Summary
Målet med detta protokoll är att möjliggöra upptäckt av i vivo antigen-specifika avlivning av en målcell i en murin modell.
Abstract
Nuvarande metoder för antigen-specifika dödande är begränsat till in vitro- användning eller utnyttjas i infektionssjukdomar modeller. Dock finns det inte ett protokoll som särskilt avsedda att mäta antigen-specifika dödande utan en infektion. Detta protokoll är utformad och beskriver metoder för att övervinna dessa begränsningar genom att tillåta för detektion av antigen-specifika avlivning av en målcell av CD8+ T celler i vivo. Detta åstadkoms genom en sammanslagning av en vaccination modell med traditionella CFSE-märkt måltavla döda assay. Denna kombination tillåter forskare att bedöma antigen-specifika CTL potential direkt och snabbt eftersom analysen inte är beroende av tumörens tillväxt eller infektion. Dessutom utslaget är baserad på flödescytometri och så bör vara lättillgängliga för de flesta forskare. Den största begränsningen av studien är att identifiera den tidslinje i vivo som är lämplig till hypotesen testas. Variationer i antigen styrka och mutationer i de T-celler som kan resultera i differential cytolytisk funktion måste bedömas noggrant för att avgöra den optimala tiden för cellen skörd och bedömning. Lämplig koncentration av peptiden för vaccination har optimerats för hgp10025-33 och OVA257-264, men ytterligare validering skulle behövas för andra peptider som kan vara mer lämpligt att en viss undersökning. Övergripande, detta protokoll tillåter en snabb bedömning av döda funktion i vivo och kan anpassas till någon viss antigen.
Introduction
Flera protokoll finns för att bedöma en CD8 cytolytisk (CTL) potential+ eller CD4+ T-cell. Denna bedömning kan lätt göras i vitro under kontrollerade förhållanden1,2,3. Dessutom infektionssjukdom modeller, såsom LCMV, klassiskt har undersökt CTL funktion med hjälp av differentially CFSE (5-(and 6)-Carboxyfluorescein diacetat succinimidyl ester) märkt målceller där den CFSEHej-märkta celler är pulsade med en peptid och CFSElo-märkta mål celler är kvar unpulsed. Cellerna är sedan injiceras i förhållandet 1:1 och bedömas för förlust av den CFSEHej-märkt pulsad mål av flöde flödescytometri4. Vaccin och avvisande modeller har också använt liknande strategier för bedömning av in-vivo dödande av båda CD8+ och CD4+ T celler samt NK cells5,6. Detta är en kraftfull analys, men kräver användning av smittämnen som prime immunsystemet före målet injektion.
Detta protokoll, däremot, kräver ingen tidigare infektion av värden och istället använder en vaccinationsstrategi för att prime immunsystemet före målet injektion. Denna vaccination består av en vatten-baserade formulering av peptid vaccin som kräver tillhandahållande av en immunstimulerande cocktail kallas covax7, bestående av en Toll-like receptor 7 (TLR7) agonist (imiquimod kräm), en agonistiska anti-CD40 antikropp och interleukin-2 (IL-2) leder till synergistisk kombination av immunstimulerande medel för elicitering av peptid-specifika priming och robust immunsvar. Som sådan, ger denna analys en snabb avläsning av CTL funktion som vaccinet administreras tillsammans med cellerna för bedömning av funktion endast tre dagar före injektion av målceller. Covax grundningen är dessutom starka nog att döda kapacitet den primade antigen-specifika T-cellen kan ses mellan 4 och 24 h efter injektionen.
Den största begränsningen av detta protokoll är att identifiera den tidslinje i vivo för detektion av mål dödandet som är lämplig för både antigenet och hypotesen testas. Försiktig bedömning måste utföras, eftersom variationer i antigen styrka samt genetiska förändringar testas i T-celler kan resultera i differential CTL-funktion som skulle kräva en annan timing identifiering av mål dödandet. Dessutom, medan lämpliga koncentrationen av peptid för vaccination har optimerats för mänskliga melanom antigen glykopeptider 100 (hgp10025-33) och äggalbumin257-264 (OVA257-264)8,9 , användning av en annan antigen modell som kan vara mer lämpligt att en studie skulle kräva ytterligare validering. På grund av förväntade skillnader i en target antigener förmåga att stimulera CTL effektor funktion i kombination med covax som ett adjuvans, kan optimering av IL-2 koncentration och dos-dosfrekvensen vara avgörande för att uppnå det eftersträvade målet. Övergripande, detta protokoll möjliggör en snabb bedömning av döda funktion i vivo och kan anpassas till någon viss antigen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla metoderna som beskrivs här har godkänts av den institutionella djur vård och användning kommittén (IACUC) av University of Texas MD Anderson Cancercenter.
