Summary
والهدف من هذا البروتوكول هو السماح للكشف عن في فيفو قتل الخلية المستهدفة في نموذج مورين مستضد على حدة.
Abstract
المنهجيات الحالية لقتل محددة مستضد محدودة للاستخدام في المختبر أو تستخدم في نماذج الأمراض المعدية. ومع ذلك، هناك لا بروتوكول خصيصا لقياس محددة مستضد القتل دون عدوى. تم تصميم هذا البروتوكول ويصف أساليب للتغلب على هذه القيود بالسماح للكشف عن حدة مستضد قتل الخلية المستهدفة واسطة CD8+ تي الخلايا في فيفو. ويتم ذلك عن طريق دمج نموذج تطعيم بهدف المسمى كفسي تقليدية مما أسفر عن مصرع المقايسة. يسمح هذا المزيج الباحث لتقييم إمكانات CTL محددة مستضد مباشرة وبسرعة كما المقايسة لا يتوقف على نمو الورم أو الإصابة. وبالإضافة إلى ذلك، قراءات يرتكز على التدفق الخلوي وهكذا ينبغي أن تكون متاحة لمعظم الباحثين. يتم تحديد القيد الرئيسي للدراسة المخطط الزمني في فيفو غير الملائمة إلى الفرضية يجري اختبارها. الاختلافات في قوة مستضد والطفرات في خلايا تي التي قد تسفر عن الدالة عن فرق بحاجة إلى أن يقيم بعناية لتحديد الوقت الأمثل للحصاد الخلية والتقييم. وقد تم تحسين تركيز مناسب من الببتيد للتطعيم hgp10025-33 والبويضات257-264، ولكن كذلك أنه يلزم التحقق من الصحة الببتيدات الأخرى التي قد تكون أكثر ملاءمة لدراسة معينة. وعموما، هذا البروتوكول يسمح بتقييم سريع لقتل الدالة في فيفو ويمكن تكييفها مع أي مستضد معين.
Introduction
توجد بروتوكولات متعددة تقييم إمكانات CD8 (CTL) عن+ أو خلايا CD4+ تي خلية. يمكن أن يتم هذا التقييم سهولة في المختبر تحت ظروف خاضعة للرقابة1،،من23. وبالإضافة إلى ذلك، نماذج الأمراض المعدية، مثل لكمف، درست كلاسيكي CTL وظيفة عن طريق استخدام خلطات كفسي (إستر سوكسينيميديل اسيتات-(and 6) 5-كاربوكسيفلوريسسين) المسماة الخلايا المستهدفة حيث كفسيمرحبا-الخلايا المسماة نابض الببتيد وكفسيلو-المسمى المستهدفة يتم ترك الخلايا أونبولسيد. الخلايا ثم حقنها بنسبة 1:1 وتقييم للخسائر كفسيمرحبا-وصفت الأهداف نابض بالتدفق الخلوي4. واستخدمت نماذج اللقاح ورفض أيضا استراتيجيات مماثلة لتقييم في فيفو قتل بكلا CD8+ وخلايا CD4 خلايا+ T، فضلا عن ناغورني كاراباخ الخلايا5،6. هذا هو مقايسة قوية، ولكن يتطلب استخدام العوامل المعدية رئيس الجهاز المناعي قبل الحقن المستهدف.
هذا البروتوكول، من ناحية أخرى، يتطلب أي عدوى مسبقة من البلد المضيف، ويستخدم بدلاً من ذلك استراتيجية تطعيم رئيس الجهاز المناعي قبل الحقن المستهدف. يتكون هذا التطعيم من وضع المياه على أساس لقاح الببتيد الذي يتطلب توفير immunostimulatory كوكتيل دعا كوبا7، تتألف من مستقبلات مثل عدد القتلى 7 (TLR7) مؤثر (إيميقويمود كريم)، ومكافحة-CD40 ناهضة الأجسام المضادة، و interleukin-2 (إيل-2) مما يؤدي إلى التآزري مزيج من العوامل إيمونوستيمولاتوري للاستثارة فتيلة محددة الببتيد واستجابة مناعية قوية. على هذا النحو، يوفر هذا التحليل قراءات سريعة للدالة CTL كما تدار اللقاح جنبا إلى جنب مع الخلايا لتقييم الدالة إلا ثلاثة أيام قبل حقن الخلايا المستهدفة. وباﻹضافة إلى ذلك، فتيلة كوبا قوية بما يكفي أن قدرة قتل الخلية تي محددة مستضد معبي يمكن أن يرى بين ح 4 و 24 بعد الحقن.
