Summary
En standard Western blotting protokol var optimeret til at analysere så få som 500 hæmatopoietisk stamceller eller stamceller. Optimering indebærer omhyggelig håndtering af cell sample, begrænse overførsler mellem rør og direkte lysing celler i Laemmli prøvebuffer.
Abstract
Hæmatopoietisk stamceller (HSCs) er sjælden celler, med musen knoglemarv indeholdende kun ~ 25.000 fænotypiske lang sigt genopretning HSCs. En Western blotting protokol blev optimeret og velegnet til analyse af et lille antal HSCs (500-15.000 celler). Fænotypisk HSCs blev renset, præcist tælles og direkte mængden i Laemmli prøvebuffer. Lysates som indeholder samme antal celler blev analyseret af sodium dodecyl sulfat polyacrylamid gelelektroforese (SDS-PAGE), og skamplet blev udarbejdet og behandlet følgende standard Western blotting protokoller. Ved hjælp af denne protokol, 2,000-5,000 HSCs kan analyseres rutinemæssigt, og i nogle tilfælde der kan indhentes data fra så få som 500 celler, i forhold til de 20.000 til 40.000 celler rapporteret i de fleste publikationer. Denne protokol skal generelt gælder for andre hæmatopoietisk celler, og gør det muligt for rutineanalyse af et lille antal celler ved hjælp af standard laboratorieprocedurer.
Introduction
Hæmatopoietisk stamceller (HSCs) er selvstændig fornyelse celler, der kan give anledning til alle blod lineages. De er relativt sjældne celler i knoglemarven, rendering biokemiske analyser vanskeligt. Tilgange egnet til at analysere sjældne celler, såsom flowcytometri, har været særdeles nyttig for kvantificering relative mængder af celle overflade markører og intracellulære proteiner. Men analysen af intracellulære proteiner kræver anvendelsen af celle permeabilization procedurer til at aktivere antistof adgang, og ikke alle celle overflade epitoper overleve disse procedurer1,2. Derudover antistoffer, der diskriminerer mellem forskellige proteinprodukter isoformer eller kavalergang er ikke ofte tilgængelige for flowcytometri, og derfor efterforskerne stadig stole på Western blotting for visse typer af analyser.
Western blot analyse af cellelysater er en rutinemæssig procedure i de fleste laboratorier. Celler kan blive renset indfødte betingelser, der bevarer epitoper af cellens overflade molekyler, og cellelysater kan efterfølgende udarbejdet og analyseret. Analyse af proteiner i sjældne primære celle populationer af Western duppes kan dog kræve euthanizing stort antal dyr at få nok celler. Ved at foretage små justeringer af flere trin, var en konventionel Western blotting protokol købedygtig opdager proteiner i et relativt lille antal af HSCs (500-15.000, afhængigt af protein af interesse). Tilpasningerne, der omfatter præcist tælle de celler, omhyggeligt håndtering celle pellet, reducere overførsler af celler mellem rør til at minimere celletab, og lysing et defineret antal celler med en koncentreret lastning buffer indeholdende proteasom og fosfatase hæmmere. Mange publicerede rapporter omfatter Western blotting fremstillet med 20.000 eller mere HSCs3,4,5,6,7; Denne enkle procedure vil reducere antallet af celler og forsøgsdyr, der kræves for at producere tilsvarende data af mellem 4 og 40 fold. Protokollen er designet til at normalisere resultater på grundlag af per celle, i stedet for en intern kontrol. Dette giver mulighed for påvisning af samlede reduktioner i protein niveauer, der kan blive overset, hvis dataene er normaliseret til en intern kontrol. Betydningen af normalisering på pr. celle grundlag blev beskrevet for analysen af gen expression data8, og det samme gælder at kvantificere proteiner af vestlige skamplet. Denne optimerede protokol skal være nyttig for alle, der skulle analysere lille antal celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedurer skal udføres i overensstemmelse med institutionelle animalske brug og pleje retningslinjer. Proceduren blev udviklet til analyse af murine hæmatopoietisk stilk og stamfader celler (HSCs og HPs), men kan tilpasses til analyse af andre cellepopulationer.
