Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

I Vivo Analysen for påvisning av Antigen-spesifikke T-celle Cytolytic funksjon med en vaksinasjon modell

Published: November 28, 2017 doi: 10.3791/56255
Automatic Translation
*1, *1, 2,3, 2
1Department of Melanoma Medical Oncology, University of Texas MD Anderson Cancer Center, 2Department of Immunology, University of Texas MD Anderson Cancer Center, 3Department of Radiation Oncology, The Second Hospital of Jilin University
* These authors contributed equally

Summary

Målet med denne protokollen er å tillate oppdaging av in vivo antigen-spesifikke drepe en Målcelle i murine modell.

Abstract

Gjeldende metoder for antigen-spesifikke drap er begrenset til i vitro bruk eller benyttet i infeksjonssykdommer modeller. Det er imidlertid ikke en protokoll spesielt ment å måle antigen-spesifikke drepe uten en infeksjon. Denne protokollen er utformet og beskriver metoder for å overvinne disse begrensningene ved å tillate for påvisning av antigen-spesifikke drepe for en Målcelle ved CD8+ T celler i vivo. Dette oppnås ved å flette en vaksinasjon modell med en tradisjonell CFSE-merket målet drepe analysen. Denne kombinasjon gjør forskeren å vurdere antigen-spesifikke CTL potensialet raskt og direkte som analysen ikke er avhengig av tumor vekst eller infeksjon. I tillegg er avlesning er basert på flowcytometri og så skal være lett tilgjengelig for de fleste forskere. Stor begrensning av studien er å identifisere de tidslinjen i vivo som passer hypotesen blir testet. Variasjoner i antigen styrke og mutasjoner i de T-cellene som kan resultere i differensial cytolytic funksjonen må vurderes nøye for å finne det optimale tidspunktet for cellen høsting og vurdering. Aktuelle konsentrasjonen av peptid for vaksinasjon er optimalisert for hgp10025-33 og OVA257-264, men ytterligere validering ville være nødvendig for andre peptider som kan være mer passende til en gitt studie. Samlet denne protokollen tillater en rask vurdering av drap funksjon i vivo og kan tilpasses alle gitt antigen.

Introduction

Flere protokoller finnes for å vurdere cytolytic (CTL) potensialet i en CD8+ eller CD4+ T-celle. Denne vurderingen kan lett gjort i vitro under kontrollerte forhold1,2,3. I tillegg infeksjonssykdommer modeller, for eksempel LCMV, klassisk har undersøkt CTL-funksjonen ved hjelp av ulikt CFSE (5-(and 6)-Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester) merket målcellene hvor den CFSEHei-merkede celler pulserende peptid og CFSElo-merket målet celler igjen unpulsed. Cellene deretter injisert på en 1:1 ratio og vurdert for tap av den CFSEHei-merket pulserende mål av flyt cytometri4. Vaksine og avvisning modeller har også brukt lignende strategier for vurdering av i vivo drepe av både CD8+ og CD4+ T celler samt NK celler5,6. Dette er en kraftig analysen, men krever bruk av smittestoffer som prime immunsystemet før målet injeksjon.

Denne protokollen, derimot, krever ingen tidligere smitte av verten og utnytter stedet en vaksinasjon strategi for å prime immunsystemet før målet injeksjon. Denne vaksinasjon består av en vannbasert formulering av peptid vaksine som krever levering av en immunostimulatory cocktail kalt covax7, bestående av en Toll-like reseptor 7 (TLR7) Agonistiske (imiquimod krem), en agonistic anti-CD40 antistoff, og interleukin-2 (IL-2) fører til synergistisk kombinasjon av immunostimulatory agenter for elicitation av peptid-spesifikke grunning og robust immunrespons. Som gir denne analysen en rask avlesning CTL-funksjonen som vaksinen administreres med cellene for vurdering av funksjonen bare tre dager før injeksjon av målcellene. I tillegg er covax grunning sterk nok til at drapet kapasitet primet antigen-spesifikke T cellen kan sees mellom 4 og 24 h etter injeksjon.