هو تحديد القيد الرئيسي لهذا البروتوكول الجدول الزمني في فيفو للكشف عن القتل المستهدف غير الملائمة إلى antigen والفرضية يجري اختبارها. يجب إجراء تقييم دقيق، كالتغيرات في قوام مستضد، فضلا عن التعديلات الوراثية يجري اختبارها في خلايا تي يمكن أن يؤدي وظيفة CTL التفاضلية التي تتطلب الكشف عن توقيت مختلف للقتل المستهدف. وبالإضافة إلى ذلك، في حين تركيز مناسب من الببتيد للتلقيح قد تم الأمثل لسرطان الجلد البشرية مستضد glycopeptide 100 (hgp10025-33) و ovalbumin257-264 (البويضات257-264)8،9 ، استخدام نموذج مستضد آخر قد يكون أكثر ملاءمة لدراسة معينة تتطلب مزيدا من التحقق من الصحة. بسبب الاختلافات المتوقعة في المستضدات المستهدفة القدرة على حفز CTL المستجيب الدالة في تركيبة مع كوبا وصفها adjuvant، قد يكون الأمثل لايل-2 جرعة التركيز والجرعة التردد ضروري لتحقيق الهدف المنشود. وعموما، هذا البروتوكول يسمح بإجراء تقييم سريع لقتل الدالة في فيفو ويمكن تكييفها مع أي مستضد معين.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
عليها جميع الأساليب الموصوفة هنا "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (إياكوك) من جامعة تكساس MD أندرسون في مركز السرطان.
1. إعداد الببتيد للقاح
- حل الببتيد المجففة بالتبريد مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) بتركيز مناسب ودوامه لمدة 30 ثانية.
ملاحظة: ل hgp10025–33، يكون التركيز النهائي 1 ملغ/مل والبويضات257–264، تركيز النهائي 0.5 ملغ/مل. إعادة تشكيل الببتيد قبل الحقن. لا تقم بتخزين بعد إعادة تشكيل.
2-عزل سبلينوسيتيس من الماوس المحورة وراثيا
ملاحظة: يجب إجراء عزل الخلية من الطحال بطريقة عقيمة.
-
Euthanize الماوس المعدلة وراثيا OT-1 استخدام أسلوب الخنق2 CO المعتمدة وإزالة الطحال.
ملاحظة: يستخدم الماوس المعدلة وراثيا ملائمة في هذه الخطوة المحددة ببتيد الاختيار.- وضع الماوس على الجانب الأيمن. رذاذ الجانب الأيسر للماوس مع 70% إيثانول (EtOH). سحب الجلد باستخدام الملقط، وقطع الجلد باستخدام مقص الجراحية؛ ستكون مرئية داخل التجويف الصفاقى الطحال. بلطف قص فتح التجويف الصفاقى الوصول إلى الطحال. إزالة الطحال باستخدام الملقط.
-
تصنيف الطحال بوضعه في عامل تصفية 70 ميكرومتر في طبق بتري مع متوسط 2 مل (برنامج تلفزيوني مع 1% مصل بقرى الجنين (FBS)) وتحطيم الطحال مع نهاية المكبس.
- جمع في سبلينوسيتيس من صحن بيتري ومكان في أنبوب 50 مل مخروطية الشكل. أغسل صحن بيتري مع 5 مل متوسطة مرتين إلى جمع كافة الخلايا. إضافة المتوسطة يصل إلى 25 مل والطرد المركزي الخلايا لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة في 475 x ز.
