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Immunology and Infection

在体内应用免疫模型检测抗原特异性 T 细胞细胞功能的试验

Published: November 28, 2017 doi: 10.3791/56255
Automatic Translation
*1, *1, 2,3, 2
1Department of Melanoma Medical Oncology, University of Texas MD Anderson Cancer Center, 2Department of Immunology, University of Texas MD Anderson Cancer Center, 3Department of Radiation Oncology, The Second Hospital of Jilin University
* These authors contributed equally

Summary

该协议的目标是允许检测在小鼠模型中的靶细胞的体内抗原特异性杀伤。

Abstract

目前用于抗原特异性致死的方法仅限于在感染性疾病模型中使用或应用于体外。然而, 没有一项专门用于测量不感染抗原特异的杀伤的协议。本协议设计并描述了克服这些限制的方法, 允许通过 CD8+ T 细胞体内检测目标细胞的抗原特异性杀伤。这是通过将疫苗接种模型与传统的 CFSE 标靶杀伤试验结合起来完成的。这种结合使研究人员能够直接和快速地评估抗原特异的 CTL 电位, 因为这种检测不依赖于肿瘤的生长或感染。此外, 读数是基于流式细胞仪, 因此应该容易接近大多数研究员。该研究的主要限制是确定适合于所测试的假设的时间轴在体内。在 T 细胞的抗原强度和突变的变化, 可能导致差异细胞功能需要仔细评估, 以确定最佳时间的细胞收获和评估。对于 hgp10025-33和卵子257-264, 已优化了用于疫苗接种的适当浓度的肽, 但对于可能更适合于特定研究的其他肽, 则需要进一步验证。总的来说, 该协议允许快速评估杀死功能在体内, 可以适应任何给定的抗原。

Introduction

存在多个协议来评估 CD8+或 CD4+ T 单元格的细胞 (CTL) 电位。这种评估可以很容易地做在体外在受控条件下1,2,3。此外, 传染病模型, 如 LCMV, 通过使用差异 CFSE (5-(和 6)-羧基双乙酸琥珀酰亚胺酯) 对 CTL 功能进行了经典的检查, 标记为 CFSEhi标记的单元格的目标单元格脉冲与多肽和 CFSElo标记的目标细胞是左 unpulsed。然后, 以1:1 的比率注入细胞, 并通过流式细胞仪4对 CFSEhi标记的脉冲目标的丢失进行评估。疫苗和排斥模型也使用类似的策略, 评估的在体内杀害的 CD8+和 CD4+ T 细胞以及 NK 细胞5,6。这是一个强有力的化验, 但需要使用的传染性药物, 在靶注射前免疫系统的首要。

这个协议, 另一方面, 不需要事先感染的主机, 而是利用疫苗接种策略, 以在目标注射前的免疫系统的首要。这种疫苗接种是由多肽疫苗的水基配方, 需要提供一种免疫鸡尾酒称为 covax7, 由 Toll 样受体 7 (TLR7) 激动剂 (莫特霜), 竞赛 anti-CD40抗体和 interleukin-2 (IL-2) 导致免疫剂的协同组合, 以诱导肽特异性启动和强健的免疫应答。因此, 这种化验提供了一个 CTL 功能的快速读数, 因为疫苗是在注射靶细胞前的三天内与细胞一起进行功能评估的。此外, covax 启动足够强, 注射后的抗原特异性 T 细胞的杀伤能力可以看到4和24小时。

该协议的主要限制是确定时间轴在体内检测目标杀死, 这是适当的抗原和假设被测试。必须进行仔细的评估, 因为抗原强度的变化以及在 T 细胞中测试的基因改变可能会导致不同的 CTL 功能, 这就需要对目标杀伤的定时检测。此外, 虽然适当浓度的肽接种已优化人类黑色素瘤抗原糖 100 (hgp10025-33) 和蛋白257-264 (卵257-264)8,9 ,使用另一个可能更适合于某项研究的抗原模型将需要进一步验证。由于预期的目标抗原的能力, 以刺激 CTL 效应功能与 covax 作为佐剂, 优化 IL-2 剂量浓度和剂量频率可能是必不可少的, 以达到预期的目标。总的来说, 该协议允许快速评估杀死功能在体内, 可以适应任何给定的抗原。