Stor begrensning av denne protokollen er å identifisere den tidslinje i vivo for deteksjon av mål drapet som passer både antigen og hypotesen blir testet. Forsiktig vurdering må utføres, som variasjoner i antigen styrke samt genetiske endringer blir testet i T-celler kan føre differensial CTL-funksjon som krever forskjellige timing gjenkjenning av målet drapet. Dessuten, mens den aktuelle konsentrasjonen av peptid for vaksinasjon er optimalisert for menneskelig melanom antigen glycopeptide 100 (hgp10025-33) og ovalbumin257-264 (OVA257-264)8,9 , bruk av en annen antigen modell som kan være mer passende til en gitt studie vil kreve ytterligere validering. På grunn av forventet forskjeller i et mål antigener evne til å stimulere CTL effektor funksjon i kombinasjon med covax som en adjuvans, kan optimalisering av IL-2 dose konsentrasjon og dose frekvens være avgjørende for å oppnå det ønskede mål. Samlet denne protokollen gir en rask vurdering av drap funksjon i vivo og kan tilpasses alle gitt antigen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle metodene som er beskrevet her er godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk Committee (IACUC) av University of Texas MD Anderson Cancer Center.

1. utarbeidelse av peptid for vaksine

  1. Oppløse den lyofilisert peptid med fosfat-bufret saltvann (PBS) til riktig konsentrasjon og vortex for 30 s.
    Merk: For hgp10025-33, siste konsentrasjonen er 1 mg/mL og OVA257-264, siste konsentrasjonen er 0,5 mg/mL. Rekonstituer peptid før injeksjon. Ikke Oppbevar etter rekonstituering.

2. isolering av Splenocytes fra transgene musen

Merk: Cellen aisolering fra milten må utføres på en steril måte.

  1. Euthanize OT-1 transgene musen med godkjente CO2 kvelning metoden og fjerne milten.
    Merk: Riktig transgene musen er benyttet i dette trinnet gjelder peptid valgfrihet.
    1. Plasser musen på høyre side. Spray venstre side av musen med 70% etanol (EtOH). Trekke opp huden ved hjelp av pinsett og kuttet huden med kirurgisk saks; milten vises i bukhulen. Forsiktig kutte åpne bukhulen til milten. Fjerne milten ved hjelp av pinsett.
  2. Disaggregate milten ved å plassere den i en 70 µm filter i en Petriskål med 2 mL medium A (PBS med 1% fosterets bovin serum (FBS)) og knuse milten med slutten av en stempelet.
    1. Samle splenocytes fra Petriskål og sted i en 50 mL konisk rør. Vask Petriskål med 5 mL av medium A to ganger for å samle alle celler. Legg til middels en opp til 25 mL og sentrifuge celler for 5 min ved romtemperatur 475 x g.
  3. Sug opp cellene og resuspend i 1 mL per milt røde blodlegemer (RBC) lyseringsbuffer. Inkuber ved romtemperatur for 5 min. legge 10 mL av medium A og sentrifuger ved romtemperatur ved 475 x g. Resuspend pellets i 10 mL av medium A og fjerne rusk ved filtrering celle suspensjon gjennom et 70 µm filter i en ren 50 mL konisk.
  4. Telle celler trypan blå og en hemocytometer. Resuspend celler i PBS til en siste konsentrasjon av 106 - 1006 celler/mL. For OVA257-264 bestemt drepe, resuspend på 106 celler/mL og for hgp10025-33 bestemt drepe, resuspend på 1006 celler/mL.
    1. Spin gjenværende cellene ved romtemperatur for 5 min på 475 x g. Sug opp nedbryting og resuspend i 15 mL kaldt PBS å vaske celler. Gjenta trinnet vask igjen. Spin cellene ved romtemperatur for 5 min på 475 x g. Sug opp nedbryting og resuspend i kalde PBS etter det siste bindet i trinn 2.4.
    2. Overfør enkelt celle suspensjon slik 1,5 mL microcentrifuge og holde på is til injeksjon i mottakerens C57/BL6 musen.