- نضح الخلايا وريسوسبيند في 1 مل/لكل المخزن المؤقت لتحلل خلايا الدم الحمراء (RBC) الطحال. احتضان في درجة حرارة الغرفة للحد الأدنى 5 إضافة 10 مل من متوسط وأجهزة الطرد المركزي في درجة حرارة الغرفة في غ. س 475 ريسوسبيند بيليه في 10 مل متوسط وإزالة الأنقاض بتصفية تعليق خلية من خلال عامل تصفية 70 ميكرومتر إلى تنظيف 50 مل مخروطية الشكل.
-
حساب عدد الخلايا باستخدام تريبان الأزرق وهيموسيتوميتير. ريسوسبيند الخلايا في برنامج تلفزيوني لتركيز نهائي 106 -1006 خلايا/مل. للبويضات257–قتل، ريسوسبيند264 محددة في 106 خلايا/مل وعلى hgp100 مما أسفر عن مصرع، ريسوسبيند25–33 محددة في 1006 خلايا/مل.
- زيادة ونقصان الخلايا المتبقية في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق في 475 x زاي نضح المادة طافية وريسوسبيند في برنامج تلفزيوني الباردة 15 مل لغسل الخلايا. كرر الخطوة يغسل مرة أخرى. زيادة ونقصان الخلايا في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق في 475 x زاي نضح المادة طافية وريسوسبيند في برنامج تلفزيوني الباردة وفقا لحجم النهائي تحديد في الخطوة 2، 4.
- نقل تعليق خلية مفردة إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل والحفاظ على الجليد حتى الحقن إلى المستلم C57/BL6 الماوس.
3-حقن سبلينوسيتيس من الفئران المحورة وراثيا
- ضع الماوس C57/BL6 المستلم في ريسترينير مع الجانب الظهرية أعلى. رذاذ حقن المنطقة قاعدة الذيل مع كحول الأيزوبروبيل 70%. إدارة 100 ميليلتر من تعليق خلية مفردة (الباب 2) عن طريق الوريد الوريد ذيل باستخدام إبرة ز 27 مع الجانب مجسم مشطوف الحواف متقابلة لأعلى.
4-كوفاكس الإدارة
ملاحظة: إذا كان يتم حقن الخلايا في فترة ما بعد الظهر، كوبا ينبغي أن تدار في صباح اليوم التالي ضمن ح 18 من حقن الخلايا.
- ضع الماوس في مربع تخدير واضحة مع إيسوفلوراني 1-3%. بعد أن يتم تخديره تماما من الفئران، نقل الفئران إلى المخروطات يعلق على المتشعبة في قاعة التخدير. الحفاظ على ضبط النفس مع الجانب الظهرية حتى الفئران.
ملاحظة: يؤكد قرصه إصبع قصيرة للتحقق من استجابة انسحاب هو لم تحظ أنيسثيتيزيشن. القانون الاتحادي بتقييد استخدام isoflurane بناء على أمر الطبيب بيطري المرخص لها. - رذاذ حقن المنطقة قاعدة الذيل مع كحول الأيزوبروبيل 70%. حقن 100 ميليلتر من حل الببتيد (من القسم 1) تحت الجلد باستخدام إبرة ز 27 مع المحاقن اختراق 4-5 مم في منطقة قاعدة الذيل، الجانب المشطوف إبرة مواجهة.
ملاحظة: يتم تحصين الفئران في الجناح واحد بالحقن تحت الجلد عند القاعدة الذيل10. - حقن 100 ميليلتر CD40 مكافحة الأجسام المضادة (0.5 ملغ/مل الأسهم) الجانبي إلى موقع حقن اللقاحات.
- بعناية تطبيق imiquimod كريم 50 ملغ/الماوس على مواقع التطعيم. فرك كريم imiquimod على السطح حتى الكريم لم تعد مرئية ويتم امتصاصه تماما.
- حقن 100 ميليلتر من البروتين رحيل-2 100,000 وحدة دولية/مل إينترابيريتونيلي (القائمة) في منطقة البطن السفلي. مراقبة الفئران لمدة 5 دقائق بعد ما يتعافى تماما من التخدير.
ملاحظة: التجربة توقفت عند هذه النقطة لمدة 3 أيام.