1. beredning av peptid för vaccinet
- Lös upp den frystorkade peptiden med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) till lämplig koncentration och virvel för 30 s.
Obs: För hgp10025–33, slutliga koncentration är 1 mg/mL och för ägg257–264, slutliga koncentration är 0,5 mg/mL. Beredes peptid före injektion. Förvara inte efter beredning.
2. isolering av Splenocytes från transgena möss
Obs: Cell isolering från mjälte måste utföras i ett sterilt sätt.
-
Euthanize OT-1 transgeniska musen metoden godkänd CO2 kvävning och bort mjälten.
Obs: Lämpliga transgena möss används i detta steg som är specifika för peptiden val.- Lägg musen på dess högra sida. Spray till vänster i musen med 70% etanol (EtOH). Dra upp huden med hjälp av pincetten och skära huden med hjälp av kirurgisk sax; mjälten blir synliga i peritoneal hålrummet. Försiktigt skära öppen i bukhålan för att komma åt mjälte. Ta bort mjälten med pincett.
-
Dela upp mjälten genom att placera det i en 70 µm filter i en petriskål med 2 mL medium A (PBS med 1% fetalt bovint serum (FBS)) och smashing mjälte med avsluta av en kolv.
- Samla splenocytes från en petriskål och placera i en 50 mL konisk tub. Tvätta petriskål med 5 mL medium A två gånger för att samla alla celler. Lägg till medium en upp till 25 mL och centrifugera cellerna för 5 min i rumstemperatur vid 475 x g.
- Aspirera cellerna och resuspendera i 1 mL / per Mjältens röda blodkroppar (RBC) lyseringsbuffert. Inkubera vid rumstemperatur i 5 min. Tillsätt 10 mL medium A och centrifugera vid rumstemperatur vid 475 x g. återsuspendera pelleten i 10 mL medium A och ta bort skräp genom att filtrera cellsuspensionen genom ett 70 µm filter till en ren 50 mL konisk.
-
Räkna celler med hjälp av trypan blå och en hemocytometer. Återsuspendera cellerna i PBS till en slutlig koncentration av 106 - 1006 celler/mL. För ägg257–dödande,264 specifika Omsuspendera på 106 celler/mL och för hgp10025–33 särskilda döda, Omsuspendera 1006 celler/ml.
- Snurra de resterande cellerna i rumstemperatur i 5 min på 475 x g. Aspirera supernatanten och återsuspendera i 15 mL kall PBS att tvätta cellerna. Upprepa tvättningen gång. Spin cellerna i rumstemperatur i 5 min på 475 x g. Aspirera supernatanten och återsuspendera i kalla PBS enligt den slutliga volymen bestäms i steg 2,4.
- Överföra enda cellsuspension till ett 1,5 mL mikrocentrifug rör och hålla på is tills injektion i mottagarens C57/BL6 mus.
3. injektion av Splenocytes från transgena möss
- Placera mottagaren C57/BL6 mus i en fasthållning med ryggsidan uppåt. Spray injektion svans basareal med 70% isopropylalkohol. Administrera 100 µL av enda cellsuspension (avsnitt 2) intravenöst i svansen ven använder en 27 G kanyl med den fasade sida uppåt.
4. Covax Administration
Obs: Om celler injiceras på eftermiddagen, covax administreras följande morgon inom 18 h av cell injektionen.
- Placera musen i en tydlig anestesi låda med 1-3% isofluran. När möss är fullt anesthetized, överföra möss till näsan konerna kopplade till samlingsröret i anestesi kammaren. Hålla möss återhållsamma med ryggsidan upp.
Obs: Anesthetization bekräftas av en kort tå nypa att verifiera ett tillbakadragande svar inte framkallas. Federal lagstiftning begränsar isofluran användning på order av en legitimerad veterinär. - Spray injektion svans basareal med 70% isopropylalkohol. Injicera 100 μl av peptid lösning (från avsnitt 1) subkutant med en 27 G nål med sprutan tränga in 4-5 mm i regionen svans bas, den nål avfasning sidan uppåt.