3. injeksjon av Splenocytes fra transgene mus

  1. Plass mottakeren C57/BL6 musen i en restrainer med dorsal side opp. Spray injeksjon hale base området med 70% isopropylalkohol. Administrere 100 µL av enkeltcelle suspensjon (inndeling 2) intravenøst i halen venen bruker en 27 G nål med skråkant siden vendt oppover.

4. Covax administrasjon

Merk: Hvis cellene blir injisert i ettermiddag, bør covax administreres morgenen i 18 h celle injeksjon.

  1. Plass musen i en klar anestesi med 1-3% isoflurane. Når mus er fullt anesthetized, overføre mus til nese koner knyttet til manifold i anestesi kammeret. Holde mus tilbakeholdne med dorsal side opp.
    Merk: Anesthetization er bekreftet av en kort tå knipe for å bekrefte tilbaketrekkingen svar ikke er skapte. Føderal lov begrenser isoflurane bruk på en med lisens veterinarian.
  2. Spray injeksjon hale base området med 70% isopropylalkohol. Injisere 100 µL av peptid løsning (fra delen 1) subcutaneously med en 27 G nål sprøyten gjennomtrengende 4-5 mm til hale base regionen, nål skråkant siden vendt oppover.
    Merk: Mus er vaksinert i en flanke med injeksjon ved foten av halen10.
  3. Sette inn 100 µL anti-CD40 antistoff (0,5 mg/mL stock) lateral til injeksjonsstedet vaksine.
  4. Forsiktig bruk imiquimod krem 50 mg/mus webområdene vaksinasjon. Gni imiquimod krem på overflaten til kremen er ikke lenger synlig og er fullstendig absorbert.
  5. Injisere 100 µL av 100.000 IU/mL rhIL-2 protein intraperitoneally (IP) på lavere mageregionen. Observere mus for 5 min etter at de fullt igjen bedøvelsen.
    Merk: Eksperimentet er stoppet på dette punktet i 3 dager.

5. isolering av målet Splenocytes for merking med CFSE

Merk: Cellen aisolering fra milten må utføres på en steril måte.

  1. Euthanize C57BL/6 mus etter godkjent CO2 kvelning metoden. Fjern spleen(s) som i trinn 2.1.1. Disaggregate milten og vask splenocytes som skritt 2.2.1 - 2.2.3. Lyse røde blodlegemer i trinn 2.3 - 2.3.2.
  2. Fjerne celler for å telle ved hjelp av en hemocytometer og beregne for en siste konsentrasjon av celler på 106 celler/mL i CFSE-merking løsning (beskrevet i trinn 7). Spinne gjenværende celler ved romtemperatur for 5 min på 475 x g. leveringstanken nedbryting.

6. peptid pulserende av målet Splenocytes

Merk: Peptid pulserende må utføres på en steril måte.

  1. Resuspend celler på 106 celler/mL i komplett (RPMI 1640 media med 10% FBS, 1% L-glutamin (L-Gln), 1% penicillin/streptomycin (penn/Strep)). Dele cellene i 2 rør (15 mL conicals). Etiketten hver rør som pulserende eller unpulsed.
  2. Legg peptid til røret merket pulserende. For OVA257-264 pulserende, Legg 1 µg/mL og hgp10025-33 pulserende, legge 2 µg/mL.
    Merk: Unpulsed cellene gjennomgår den samme inkubering som pulserende cellene bare uten tilsetning av peptid.
    1. Inkuber celler + peptid ved 37 ° C i 1 time.
  3. Legge til 10 mL av komplett (RPMI 1640 media med 10% FBS, 1% L-glutamin (L-Gln), 1% penicillin/streptomycin (penn/Strep)) til hver tube å vaske både pulserende og unpulsed målcellene. Spinne gjenværende celler ved romtemperatur for 5 min på 475 x g. leveringstanken nedbryting.