1. flow flowcytometri Isolation af Murine HSCs og HPs
- Høste murine knoglemarv celler, som beskrevet i litteraturen6.
NOTE: Data præsenteret i figur 1 og figur 2, knoglemarv er høstet fra C57BL/6J mus. - Udføre lineage udtynding af knoglemarv celler ved hjælp af en mus lineage udtynding kit, efter fabrikantens anvisninger.
- Inkuber celler med antistoffer mod de celle overflade markører af interesse som beskrevet7. I forsøgene vist i figur 1 og figur 2, bruges antistoffer til Sca-1, Kit, Flt3 og afstamning (Lin) markører Mac1, Gr1, CD3e, B220 og Ter119.
- Sortere 2.000-20.000 Lin- Sca1+Kit+ Flt3- celler (HSCs) eller Lin-Sca1-Kit+ celler (HPs) i 1,5 mL Eppendorf-rør indeholdende 0,1 mL af phosphat bufferet saltvand (PBS) med 2% føtal kvæg serum (FBS).
Bemærk: De data, der er vist i figur 1 og figur 2celler blev sorteret ved hjælp af en Flow Flowcytometret med en 70 µM dyse. Den maksimale samling volumen er 1,4 mL.
2. Prøvetilberedning
Bemærk: Dette trin er kritisk. Behandle prøven meget omhyggeligt. Når du fjerner supernatanten, være meget omhyggelig med ikke at forstyrre den celle pellet.
- 1,5 mL centrifugeglas sorteret celler i en swingende spand rotoren ved 4 ° C, 500 x g, i 5 min. Fjern alle, men ca 100 µL af supernatanten fra cellen pellet meget forsigtigt ved hjælp af en pipette, og en 20 µL afpipetteres tip. Lave ikke forstyrre pelleten.
- Hvis prøven indeholder færre end 5.000 celler, og det samlede volumen af den sorterede prøve er mindre end 0,2 mL, overføre cellerne først at lave bindende 0,2 mL PCR rør inden centrifugering.
- Hvis prøven indeholder færre end 5.000 celler og volumen er mere end 0,2 mL, spin cellerne ned med en centrifuge ved 4 ° C, 500 x g, i 5 min, og fjern alle, men 200 µL af supernatanten. Genopslæmmes pelleted cellerne i de resterende 200 µL af supernatanten, og derefter overføre cellerne til 0,2 mL PCR rør og spin ned igen. Fjern alle men 20-30 µL fra toerstoffet efter den anden spin og genopslæmmes celler.
- Resuspend celler i supernatanten venstre i røret. Om nødvendigt tilsættes ekstra PBS i 2% FBS/PBS (du kan også bruge 2% bovint serumalbumin (BSA) / PBS eller PBS alene) at opnå en koncentration 5 x104 til 5 x 105 celler/mL.
Bemærk: Brug cellen tæller indsamlet ved flowcytometri til at anslå den diskenhed, der bruges til at suspendere celler. - Bruge 2-5 µL af de re suspenderede celler til at bestemme en nøjagtig celle koncentration ved hjælp af en automatiseret celle counter (efter producentens anvisninger) eller en hemocytometer9.
- Overføre et volumen på re suspenderede celler, der indeholder det ønskede antal celler til nye 1,5 mL rør. Til forsøget i figur 1, blev 2.000, 1.000 eller 500 HSCs eller HPs overført. Det ønskede antal celler afhænger af styrken signalet fremstillet af vestlige skamplet, og bestemmes empirisk. Udføre overførslen ved hjælp af en 20 µL eller 100 µL Eppendorf pipette tip.
- Der centrifugeres celler i en swingende spand rotoren ved 4 ° C, 500 x g, i 5 min.
- For at generere 100 x stamopløsninger, opløses proteasom og fosfatase hæmmere i DMSO ifølge producentens anvisninger.