Obs: Möss är vaccinerade i ena flanken med subkutan injektion vid basen av svansen10. - Injicera 100 µL anti-CD40 antikropp (0,5 mg/mL lager) i sidled vaccin injektionsstället.
- Försiktigt Applicera imiquimod kräm 50 mg/mus på vaccination webbplatser. Gnugga imiquimod kräm på ytan tills krämen är inte längre synlig och är fullt absorberad.
- Injicera 100 μl av 100 000 IU/mL rhIL-2 protein intraperitonealt (i.p.) på nedre buken regionen. Iaktta möss för 5 min efter de återhämta sig helt från anestesi.
Obs: Experiment pausas vid denna punkt i 3 dagar.
5. isolering av målet Splenocytes för märkning med CFSE
Obs: Cell isolering från mjälte måste utföras i ett sterilt sätt.
- Euthanize C57BL/6 möss enligt godkänd CO2 kvävning metod. Ta bort spleen(s) som i steg 2.1.1. Dela upp mjälten och tvätta splenocytes som i steg 2.2.1 - 2.2.3. Lysera röda blodkroppar som i steg 2,3 - 2.3.2.
- Ta bort celler för inventering med hjälp av en hemocytometer och beräkna för en slutlig koncentration av celler vid 106 celler/mL i CFSE-märkning lösning (som beskrivs i steg 7). Snurra resterande celler i rumstemperatur i 5 min på 475 x g. Aspirera supernatanten.
6. peptid pulserande av mål Splenocytes
Obs: Peptid pulserande måste utföras i ett sterilt sätt.
- Återsuspendera cellerna på 106 celler/mL i komplett media (RPMI 1640 media med 10% FBS, 1% L-glutamin (L-Gln), 1% penicillin/streptomycin (penna/Strep)). Dela celler i 2 rör (15 mL conicals). Märka varje tub som pulsade eller unpulsed.
-
Lägg till peptid för att röret pulsade. OVA257–264 pulserande, tillsätt 1 µg/mL och för hgp10025–33 pulserande, lägga till 2 µg/mL.
Obs: De unpulsed cellerna genomgår samma ruvning som pulsade cellerna bara utan tillsats av peptiden.- Inkubera cellerna + peptid vid 37 ° C i 1 h.
- Tillsätt 10 mL av komplett media (RPMI 1640 media med 10% FBS, 1% L-glutamin (L-Gln), 1% penicillin/streptomycin (penna/Strep)) till varje rör att tvätta båda pulsade och unpulsed målceller. Snurra resterande celler i rumstemperatur i 5 min på 475 x g. Aspirera supernatanten.
7. förberedelse av CFSE för märkning mål Splenocytes
-
Förbereda CFSE-märkning lösning under cellen tvätt i steg 6.3; pulsad cellerna kommer att märkas CFSEHej och den unpulsed som CFSElo. Förbereda 1 mL CFSE-märkning lösning för 106 celler.
Obs: CFSE är ljuskänsligt och ska skyddas från ljus hela tiden.- Förbereda CFSEHej -märkning media genom att lägga till 1 uL/mL CFSE (5 mM stamlösning) för en slutlig koncentration av 5 µM/mL i media RPMI 1640 med 2% FBS.
- Förbereda CFSElo -märkning media genom att lägga till 1 uL/mL CFSE (0,5 mM stamlösning) för en slutlig koncentration på 0,5 µM/mL RPMI media 1640 med 2% FBS.
8. märkning av målet Splenocytes med CFSE
Obs: CFSE märkning måste utföras i ett sterilt sätt.
- Återsuspendera pulsad och unpulsed målcellerna (från steg 6.3) på 106 celler/mL CFSE-märkning media. Omsuspendera pulsad cellerna med förberedda CFSEHej-märkning media och unpulsed celler med beredd CFSElo-märkning media.
- Blanda celler och CFSE-märkning media genom varsam inversion eller virvlande. Blanda inte av vortexa. Inkubera cellerna och CFSE-märkning media vid 37 ° C i 15 min. Remix cellerna var 5 minut.
- Tillsätt 10 mL av komplett media till varje cell fjädring och spin celler i rumstemperatur i 5 min vid 475 x g.
- Aspirera supernatanten och återsuspendera cellerna i 10 mL kall PBS. Snurra celler vid 4 ° C för 5 min vid 475 x g.
- Upprepa steg 8,4.