7. utarbeidelse av CFSE for merking målet Splenocytes

  1. Forberede CFSE-merking løsning under cellen vaske i trinn 6.3; pulserende cellene vil bli merket som CFSEHei og den unpulsed som CFSElo. Forberede 1 mL av CFSE-merking løsning 106 celler.
    Merk: CFSE er følsomt for lys og skal beskyttes fra lys til alle tider.
    1. Forberede CFSEHei -merking medier ved å legge til 1 uL/mL CFSE (5 mM lagerløsning) for en siste konsentrasjon av 5 µM/mL RPMI media 1640 med 2% FBS.
    2. Forberede CFSElo -merking medier ved å legge til 1 uL/mL CFSE (0,5 mM lagerløsning) for en siste konsentrasjon på 0,5 µM/mL RPMI media 1640 med 2% FBS.

8. merking av målet Splenocytes med CFSE

Merk: CFSE merking må utføres på en steril måte.

  1. Resuspend pulserende og unpulsed målet celler (fra trinn 6.3) på 106 celler/mL CFSE-merking media. Resuspend pulserende cellene med forberedt CFSEHei-merking media og unpulsed cellene med forberedt CFSElo-merking medier.
  2. Bland celler og CFSE-merking medier av mild inversjon eller virvler. Bland ikke av vortexing. Inkuber celler og CFSE-merking medier på 37 ° C i 15 min. Remix cellene hver 5 min.
  3. Legge til 10 mL av komplett i hver celle suspensjon og spinn celler ved romtemperatur for 5 min 475 x g.
  4. Sug opp nedbryting og resuspend celler i 10 mL kaldt PBS. Spinne celler ved 4 ° C i 5 min 475 x g.
  5. Gjenta trinn 8.4.
  6. Telle celler og blanding peptid-pulserende, CFSEHei-merket med unpulsed, CFSElo-merket cellene på en 1:1 ratio for injeksjon i mottakerens mus. Holde en aliquot på 1 x 106 blandet å kunne bruke en baseline flyt cytometri vurdering (inndelingen 11).
    NOTE Det siste bindet for injeksjon er 100 µL per musen. Den endelige celletall er 10e6 celler. Tap av volumet i sprøyten og nålen må tas i betraktning og bør være anslått til 500 µL.

9. injeksjon av målcellene

Merk: Holde CFSE-merket celler som er beskyttet fra lys før og under injeksjon som mulig.

  1. Plass mottakeren C57BL/6 mus i en restrainer med dorsal side opp. Spray injeksjon hale base området med 70% isopropylalkohol. Administrere 100 µL av enkeltcelle suspensjon intravenøst i halen venen med skråkant siden vendt oppover.

10. re isolering av målcellene

Merk: Tidspunktet for dette trinnet er kritisk og avhengig CTL cytotoksisitet og styrke antigen for stimulering. For vurdering av drepe en OVA257-264 pulserende mål, må cellene være høstet 4-6 h etter injeksjon. Siden CFSE-merket cellene er lys følsom, behandle spleens i mørket.

  1. Euthanize mottaker C57BL/6 mus etter godkjent CO2 kvelning metoden.
  2. Fjern spleen(s) som i trinn 2.1.1. Disaggregate milten og vask splenocytes som skritt 2.2.1 - 2.2.3. Lyse røde blodlegemer i trinn 2.3 - 2.3.2.
  3. Resuspend celler i 1 mL fluorescens aktivert celle sortering (FACs) buffer (1% BSA + PBS) for vurdering av flowcytometri.

