorcio Canadiense de neurodegeneración y envejecimiento (CCNA), el Instituto canadiense de salud Research (CIHR), la sociedad de ALS de Canadá (Canadá ALS) y la sociedad de Alzheimer de Canadá (ASC). Los autores desean agradecer a Darvesh Sultan y Andrew Reid de la marítima Banco de tejido cerebral para proporcionar los tejidos del cerebro de DLFT, Ganguly de Milán desde el programa de orientación espacio-temporal y la amplificación de la respuesta de la radiación (STTARR) y sus afiliadas financiación de agencias para el tejido inclusión y corte de servicios y la avanzada óptica microscopia instalación (AOMF) para proporcionar instrumentos de microscopía. Kevin Hadley se agradeció a la revisión crítica del manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trizma Base | Sigma-Aldrich | T6066 | |
| Sodium Choloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Hydrochloric Acid | Caledon Laboratory Chemicals | 1506656 | |
| Sodium Azide | BioShop Canada | SAZ001 | |
| 100 mm x 100 mm x 20 mm Pitri dish | Sarstedt | 82.9923.422 | All components of photobleacher can be substituted based on availability |
| 6 W LED Dimmable Desk Lamp | DBPower | DS501 | All components of photobleacher can be substituted based on availability |
| Citric Acid | Sigma-Aldrich | C-2404 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | BioShop Canada | EDT001 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P-7949 | |
| Sodium Hydroxide | BioShop Canada | SHY700.1 | |
| Water bath | Haake Fisons | K15 | |
| Slide collector | FisherScientific | 12-587-17B | |
| Staining Jar | FisherScientific | E94 | |
| Orbital Shaker | Bellco Glass | 7744-08115 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T7878 | |
| Bovine Serum Albumin | FisherScientific | BP1600-1 | |
| Normal Goat Serum | Aurion | 905.002 | |
| Hydrophobic pen | Sigma-Aldrich | Z672548-1EA | |
| Phospho-Tau (Ser202, Thr205) Monoclonal Antibody (AT8) | ThermoFisher | MN1020 | |
| Goat anti-Mouse Secondary Antibody, Texas Red-X | ThermoFisher | T862 | |
| Goat anti-Mouse Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher | A-11029 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Mounting medium | ThermoScientific | 28-600-42 | |
| Glass soverslip | |||
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM710 | |
| Imaging software ZEN 2012 Black Edition 11.0 | Zeiss | LSM710 | Software accompanies the Confocal Microscope |
| ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/download.html | |
| RGB Profile Tools macro | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/macros/tools/RGBProfilesTool.txt | |
| Commercial chemical quencher | Biotum | 23007 |
References
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