- Forberede 2 x Laemmli prøvebuffer ved at fortynde den 4 x Laemmli prøvebuffer leveret af producenten med en tilsvarende mængde destilleret vand. Tilføje en passende mængde af 100 x beholdningen af proteasom og fosfatase hæmmere at opnå en endelig koncentration på 2 x hæmmere i 2 x Laemmli prøvebuffer.
Bemærk: De 2 x Laemmli prøvebuffer kan gøres på forhånd, men de proteasom og fosfatase hæmmere lægges umiddelbart før du tilføjer den 2 x Laemmli prøvebuffer (plus hæmmere) til celle pellet for at lyse celler, som beskrevet i de følgende trin. - Omhyggeligt fjerner en del af supernatanten fra celle pellet, og supernatanten tilbage i røret med celle pellet, tilføje et lige saa stort volumen af 2 x Laemmli prøvebuffer plus proteasom og fosfatase hæmmere at opnå en slutkoncentration på 500 celler/mikroliter i 1 x Laemmli prøvebuffer.
Bemærk: For eksempel, hvis du overfører 2.000 celler i en samlet maengde paa 20 µL til en tube i trin 2.5, efter centrifugering celler (trin 2.6) du bør fjerne 18 µL af supernatanten fra pellet, og at de 2 µL af supernatanten, der er tilbage, tilføje en tilsvarende mængde (2 µL) 2 x Laemmli prøvebuffer at opnå en slutkoncentration på 500 celler/mikroliter i 1 x Laemmli prøvebuffer. - Resuspenderes for at generere den lysate så hurtigt som muligt. På dette tidspunkt, prøverne kan straks electrophoresed gennem SDS-PAGE geler, eller kan være snap frosset i flydende N2 og opbevares ved-80 ° C til fremtidig brug.
3. elektroforese
- Opvarme lysates i en varme blok ved 95 ° C eller i kogende vand i 5 min.
- Electrophorese 1-40 µL af lysates (indeholdende fra 500 op til 20.000 celle ækvivalenter) gennem SDS-PAGE geler på 100V bruger standardprotokoller10.
Bemærk: Volumen af lysate indlæses i gelen bestemmes af antallet af celler, der er nødvendige for at generere det ønskelige signal, og vil afhænge af overfloden af protein af interesse, og kvaliteten af antistoffet. Dataene i figur 1 er fremstillet med 2.000, 1.000 og 500 celle ækvivalenter af lysate. Bredde af brønden skal være i rækken af 3 mm til 1,5 mm. 1,5 mm tænder kan være skåret fra et kommercielt tilgængelige kam med bredere tænder ved hjælp af saks.
4. overførsel og blokere
Bemærk: Udføre en vestlige skamplet efter standardprotokoller11. Trinene er kort beskrevet her:
- Forbehandle en polyvinylidene xenondifluorid (PVDF) membran med methanol for 10 s, så vask membranen kort med destilleret vand.
- Overføre proteinet fra SDS-PAGE gel til membranen følge vejledningen i den håndbog, leveret af fabrikanten af apparatet overførsel.
- Efter overførslen, blokere membran med 2 mL 5% bovint serumalbumin (BSA) i PBST (PBS med 0,1% Tween) natten over ved 4 ° C efter standardprotokoller11.
5. antistof mærkning
- Inkuber membran med antistoffer på en shaker natten over ved 4 ° C ved hjælp af antistof fortyndinger anbefalet af leverandøren.
NOTE: I tabellen materialer, antistoffer, som vi har godkendt til HSCs og HPs og de tilsvarende antistof fortyndinger, er vist. Udføre antistof mærkning ved hjælp af standardprocedurer8.
6. registrering
- Vask membranen 3 gange, 5 min til hver vask i PBST ved stuetemperatur.
