Summary
הרקע autofluorescence של דגימות ביולוגיות לעיתים קרובות מסבך מבוסס על-ידי קרינה פלואורסצנטית טכניקות הדמיה, במיוחד ברקמות בגילאי postmitotic האנושית. פרוטוקול זה מתאר איך autofluorescence מן הדגימות ניתן להסיר ביעילות באמצעות אור זמינים מסחרית פליטת אור דיודה המקור photobleach המדגם לפני immunostaining.
Abstract
Immunofluorescence היא שיטה נפוצה כדי להמחיש תאים subcellular וכדי לקבוע הלוקליזציה של חלבונים ספציפיים בתוך דגימת רקמה. מכשול גדול כדי הרכישה של תמונות באיכות גבוהה immunofluorescence הוא autofluorescence אנדוגני של הרקמה שנגרם על ידי פיגמנטים הזדקנות כגון lipofuscin או תהליכים הכנה מדגם נפוצים כגון קיבוע אלדהיד. פרוטוקול זה מתאר כיצד רקע זריחה יכול להיות הקטנו דרך photobleaching באמצעות אור זרחן לבן פולטות נורית led מערכים לפני הטיפול עם הגששים פלורסנט. רחבת ספקטרום הפליטה של זרחן לבן נוריות לאפשר הלבנת של fluorophores על פני טווח של פליטת פסגות. המנגנון photobleaching יכול להיות בנוי רכיבים מדף במחיר נמוך מאוד, ומציע אלטרנטיבה נגיש זמין מסחרית quenchers כימי. טיפול קדם photobleaching של הרקמה ואחריו immunofluorescence המקובלת מכתים יוצר תמונות חינם של הרקע autofluorescence. בהשוואה ל הוקמה quenchers כימיים אשר מופחת בדיקה, כמו גם רקע אותות, טיפול photobleaching לא היתה השפעה על עוצמת קרינה פלואורסצנטית בדיקה בעוד הוא ביעילות מופחת קרינה פלואורסצנטית הרקע ואת lipofuscin. למרות photobleaching דורשת יותר זמן לטיפול מראש, מערכים LED בעוצמה גבוהה יותר עשוי לשמש כדי לצמצם את זמן photobleaching. ניתן להחיל שיטה פשוטה זו פוטנציאל למגוון של רקמות, במיוחד postmitotic הרקמות שנצברים lipofuscin כמו המוח והשרירים לב או השלד.
Introduction
קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ באמצעות נוגדנים מיקוד חלבונים ספציפיים משמש באופן שגרתי כדי להמחיש חלבונים עניין בתרבית תאים ורקמות. סיבוך הגדולות רכישת תמונות ברורה ומוחלטת ב- immunofluorescence הוא autofluorescence, אשר יכולה להיגרם endogenously בתרבית של רקמה על ידי lipofuscin פיגמנט של הגיל על ידי חלבונים כגון אלסטין וקולגן1, 2. יכול להיות הציג את מקורות אחרים של autofluorescence הצעדים הכנה מדגם כגון אלדהיד קיבוע3. Lipofuscin בגרגרים, המורכבת בעיקר חלבון oxidatively שונה, השומנים השפלה ומשקעים, להצטבר בתאים חיים ארוך עם גיל מוגבר2. גורם לקשיים הדמיה postmitotic רקמות כגון את המוח ואת הלב או השלד השרירים, כפי ספקטרום הפליטה זריחה של lipofuscin הינו רחב ומשתנה, לעיתים קרובות בד בבד עם אורך הגל פליטה של fluorophores נפוץ המשמש תיוג4. גורמים אלה לבצע הדמיה של רקמת המוח האנושי מפני מקרים של מחלות ניווניות בגיל מאוחר כמו ניוון frontotemporal אוני (FTLD) מאתגר במיוחד.
כדי לצמצם את autofluorescence, אנחנו המציאו טכניקה שבה אנחנו להאיר הסעיפים רקמות רכוב שקופיות עם אור לבן פולטות מערך דיודות (LED) באמצעות מנורת שולחן ביתי5. טכניקה פשוטה זו מספקת אלטרנטיבה טכניקות שמשתמשות quenchers כימיים כגון CuSO4 אמוניום אצטט, או זמינים מסחרית שכבתה צבעי כגון סודאן שחור B ו- T שחורה Eriochrome6. יש לו גם יותר חסכוניים משמעותית מולטי ספקטריאליות הוביל המנורה photobleaching טכניקות ומונע סיבוכים וחפצי המופקים autofluorescence דיגיטלי שיטות להסרת כמו ספקטרלי ערבוב האו ם7,8. זרחן לבן נוריות יש ספקטרום פליטה רחבה, עוצמת אור גבוהה עלות הייצור נמוך, הפיכתם ומהווה מרכיב מדף עבור photobleaching מגוון הן5,9.