11. gating logikk for å bestemme CTL aktivitet av flowcytometri

  1. Utføre vurdering av CTL aktivitet bruker en standard flyt cytometri protokoll. Erverve celler med FITC kanalen på en flyt cytometer med en 488 nm laser for eksitasjon11.
    1. Gate på live lymfocytter bruker parameterne frem xy (FSC) vs siden xy (SSC). Subgate i live lymfocytt porten for CFSE-positive befolkningen.
      Merk: Injisert CFSE-merket cellene utgjør en undergruppe av total lymfocytter i milten. CSFE-positive cellene skal vises som to forskjellige bestander på log skala.
    2. Bruk et histogram-format til å finne ut prosentandelen av unpulsed (venstre peak, CFSElo) og pulserende (høyre peak, CFSEHei) populasjoner. Tap av CFSEHei cellene angir antigen-spesifikke CTL aktivitet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Før injeksjon av CFSE-merket målcellene kjøres 1:1 celle blandingen på en flyt cytometer å bestemme planlagte frekvenser av både CFSEHei og CFSElo målet celler. Figur 1 En viser gating strategien å oppdage endringer i befolkningene som CFSE, en første gate er laget med FSC og SSC parameterne. Totalt CFSE-positive cellene er deretter subgated før vurdere endringer i frekvens, som denne befolkningen er relativt lite i forhold til den umerkede endogene splenocytes. Den relative hyppigheten av den CFSEHei og CFSElo populasjoner er beregnet ved å sette CFSE-positive befolkningen på 100%. Denne analysen kan gjøres med et histogram- eller dot tomten format. Et eksempel på den relative hyppigheten av CFSE bestander før injeksjon er vist i figur 1B. Dette forholdet vil sjelden være nøyaktig 1:1, men bør være rimelig nærhet. Nødvendigheten av covax grunning er vist i figur 1C hvor ingen drap av antigen pulserende, CFSEHei målcellene er observert på 24 h innlegget injeksjon. Figur 1 D viser effektiv drapet av antigen pulserende, CFSEHei-merket målcellene som toppen som ble observert før injeksjon er nesten ubemerket og forholdet er dramatisk flyttet fra 50% til 1% deteksjon. Figuren viser også the kinetics av antigen pulserende, CFSEHei-merket målet cellen drepe ved å vurdere tap av denne befolkningen både 6 h og 24 h innlegget injeksjon.

Figure 1
Figur 1: Sammenligning av merkede celler ved baseline og etter injeksjon av CFSE-merket målcellene. (A) gating strategien for vurdering av CTL-funksjonen vises. Kort, live lymfocytter er gated med fremover xy (FSC) vs siden xy (SSC) parameterne. Totalt CSFE-positive celler er subgated i levende celle porten. Forholdet CFSEHei og CFSElo er basert på deres respektive frekvens innenfor CFSE-positive befolkningen. (B) følgende CFSE merking, er målcellene blandet 1:1 og vurdert for forholdet mellom CFSEHei og CFSElo celler av flowcytometri. Tallene angir frekvensen av de respektive toppene på både et histogram (venstre) og CFSE vs SSC dot plot (høyre) formater. (C) Dette viser mangel på målcellene drap uten forutgående vaksinering med covax diett. Splenocytes ble høstet 24 timer etter injeksjon. (D) dette demonstrerer drapet på antigen-pulserende CFSEHei målcellene på 6 h (øverste grafene) og 24 timer (nederste grafene) legge injeksjon. Tallene angir frekvensen av de CFSE-merket toppene på både histogrammet (venstre) og CFSE vs SSC dot plot (høyre) format. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne protokollen er ukomplisert, er det noen viktige trinn som må utføres nøye. Covax grunning etter injeksjon av antigen-spesifikke T-celle testes er nødvendig å se noen drapet på de pulserende mål. Det er mulig at vannbasert covax vaksinasjon skaper en akutt betennelsestilstand, for kronisk inflammatorisk fase, kan erstatte kortvarig vannbasert formulering med en langsom antigen utgivelsen olje-basert tilnærming gi en bedre utfallet7,12.