5-عزل سبلينوسيتيس المستهدفة لوضع العلامات مع كفسي
ملاحظة: يجب إجراء عزل الخلية من الطحال بطريقة عقيمة.
- Euthanize الفئران C57BL/6 وفقا لأسلوب الخنق2 CO المعتمدة. إزالة spleen(s) كما في الخطوة 2.1.1. تصنيف الطحال وتغسل سبلينوسيتيس كما هو الحال في الخطوات 2.2.1-2.2.3. خلايا الدم الحمراء كما هو الحال في الخطوات 2، 3-2.3.2.
- إزالة الخلايا لعد استخدام هيموسيتوميتير وحساب لتركيز نهائي للخلايا في 106 خلايا/مل في حل كفسي العلامات (كما هو موضح في الخطوة 7). تدور الخلايا المتبقية في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق في 475 × المادة زاي أسبيراتي طافية.
6-الببتيد النبض للهدف سبلينوسيتيس
ملاحظة: الببتيد النبض يجب إجراء بطريقة عقيمة.
- ريسوسبيند الخلايا في 106 خلايا/مل في وسائط كاملة (RPMI 1640 وسائل الإعلام مع 10% FBS، 1% لالجلوتامين (L-جلن)، 1% البنسلين/ستربتوميسين (القلم/بكتيريا)). تقسيم الخلايا في أنابيب 2 (15 مل كونيكالس). قم بتسمية كل أنبوبة كنابض أو أونبولسيد.
-
إضافة الببتيد إلى الأنبوبة المسماة نابض. للبويضات257–264 النبض، إضافة 1 ميكروغرام/مل و hgp10025–33 النبض، إضافة 2 ميكروغرام/مل.
ملاحظة: تخضع الخلايا أونبولسيد في الحضانة نفسها كخلايا نابض فقط دون إضافة الببتيد.- احتضان خلايا + الببتيد في 37 درجة مئوية ح 1.
- إضافة 10 مل وسائط كاملة (RPMI 1640 وسائل الإعلام مع 10% FBS، 1% L-الجلوتامين (L-جلن)، 1% البنسلين/ستربتوميسين (القلم/بكتيريا)) لكل أنبوبة لغسل كل نابض وأونبولسيد الخلايا المستهدفة. تدور الخلايا المتبقية في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق في 475 × المادة زاي أسبيراتي طافية.
7-إعداد كفسي لوسم سبلينوسيتيس الهدف
-
تعد العلامات كفسي الحل خلال الخلية الغسيل في خطوة 6.3؛ سوف يكون المسمى الخلايا نابض كفسيمرحبا وأونبولسيد ككفسيلو. إعداد 1 مل من محلول وسم كفسي 106 خلايا.
ملاحظة: كفسي هي حساسة للضوء، وينبغي أن تكون محمية من الضوء في جميع الأوقات.- إعداد كفسيمرحبا -تسمية الوسائط بإضافة 1 ماي/مل كفسي (حل الأسهم 5 مم) لتركيز نهائي من 5 ميكرومتر/مل في الإعلام RPMI 1640 مع 2% FBS.
- إعداد كفسيلو -وسم وسائل الإعلام عن طريق إضافة 1 ماي/مل كفسي (0.5 مم حل الأسهم) لتركيز نهائي من 0.5 ميكرومتر/مل ربمي الوسائط 1640 مع 2% FBS.
8-وضع العلامات للهدف سبلينوسيتيس مع كفسي
ملاحظة: الوسم كفسي يجب إجراء بطريقة عقيمة.
- ريسوسبيند الخلايا الهدف نابض وأونبولسيد (من الخطوة 6.3) في 106 خلايا/مل كفسي تسمية الوسائط. ريسوسبيند الخلايا نابض مع استعداد كفسيمرحبا-تسمية الوسائط والخلايا أونبولسيد مع إعداد كفسيلو-وصف وسائل الإعلام.
- مزيج الخلايا والعلامات كفسي وسائل الإعلام بانعكاس لطيف أو دوامات. لا تخلط فورتيكسينج. احتضان خلايا والعلامات كفسي وسائل الإعلام في 37 درجة مئوية للحد الأدنى 15 ريمكس الخلايا كل 5 دقائق.