פרוטוקול זה, אנחנו מדגימים הקמת מנגנון photobleaching באמצעות רכיבי נגיש, photobleaching חלות על מקרה של רקמות FTLD המכיל הכללות טאו-חיוביות (FTLD-T) באמצעות של נוגדנים ספציפיים טאו phosphorylated. נדגים את השפעת photobleaching על הדמיה נוגדנים fluorescently התווית על-ידי העסקת שתי הנפוצות הן: אלקסה 488 ואדום טקסס. ההשפעה של photobleaching לעומת סעיפים שלא טופלו או כאלה שטופלו כ'חטיף כימי מסחרי לכמת, בהשוואה. טיפול קדם זה photobleaching שניתן לשלבן בכל פרוטוקול מוכתמים immunofluorescence סטנדרטי להסרת autofluorescence דגימה ביולוגית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: העבודות שהוצגו נעשו בהתאם שזוהה בסטנדרטים בינלאומיים, הכולל את הכנס הבינלאומי על משלים (ICH), המועצה עבור הבינלאומי ארגוני של רפואי מדעי (CIOMS) , ואת עקרונות הצהרת הלסינקי. השימוש רקמה אנושית היה באישור דירקטוריון האתיקה של המחקר רשת בריאות האוניברסיטה. הדגימות המוח האנושי נאספו במסגרת של הבנק הימי של רקמות המוח. בזמנו של אוסף, הושגה הסכמה מדעת מחולים כל.
1-בניית פתרונות של המנגנון photobleaching
- פתרונות מניות הכן.
- להכין 1 L 1 x מניות באגירה טריס תמיסת מלח (1 x TBS) פתרון (150 מ"מ NaCl, 50 מ מ טריס-קלרנית, pH 7.4) על ידי המסת 8.77 g של NaCl ו- g 6.06 של טריס בסס 800 מיליליטר ddH 2 O ולהתאים את ה-pH ל 7.4 באמצעות HCl. הביאו את עוצמת הקול 1 ליטר, תא לחץ. < / li >
- להכין אזיד הנתרן 10% (200 x מניות) על ידי המסת 1g של אזיד הנתרן ב- 10 מ"ל של ddH 2 O (10%, מניות 200 x).
- 1-3 שקופיות בגודל סטנדרטי, לשימוש יחיד 100 מ"מ x 100 מ"מ שקוף, מרובע פטרי כמו תא שקופיות. עבור חדר שקופית בודדת, להוסיף 0.25 mL של מניות של אזיד הנתרן x 200 50 מ של x TBS 1 כדי להפוך פתרון אזיד-TBS 0.05%. מחסנית 2-3 שקופיות צ'יימברס אנכית כדי לעבד שקופיות נוספות. להכין של 50 מ ל נוספים של אזיד-TBS פתרון עבור כל תא.
- צור לפיגום כדי לרומם את chamber(s) שקופיות כזה ראש המנורה יכולה להתאים מתחת.
- עבור 100 מ"מ x 100 מ"מ שקופית קאמרית, לחתוך פתחים התחתון ואת צדי 100 מ"מ x 100 מ"מ x מיכל מזון ממ פלסטיק 30 ו היפוך המכולה. להבטיח הפתחים בצד הם גדולים מספיק כדי להתאים מקור אור LED ולהבטיח הפתח התחתון הוא מספיק גדול כזה אור מקור האור מגיע תא הדגימה ללא מכשול.
- חלות איזולירבנד לגרדום כדי להגדיל את האחיזה בין לגרדום את הדגימה הקאמרית/benchtop. להשתמש בחומרים אלטרנטיביים מכל לבנות בפיגומים. כל עוד זה מעלה בצורה מאובטחת תא שקופית ללא הפגיעה האור מלהגיע המדגם.
- להסיר מנורת השולחן עשוי לעכב את נורית ה-LED מלהגיע ישירות את המדגם, (במידת האפשר), אוריינט המערך LED כלפי מעלה כל רשתות ומפזרים או פלסטיק אטומה. מניחים את chamber(s) לגרדום והחלק מעל המערך LED. להשתמש מנורה עם צוואר גמיש עבור טיפול קל.
- לבנות כיפה רפלקטיביים לחפות המנגנון על ידי רירית בתוך קופסה גדולה מספיק כדי לכסות את השקופית קאמרית לגרדום ברדיד אלומיניום. השתמש בתיבה עצה פיפטה 1 מ"ל תא יחיד או של 150 מ"מ x 150 מ"מ x קופסת קרטון מ מ 150 למרובים, אנכית מוערמים צ'יימברס.
2. טיפול קדם Photobleaching סעיפים רקמת
הערה: הכנה בסעיף רקמות עשויים להשתנות בהתאם המקור של רקמות, קיבוע, הטמעה השיטות. כאן, רקמת מוח (orbitofrontal gyri) ממקרה של FTLD-T היה קבוע ~ 2 ימים בפורמלין, לרוץ דרך מעבר הדרגתי סוכרוז, המוטבעות OCT, ולחתוך 10 מיקרומטר עבה למקטעים באמצעות cryostat.
- קר ºC 4 חדרים, הקבינט קר או מקרר, אוריינט המנורה מתחת לגרדום ולמקם תא הדגימה על הגרדום. שופכים 50 מ של אזיד-TBS פתרון לתוך תא הדגימה.
- Submerge רקמות מקטעים רכוב על שקופיות מיקרוסקופ רגיל זכוכית אל החדר השקופית המכילה אזיד-TBS באמצעות מלקחיים נקי. עבור שקופיות מרובות, ודא כי השקופיות ממוקמים בבית הבליעה בשכבה אחת.
- מכסים את המנגנון עם הכיפה רפלקטיביים, להדליק את מנורת LED, תקופת דגירה של 48 שעות-4 ºC.
3. Immunofluorescence
- כדי להכתים את הרקמה phosphorylated טאו באמצעות דאפי counterstain ו אלקסה 488 - רד טקסס מצומדת נוגדנים משניים, להכין תחילה פתרונות אחזור אנטיגן, permeabilization, חסימה של ראשי כריכת נוגדן.
מאגר
- להכין 500 מל אנטיגן ההחזרה (10 מ מ חומצת לימון, חומצה ethylenediaminetetraacetic 2 מ מ, 0.05% Tween 20; pH 6.2) על ידי המסת 0.92 g של חומצה ציטרית ו- 0.37 g ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA) 500 מ"ל של ddH 2 O. התאם ה-pH כדי 6.2 עם NaOH ולהוסיף 0.25 mL Tween 20-
- הכנת 500 מ"ל של 0.025% טריטון X-100 בתמיסה TBS (TBS-Triton) על-ידי הוספת מ ל 0.125 של טריטון X-100 500 מ ל 1 x TBS.
- הכן פתרון 1% אלבומין שור (BSA) ב- TBS (BSA-TBS מאגר) על ידי המסת 0.1 g BSA ב 10 מ"ל TBS.
- להכין פתרון חסימה על-ידי הוספת 0.2 מ של עז נורמלית בסרום 1.8 מ של 1% BSA/TBS.
- עבור כל שקופית, להכין µL 150 של נוגדן ראשוני פתרון (דילול מטריים) על-ידי pipetting 1.5 µL pSer202 אנטי-פוספו-PHF-טאו + Thr205 (AT8) נוגדן לתוך µL 148.5 של 1% BSA-TBS מאגר ולהשאיר על קרח
- כדי לבצע אחזור אנטיגן, להטביע את השקופיות photobleached אנכית אספן השקופית המכילה 25 מ של אנטיגן אחזור מאגר. לאבטח האספן עם הקלטת ו/או מחרוזות כך האספן לא נופל לתוך האמבט במים. מחממים האספן באמבט מים-90 ºC למשך 30 דקות ולאפשר האספן להתקרר לטמפרטורת החדר למשך 30 דקות לפני הסרת את השקופיות. האם לא להסיר השקופיות באופן מיידי כפי שהוא יגרום הסעיפים להתייבש.
- להעביר את השקופיות האספן אחזור אנטיגן לתוך צנצנת מכתימים מלא עם 30 מ של TBS-טריטון ולשטוף הסעיפים למשך 5 דקות על תפקודי לב / נשימה עם טלטול עדין. חזור על לשטוף את פעם אחת עם TBS טריים-טריטון. הפתיל מאגר עודף משם עם רקמת נטולת מוך, המתאר הרקמה עם עט הידרופובי. . שמור על עצמך לא לתת את השקופיות להתייבש.
- עבור כל שקופית, חסום את הרקמה pipetting µL 200 של חסימת פתרון אל הרקמה ולמקם את השקופית בתוך תא humidified. בנו התא על-ידי הצבת ארון שקופיות בתוך קופסא עצה פיפטה המכיל מגבת נייר רטובה. דגירה בטמפרטורת החדר במשך שעתיים על משטח הרמה. ודאו כי הפתרון חסימה מלאה מכסה הרקמה.
- להסיר את הפתרון חסימה על ידי השאיפה, pipette µL 100-150 של נוגדן ראשוני פתרון אל הרקמה. ודא נפח מספיק של נוגדן קיים בסעיף על משטח רמת להימנע איגום של נוגדן פתרון לצד אחד. דגירה-ºC 4 לילה ב תא humidified.
- להכין לתערובת נוגדנים משניים counterstain הגרעין של דאפי.
- עבור כל שקופית, להכין µL 150 תערובת נוגדנים משניים (בטחונות דילולים) על-ידי הוספת µL 1.5 של עז אנטי עכבר אלקסה 488 µL 1.5 של עז העכבר נגד טקסס אדומה µL 147 של BSA-TBS, להשאיר על קרח
- הכנת 0.1 µg/mL דאפי counterstain על ידי דילול טורי. לערבב את הפתרון מניות ביסודיות, לדלל 1 µL של מניות 5 מ"ג למ"ל דאפי ב 999 של TBS לעשות 1 מ"ל של 5 פתרון µg/mL. עבור כל שקופית, לדלל ממוצע 3L של פתרון µg/mL 5 עם µL 147 של TBS כדי ריכוז סופי של 0.1 µg/mL.
התראה: דאפי היא מוטגן ידוע ויש לטפל בזהירות.
- להסיר את הנוגדן העיקרי על ידי השאיפה. להטביע את השקופיות בכוס מכתימה את הצנצנת המכילה 30 מ של TBS-טריטון ושטוף במשך חמש דקות עם ערבוב עדין על תפקודי לב / נשימה. חזור על השלב לשטוף עם TBS טריים-טריטון. לפתיל משם עודף TBS-טריטון, פיפטה 100 עד 150 µL של נוגדנים משניים תערובת לכל שקופית.
- ודא הרקמה מכוסה במלואה על ידי התערובת נוגדן. תקופת דגירה של 2 h בטמפרטורת החדר בבית הבליעה humidified בחושך.
- להסיר את התערובת נוגדנים משניים על ידי השאיפה ולהעביר את השקופית לתוך כוס מכתימה את הצנצנת המכילה 30 מ של TBS (אין Triton). רחץ במשך חמש דקות עם ערבוב עדין על תפקודי לב / נשימה. חזור על השלב לשטוף עם TBS. טריים להחיל 100 עד 150 µL של 0.1 µg/mL דאפי counterstain כל שקופית, תקופת דגירה של 10 דקות בטמפרטורת החדר בחושך.
- להעביר את השקופיות כוס מכתימה את הצנצנת המכילה TBS ולשטוף 3 פעמים עם ערבוב עדין למשך 5 דקות כל אחד, באמצעות TBS טריים עבור כל כביסה. מאגר עודף משם וויק.
- להחיל 3 טיפות של הרכבה מימית בינוני לרקמות. באמצעות מלקחיים, והורד בעדינות coverslip זכוכית נקי אל הרקמה, מתחיל עם קצה אחד והורדת לאט לקצה השני כדי להימנע לכידה של בועות אוויר. לטפל לא כדי לסלק את coverslip אם הדמיה באופן מיידי. אחרת, לאפשר המדיום הרכבה להתייבש לפני אחסון ב- 4 ºC בחושך.
4. קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ
- התור על המנורה פלורסצנטיות, המיקרוסקופ למחשב ולאפשר את המנורה לחמם עד 15 דקות במקום הרקמה מוכתם שקופיות על הבמה מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית. להשתמש בתמונה שדה בהיר כדי לאתר את הרקמה בהגדלה x 10-
- להחיל טיפת ddH 2 O השטח coverslip ולהשתמש עדשה המטרה 20 x טבילה במים (NA = 1.0). בחר את הסריקה המטוס בממוצע ארבע שורות הגדרת. הגדר את גודל חריר 1 יחידה אוורירי נותן פרוסה אופטי של ~ 3 מיקרון. בחר לייזר עירור, פליטה אורכי הגל עבור כל fluorophore מסלולים נפרדים עבור האות הטוב ביותר.
הערה: אלקסה 488: λ ex = λ 488 ננומטר (לייזר ארגון) em = 493-570 ננומטר; טקסס אדום: λ ex = 561 nm (DPSS 561 ננומטר לייזר), λ em = 601-635 ננומטר; דאפי: λ ex = 405 ננומטר (405 דיודת לייזר), λ em = 410-507 ננומטר.- להתאים את עוצמת הלייזר ולהשיג הגדרות כדי למטב את עוצמת האות של כל רצועה. לאסוף תמונה מורכבת ולשמור. להשתמש באותן הגדרות לייזר כדי להשוות עוצמות קרינה פלואורסצנטית בשקופית שונה.
- עבור ויזואליזציה של עוצמת קרינה פלואורסצנטית בכל אחד מהערוצים, להתקין את המאקרו כלים פרופיל RGB ImageJ 10. לשמור את המאקרו של דף האינטרנט כקובץ טקסט (https://imagej.nih.gov/ij/macros/tools/RGBProfilesTool.txt). מתפריט ' ImageJ ', בחר תוספים - > מאקרו - > להתקין; בחר את קובץ הטקסט כדי להתקין את הכלי פרופילי RGB.
- לפתוח את קובץ התמונה קונאפוקלית ב ImageJ ו להמיר את התמונות ללא הפרדות צבע הערימות 3 ל- RGB על-ידי ביצוע הפעולות הבאות: תמונה - > צבע - > ערוץ כלי. בחר " ללא הפרדות צבע " מתוך התפריט הנפתח ולבדוק כל שלושה ערוצי. לאחר מכן, בחר תמונה - > סוג - > צבע RGB.