I tillegg CFSE-merkingen av målcellene etter antigen pulserende må være enhetlig for en perfekt flyt cytometri avlesning. Merkingen av den CFSEHei med 5 µM og den CFSElo med 0,5 µM ble funnet for å være i dette systemet for å gi en logg forskjell i befolkningene som lett kan skilles.

Denne protokollen er enkelt å endre for spesifikke antigen systemet blir testet. Først bør konsentrasjonen av peptid administrert som en del av covax bekreftes. En enkel måte å finne ut denne aktuelle konsentrasjonen er å vaksinere og spore utvidelsen av de injiserte, antigen-spesifikke T cellene i blodet. I dette tilfellet krever en svak antigen (hgp10025-33) dobbelt så mye peptid som en sterk antigen (OVA257-264). Validerte konsentrasjonen i denne protokollen ville være et rimelig utgangspunkt for testing andre antigener basert på styrken av stimulering. Ett kontaktpunkt endring ville være bare Immunize vill-type musen med et antigen rundt etterfulgt av peptid pulserende mål for å vurdere CTL-funksjon. Men denne endringen ville stole på aktivisering og utvidelse av endogene antigen-spesifikke tiltak og så timingen av målet cellen ville trolig må skje 7-14 dager etter immunisering. I tillegg kan nivået av antigen-spesifikke drapet bli sterkt redusert sammenlignet som observert ved overføring av transgene T-celler. En påminnelse med denne endringen er at nivået på CTLEN svar til målet kan være for lav til å bli oppdaget.

I tillegg til mengden av antigen kreves for T-celle grunning, må tidspunktet for re isolering av CFSE-merket målcellene optimaliseres for en bestemt hypotese. Endringer i den T-celle er testet som resulterer i differensial drepe evner kan kreve justeringer i timingen av re isolasjon. En T-celle med en forbedret drapet funksjon må ha mål vurdert mye raskere enn motparten vill-type. Denne kinetiske profilen bør utforskes nøye for å fastslå den optimale timepoint å ta testet hypotesen. Generelt, har vi funnet dette å variere mellom 4 og 24 timer etter injeksjon av målcellene.

En begrensning av analysen er at Effektor celler ikke har vært kronisk stimuleres til å indusere en utmattet tilstand. CTL-funksjonen er derfor begrenset til sist aktiverte Effektor celler. Det er mulig at denne metoden kunne endres for å vurdere tilbakekalling funksjon av et minne befolkningen eller drepe evnen til en kronisk aktivert antigen-spesifikke T-celle delsett, som ville være interessant for framtidige applikasjoner.