- إضافة 10 مل من وسائل الإعلام كاملة لكل الخلايا خلية تعليق وتدور في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق في غ س 475.
- نضح المادة طافية وريسوسبيند الخلايا في برنامج تلفزيوني الباردة 10 مل. تدور الخلايا عند 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق في 475 x ز.
- كرر الخطوة 8، 4.
- عد الخلايا ومزيج الببتيد-نابض، كفسيمرحبا-المسمى مع أونبولسيد، كفسيلو-تسمية الخلايا بنسبة 1:1 للحقن في الفئران المستفيدة. الاحتفاظ قاسمة 1 × 106 مختلطة الخلايا استخدامها لتقييم خط أساس تدفق الخلوي (المادة 11).
ملاحظة: هو الحجم النهائي لحقن 100 ميليلتر للماوس. العد النهائي خلية من خلايا 10e6. يجب أن يؤخذ في الاعتبار فقدان وحدة التخزين في المحاقن والإبر وينبغي أن تكون المقدرة بمبلغ 500 ميليلتر.
9-الحقن بالخلايا الهدف
ملاحظة: الاحتفاظ الخلايا المسماة كفسي محمية من الضوء قبل وأثناء الحقن بقدر الإمكان.
- ضع المتلقية الفئران C57BL/6 في ريسترينير مع الجانب الظهرية أعلى. رذاذ حقن المنطقة قاعدة الذيل مع كحول الأيزوبروبيل 70%. إدارة 100 ميليلتر من تعليق خلية واحدة فقط عن طريق الوريد الوريد الذيل مع الجانب مجسم مشطوف الحواف متقابلة لأعلى.
10-إعادة عزل الخلايا الهدف
ملاحظة: توقيت هذه الخطوة الحاسمة وتعتمد على سيتوتوكسيسيتي CTL وقوة مستضد التحفيز. تقييم لقتل البويضات257–264 هدف النبضي، يلزم الخلايا المقطوع 4-6 ح بعد الحقن. حيث تكون الخلايا المسماة كفسي الطحال الحساسة، وعملية الضوء في الظلام.
- Euthanize الفئران C57BL/6 المستفيدة وفقا لطريقة الخنق2 CO المعتمدة.
- إزالة spleen(s) كما في الخطوة 2.1.1. تصنيف الطحال وتغسل سبلينوسيتيس كما هو الحال في الخطوات 2.2.1-2.2.3. خلايا الدم الحمراء كما هو الحال في الخطوات 2، 3-2.3.2.
- ريسوسبيند الخلايا في 1 مل fluorescence تنشيط الخلية الفرز المخزن المؤقت (الأصول) (1% جيش صرب البوسنة + برنامج تلفزيوني) للتقييم بالتدفق الخلوي.
11-النابضة المنطق لتحديد نشاط CTL بالتدفق الخلوي
-
إجراء تقييم لنشاط CTL باستخدام بروتوكول قياسي تدفق الخلوي. الحصول على الخلايا باستخدام قناة فيتك في سيتوميتير تدفق مع ليزر 488 نانومتر للإثارة11.
- بوابة على العيش لمفاوية استخدام معلمات مبعثر (SSC) الجانب مقابل المبعثر إلى الأمام (FSC). سوبجيت داخل بوابة اللمفاويات الحية لمجموع السكان كفسي إيجابية.
ملاحظة: حقن الخلايا المسماة كفسي سوف يشكلون مجموعة فرعية صغيرة من الخلايا اللمفية الإجمالي الحالي في الطحال. يجب أن تظهر الخلايا إيجابية كسفي اثنين من السكان متميزة بمقياس سجل. - استخدام تنسيق الرسم بياني لتحديد النسبة المئوية من أونبولسيد (اليسار الذروة، كفسيلو) ونابض (حق الذروة، كفسيمرحبا) السكان. فقدان كفسيمرحبا الخلايا يشير إلى نشاط CTL مستضد على حدة.
- بوابة على العيش لمفاوية استخدام معلمات مبعثر (SSC) الجانب مقابل المبعثر إلى الأمام (FSC). سوبجيت داخل بوابة اللمفاويات الحية لمجموع السكان كفسي إيجابية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
قبل حقن الخلايا المسماة كفسي المستهدفة، يتم تشغيل الخليط خلية 1:1 على سيتوميتير تدفق لتحديد الترددات الأساس وعلى السواء كفسيمرحبا كفسيلو الخلايا المستهدفة. الشكل 1 A يوضح استراتيجية النابضة للكشف عن التغيرات في السكان كفسي، بوابة أولية باستخدام معلمات منتدى التعاون الأمني، والتعاون بين بلدان الجنوب. ثم يتم سوبجاتيد مجموع الخلايا كفسي الإيجابية قبل تقييم التغيرات في التردد، كما هذا السكان صغيرة نسبيا بالمقارنة مع سبلينوسيتيس الذاتية غير مسمى. التواتر النسبي كفسيمرحبا كفسيلو السكان وهو المحسوب بتحديد مجموع السكان كفسي إيجابية 100%. هذا التحليل يمكن أن يتم استخدام تنسيق ارسم المدرج التكراري أو نقطة. ويرد مثال على التواتر النسبي للسكان كفسي قبل الحقن في الشكل 1ب. هذه النسبة نادراً ما سيكون بالضبط 1:1 ولكن ينبغي أن تكون معقولة إغلاق. ضرورة فتيلة كوبا يرد في الشكل 1ج حيث لا قتل antigen نابض، يلاحظ كفسيمرحبا الخلايا المستهدفة في 24 ساعة بعد الحقن. الشكل 1 يوضح د قتل الفعال للمستضد نابض، كفسيمرحبا-وصفت الخلايا المستهدفة كما الذروة الذي لوحظ قبل الحقن تقريبا غير مكتشفة وتحول النسبة كبيرة من 50% للكشف عن 1%. ويوضح الشكل أيضا حركية مستضد نابض، كفسيمرحبا-المسمى قتل الخلية المستهدفة بتقييم الخسائر في هذه الفئة من السكان في ح 6 و 24 ساعة بعد الحقن.
رقم 1: مقارنة بين الخلايا المسماة في الأساس وبعد حقن الخلايا الهدف المسمى كفسي. (أ) يظهر استراتيجية النابضة لتقييم دالة CTL. باختصار، هي بوابات لمفاوية يعيش استخدام مبعثر إلى الأمام (FSC) مقابل الجانب مبعثر (SSC) معلمات. يتم سوبجاتيد مجموع كسفي-إيجابية الخلايا داخل بوابة الخلية الحية. نسبة كفسيمرحبا وكفسيلو يستند على تواترها كل منهما ضمن مجموع كفسي إيجابية. كفسي التالية (ب) وضع العلامات، تمتزج 1:1 الخلايا الهدف وتقييم لنسبة كفسيمرحبا ولو الخلايا كفسي بالتدفق الخلوي. الأرقام تشير إلى تردد قمم كل منهما في كل من الرسم بياني (يسار) ومقابل كفسي SSC دوت الأرض تنسيقات (يمين). (ج) وهذا يدل على عدم وجود الخلايا الهدف قتل دون التطعيم السابقة مع نظام كوبا. وكانت سبلينوسيتيس المقطوع 24 ساعة بعد الحقن. (د) وهذا يدل على قتل نابض مستضد كفسيمرحبا الخلايا الهدف في ح 6 (أعلى الرسوم البيانية) وآخر 24 ساعة (أسفل الرسوم البيانية) الحقن. الأرقام تشير إلى تواتر قمم المسمى كفسي على كلا من الرسم البياني (يسار) ومقابل كفسي SSC دوت ارسم الشكل (يمين). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في حين أن هذا البروتوكول مباشرة، وهناك بعض الخطوات الحاسمة التي يجب أن يتم بعناية. فتيلة كوبا عقب حقن محددة مستضد تي-خلية يجري اختبار ضروري لمعرفة أي قتل الأهداف نابض. وفي حين أنه من الممكن أن التطعيم ضد كوبا المستندة إلى الماء يخلق حالة التهابات حادة، لمرحلة التهاب مزمن، الاستعاضة عن وضع المياه على أساس قصير الأجل مع نهج القائم على النفط مستضد بطء الإفراج قد تنتج أفضل نتائج7،12.
وبالإضافة إلى ذلك، كفسي تسمية الخلايا المستهدفة بعد مستضد النبض يجب أن يكون موحدا لقراءات قياس تدفق مثالي. تم العثور على العلامات كفسيمرحبا مع 5 ميكرومتر وكفسيلو مع 0.5 ميكرومتر يكون مثاليا في هذا النظام لتوفير سجل فرق في المجموعات السكانية التي يمكن تمييزها بسهولة.
هذا البروتوكول بسيط لتعديل نظام مستضد محدد يجري اختبارها. أولاً، ينبغي تأكيد تركيز الببتيد تدار كجزء من كوبا. هو طريقة بسيطة لتحديد هذا التركيز المناسب تلقيح وتتبع التوسع في خلايا تي محددة مستضد وحقن الدم. في هذه الحالة، يتطلب مستضد ضعيفة (hgp10025-33) ضعفي الببتيد مستضد قوية (257–البويضات264). تم التحقق من صحتها التركيزات المستخدمة في هذا البروتوكول سيكون نقطة انطلاق معقولة لاختبار مولدات أخرى تستند إلى قوة التحفيز. وسيكون نقطة واحدة للتعديل لتحصين ببساطة الماوس البرية من نوع مع مستضد الاهتمام تليها الببتيد نابض أهدافا لتقييم دالة CTL. غير أن هذا التعديل سوف تعتمد على تنشيط وتوسيع نطاق الاستجابات محددة مستضد الذاتية وحتى توقيت نقل الخلية الهدف سيحتاج يرجح أن تحدث 7-14 يوما بعد التحصين. وباﻹضافة إلى ذلك، قتل محددة مستضد قد كثيرا خفض المستوى ومقارنة بمراعاتها عند نقل الخلايا المحورة وراثيا. تحذير مع هذا التعديل أن مستوى استجابة CTL للهدف قد يكون منخفض جداً الكشف عنها.
بالإضافة إلى مقدار مستضد المطلوبة فتيلة تي خلية، يجب أن يكون توقيت إعادة عزل الخلايا المسماة كفسي الهدف الأمثل لفرضية معينة. تعديلات ليجري تي خلية اختبار تلك النتيجة في فرق قتل قدرات قد تتطلب تعديلات في التوقيت إعادة العزلة. تي خلية مع دالة قتل المحسن ستحتاج إلى أهداف تقييم أسرع بكثير من نظيرتها البرية من نوع. وينبغي استكشاف هذه الشخصية الحركية بعناية لتحديد تيميبوينت الأمثل للتصدي لاختبار الفرضية. بشكل عام، وقد وجدنا هذا تتفاوت بين 4 و 24 ساعة بعد حقن الخلايا المستهدفة.
واحد الحد من المقايسة أن خلايا المستجيب لا تحفز مزمن للحث على إقامة دولة منهكة. ولذلك، الدالة CTL مقيد إلى خلايا المستجيب تفعيلها مؤخرا. فمن الممكن أن يمكن تعديل هذا الأسلوب لتقييم دالة استدعاء قدرة السكان أو قتل الذاكرة من مجموعة فرعية، مزمن تنشيط خلية T حدة مستضد التي ستكون مثيرة للاهتمام لتطبيقات في المستقبل.