- בחר בסמל כלים פרופיל RGB, לצייר קו לרוחב החלק בתמונה כדי להיות מתועדים. לשמור את נתוני עוצמת כגיליון להתוויה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ניתן להוסיף שלב טרום טיפול photobleaching פרוטוקול סטנדרטי immunofluorescence מייד לפני אחזור אנטיגן ו- immunostaining (איור 1 א'). הרכבה של המנגנון photobleaching ניתן גם לבצע שימוש שונים, רכיבים זולים, מדף (איור 1B). ספקטרום הפליטה של זרחן לבן נוריות מכסה מגוון רחב של אורכי גל, מה שהופך אותם מתאימים עבור מגוון רחב photobleaching, מסכים עם דוחות (איור 1C) הקודם5,11. לאחר 48 שעות photobleaching, עוצמת ספאקלס autofluorescent הדומים lipofuscin, כמו גם רקע כללי פלורסצנטיות צומצם במידה ניכרת בשני אורכי גל פליטה בסעיף וללא רבב FTLD-T (איור 1D). כדי להדגים את היעילות של photobleaching, אנחנו מוכתם hyperphosphorylated טאו להמחיש טאו פתולוגיים תכלילים במקרה של FTLD-T באמצעות שני נוגדנים משניים שונים. צורה ברורה של טאו תכלילים ושימוש של שני הן עבור תיוג גם מאפשרת לנו להבחין בביטחון autofluorescent תכונות לבין מטרות נועד כדי לאמת את הטכניקה.
של תמונות ללא הפרדות צבע בהגדלה נמוכה יותר, המורפולוגיה של תכלילים טאו-חיובית, צבעונית צהוב משילוב של ערוצי אלקסה 488 ואדום טקסס, מורכב בצורת טבעת אוספים של תהליכים תא קצר מכונים ' astrocytic שלטי (איור 2 א-ג). זו היא מאפיין של קליפת המוח ניוון (המע ר)12,13, אשר מסכים עם ח הפתולוגיה של המקרה הזה. המדגם אינו מטופל, מבנים רבים נמצאים בתמונה ללא הפרדות צבע זה לא דמה תכלילים טאו, והראה פלורסצנטיות בעיקר בערוץ אדום, רומז כי זה autofluorescence ולא נוגדנים המיועדים מכתים. רמה מורגש של רקע זריחה מוצגת גם ב ערוץ זה לאורך כל שדה הראייה (איור 2 א). תכונות autofluorescent אלה יוסרו, התמונה הכוללת מופיעה נקי יותר כאשר דגימות שטופלו photobleaching (PB), את כ'חטיף כימי (איור 2b-c).
אנחנו מכן לכמת את ההבדלים פלורסצנטיות בדגימות אלה על-ידי יצירת פרופיל אזור קטן יותר בכל מדגם. שלט astrocytic בודד מוצגת במצב כל טיפול להשוואה (איור דו-ממדי-r). המדגם אינו מטופל, הרקע הוא נוכח כל הערוצים שלושה, אבל קרינה פלואורסצנטית נוגדנים משניים עבור נוגדנים אלקסה 488 ואדום טקסס היה גבוה יחסית (תאנה 2h). עם זאת, המבנים autofluorescent נוכח המדגם אינו מטופל היה עוצמות קרינה פלואורסצנטית בערוץ טקסס אדום להשוות הנוגדן משני טקסס אדום זה מוכתם טאו (איור 2 h). אם חלבון המטרה לא היה של מורפולוגיה ברורה, צפוי כגון טאו במקרה שלנו, autofluorescence בתוך רקמת היינו מסוגלים התמונה uninterpretable.
לעומת זאת, כאשר הטיפול מראש photobleaching הוחל לפני immunostaining, רקע זריחה ב- 488 אלקסה, רד טקסס ערוצי צומצם באופן משמעותי בהשוואה ל המדגם אינו מטופל, ו על ידי קרינה פלואורסצנטית של immunostained טאו נותרה מעושה (איור 2i-m). כ'חטיף כימי מסחרי מתרצה את autofluorescence בערוץ 488 אלקסה רק בצורה יעילה כמו photobleaching. זה גם לדכא דאפי רקע זריחה, אשר לא הושפע על ידי טיפול photobleaching 48 שעות (איור 2 מ'). עם זאת, כ'חטיף כימי גם מופחת האינטנסיביות של טקסס משני והאדום אותות דאפי, רומז מידה מסוימת של לא מועיל שכבתה (איור 2n-r).
איור 1 : יישום של טיפול קדם photobleaching בזרימת עבודה סטנדרטי immunofluorescence. A) פשוטה סכמטית הפרוטוקול immunofluorescence סטנדרט משלב הרכישה רקמות הדמיה. היישום של נוגדנים פלורסנט והמשניים מיוצג על ידי סרטים מצויירים. תמונת מיקרוסקופ נציג מופק. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. B) מנגנון photobleaching נציג נבנה באמצעות רכיבי מדף (המכסה רעיוני לא מוצג). ג) ספקטרום הפליטה של מערך LED לבן. לשיא פליטה צר-450 nm ו לשיא רחבה-550 ננומטר הם נצפו. ד) השפעת photobleaching על רקע אנדוגני זריחה של FTLD-T רקמת אלקסה 488 (493-570 ננומטר), אורכי גל פליטה טקסס אדום (601-635 ננומטר). ספאקלס Autofluorescent הדומה lipofuscin מופחתים בעליל לאחר 48 שעות photobleaching. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2:אפקט של הסרת autofluorescence על איכות התמונה של תיק של רקמות FTLD-T עם טאו anti-phosphorylated immunostaining. -ג) הגדלה נמוכה, תמונות immunofluorescence ללא הפרדות צבע של נציג שדות ראייה ב ללא טיפול (א), photobleached עבור 48 h (ב) וכ'חטיף כימי מטופלים (ג) דגימות. הצבעים מייצגים זריחה בהערוצים הבאים באמצעות עירור על ידי מקורות אור בהתאמה שלהם: אלקסה 488 (ירוק): λex = λ 488 ננומטר (לייזר ארגון)em = 493-570 ננומטר; טקסס אדום (אדום): λex = 561 nm (DPSS 561 ננומטר לייזר), λem = 601-635 ננומטר; דאפי (כחול): λex = 405 ננומטר (405 דיודת לייזר), λem = 410-507 ננומטר. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. d-r) גבוה יותר הגדלה של האזורים מנוקד לא מטופל (d-g), photobleached (i-l), דגימות כ'חטיף כימי מטופלים (n-q), עם ערוצים נפרדים פלורסצנטיות, התמונה התמזגו, ותמונות לכמת פלורסצנטיות אות פרופילים. קווים מנוקדים בערוצים הממוזג (g, l, q) מייצגים את הקו בסימן אשר נוצרו פרופילים (h, m, r). סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. Autofluorescent חלקיקים (af).immunolabeled טאו קרינה פלואורסצנטית (טאו) ושידור גרעין (nuc) מסומנים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הטיפול מראש photobleaching של רקמות תיאר כתב יד זה מאפשר לחיסול יעיל של autofluorescence באמצעות רכיבי מדף. הפרוטוקול מתאר immunofluorescence הדמיה של טאו phosphorylated אגרגטים ברקמת המוח האנושי פורמלין-קבוע באמצעות נוגדנים משניים מצומדת 488 אלקסה, רד טקסס, עם דאפי כמו גרעיני counterstain. כדי להחיל את השיטה על רקמות אחרות, אנו ממליצים על ביצוע טיפול קדם photobleaching 48 שעות כדי המדגם כנקודת התחלה. לאחר photobleaching, לבצע את immunofluorescence רגיל מכתים פרוטוקול עבור התכונות של הריבית באמצעות נוגדן דילולים בעקבות ההמלצות של היצרן. אם הרקע הוא עדיין נוכחים, משך photobleaching ו/או נוגדן צביעת מדרגות צריך להיות שונה. משך הזמן של photobleaching משתנה בהתאם המנורה נבחרה כדי לבנות את המנגנון ואת רמת autofluorescence במדגם. הפעם הלבנת האופטימלי עבור כל מכשיר ייחודי המנורה צריכה להיקבע. ניתן לבצע זאת על-ידי photobleaching של סעיף הרקמה וללא רבב, coverslipped רכוב ב- TBS-אזיד ומדידת של זריחה אנדוגני של השקופית במרווחי 12 שעות באמצעות מיקרוסקופ זריחה. בדוחות קודמים, אנחנו במעקב lipofuscin photobleaching על ידי ניתוח של חלקיקים, עקומה פולינומיאלית על דעיכה מעריכית פונקציות5, אבל לפשטות, התצפית הויזואלית של הסעיפים במרווחי זמן קבועים יכול להיות יעיל באותה מידה לשפוט משך-רוב רובן קרינה פלואורסצנטית הופך מתרצה. במקרה שלנו של רקמת המוח בגילאי המכילים כמויות גבוהות של פיגמנטים lipofuscin, דגירה 48 שעות עם מנורת לאקס 800 היה מספיק. אם אות מסוימת נותר חלש בהשוואה לרקע לאחר photobleaching, שקול להגדיל את הריכוז של נוגדנים והמשניים במהלך מכתים. חשוב גם לבצע פקד נוגדן בלבד משני כדי להבטיח שהאות רקע לא נגרם על-ידי איגוד נוגדנים משניים שאינם ספציפיים. . שמור על עצמך כדי לבחור נוגדנים לא cross-react, במיוחד כאשר צביעת עבור מטרות מרובות. בנוסף, ודא כי אותות מסוימים הם לא בשוגג מתרצה במהלך תהליך צביעת. למשל, Nissl הכתם (עבור צביעת נוירונים) הוא מתרצה מאת BSA. במקרה זה, הרכיב BSA של הפתרון חסימה צריך להיות מוחלף עם חלופות כגון ג'לטין דגים העור5.