- Räkna celler och mix peptid pulsade, CFSEHej-märkt med unpulsed, CFSElo-märkt celler i förhållandet 1:1 för injektion i mottagarens möss. Hålla en alikvot av 1 x 106 blandade celler att använda för ett flöde flödescytometri lägesbedömning (avsnitt 11).
Obs: Den slutliga volymen för injektion är 100 µL per mus. Det slutliga celltalet är 10e6 celler. Förlust av volymen i sprutan och nålen måste beaktas och bör uppskattas till 500 µL.
9. injektion av målceller
Obs: Tänk CFSE-märkt celler skyddas från ljus före och under injektionen så mycket som möjligt.
- Placera mottagaren C57BL/6 möss i en fasthållning med ryggsidan uppåt. Spray injektion svans basareal med 70% isopropylalkohol. Administrera 100 µL av enda cellsuspension intravenöst i svansen ven med den fasning uppåt.
10. ny isolering av målceller
Obs: Tidpunkten för detta steg är kritisk och beroende av CTL cytotoxiciteten och styrkan av antigenet för stimulering. För bedömning av döda ett OVA257–264 pulsad mål, behöver cellerna vara skördade 4-6 h efter injektionen. Sedan CFSE-märkt celler är ljus känslig, bearbeta mjälte i mörkret.
- Euthanize mottagarens C57BL/6 möss enligt metoden godkänd CO2 kvävning.
- Ta bort spleen(s) som i steg 2.1.1. Dela upp mjälten och tvätta splenocytes som i steg 2.2.1 - 2.2.3. Lysera röda blodkroppar som i steg 2,3 - 2.3.2.
- Att resuspendera cellerna i 1 mL fluorescens aktiverad cell sortering (FACs) buffert (1% BSA + PBS) för bedömning av flödescytometri.
11. gating logik för att bestämma CTL aktivitet av flödescytometri
-
Utför bedömning av CTL aktivitet använder en standard flöde flödescytometri protokoll. Förvärva celler med FITC-kanal på en flödescytometer med 488 nm laser för magnetisering11.
- Grind på levande lymfocyter med framåt scatter (FSC) vs side scatter (SSC) parametrar. Subgate inom levande lymfocyter grinden för totalbefolkningen CFSE-positiv.
Obs: De injicerade CFSE-märkt cellerna kommer att göra upp en liten delmängd av totala lymfocyter i mjälten. CSFE-positiva celler ska visas som två skilda populationer i log-skala. - Använda ett histogram format för att bestämma procentandelen av den unpulsed (vänster topp, CFSElo) och pulsad (rätt topp, CFSEHej) populationer. Förlust av CFSEHej cellerna indikerar antigen-specifika CTL aktivitet.
- Grind på levande lymfocyter med framåt scatter (FSC) vs side scatter (SSC) parametrar. Subgate inom levande lymfocyter grinden för totalbefolkningen CFSE-positiv.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Före injektion av CFSE-märkta målceller körs 1:1 cell blandningen på en flödescytometer att bestämma baslinjen frekvenserna av både CFSEHej och CFSElo målceller. Figur 1 A visar Usenets strategin för att upptäcka förändringar i CFSE populationer, en inledande gate görs med FSC och SSC parametrar. De totala CFSE-positiva cellerna är sedan subgated före att bedöma förändringar i frekvens, som denna population är relativt liten jämfört med den namnlösa endogena splenocytes. Relativa frekvensen CFSEHej och CFSElo populationer är beräknat genom att ange den totala CFSE-positiv befolkningen på 100%. Denna analys kan göras med ett histogram eller dot tomt format. Ett exempel på den relativa frekvensen av CFSE befolkningen före injektion visas i figur 1B. Detta förhållande blir sällan exakt 1:1 men bör rimligen nära. Nödvändigheten av covax grundningen visas i figur 1C där ingen dödandet av antigen pulsade, CFSEHej målceller observeras på 24 h efter injektionen. Figur 1 D visar effektiv dödandet av antigen pulsade, CFSEHej-märkt målceller som toppen som observerades före injektion är nästan oupptäckta och förhållandet är dramatiskt skiftat från 50% till 1% upptäckt. Figuren visar även kineticsen av antigen pulsade, CFSEHej-märkt mål cell dödande genom att bedöma förlusten av denna patientgrupp både 6 h och 24 h efter injektionen.