Denne metoden for testing CTL funksjon i vivo gir rask oppdagelsen for vivo drepe som overvinner noen av begrensningene i et i vitro innstillingen. En intakt immun system er på plass og grunning av de overførte T-cellene via covax metoden er avhengig av peptid presentasjon og co-stimulering av endogene antigen presentere celler. I motsetning til andre i vivo drepe analyser, er denne metoden ikke forlange en infeksjon eller tilstedeværelse av en svulst mål. Men tillegg av en svulst mål ville gi en ekstra komparator og kan legges til analysen før injeksjon av antigen-spesifikke T celler og covax administrasjon for fremtidige anvendelser av denne metoden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet er støttet av NIH forskning (A1R03AI120027 (RN) og 1R21AI20012 (RN)), institusjonelle Research Grant (RN), oppstart gi (RN) og MD Anderson CIC frø gi (RN).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6 to 12 week old female C57BL/6 mice  Charles River 027 C57 Black 6 mice
OT-1 6-12 week old female mice  Jackson Labs 003831
hgp10025–33  CPCScientific 834139 KVPRNQDWL
OVA 257–264  CPCScientific MISC-012 SIINFEKL
Imiquimod cream 5%  Fougera 51672-4145-6 Aldara Cream
CD40-specific mAb  BioXcell BE0016-2 clone FGK4.5
rhIL-2 protein  Hoffman LaRoche Inc 136 Recombinant human IL-2 protein
70% isopropyl alcohol Prep  Kendall S-17474
PBS Life Technologies 10010-023 Phosphate Buffered Saline
FBS Life Technologies 26140-079 fetal bovine serum
RBC lysis buffer  Life Technologies A10492-01 red blood cell lysis buffer
RPMI 1640 Media Life Technologies 11875119
L-Glutamine  Life Technologies 25030081
Pen/Strep Life Technologies 15140122 penicillin/streptomycin
CFSE Life Technologies C34554 5-(and 6)-Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester
Bovine serum albumin (BSA) Sigma  A4503
1.5 mL MCT graduated natural  Fisher 05-408-129 microcentrifuge tube
70% ethanol Fisher BP8201500 EtOH
Trypan blue solution, 0.4%   Life Technologies 15250-061
Hemocytometer Fisher 267110
27 gauge needle BD 305109
1 mL syringe BD 309659

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Liu, L., et al. Visualization and quantification of T cell-mediated cytotoxicity using cell-permeable fluorogenic caspase substrates. Nat Med. 8 (2), 185-189 (2002).
  2. Wherry, E. J., et al. Lineage relationship and protective immunity of memory CD8 T cell subsets. Nat Immunol. 4 (3), 225-234 (2003).
  3. He, L., et al. A sensitive flow cytometry-based cytotoxic T-lymphocyte assay through detection of cleaved caspase 3 in target cells. J Immunol Methods. 304 (1-2), 43-59 (2005).
  4. Barber, D. L., Wherry, E. J., Ahmed, R. Cutting edge: rapid in vivo killing by memory CD8 T cells. J Immunol. 171 (1), 27-31 (2003).
  5. Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. The use of fluorescent target arrays for assessment of T cell responses in vivo. J Vis Exp. (88), e51627 (2014).
  6. Johansson, S., et al. Natural killer cell education in mice with single or multiple major histocompatibility complex class I molecules. J Exp Med. 201 (7), 1145-1155 (2005).
  7. Hailemichael, Y., et al. Persistent antigen at vaccination sites induces tumor-specific CD8(+) T cell sequestration, dysfunction and deletion. Nat Med. 19 (4), 465-472 (2013).
  8. Overwijk, W. W., et al. Tumor regression and autoimmunity after reversal of a functionally tolerant state of self-reactive CD8+ T cells. J Exp Med. 198 (4), 569-580 (2003).
  9. Cho, H. I., Celis, E. Optimized peptide vaccines eliciting extensive CD8 T-cell responses with therapeutic antitumor effects. Cancer Res. 69 (23), 9012-9019 (2009).
  10. Ya, Z., Hailemichael, Y., Overwijk, W., Restifo, N. P. Mouse model for pre-clinical study of human cancer immunotherapy. Curr Protoc Immunol. 108, 21-43 (2015).
  11. Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types. J Vis Exp. (94), (2014).
  12. Durward, M., Harms, J., Splitter, G. Antigen specific killing assay using CFSE labeled target cells. J Vis Exp. (45), (2010).

Tags

Immunologi problemet 129 Cytolytic funksjon CD8+ T celler i vivo analysen peptid vaksinasjon CFSE-merking akutt reaksjon
<em>I Vivo</em> Analysen for påvisning av Antigen-spesifikke T-celle Cytolytic funksjon med en vaksinasjon modell
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Haymaker, C. L., Hailemichael, Y.,… More

Haymaker, C. L., Hailemichael, Y., Yang, Y., Nurieva, R. In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model. J. Vis. Exp. (129), e56255, doi:10.3791/56255 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter