Summary
Fundo autofluorescência de amostras biológicas muitas vezes complica a técnicas de imagem baseada em fluorescência, especialmente em tecidos postmitotic humanos envelhecidos. Este protocolo descreve como autofluorescência destas amostras pode ser efetivamente removida usando uma luz disponível comercialmente, emitindo luz de diodo fonte para photobleach a amostra antes da imunocoloração.
Abstract
Imunofluorescência é um método comum usado para visualizar os compartimentos subcelulares e determinar a localização de proteínas específicas dentro de uma amostra de tecido. Um grande obstáculo para a aquisição de imagens de alta qualidade imunofluorescência é endógena autofluorescência do tecido causada por pigmentos de envelhecimento como lipofuscina ou por processos de preparação de amostra comum tais como fixação de aldeído. Este protocolo descreve como fluorescência de fundo pode ser grandemente reduzida com fotobranqueamento usando fósforo branco luz emitindo matrizes de diodo (LED) antes do tratamento com sondas fluorescentes. A amplo espectro emissão de fósforo branco LEDs permitem clareamento de fluorophores em toda uma gama de picos de emissão. O aparelho de fotobranqueamento pode ser construído a partir de componentes prontos para uso, a um custo muito baixo e oferece uma alternativa acessível para quenchers químicas disponíveis comercialmente. Um fotobranqueamento pré-tratamento do tecido seguido de mancha da imunofluorescência convencional gera imagens livre de autofluorescência de fundo. Em comparação estabelecida quenchers químicas que reduziu a sonda, bem como plano de fundo sinaliza, fotobranqueamento tratamento não teve efeito na intensidade de fluorescência da sonda enquanto efetivamente reduziu fundo e lipofuscina fluorescência. Embora fotobranqueamento requer mais tempo para pré-tratamento, matrizes de LED de intensidade mais elevadas podem ser usados para reduzir o tempo de fotobranqueamento. Potencialmente, este método simples pode ser aplicado a uma variedade de tecidos, tecidos particularmente postmitotic que acumulam lipofuscina, tais como o cérebro e músculos cardíacos ou esqueléticos.
Introduction
Microscopia de fluorescência usando anticorpos, proteínas específicas de direcionamento é rotineiramente usada para visualizar as proteínas de interesse em cultura de células e tecidos. Uma grande complicação para a aquisição de imagens claras e definitivas em imunofluorescência é autofluorescência, que pode ser causada endogenamente em tecidos de mamíferos pela idade do pigmento lipofuscina e por proteínas como a elastina e colágeno1, 2. Outras fontes de autofluorescência podem ser introduzidos através de etapas de preparação de amostra como aldeído fixação3. Grânulos de lipofuscina, compostos principalmente de proteína oxidativamente modificada e resíduos de degradação de lipídios, acumulam-se nas células de vida longa, com aumento de idade2. Isto provoca dificuldades em imagens postmitotic tecidos como o cérebro e os músculos cardíacos ou esqueléticos, como o espectro de emissão de fluorescência de lipofuscina é amplo e variável, muitas vezes coincidindo com o comprimento de onda de emissão de fluorophores comum usado para rotulagem de4. Esses fatores tornam a imagem do tecido do cérebro humano de casos de doenças neurodegenerativas de início tardio, como degeneração lobar frontotemporal (FTLD) especialmente desafiador.
Para reduzir a autofluorescência, criámos uma técnica na qual podemos irradiar as secções de tecido slide-montado com uma luz branca, emitindo a matriz de diodo (LED) usando uma lâmpada de mesa domésticos5. Esta técnica simples fornece uma alternativa às técnicas que usam químicas quenchers como CuSO4 em acetato de amónio, ou comercialmente disponível extinguer corantes como Sudão negro B e preto de eriocromo T6. Também tem significativa economia de custo sobre multiespectral técnicas de fotobranqueamento lâmpada de LED e evita complicações e artefatos gerados a partir de métodos de remoção de autofluorescência digital como espectral un-mistura7,8. Fósforo branco LEDs têm um amplo espectro de emissão, a alta luminosidade e a fabricação de baixo custo, tornando-os ideais como um componente de prateleira para fotobranqueamento uma variedade de cromóforos5,9.