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Protocol

这里描述的所有方法都得到了德克萨斯大学安德森癌症中心的机构动物保育和使用委员会 (IACUC) 的批准。

1. 疫苗用肽的制备

  1. 将冻干肽与磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 溶于三十年代的适当浓度和涡旋。
    注: 对于 hgp10025-33, 最终浓度为1毫克/毫升, 对于卵子257-264, 最终浓度为0.5 毫克/毫升。注射前重组肽。重建后不要存储。

2. 转基因小鼠脾的分离

注意: 细胞与脾脏的分离必须以不育的方式进行。

  1. 安乐 OT-1 转基因小鼠使用经批准的 CO2窒息法并切除脾脏。
    注意: 在这一步中, 使用合适的转基因小鼠来选择特定的肽。
    1. 将鼠标放在右侧。用70% 乙醇 (乙醇) 喷洒鼠标左侧。用钳子拉起皮肤, 用外科剪刀切开皮肤;脾脏在腹膜腔内可见。轻轻切开腹膜腔, 进入脾脏。用镊子取出脾。
  2. 将脾脏放在一个70µm 过滤器中, 用2毫升培养基 a (PBS 1% 胎牛血清 (FBS)), 用柱塞末端粉碎脾脏。
    1. 从培养皿中收集脾, 并在50毫升锥形管中放置。用两次5毫升培养基冲洗培养皿, 收集所有细胞。加入培养基 A 至25毫升, 在室温下离心5分钟, 475 x g。
  3. 在1毫升/每脾红血球 (RBC) 裂解缓冲液中吸出细胞和重。室温孵育5分钟. 在室温下加入10毫升的培养基 a 和离心机, 在 475 x g. 重在10毫升中 a 的颗粒, 并通过过滤细胞悬浮通过一个70µm 过滤到一个干净的50毫升圆锥。
  4. 使用台盼蓝和例计数细胞。PBS 中的重细胞最终浓度为 106 -1006单元/mL。对于卵子257-264特定的杀戮, 重在 106单元/mL 和为 hgp10025-33特定的杀戮, 重在 1006单元/ml。
    1. 在室温下旋转剩余的细胞5分钟, 475 x g. 在15毫升冷 PBS 中吸取上清和重以洗涤细胞。再重复一次洗涤步骤。在室温下旋转细胞5分钟, 475 x g. 根据步骤2.4 中确定的最终体积, 在冷 PBS 中吸取上清和重。
    2. 将单细胞悬浮液转移到1.5 毫升离心管上, 并将其保持在冰上直到注射入受体 C57/BL6 鼠。

3. 转基因小鼠注射脾

  1. 将接受 C57/BL6 的老鼠放在抑制剂上, 背侧向上。喷淋尾基区与70% 异丙醇。管理100µL 单细胞悬架 (第2节) 静脉注射到尾部静脉使用27克针与斜面面朝上。

4. Covax 行政

注: 如果在下午注射细胞, covax 应在第二天早上18小时内进行细胞注射。

  1. 将鼠标放在一个透明的麻醉箱中, 1-3% 异氟醚。小鼠完全麻醉后, 将小鼠转移到麻醉室中附着在歧管上的鼻锥。将小鼠的背侧保持克制。
    注: 麻醉被确认为一个简短的脚趾捏, 以验证撤回反应没有被诱发。联邦法律限制异氟醚的使用顺序的特许兽医。
  2. 喷淋尾基区与70% 异丙醇。注入100µL 的肽溶液 (从1节) 皮下注射使用27克针与注射器穿透 4-5 毫米进入尾部基地区域, 针锥面朝上。
    注意: 小鼠在一个侧面接种了皮下注射在尾部的底部10。
  3. 注射100µL anti-CD40 抗体 (0.5 毫克/毫升的股票) 侧向疫苗注射场。
  4. 小心应用莫特霜50毫克/鼠标在疫苗接种点。在表面擦莫特奶油, 直到奶油不再可见并完全吸收。
  5. 在下腹区注射100µL 10万毫升 rhIL-2 蛋白腹腔 (ip)。观察小鼠5分钟后, 他们完全恢复从麻醉。
    注: 在这一点上, 实验暂停3天。