השימוש של זרחן לבן נוריות עבור photobleaching יש הגבלות מסוימות בשל ספקטרום הפליטה שלה מ- 420 nm 650 ננומטר. לפיכך, אין photobleaching משמעותי ב- UV אורכי הגל אפשרי. גם, בשל ספקטרום הפליטה רחבה, הן photobleaching של אורכי גל מסוים דורש שינויים כגון בשכבת-על מסנן צבע גליונות מעל מערכי LED לסנן את אורכי הגל פליטה לא רצויים. בנוסף, photobleaching של רקמת עשויות לדרוש פעמים עיבוד ארוך יותר מאשר שיטות אחרות. במקרה זה, בשל גיל רקמת המוח (מאדם בודד בן 89) ואת תקופת קיבוע אלדהיד ארוך יותר מ- 2 ימים, משך photobleaching 48 שעות היה נדרש. אמנם אין זמן עיבוד פעיל נדרש, אחד חייב לקחת בחשבון הזמן photobleaching, בהתאם לתוכנית ההפעלה מוכתמים. מנורות LED של עוצמת אור גבוהה יותר או השימוש של מנורות מרובות עשוי להפחית באופן משמעותי את הזמן photobleaching על ידי הגדלת פשוטים שטף הפוטונים.
לעומת שיטות קיימות, הטכניקה שלנו מציע מספר יתרונות משמעותיים. בניגוד photobleaching באמצעות לייזרים סריקה קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ, נצפו סימנים של נזק צילום-induced של הדגימות שלנו באמצעות LED photobleaching. יתרון מרכזי נוסף של המנגנון שלנו נגמר הפחתה משמעותית של עלות טכניקות אחרות. עלות הרכבה של המנגנון שלנו הוא כ $10 דולר, ההרכבה של המנגנון הוא גמיש מספיק כזה בכל מעבדה יכולים לאמץ את הגרסה שלהם photobleacher. לשם השוואה, שיטות אחרות באמצעות mutispectral הוביל מערכים עם מחזיקי שקופית מותאמות אישית ודורש קירור צ'יימברס עד $1000 דולר כדי לבנות8. בנוסף, מסחרי quenchers כימיים הם מתכלים עולה $ USD 120 עבור שקופיות 100, להציג תרכובות רצויות לתוך הדגימה. כ'חטיף כימי המשמש להשוואה במחקר הנוכחי סביר מכיל את צבען שחור סודאן השומנים מחייב, אשר עלולים להפריע immunostaining של lipoproteins.
בסך הכל, השלבים הקריטיים ביותר לטיפולי קדם photobleaching, immunostaining של הדגימה כרוך הטיפול של המקטע במהלך immunostaining. חשוב כי ברגע בסעיף זה ולמיומנות במהלך photobleaching, אסור לייבש בכל אחד והשלבים הבאים. ייבוש של השקופית לגרום הפצה אחידה של נוגדנים וליצור חפצים uninterpretable. כדי למנוע אובדן זמן ודוגמאות שעשוי להיות יקר, חייבים להקפיד על מספר צעדים בפרוטוקול. לאחר אחזור אנטיגן, לאפשר את הרקמה לקרר לפני העברת הפתרון permeabilization TBS-טריטון. חשיפה רגעית אפילו האוויר כאשר המדגם מחומם לטמפרטורות גבוהות יגרמו ייבוש מיידי של הרקמה. גם להבטיח כי נוגדנים, חסימה או counterstain פתרונות כיסוי מלא הרקמות במהלך היישום. זו יכולה להיות מושגת על ידי מוודא כי הרקמה תחומה באופן מלא על-ידי העט הידרופובי כדי למנוע זרימת פתרון כי כל הפתרונות מוחלים בתוך תא humidified על משטח הרמה. הדבר חשוב במיוחד במהלך לילה incubations (נוגדן ראשוני מחייב).
יישום מוצלח של photobleaching באמצעות זרחן לבן נוריות לפני צביעת עשוי להקל על היישום של שיטות immunofluorescence רקמות בארכיון. זה טיפול רב תכליתי ולא יקר כי אנחנו מצפים להיות מקובל מגוון רחב של דגימות בעתיד. אמנם אנחנו רק שהחלת שיטה זו על רקמת המוח האנושי, טכניקה זו ניתן בקלות לשלב בכל פרוטוקול מכתימים ב autofluorescence אשר מונעת תוצאות רצויות, בפרט postmitotic רקמות כגון הלב או השלד השרירים איפה lipofucin סביר יותר לצבור.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
מחקר זה נתמך באופן מלא או באופן חלקי על ידי הקנדי קונסורציום של הקשורים ניוון מוחיים הזדקנות (CCNA), המכון הקנדי של הבריאות מחקר (CIHR), החברה ALS של קנדה (ALS קנדה) והחברה האלצהיימר של קנדה (ASC). המחברים רוצה להודות סולטן Darvesh, אנדרו ריד מהבנק הימי במוח רקמות למתן הרקמות במוח FTLD, מילאנו גנגולי מן התוכנית מיקוד-עתיים, הגברה של קרינה התגובה (STTARR) ובאמצעות שלה מימון לסוכנויות רקמות הטבעה ואת חלוקתה, וכן את מתקדמת אופטי מיקרוסקופ מתקן (AOMF) על מתן כלים מיקרוסקופ. קווין האדלי. הוא הודה על סקירה ביקורתית של כתב היד.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trizma Base | Sigma-Aldrich | T6066 | |
| Sodium Choloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Hydrochloric Acid | Caledon Laboratory Chemicals | 1506656 | |
| Sodium Azide | BioShop Canada | SAZ001 | |
| 100 mm x 100 mm x 20 mm Pitri dish | Sarstedt | 82.9923.422 | All components of photobleacher can be substituted based on availability |
| 6 W LED Dimmable Desk Lamp | DBPower | DS501 | All components of photobleacher can be substituted based on availability |
| Citric Acid | Sigma-Aldrich | C-2404 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | BioShop Canada | EDT001 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P-7949 | |
| Sodium Hydroxide | BioShop Canada | SHY700.1 | |
| Water bath | Haake Fisons | K15 | |
| Slide collector | FisherScientific | 12-587-17B | |
| Staining Jar | FisherScientific | E94 | |
| Orbital Shaker | Bellco Glass | 7744-08115 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T7878 | |
| Bovine Serum Albumin | FisherScientific | BP1600-1 | |
| Normal Goat Serum | Aurion | 905.002 | |
| Hydrophobic pen | Sigma-Aldrich | Z672548-1EA | |
| Phospho-Tau (Ser202, Thr205) Monoclonal Antibody (AT8) | ThermoFisher | MN1020 | |
| Goat anti-Mouse Secondary Antibody, Texas Red-X | ThermoFisher | T862 | |
| Goat anti-Mouse Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher | A-11029 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Mounting medium | ThermoScientific | 28-600-42 | |
| Glass soverslip | |||
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM710 | |
| Imaging software ZEN 2012 Black Edition 11.0 | Zeiss | LSM710 | Software accompanies the Confocal Microscope |
| ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/download.html | |
| RGB Profile Tools macro | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/macros/tools/RGBProfilesTool.txt | |
| Commercial chemical quencher | Biotum | 23007 |
References
- Banerjee, B., Miedema, B. E., Chandrasekhar, H. R. Role of basement membrane collagen and elastin in the autofluorescence spectra of the colon. J Investig Med. 47 (6), 326-332 (1999).
- Terman, A., Brunk, U. T.
- Del Castillo, P., Llorente, A. R., Stockert, J. C. Influence of fixation, exciting light and section thickness on the primary fluorescence of samples for microfluorometric analysis. Basic Appl Histochem. 33 (3), 251-257 (1989).
- Ottis, P., Koppe, K., et al.
- Sun, Y., Chakrabartty, A. Cost-effective elimination of lipofuscin fluorescence from formalin-fixed brain tissue by white phosphor light emitting diode array. Biochem Cell Biol. 94 (6), 545-550 (2016).
- Davis, A. S., Richter, A., et al. Characterizing and Diminishing Autofluorescence in Formalin-fixed Paraffin-embedded Human Respiratory Tissue. J Histochem Cytochem. 62 (6), 405-423 (2014).
- Zimmermann, T., Rietdorf, J., Pepperkok, R. Spectral imaging and its applications in live cell microscopy. FEBS Lett. 546 (1), 87-92 (2003).
- Duong, H., Han, M. A multispectral LED array for the reduction of background autofluorescence in brain tissue. J Neurosci Methods. 220 (1), 46-54 (2013).
- Albeanu, D. F., Soucy, E., Sato, T. F., Meister, M., Murthy, V. N. LED arrays as cost effective and efficient light sources for widefield microscopy. PLoS One. 3 (5), 1-7 (2008).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Robertson, J. B., Zhang, Y., Johnson, C. H. Light-emitting diode flashlights as effective and inexpensive light sources for fluorescence microscopy. J Microsc. 236 (1), 1-4 (2009).
- Mackenzie, I. R. A., Neumann, M. Molecular neuropathology of frontotemporal dementia: insights into disease mechanisms from postmortem studies. J Neurochem. 138 (S1), 54-70 (2016).
- Kouri, N., Whitwell, J. L., Josephs, K. A., Rademakers, R., Dickson, D. W. Corticobasal degeneration: a pathologically distinct 4R tauopathy. Nat Rev Neurol. 7 (5), 263-272 (2011).