Neste protocolo, demonstramos a construção de um aparelho de fotobranqueamento usando componentes acessíveis e aplicar fotobranqueamento para um caso de tecido FTLD contendo inclusões tau-positivo (FTLD-T), usando um anticorpo específico para tau fosforilada. Vamos demonstrar o efeito de fotobranqueamento na imagem fluorescente etiquetado anticorpos empregando dois cromóforos comumente usados: Alexa 488 e Texas Red. O efeito de fotobranqueamento contra seções não tratadas ou aqueles tratados com um quencher químico comercial são quantificados e comparados. Este pré-tratamento fotobranqueamento pode ser incorporado em qualquer protocolo de coloração padrão de imunofluorescência para remover autofluorescência em uma amostra biológica.
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Protocol
Nota: O trabalho apresentado foi realizado em conformidade com as normas internacionais reconhecidas, incluindo a conferência internacional sobre harmonização (ICH), o Conselho para internacional organizações de Medical Sciences (CIOMS) e os princípios da declaração de Helsinque. Utilização de tecido humano foi com a aprovação do Conselho de ética de pesquisa rede Universidade saúde. As amostras de cérebro humano foram coletadas como parte do banco de tecido cerebral marítima. No momento da coleta, foi obtido o consentimento de todos os pacientes.
1. construção de fotobranqueamento aparelhos e soluções
- preparar Soluções conservadas em estoque.
- Preparar 1 L de 1 x solução de estoque salino Tris (1 x TBS) (150 mM NaCl, 50 mM Tris-Cl, pH 7,4) dissolvendo 8,77 g de NaCl e 6,06 g de Tris base em 800 mL de DDQ 2 O e ajustar o pH para 7,4 usando HCl. Bring o volume de 1 L e autoclave. < / Li >
- preparar a azida de sódio 10% (estoque de x 200) pela dissolução de 1 g de azida de sódio em 10 mL de DDQ 2 O (10%, estoque x 200).
- Para 1-3 slides de tamanho padrão, use um prato de petri de simples 100 x 100 mm transparente, quadrado como uma câmara de slide. Para a câmara de um único slide, adicione 0,25 mL de 200 ações de azida de sódio x a 50 mL de 1 x TBS para fazer uma solução de azida-TBS de 0,05%. Pilha de 2-3 câmaras de slide verticalmente para processar slides adicionais. Preparar um adicional 50 mL de solução de azida-TBS para cada câmara.
- Criar um andaime para elevar o slide chamber(s) tal que uma cabeça de lâmpada pode caber debaixo.
- Para um 100 mm x 100 mm slide câmara, cortar aberturas na parte inferior e os lados de uma 100 x 100 mm x 30 mm plástico prato de Papa e inverter o recipiente. Certifique-se de aberturas laterais são grandes o suficiente para caber uma fonte de luz LED e assegurar a abertura inferior é suficientemente grande tal que a luz da fonte de luz atinge a câmara de amostra sem impedimento.
- Aplicar fita isolante o andaime para aumentar a aderência entre o cadafalso e a câmara de amostra/bancada. Usar quaisquer materiais alternativos para construir o andaime enquanto ele firmemente eleva a câmara slide sem impedir a luz de atingir a amostra.
- Remover qualquer difusores ou plástico opaco da lâmpada de mesa que pode impedir o diodo emissor de luz atinjam diretamente a amostra (se possível) e orientar a matriz de LED para cima. Coloque o andaime e slide chamber(s) acima da matriz de LED. Usar uma lâmpada com um pescoço flexível para fácil manipulação.
- Construir uma cúpula reflexiva cobre para o aparelho, alinhando o interior de uma caixa grande o suficiente para cobrir a câmara de slide e o andaime com folha de alumínio. Use uma caixa de ponta de pipeta de 1 mL para uma única câmara ou uma 150 x 150 mm x 150 mm de papelão caixa para múltiplo, verticalmente empilhados câmaras.
2. Fotobranqueamento pré-tratamento de seções do tecido
Nota: preparação de secção do tecido pode variar dependendo da fonte de tecido e a fixação e a incorporação de métodos utilizados. Aqui, o tecido cerebral (orbitofrontal corticais) de um caso de FTLD-T foi fixado para ~ 2 dias em formalina, executado através de um gradiente de sacarose, incorporado na OCT e cortar a 10 µm de espessura seções usando um criostato.