5. CFSE 标靶脾的分离

注意: 细胞与脾脏的分离必须以不育的方式进行。

  1. 根据批准的 CO2窒息方法安乐 C57BL/6 小鼠。移除脾脏, 如步2.1.1。将脾脏和洗涤脾的步骤 2.2.1 2.2.3。溶解红血球, 如步骤 2.3-2.3.2。
  2. 移除使用例计数的单元格, 并在 CFSE 标记解决方案 (步骤7中描述) 中计算 106单元/mL 的最后浓度的单元格。在室温下旋转剩余的细胞5分钟, 在 475 x g。

6. 靶脾的多肽脉冲

注: 多肽脉冲必须以无菌的方式进行。

  1. 重细胞在 106细胞/毫升在完整的媒体 (RPMI 1640 媒体与 10% FBS, 1% l-谷氨酰胺 (l-酰), 1% 青霉素/链霉素 (笔/链球菌))。将细胞分成2管 (15 毫升 conicals)。将每个管的标签为脉冲或 unpulsed。
  2. 将肽添加到标有脉冲的管中。对于卵子257-264脉冲, 添加1µg/ml, 并为 hgp1002533脉冲, 添加2µg/ml。
    注: unpulsed 细胞与脉冲细胞进行相同的孵育, 而不增加肽。
    1. 孵育细胞 + 肽在37° c 为 1 h。
  3. 添加10毫升的完整媒体 (RPMI 1640 媒体与 10% FBS, 1% l-谷氨酰胺 (l-酰), 1% 青霉素/链霉素 (笔/链球菌)), 以清洗两个脉冲和 unpulsed 靶细胞。在室温下旋转剩余的细胞5分钟, 在 475 x g。

7. 用于标记目标脾的 CFSE 的制备

  1. 在步骤6.3 中的细胞洗涤过程中准备 CFSE 标记溶液;脉冲单元格将被标记为 CFSEhi , unpulsed 为 CFSElo。为 106单元准备1毫升的 CFSE 标记解决方案。
    注意: CFSE 是轻的敏感和应该保护免受光在任何时候。
    1. 准备 CFSEhi -通过添加 1 uL/ml CFSE (5 毫米的库存解决方案) 为最终浓度为5µM/毫升在 RPMI 媒体1640与 2% FBS。
    2. 准备 CFSElo -通过添加 1 uL/ml CFSE (0.5 毫米的库存解决方案) 为最终浓度为0.5 µM/毫升 RPMI 媒体1640与 2% FBS。

8. 用 CFSE 标记目标脾

注: CFSE 标签必须以无菌的方式进行。

  1. 重脉冲和 unpulsed 目标单元格 (从步骤 6.3) 到 106单元格/mL CFSE 标记介质。重用准备好的 CFSEhi标记介质和带有准备好的 CFSElo标记介质的 unpulsed 单元进行脉冲电池的使用。
  2. 混合细胞和 CFSE 标签媒体通过温和的反转或旋转。不要由涡流混合。孵育细胞和 CFSE 标记介质在37° c 15 min. 混合细胞每5分钟。
  3. 在室温下将10毫升的完整介质添加到每个细胞悬浮和旋转细胞中, 5 分钟, 475 x g。
  4. 在10毫升冷 PBS 中抽吸上清和重细胞。旋转细胞在4° c 为5分钟在 475 x g。
  5. 重复步骤8.4。
  6. 计数的细胞和混合肽脉冲, CFSEhi-标记为 unpulsed, CFSElo-标记的细胞在1:1 的比率注射到受体小鼠。将分 1x 106混合单元用于基线流式细胞仪评估 (第11节)。
    注: 注射的最终体积为每只老鼠100µL。最后的细胞计数是10e6 细胞。需要考虑到注射器和针头的体积损失, 估计为500µL。

9. 注射靶细胞

注意: 在注射之前和期间尽量保持 CFSE 标记的细胞免受光的保护。

  1. 将受体 C57BL/6 的老鼠放在抑制剂, 背侧向上。喷淋尾基区与70% 异丙醇。将100µL 的单细胞悬浮液静脉注射到尾静脉, 并朝上。

10. 目标细胞的重新隔离

注意: 这一步的时间是关键的, 依赖于 CTL 的细胞毒性和刺激抗原的强度。为了评估杀死一个卵子257-264脉冲目标, 需要在注入后 4-6 小时内捕获细胞。由于 CFSE 标记细胞是轻的敏感, 过程脾脏在黑暗中。

  1. 根据批准的 CO2窒息方法, 安乐接受者 C57BL/6 小鼠。
  2. 移除脾脏, 如步2.1.1。将脾脏和洗涤脾的步骤 2.2.1 2.2.3。溶解红血球, 如步骤 2.3-2.3.2。
  3. 重细胞在1毫升荧光活化细胞分选 (外地) 缓冲 (1% BSA + PBS) 的评估流式细胞仪。

11. 用流式细胞仪测定 CTL 活性的浇注逻辑

  1. 使用标准流式细胞仪协议对 CTL 活动进行评估。使用 488 nm 激光器的流式细胞仪上的 FITC 通道获取单元, 用于激发11。
    1. 使用前向散射 (FSC) vs 侧散射 (SSC) 参数的活淋巴细胞门。Subgate 在活淋巴细胞门之内为总 CFSE 阳性人口。
      注: 注射 CFSE 标记的细胞将构成脾脏中总淋巴细胞的一个小子集。CSFE 阳性细胞应在对数刻度上显示为两个不同的种群。
    2. 使用直方图格式确定 unpulsed (左峰值、CFSElo) 和脉冲 (右峰值、CFSEhi) 填充的百分比。CFSEhi单元格的丢失指示特定于抗原的 CTL 活动。

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Representative Results

在注射 CFSE 标记的靶细胞之前, 在流式细胞仪上运行1:1 单元混合物, 以确定 CFSEhi和 CFSElo目标单元格的基线频率。图 1A显示了用于检测 CFSE 种群变化的浇口策略, 使用 FSC 和 SSC 参数进行初始化。在评估频率变化之前, 总的 CFSE 阳性细胞 subgated, 因为相对于未标记的内生脾, 这个种群的数量比较小。CFSEhi和 CFSElo填充的相对频率是通过将总 CFSE 阳性总体值设置为100% 来计算的。这种分析可以使用直方图或点图格式来完成。在图 1B中显示了在注入之前 CFSE 填充的相对频率的一个示例。这一比例将很少是刚好 1:1, 但应该相当接近。covax 启动的必要性如图 1C中所示, 在 24 h post 注入时观察到没有杀死抗原脉冲、CFSEhi靶细胞。图 1D演示有效杀灭抗原脉冲、CFSEhi标记的目标单元格, 因为在注入之前观察到的峰值几乎未被发现, 并且该比率从50% 到1% 的检测被戏剧性地转移。该图还显示了抗原脉冲的动力学, CFSEhi标记的目标细胞杀死通过评估这一人群的损失在6小时和 24 h 后注射。

Figure 1
图 1:比较基线上标记的单元格, 并在注入 CFSE 标记的目标单元格之后进行.(A) 显示了 CTL 功能评估的浇口策略。简单地, 活淋巴细胞采用前向散射 (FSC) vs 侧散射 (SSC) 参数进行封闭。总 CSFE 阳性细胞在活细胞门内 subgated。CFSEhi和 CFSElo的比率基于它们各自在总 CFSE 阳性总体中的频率。(B) 在 CFSE 标记后, 目标单元格混合 1:1, 并通过流式细胞仪对 CFSEhi和 CFSElo单元格的比率进行评估。数字表明, 在直方图 (左) 和 CFSE vs SSC 点情节 (右) 格式各自的峰值频率。(C) 这表明, 没有预先接种 covax 方案的目标细胞没有被杀死。脾在注射后24小时收获。(D) 这说明了在 6 h (top 图) 和 24 h (底图) 后注入的抗原脉冲 CFSEhi目标单元的杀伤。这些数字表示 CFSE 标记的峰值在直方图 (左) 和 CFSE vs SSC 点图 (右) 格式的频率。请单击此处查看此图的较大版本.

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Discussion

虽然该协议很简单, 但还有一些关键步骤必须仔细执行。covax 注射后的抗原特异性 T 细胞被测试是必要的, 看到任何杀害的脉冲目标。虽然水基 covax 疫苗可能造成急性炎症状态, 为慢性炎症阶段, 取代短命的水基配方与缓慢抗原释放油的方法可能会产生更好的结果7,12。

此外, 对于理想的流式细胞仪, 在抗原脉冲后的靶细胞的 CFSE 标记必须是一致的。在该系统中, CFSEhi的标记为5µM, CFSElo与0.5 µM 被发现是理想的, 以便在易于区分的群体中提供日志差异。

该协议是简单的修改对特定的抗原系统进行测试。首先, 应确认作为 covax 的一部分的肽的浓度。一个简单的方法来确定这种适当的浓度是接种和跟踪注射, 抗原特异性 T 细胞在血液中的扩展。在这种情况下, 弱抗原 (hgp10025-33) 需要两倍多肽作为强抗原 (卵子257264)。本协议中使用的验证浓度是根据刺激强度测试其他抗原的一个合理起点。一个修改的点是简单地免疫野生型小鼠与抗原的兴趣, 其次是肽脉冲靶评价 CTL 功能。然而, 这种改变将依赖于激活和扩大内源性抗原特异的反应, 因此, 目标细胞转移的时间可能需要发生 7-14 天后免疫接种。此外, 与转基因 T 细胞的转移相比, 抗原特异性致死的水平可能会大大降低。此修改的一个警告是, 对目标的 CTL 响应级别可能过低, 无法检测到。

除了 T 细胞启动所需的抗原量外, CFSE 标记的靶细胞 re-isolation 的定时也必须针对给定的假设进行优化。对被测试的 T 细胞的修改, 导致不同的杀伤能力可能需要调整 re-isolation 的时间。一个具有增强的杀伤功能的 T 细胞需要有比它的野生型对手更快的评估目标。这一动力学剖面应仔细探索, 以确定最佳的 timepoint, 以解决被测试的假说。一般情况下, 我们发现这是变化的4和24小时后注射的目标细胞。

该方法的一个局限性是, 效应细胞没有被长期刺激, 以诱发一个疲惫的状态。因此, CTL 函数仅限于最近激活的效应单元。这是可能的, 这种方法可以修改, 以评估回忆功能的记忆群体或杀伤能力的慢性活化抗原特异性 T 细胞子集, 这将是有趣的未来的应用。

这种测试 CTL 功能的方法在体内允许快速检测在体内杀死, 克服了体外设置的一些限制。一个完整的免疫系统到位, 并通过 covax 方法的转移 T 细胞启动依赖于肽表达和刺激内源性抗原呈递细胞。不像其他的在体内杀死化验, 这种方法不需要感染或存在的肿瘤靶。然而, 增加一个肿瘤靶将提供一个额外的比较器, 并可以添加到分析之前, 注射抗原特异性 T 细胞和 covax 管理的未来应用这种方法。

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

这项工作得到 NIH 研究 (A1R03AI120027 (rn) 和 1R21AI20012 (rn)), 机构研究补助金 (rn), 启动补助金 (rn) 和 MD 安德森 CIC 种子补助金 (rn) 的支持。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6 to 12 week old female C57BL/6 mice  Charles River 027 C57 Black 6 mice
OT-1 6-12 week old female mice  Jackson Labs 003831
hgp10025–33  CPCScientific 834139 KVPRNQDWL
OVA 257–264  CPCScientific MISC-012 SIINFEKL
Imiquimod cream 5%  Fougera 51672-4145-6 Aldara Cream
CD40-specific mAb  BioXcell BE0016-2 clone FGK4.5
rhIL-2 protein  Hoffman LaRoche Inc 136 Recombinant human IL-2 protein
70% isopropyl alcohol Prep  Kendall S-17474
PBS Life Technologies 10010-023 Phosphate Buffered Saline
FBS Life Technologies 26140-079 fetal bovine serum
RBC lysis buffer  Life Technologies A10492-01 red blood cell lysis buffer
RPMI 1640 Media Life Technologies 11875119
L-Glutamine  Life Technologies 25030081
Pen/Strep Life Technologies 15140122 penicillin/streptomycin
CFSE Life Technologies C34554 5-(and 6)-Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester
Bovine serum albumin (BSA) Sigma  A4503
1.5 mL MCT graduated natural  Fisher 05-408-129 microcentrifuge tube
70% ethanol Fisher BP8201500 EtOH
Trypan blue solution, 0.4%   Life Technologies 15250-061
Hemocytometer Fisher 267110
27 gauge needle BD 305109
1 mL syringe BD 309659

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References

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免疫学 问题 129 细胞功能 CD8+ T 细胞,体内化验 肽疫苗接种 CFSE 标记 急性反应
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Haymaker, C. L., Hailemichael, Y.,… More

Haymaker, C. L., Hailemichael, Y., Yang, Y., Nurieva, R. In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model. J. Vis. Exp. (129), e56255, doi:10.3791/56255 (2017).

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