يسمح هذا الأسلوب لاختبار CTL الدالة في فيفو للكشف السريع في فيفو قتل أن يتغلب على بعض أوجه القصور في في المختبر وضع. نظام المناعة سليمة في مكان وفتيلة الخلايا T المنقولة عبر طريقة كوبا تعتمد على العرض الببتيد والتحفيز المشارك بخلايا مستضد تقديم الذاتية. خلافا لغيرها في فيفو قتل فحوصات، لا يتطلب هذا الأسلوب بعدوى أو وجود ورم هدفا. ومع ذلك، إضافة هدفا الورم سيتيح المقارنة إضافية ويمكن أن يضاف إلى الفحص قبل حقن الخلايا T مستضد على حدة والإدارة كوبا للتطبيقات المستقبلية لهذا الأسلوب.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
هذا العمل تدعمه أبحاث المعاهد الوطنية للصحة (A1R03AI120027 (RN) و 1R21AI20012 (RN)) ومنح البحوث المؤسسية (RN)، بدء منح (RN)، ومنح البذور MD أندرسون وزارة الجنسية والهجرة (RN).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6 to 12 week old female C57BL/6 mice | Charles River | 027 | C57 Black 6 mice |
| OT-1 6-12 week old female mice | Jackson Labs | 003831 | |
| hgp10025–33 | CPCScientific | 834139 | KVPRNQDWL |
| OVA 257–264 | CPCScientific | MISC-012 | SIINFEKL |
| Imiquimod cream 5% | Fougera | 51672-4145-6 | Aldara Cream |
| CD40-specific mAb | BioXcell | BE0016-2 | clone FGK4.5 |
| rhIL-2 protein | Hoffman LaRoche Inc | 136 | Recombinant human IL-2 protein |
| 70% isopropyl alcohol Prep | Kendall | S-17474 | |
| PBS | Life Technologies | 10010-023 | Phosphate Buffered Saline |
| FBS | Life Technologies | 26140-079 | fetal bovine serum |
| RBC lysis buffer | Life Technologies | A10492-01 | red blood cell lysis buffer |
| RPMI 1640 Media | Life Technologies | 11875119 | |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030081 | |
| Pen/Strep | Life Technologies | 15140122 | penicillin/streptomycin |
| CFSE | Life Technologies | C34554 | 5-(and 6)-Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A4503 | |
| 1.5 mL MCT graduated natural | Fisher | 05-408-129 | microcentrifuge tube |
| 70% ethanol | Fisher | BP8201500 | EtOH |
| Trypan blue solution, 0.4% | Life Technologies | 15250-061 | |
| Hemocytometer | Fisher | 267110 | |
| 27 gauge needle | BD | 305109 | |
| 1 mL syringe | BD | 309659 |
References
- Liu, L., et al. Visualization and quantification of T cell-mediated cytotoxicity using cell-permeable fluorogenic caspase substrates. Nat Med. 8 (2), 185-189 (2002).
- Wherry, E. J., et al. Lineage relationship and protective immunity of memory CD8 T cell subsets. Nat Immunol. 4 (3), 225-234 (2003).
- He, L., et al. A sensitive flow cytometry-based cytotoxic T-lymphocyte assay through detection of cleaved caspase 3 in target cells. J Immunol Methods. 304 (1-2), 43-59 (2005).
- Barber, D. L., Wherry, E. J., Ahmed, R. Cutting edge: rapid in vivo killing by memory CD8 T cells. J Immunol. 171 (1), 27-31 (2003).
- Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. The use of fluorescent target arrays for assessment of T cell responses in vivo. J Vis Exp. (88), e51627 (2014).
- Johansson, S., et al. Natural killer cell education in mice with single or multiple major histocompatibility complex class I molecules. J Exp Med. 201 (7), 1145-1155 (2005).
- Hailemichael, Y., et al. Persistent antigen at vaccination sites induces tumor-specific CD8(+) T cell sequestration, dysfunction and deletion. Nat Med. 19 (4), 465-472 (2013).
- Overwijk, W. W., et al. Tumor regression and autoimmunity after reversal of a functionally tolerant state of self-reactive CD8+ T cells. J Exp Med. 198 (4), 569-580 (2003).
- Cho, H. I., Celis, E. Optimized peptide vaccines eliciting extensive CD8 T-cell responses with therapeutic antitumor effects. Cancer Res. 69 (23), 9012-9019 (2009).
- Ya, Z., Hailemichael, Y., Overwijk, W., Restifo, N. P. Mouse model for pre-clinical study of human cancer immunotherapy. Curr Protoc Immunol. 108, 21-43 (2015).
- Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types. J Vis Exp. (94), (2014).
- Durward, M., Harms, J., Splitter, G. Antigen specific killing assay using CFSE labeled target cells. J Vis Exp. (45), (2010).