- Frio de º c em 4 um quarto, armário de frio ou frigorífico, orientar a lâmpada sob o andaime e coloque a câmara de amostra no cadafalso. Despeje a câmara de amostra 50 mL de solução de azida-TBS.
- Submergir histologicos montagem em padrão de vidro corrediças do microscópio para a câmara de slide contendo azida-TBS usando pinça limpa. Para vários slides, certifique-se de que os slides são colocados na câmara em uma única camada.
- Cobrir o aparelho com a cúpula reflexiva, acenda a lâmpada LED e incubar durante 48 h a 4 ° c.
3. Imunofluorescência
- para manchar o tecido para tau fosforilada usando corante de contraste DAPI e Alexa 488 - e anticorpos secundarios conjugados a Texas Red, primeiro preparar soluções para a recuperação do antígeno, permeabilização, bloqueando e primária ligação de anticorpo.
- Preparar 500 mL de recuperação do antígeno do tampão (10 mM, ácido cítrico, 2mm ácido etilenodiaminotetracético, 0,05% Tween 20; pH 6.2) dissolvendo 0,92 g de ácido cítrico e 0,37 g de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) em 500 mL de DDQ 2 O. ajustar o pH 6.2 com NaOH e adicionar 0,25 mL de Tween 20.
- Preparar 500 mL de 0.025% Triton X-100 em solução TBS (TBS-Triton) adicionando 0,125 mL de Triton X-100 500 mL 1 x TBS
- Prepare uma solução de 1% albumina de soro bovino (BSA) em TBS (tampão de BSA-TBS) dissolvendo-se 0,1 g de BSA em 10 mL de TBS.
- Preparar uma solução de bloqueio pela adição de 0,2 mL de soro de cabra normal a 1,8 mL de 1% BSA/TBS
- Para cada slide, prepare 150 µ l de solução de anticorpo primário (diluição de 1: 100), pipetagem 1,5 μL de antifosfo-PHF-tau pSer202 + Thr205 (AT8) Anticorpo em 148,5 µ l de 1% de BSA-TBS buffer e deixar no gelo
- Para executar a recuperação do antígeno, mergulhe os slides de foto verticalmente em um coletor de slide contendo 25 mL de tampão de recuperação de antígeno. Secure coletor com fita e/ou sequências de tal forma que o coletor não cair o banho de água. Aquecer o coletor em um banho de água a 90 ° c por 30 min e permitir que o coletor de arrefecer à temperatura ambiente por 30 min antes de remover os slides. Fazer não remove os slides imediatamente, pois isso fará com que as seções de dessecar.
- Transferir as lâminas do coletor de recuperação de antígeno em um frasco de coloração preenchido com 30 mL de TBS-Triton e lavar as seções por 5 min em um agitador orbital com agitação suave. Repeti a lavagem uma vez com TBS-Triton fresco. Pavio fora buffer em excesso com um pano livre de fiapos e contorne o tecido com uma caneta hidrofóbica. Tome cuidado para não deixar os slides seque.
- Para cada slide, bloqueie o tecido por pipetagem 200 µ l de solução sobre o tecido de bloqueio e colocar o slide em uma câmara umidificada. Construa a câmara, colocando um porta-lâminas dentro de uma caixa de ponta de pipeta contendo uma toalha de papel molhada. Incube a temperatura ambiente por 2 h sobre uma superfície plana. Certifique-se de que a solução bloqueio cobre totalmente o tecido.
- Remover a solução de bloqueio por aspiração e pipetar 100-150 µ l de solução de anticorpo primário sobre o tecido. Certifique-se de um volume suficiente de anticorpo está presente e que a seção é sobre uma superfície plana para evitar acúmulo de solução anticorpo para um lado. Incubar a 4 ° c durante a noite em uma câmara umidificada.
- Preparar a mistura de anticorpo secundário e o corante de contraste nuclear DAPI.
- Para cada slide, preparar 150 µ l de mistura de anticorpo secundário (diluições de 1: 100) pela adição de 1,5 µ l de anti-rato de cabra Alexa 488 e 1,5 µ l de anti-rato cabra Vermelho Texas a µ l 147 de BSA-TBS e deixar no Ice.
- Preparar 0,1 µ g/mL DAPI counterstain por diluição serial. Homogeneizar a solução e diluir a 1 µ l de estoque 5 mg/mL DAPI em 999 de TBS tornar-se 1 mL de solução de 5 µ g/mL. Para cada slide, diluir 3 µL de 5 µ g/mL de solução com 147 µ l de TBS para uma concentração final de 0,1 µ g/mL.
Cuidado: DAPI é um conhecido agente mutagénico e devem ser manuseado com cuidado.
- Remover o anticorpo primário por aspiração. Mergulhe os slides em um vidro frasco contendo 30 mL de TBS-Triton e lavagem por 5 min com a mistura suave em um agitador orbital de coloração. Repita a etapa de lavagem com TBS-Triton fresco. Pavio fora excesso TBS-Triton e pipetar 100 a 150 µ l de mistura de anticorpo secundário para cada slide.
- Certifique-se o tecido é inteiramente coberta com a mistura de anticorpo. Incubar durante 2 h à temperatura na câmara umidificada no escuro.
- Retire a mistura do anticorpo secundário por aspiração e transferir o slide em um vidro de coloração frasco contendo 30 mL de TBS (sem Triton). Lavagem por 5 min com a mistura suave em um agitador orbital. Repetir a etapa de lavagem com TBS fresca aplicar 100 a 150 µ l de 0,1 µ g/mL DAPI corante de contraste para cada slide e incubar durante 10 minutos à temperatura ambiente no escuro.
- Transferir os slides para um vidro de coloração jar contendo TBS e lavar 3 vezes com a mistura suave por 5 min cada, usando TBS fresco para cada lavagem. Embora buffer excesso de pavio.
- Aplicar 3 gotas de meio de montagem aquoso para o tecido. Usando fórceps, baixe suavemente uma lamela de vidro limpo para o tecido, começando com uma borda e abaixando lentamente a outra borda para evitar armadilhas de bolhas de ar. Tome cuidado para não deslocar a lamela se imagem imediatamente. Caso contrário, permitir que o meio de montagem secar antes de guardar a 4 ° c no escuro.
4. Microscopia de fluorescência
- vez a lâmpada da fluorescência, o microscópio e o computador e permitir que a lâmpada aquecer durante 15 min. lugar o tecido manchado desliza na fase de microscópio de fluorescência. Usar a imagem de campo claro para localizar o tecido na ampliação de 10x.
- Aplique uma gota de DDQ 2 O na superfície de lamela e usar uma lente de objetiva de imersão de água 20 x (at = 1.0). Selecione o exame 4-linha média avião configuração. Defina o tamanho do pinhole 1 unidade arejados que dá uma fatia óptica de ~ 3 mícrons. Selecione os laser da excitação e emissão de comprimentos de onda para cada fluoróforo em faixas separadas, para melhor sinal.
Nota: Alexa 488: λ ex = 488 nm (laser de argônio) λ em = 493-570 nm; Texas Red: λ ex = 561 nm (laser de DPSS 561 nm), λ em = 601-635 nm; DAPI: λ ex = 405 nm (laser de diodo 405), λ em = 507-410 nm.- Ajustar a potência do laser e configurações para otimizar a intensidade de sinal para cada faixa de ganho. Recolher a imagem composta e salvar. Usar as mesmas configurações do laser para comparar as intensidades de fluorescência em um slide diferente.
- Para visualização da intensidade de fluorescência em cada canal, instalar a macro de ferramentas de perfil RGB para ImageJ 10. Salve a macro da página da Web como um arquivo de texto (https://imagej.nih.gov/ij/macros/tools/RGBProfilesTool.txt). No menu do ImageJ, selecione Plugins - > Macros - > instalar; Selecione o arquivo de texto para instalar a ferramenta de perfis RGB.
- Abrir o arquivo de imagem confocal no ImageJ e converter as imagens compostas de 3 pilhas para RGB, executando o seguinte: imagem - > cor - > ferramenta de canal. Selecione " composto " do menu dropdown e cheque todos os três canais. Em seguida, selecione imagem - > tipo - > da cor do RGB.
- Selecione o ícone de ferramentas de perfil RGB e desenhe uma linha em toda a seção da imagem a ser perfilado. Salve os dados de intensidade como uma planilha para plotagem.
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Representative Results
A etapa de pré-tratamento de fotobranqueamento pode ser adicionada a um protocolo padrão de imunofluorescência imediatamente antes da recuperação do antígeno e imunocoloração (figura 1A). A montagem do aparelho fotobranqueamento também pode ser realizada usando vários, componentes baratos, prontos para uso (figura 1B). O espectro de emissão de fósforo branco LEDs abrange uma ampla gama de comprimentos de onda que os torna adequados para vasta gama fotobranqueamento, concordando com o anterior de5,de relatórios (Figura 1)11. Após 48 h fotobranqueamento, a intensidade das manchas de autofluorescent que se assemelham a lipofuscina, bem como a fluorescência de fundo geral foi reduzida consideravelmente em ambos os comprimentos de onda de emissão em uma seção imaculado de FTLD-T (Figura 1). Para demonstrar a eficácia de fotobranqueamento, nós manchada para hyperphosphorylated tau Visualizar inclusões de tau patológico em um caso de FTLD-T usando dois diferentes anticorpos secundários. A forma distinta de inclusões de tau e o uso de dois cromóforos para rotulagem também permitem distinguir com confiança autofluorescent características dos alvos pretendidos para validar a técnica.
Nas imagens compostas na ampliação baixa, a morfologia das inclusões tau-positivo, manchadas de amarelo da combinação de canais Alexa 488 e vermelho Texas, consiste em coleções em forma de anel de processos de célula curto que são referidos como ' hamartomas placas (Fig. 2a-c). Esta morfologia é característica de corticobasal degeneração (CBD)12,13, que de acordo com o relatório de patologia deste caso. Na amostra não tratada, numerosas estruturas estão presentes em uma imagem composta que não se parecem com inclusões de tau, mostrou a fluorescência principalmente no canal vermelho, sugerindo que é autofluorescência ao invés de mancha do anticorpo pretendido. Um notável nível de fluorescência de fundo é também visível neste canal em todo o campo de visão (Figura 2a). Estas características de autofluorescent são removidas e a imagem global aparece muito mais limpa quando as amostras foram tratadas com fotobranqueamento (PB) e o quencher química (Figura 2b-c).
Nós então quantificar as diferenças de fluorescência nestas amostras por criação de perfil de uma região menor em cada amostra. Uma única placa hamartomas é apresentada em cada condição de tratamento para comparação (Figura 2d-r). Na amostra não tratada, fluorescência de fundo está presente em todos os três canais, mas fluorescência de anticorpo secundário para anticorpos tanto Alexa 488 e vermelho Texas foi relativamente alta (Fig. 2h). No entanto, as estruturas de autofluorescent presentes na amostra não tratada tinham as intensidades de fluorescência no canal vermelho Texas comparável ao anticorpo secundário Vermelho Texas que manchados por tau (Figura 2 h). Se a proteína do alvo não tem uma morfologia distinta, previsível como tau no nosso caso, a autofluorescência no tecido teria tornado a imagem difíceis de interpretar.
Em contraste, quando o fotobranqueamento pré-tratamento foi aplicado antes da imunocoloração, fluorescência de fundo no Alexa 488 e canais vermelho Texas foi significativamente reduzida em comparação com a amostra não tratada e a fluorescência de tau immunostained permaneceram inalterados (Figura 2i-m). O quencher química comercial tão eficazmente como fotobranqueamento saciada a autofluorescência no canal Alexa 488. Ele também suprimida a fluorescência de fundo DAPI, que não foi afetada pelo tratamento fotobranqueamento 48 h (Figura 2m). No entanto, o quencher química também reduziu a intensidade do Vermelho Texas secundária e sinais DAPI, sugerindo um certo grau de contraproducente têmpera (Figura 2n-r).
Figura 1 : Aplicação de fotobranqueamento pré-tratamento em um fluxo de trabalho padrão de imunofluorescência. A) Esquema simplificado do protocolo padrão de imunofluorescência de aquisição de tecido para geração de imagens. Aplicação de anticorpos fluorescentes primários e secundários é representada por desenhos animados. Uma imagem representativa do microscópio é produzida. Barra de escala = 100 µm. B) um aparelho representativo fotobranqueamento construído usando componentes prontos para uso (tampa reflexiva não é mostrada). C) espectro de emissão de matriz de LED branco. Um pico estreito de emissão em 450 nm e um grande pico em 550 nm são observados. D) efeito de fotobranqueamento na fluorescência de fundo endógena do tecido FTLD-T no Alexa 488 (493-570 nm) e comprimentos de onda de emissão de Texas Red (601-635 nm). Autofluorescent cegueta assemelhando-se a lipofuscina é visivelmente reduzidas após 48 h fotobranqueamento. Barra de escala = 100 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2:efeito da remoção de autofluorescência na qualidade da imagem de um caso de tecido FTLD-T com antifosforilada tau immunostaining. a-c) ampliação baixa, composto de imunofluorescência imagens representativas campos de visão em Não tratado (a), foto por 48 h (b) e quencher químico tratados (c) as amostras. As cores representam a fluorescência nos seguintes canais através da excitação por suas respectivas fontes de luz: Alexa 488 (verde): λex = 488 nm (laser de argônio) λem = 493-570 nm; Texas Red (vermelho): λex = 561 nm (laser de DPSS 561 nm), λem = 601-635 nm; DAPI (azul): λex = 405 nm (laser de diodo 405), λem = 507-410 nm. Barra de escala = 100 µm. d-r) imagens de alta ampliação das regiões pontilhadas não tratada (d-g), foto (i-l) e amostras químicas quencher Tratado (n-q), com canais de fluorescência separado, mesclados a imagem e quantificado perfis do sinal de fluorescência. Linhas pontilhadas nos canais mesclados (g, l, q) representam a linha na qual sinal perfis (h, m, r) foram gerados. Barra de escala = 50 µm. Autofluorescent partículas (af),immunolabeled tau fluorescência (tau) e sinal de núcleo (nuc) são indicados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O fotobranqueamento pré-tratamento dos tecidos descrito neste manuscrito permite a eliminação eficaz de autofluorescência usando componentes prontos para uso. O protocolo descreve a imagem latente de imunofluorescência de agregados de tau fosforilada no tecido do cérebro humano fixada em formol usando anticorpos secundarios conjugados a Alexa 488 e vermelho Texas, com DAPI como um corante de contraste nuclear. Para aplicar o método para outros tecidos, recomendamos realizar um tratamento prévio de fotobranqueamento 48 h para a amostra como um ponto de partida. Depois fotobranqueamento, execute a padrão imunofluorescência que mancha o protocolo para as características de interesse usando diluições de anticorpo seguindo as recomendações do fabricante. Se fluorescência de fundo ainda está presente, a duração de fotobranqueamento e/ou o anticorpo que mancha passos precisa ser modificado. A duração de fotobranqueamento irá variar dependendo da lâmpada selecionada para construir o aparelho e o nível de autofluorescência na amostra. O tempo ideal de branqueamento para cada aparelho exclusivo da lâmpada deve ser determinado. Isso pode ser feito por fotobranqueamento uma secção de tecido coverslipped imaculado, montado em TBS-azida e medir a fluorescência endógena do slide em intervalos de 12 h, usando um microscópio de fluorescência. Em relatórios anteriores, temos monitorado lipofuscina fotobranqueamento por análise de partícula e5funções de encaixe de decaimento exponencial de curva, mas para simplificar, observação visual das seções em intervalos regulares pode ser igualmente eficaz para julgar o duração, no qual a maioria da fluorescência torna-se extinto. No nosso caso do tecido de cérebro envelhecido que contém quantidades elevadas de pigmentos de lipofuscina, incubação de 48 h com uma lâmpada de 800 lux foi suficiente. Se o sinal específico permanece fraco em comparação com o plano de fundo depois fotobranqueamento, considere aumentar a concentração de anticorpos primários e secundários durante a coloração. Também é importante realizar um controle somente anticorpo secundário para garantir que o sinal de fundo não é causado pela ligação de anticorpo secundário não-específica. Tome cuidado para selecionar os anticorpos que não reação cruzada, especialmente quando a mancha para vários destinos. Além disso, certifique-se que os sinais específicos não são extinguidos inadvertidamente durante o processo de coloração. Por exemplo, mancha de Nissl (para coloração de neurônios) é extinguida pela BSA. Neste caso, o componente de BSA da solução de bloqueio deve ser substituído com alternativas como peixes pele gelatina5.
O uso de fósforo branco LEDs para fotobranqueamento tem certas limitações devido ao seu espectro de emissão de 420 nm a 650 nm. Assim, nenhum fotobranqueamento significativo nos comprimentos de onda UV é possível. Além disso, devido ao amplo espectro de emissão, fotobranqueamento cromóforos de comprimentos de onda específicos requer modificações como sobreposição de folhas cor de filtro acima as matrizes de LED para filtrar os comprimentos de onda de emissão indesejável. Além disso, fotobranqueamento do tecido pode exigir mais longos tempos de processamento do que outros métodos. Neste caso, devido a idade do tecido cerebral (a partir de um indivíduo de 89 anos de idade) e o período de fixação do aldeído longo de mais de 2 dias, uma duração de fotobranqueamento 48 h foi necessária. Embora nenhum ativo tempo de processamento é necessário, deve levar em consideração o tempo de fotobranqueamento e planejar a sessão de coloração de acordo. Lâmpadas de LED de maior luminosidade ou a utilização de lâmpadas de múltiplos pode reduzir significativamente o tempo de fotobranqueamento pelo simples aumento no fluxo de fóton.
Em comparação com os métodos existentes, nossa técnica oferece várias vantagens significativas. Ao contrário de fotobranqueamento usando digitalização laser em microscopia de fluorescência, observamos sem sinais de dano induzido por foto de nossas amostras usando LED fotobranqueamento. Outra grande vantagem do nosso aparelho é a redução significativa no custo sobre outras técnicas. A montagem do nosso aparelho custa cerca de US $10 USD, e a montagem do aparelho é flexível suficiente tal que qualquer laboratório pode adotar sua própria versão do photobleacher. Em comparação, outros métodos usando mutispectral conduziu matrizes com suportes de lâmina personalizado e câmaras de refrigeração requer até $1000 USD para construir8. Além disso, quenchers químicos comerciais são consumíveis que custam US $120 USD para 100 slides e introduzir compostos potencialmente indesejados na amostra. O quencher químico usado para comparação no presente estudo provavelmente contém o corante de Sudão negro lipid-ligação, que pode interferir com imunocoloração de lipoproteínas.
Em geral, os passos mais críticos na fotobranqueamento pré-tratamento e imunocoloração da amostra envolve a manipulação da seção durante immunostaining. É importante que, uma vez que a seção é reidratada durante fotobranqueamento, não é permitido secar em qualquer uma das etapas subsequentes. Secagem do slide irá causar uma distribuição desigual de anticorpos e criar artefatos difíceis de interpretar. Para evitar perda de tempo e amostras potencialmente preciosas, deve ter-se cuidado em várias etapas do protocolo. Depois da recuperação do antígeno, permitir que o tecido esfrie antes de transferir para a solução de permeabilização de TBS-Triton. Até mesmo momentânea exposição ao ar quando a amostra é aquecida a altas temperaturas irá causar secagem instantânea do tecido. Também, certifique-se de que soluções de corante de contraste, bloqueando ou anticorpo cobrem totalmente os tecidos durante a aplicação. Isto pode ser conseguido, certificando-se que o tecido é totalmente descrito pela caneta hidrofóbica para evitar o escoamento da solução, e que todas as soluções são aplicadas em uma câmara umidificada sobre uma superfície plana. Isto é especialmente importante durante a incubação do overnight (ligação de anticorpo primário).
A aplicação bem sucedida de fotobranqueamento usando fósforo branco LEDs antes da coloração pode facilitar a aplicação de métodos de imunofluorescência para tecidos arquivados. É um tratamento versátil e de baixo custo que esperamos estar receptivos a uma ampla gama de espécimes no futuro. Embora apenas aplicamos esse método ao tecido do cérebro humano, esta técnica pode ser facilmente incorporada em qualquer protocolo de coloração no qual autofluorescência está impedindo os resultados desejáveis, particularmente no tecido postmitotic como cardíaco ou esquelético músculos onde lipofucin é mais provável que se acumulam.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Este estudo foi suportado no todo ou em parte pelo consórcio canadense de neurodegeneração e envelhecimento (CCNA), o Instituto canadense de pesquisa de saúde (CIHR), a sociedade ALS de Canadá (Canada ALS) e a sociedade de Alzheimer do Canadá (ASC). Os autores gostaria de agradecer ao sultão Sheilane e Andrew Reid do cérebro marítima tecido banco para fornecer os tecidos cerebrais FTLD, Milan Gomes do programa visando espaço-Temporal e amplificação da radiação resposta (STTARR) e suas afiliadas financiamento de agências para tecido, incorporação e serviços e o avançado óptico microscopia Facility (AOMF) para fornecer instrumentos de microscopia de seccionamento. Kevin Hadley é agradeceu pela revisão crítica do manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trizma Base | Sigma-Aldrich | T6066 | |
| Sodium Choloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Hydrochloric Acid | Caledon Laboratory Chemicals | 1506656 | |
| Sodium Azide | BioShop Canada | SAZ001 | |
| 100 mm x 100 mm x 20 mm Pitri dish | Sarstedt | 82.9923.422 | All components of photobleacher can be substituted based on availability |
| 6 W LED Dimmable Desk Lamp | DBPower | DS501 | All components of photobleacher can be substituted based on availability |
| Citric Acid | Sigma-Aldrich | C-2404 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | BioShop Canada | EDT001 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P-7949 | |
| Sodium Hydroxide | BioShop Canada | SHY700.1 | |
| Water bath | Haake Fisons | K15 | |
| Slide collector | FisherScientific | 12-587-17B | |
| Staining Jar | FisherScientific | E94 | |
| Orbital Shaker | Bellco Glass | 7744-08115 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T7878 | |
| Bovine Serum Albumin | FisherScientific | BP1600-1 | |
| Normal Goat Serum | Aurion | 905.002 | |
| Hydrophobic pen | Sigma-Aldrich | Z672548-1EA | |
| Phospho-Tau (Ser202, Thr205) Monoclonal Antibody (AT8) | ThermoFisher | MN1020 | |
| Goat anti-Mouse Secondary Antibody, Texas Red-X | ThermoFisher | T862 | |
| Goat anti-Mouse Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher | A-11029 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Mounting medium | ThermoScientific | 28-600-42 | |
| Glass soverslip | |||
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM710 | |
| Imaging software ZEN 2012 Black Edition 11.0 | Zeiss | LSM710 | Software accompanies the Confocal Microscope |
| ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/download.html | |
| RGB Profile Tools macro | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/macros/tools/RGBProfilesTool.txt | |
| Commercial chemical quencher | Biotum | 23007 |
References
- Banerjee, B., Miedema, B. E., Chandrasekhar, H. R. Role of basement membrane collagen and elastin in the autofluorescence spectra of the colon. J Investig Med. 47 (6), 326-332 (1999).
- Terman, A., Brunk, U. T.
- Del Castillo, P., Llorente, A. R., Stockert, J. C. Influence of fixation, exciting light and section thickness on the primary fluorescence of samples for microfluorometric analysis. Basic Appl Histochem. 33 (3), 251-257 (1989).
- Ottis, P., Koppe, K., et al.
- Sun, Y., Chakrabartty, A. Cost-effective elimination of lipofuscin fluorescence from formalin-fixed brain tissue by white phosphor light emitting diode array. Biochem Cell Biol. 94 (6), 545-550 (2016).
- Davis, A. S., Richter, A., et al. Characterizing and Diminishing Autofluorescence in Formalin-fixed Paraffin-embedded Human Respiratory Tissue. J Histochem Cytochem. 62 (6), 405-423 (2014).
- Zimmermann, T., Rietdorf, J., Pepperkok, R. Spectral imaging and its applications in live cell microscopy. FEBS Lett. 546 (1), 87-92 (2003).
- Duong, H., Han, M. A multispectral LED array for the reduction of background autofluorescence in brain tissue. J Neurosci Methods. 220 (1), 46-54 (2013).
- Albeanu, D. F., Soucy, E., Sato, T. F., Meister, M., Murthy, V. N. LED arrays as cost effective and efficient light sources for widefield microscopy. PLoS One. 3 (5), 1-7 (2008).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Robertson, J. B., Zhang, Y., Johnson, C. H. Light-emitting diode flashlights as effective and inexpensive light sources for fluorescence microscopy. J Microsc. 236 (1), 1-4 (2009).
- Mackenzie, I. R. A., Neumann, M. Molecular neuropathology of frontotemporal dementia: insights into disease mechanisms from postmortem studies. J Neurochem. 138 (S1), 54-70 (2016).
- Kouri, N., Whitwell, J. L., Josephs, K. A., Rademakers, R., Dickson, D. W. Corticobasal degeneration: a pathologically distinct 4R tauopathy. Nat Rev Neurol. 7 (5), 263-272 (2011).