Figur 1: Jämförelse av märkta celler vid baseline och efter injektion av CFSE-märkta målceller. (A) den portande strategin för bedömning av CTL funktion visas. Kort, levande lymfocyter är gated med framåt scatter (FSC) vs side scatter (SSC) parametrar. Totala CSFE-positiva celler är subgated inom den levande cellen gaten. Förhållandet mellan CFSEHej och CFSElo är baserad på deras respektive frekvens inom CFSE-positiv totalbefolkningen. (B) följande CFSE märkning, målceller blandas 1:1 och bedömas för förhållandet mellan CFSEHej och CFSElo celler av flödescytometri. Siffrorna anger frekvensen av de respektiva topparna på både histogram (vänster) och CFSE vs SSC dot tomt (höger) format. (C) Detta visar bristen på målceller avlivning utan föregående vaccination med covax regim. Splenocytes var skördade 24 h efter injektionen. (D) Detta visar dödandet av antigen pulsade CFSEHej målceller på 6 h (översta grafer) och 24 h (botten grafer) efter injektionen. Siffrorna anger frekvensen av CFSE-märkta topparna på både histogram (vänster) och CFSE vs SSC dot tomt (höger) format. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Medan detta protokoll är enkelt, finns det några avgörande steg som måste utföras noga. Covax grundningen efter injektion av antigen-specifika T-cellen som testas är nödvändigt att se någon dödandet av pulsad målen. Det är möjligt att den vattenbaserade covax vaccinationen skapar ett akut inflammatoriskt tillstånd, för kronisk inflammatorisk fas, kan ersätta den kortlivade vattenbaserad formula med en långsam-antigen release oljebaserade strategi ge en bättre resultatet7,12.
I tillägg, CFSE-märkning av målceller efter antigen pulserande måste vara enhetlig för en perfekt flöde flödescytometri avläsning. Märkning av den CFSEHej med 5 µM och den CFSElo med 0,5 µM befanns vara idealisk i detta system för att ge en logg skillnad i populationer som enkelt kan särskiljas.
Detta protokoll är enkla att modifiera för specifika antigen systemet testas. Först, koncentrationen av peptid administreras som en del av covax bör bekräftas. Ett enkelt sätt att avgöra detta lämplig koncentration är att vaccinera och spåra utbyggnaden av de injicerade, antigen-specifika T-cellerna i blodet. I detta fall, kräver en svag antigen (hgp10025-33) dubbelt så mycket peptid som en stark antigen (OVA257–264). De validerade koncentrationer som används i detta protokoll skulle vara en rimlig utgångspunkt för att testa andra antigener baserat på styrkan av stimulering. En punkt av modifiering skulle vara att bara vaccinera vildtyps-musen med antigen av intresse följt av peptid pulsade mål för bedömning av CTL-funktion. Dock denna ändring skulle lita på aktivering och expansion av kroppsegna antigen-specifika svar och så tidpunkten för mål cell överföring skulle sannolikt behöva uppstå 7-14 dagar efter immunisering. Dessutom kan för antigen-specifika avlivning kraftigt minskas jämfört som observerats vid överföring av transgena T-celler. En varning med denna ändring är att nivån på CTL svar till målet kan vara för låga för att upptäckas.
Förutom mängden antigen krävs för T-cell priming, måste tidpunkten för förnyad isoleringen av CFSE-märkta målceller optimeras för en given hypotes. Ändringar av den T-cell som testas som resulterar i differential döda funktioner kan kräva justeringar i tidpunkten för den förnyade isoleringen. En T-cell med en förbättrad dödande funktion behöver ha mål bedömas mycket snabbare än vildtyp motsvarighet. Denna kinetiska profilen bör undersökas noggrant för att avgöra den optimala tidpunkt ta testade hypotesen. I allmänhet har vi funnit detta att variera mellan 4 och 24 timmar efter injektionen av målceller.
En begränsning av analysen är att effektor cellerna inte har stimulerats kroniskt för att framkalla en utmattad tillstånd. CTL funktion är därför begränsad till nyligen aktiverat effektor celler. Det är möjligt att denna metod skulle kunna ändras för att bedöma recall funktion av en minneskapacitet för befolkningen eller dödande av en kroniskt aktiverade antigen-specifika T-cell delmängd, som skulle vara intressant för framtida tillämpningar.
Denna metod för testning CTL funktion i vivo möjliggör snabb påvisande av i vivo döda som övervinner några av begränsningarna i en in vitro- inställning. Ett intakt immunsystem är på plats och grundningen av de överförda T-cellerna via metoden covax bygger på peptid presentation och samtidig stimulering av kroppsegna antigen-presenterande celler. Till skillnad från andra i vivo döda analyser, kräver denna metod inte en infektion eller förekomsten av en tumör mål. Men tillägg av en tumör mål skulle ge ett ytterligare jämförelseläkemedel och kunde läggas till analysen före injektion av antigen-specifika T-celler och covax administration för framtida tillämpningar av denna metod.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av NIH forskning (A1R03AI120027 (RN) och 1R21AI20012 (RN)), institutionella Research Grant (RN), start-up bevilja (RN) och MD Anderson CIC utsäde bevilja (RN).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6 to 12 week old female C57BL/6 mice | Charles River | 027 | C57 Black 6 mice |
| OT-1 6-12 week old female mice | Jackson Labs | 003831 | |
| hgp10025–33 | CPCScientific | 834139 | KVPRNQDWL |
| OVA 257–264 | CPCScientific | MISC-012 | SIINFEKL |
| Imiquimod cream 5% | Fougera | 51672-4145-6 | Aldara Cream |
| CD40-specific mAb | BioXcell | BE0016-2 | clone FGK4.5 |
| rhIL-2 protein | Hoffman LaRoche Inc | 136 | Recombinant human IL-2 protein |
| 70% isopropyl alcohol Prep | Kendall | S-17474 | |
| PBS | Life Technologies | 10010-023 | Phosphate Buffered Saline |
| FBS | Life Technologies | 26140-079 | fetal bovine serum |
| RBC lysis buffer | Life Technologies | A10492-01 | red blood cell lysis buffer |
| RPMI 1640 Media | Life Technologies | 11875119 | |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030081 | |
| Pen/Strep | Life Technologies | 15140122 | penicillin/streptomycin |
| CFSE | Life Technologies | C34554 | 5-(and 6)-Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A4503 | |
| 1.5 mL MCT graduated natural | Fisher | 05-408-129 | microcentrifuge tube |
| 70% ethanol | Fisher | BP8201500 | EtOH |
| Trypan blue solution, 0.4% | Life Technologies | 15250-061 | |
| Hemocytometer | Fisher | 267110 | |
| 27 gauge needle | BD | 305109 | |
| 1 mL syringe | BD | 309659 |
References
- Liu, L., et al. Visualization and quantification of T cell-mediated cytotoxicity using cell-permeable fluorogenic caspase substrates. Nat Med. 8 (2), 185-189 (2002).
- Wherry, E. J., et al. Lineage relationship and protective immunity of memory CD8 T cell subsets. Nat Immunol. 4 (3), 225-234 (2003).
- He, L., et al. A sensitive flow cytometry-based cytotoxic T-lymphocyte assay through detection of cleaved caspase 3 in target cells. J Immunol Methods. 304 (1-2), 43-59 (2005).
- Barber, D. L., Wherry, E. J., Ahmed, R. Cutting edge: rapid in vivo killing by memory CD8 T cells. J Immunol. 171 (1), 27-31 (2003).
- Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. The use of fluorescent target arrays for assessment of T cell responses in vivo. J Vis Exp. (88), e51627 (2014).
- Johansson, S., et al. Natural killer cell education in mice with single or multiple major histocompatibility complex class I molecules. J Exp Med. 201 (7), 1145-1155 (2005).
- Hailemichael, Y., et al. Persistent antigen at vaccination sites induces tumor-specific CD8(+) T cell sequestration, dysfunction and deletion. Nat Med. 19 (4), 465-472 (2013).
- Overwijk, W. W., et al. Tumor regression and autoimmunity after reversal of a functionally tolerant state of self-reactive CD8+ T cells. J Exp Med. 198 (4), 569-580 (2003).
- Cho, H. I., Celis, E. Optimized peptide vaccines eliciting extensive CD8 T-cell responses with therapeutic antitumor effects. Cancer Res. 69 (23), 9012-9019 (2009).
- Ya, Z., Hailemichael, Y., Overwijk, W., Restifo, N. P. Mouse model for pre-clinical study of human cancer immunotherapy. Curr Protoc Immunol. 108, 21-43 (2015).
- Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types. J Vis Exp. (94), (2014).
- Durward, M., Harms, J., Splitter, G. Antigen specific killing assay using CFSE labeled target cells. J Vis Exp. (45), (2010).