- Inkuber membran med 2 mL af forbedrede kemiluminescens buffer i 1 minut ved stuetemperatur. Registrere signaler ved hjælp af et billedbehandlingssystem efter producentens anvisninger, eller Autoradiografi film og film processor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Repræsentative resultater fra 500-2.000 renset HSCs og HPs er vist i figur 1 og figur 2. Β-actin signalet i figur 1 kan registreres fra så få som 500 HSCs og HPs renset fra knoglemarven af en mus. Bemærk, at indlæse lysates i 1,5 mm brønde produceret en meget stærkere signal fra 500 HPs end lastning i 3,0 mm brønde. Figur 2 er en Western blot af EIF4G og fosforylering af Rps6 (p-Rps6), som begge er involveret i reguleringen af protein oversættelse12, i HSCs, og i HPs med og uden stimulation af stamceller faktor (SCF) i vitro.
Figur 1: vestlige skamplet for β-actin udført med lysates fra murine HSCs og HPs. HSCs blev sorteret fra lineage forarmet murine knoglemarv celler som Lin-Sca1+Kit+ Flt3- celler og HPs var Lin-Sca1-Kit+. Lysates fremstillet af forskellige antal celler blev electrophoresed gennem en 12% SDS-PAGE gel tilberedt med mini glasplader med 1 mm spacere. Skamplet var probed med antistof til β-actin. Skamplet viser sammenlignende β-actin signaler fra 500 til 2.000 HPs når lysates blev indlæst i 1,5 mm brønde (baner 4-6) i forhold til 3 mm brønde (baner 1 - 2). Lysates fra 2.000 til 500 celler blev læsset på baner 7 til 9. Møller, molekylvægt markører. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Western Blot analyse af frisk isoleret HSCs og HPs stimuleret in vitro- med cytokin stamcelle faktor (SCF). HPs blev renset af fluorescens aktiveret celle sortering (FACS), centrifugeres, genopslemmes i 2% FBS/PBS, tælles, så delt i to rør. HPs i det første rør blev stimuleret med SCF (10 ng/mL) for 5 min. ved 37 ° C (+ SCF) og HPs i anden rør var kulturperler i 5 min i mangel af SCF (-SCF). Cellerne blev derefter centrifugeres og celle toerstoffet mængden med Laemmli prøvebuffer. HSCs blev renset og direkte mængden med Laemmli prøvebuffer uden dyrkning. Lysates blev indlæst i 1,5 mm brønde og electrophoresed gennem 12% SDS-PAGE geler. Skamplet blev udviklet med antistoffer mod igangsættende strækningsfaktor 4G (EIF4G), β-actin og fosforyleres lille ribosomet subunit S6 (p-Rps6). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Western Blotting er en almindelig teknik til påvisning af specifikke proteiner og aktivering af signaling veje i væv eller celler. Ved at indføre små justeringer til et almindeligt anvendte procedure, var vi købedygtig rutinemæssigt opdager 15 forskellige proteiner (Table of Materials) 15.000 HSCs, og i nogle tilfælde i så få som 500 HSCs. The most kritiske trin i denne protokol er: 1) præcist at tælle cellerne, 2) minimere antallet af overførsler mellem rør og 3) lysing celler direkte med Laemmli prøvebuffer. Når lysing celle pellet med Laemmli prøvebuffer, fandt vi der i stedet for at fjerne alle supernatant fra celle pellet og re suspendere det i Laemmli prøvebuffer, hvis vi i stedet forlod en lille mængde af supernatanten i røret og tilføjet en tilsvarende mængden af 2 x Laemmli prøvebuffer, kunne vi undgå celletab. Centrifugering celler i en swingende spand rotor faldt også risikoen for celletab. At reducere bredden af brønden ved at trimme kam tænder forbedret følsomheden af påvisning.
Med disse enkle justeringer til proceduren har vi kunnet opnå reproducerbare resultater svarende til dem i offentliggjorte papirer, der havde brugt 10 - 20 gange flere celler3,4,5,6, 7. yderligere, at blots kan blive strippet for re blotting følge standard procedurer13, øge mængden af oplysninger, der kan fås fra et lille antal celler. Evnen til at opdage proteiner af interesse vil være begrænset af kvaliteten af antistoffet og protein overflod. Denne modificerede teknik skal reducere antallet af dyr, der er nødvendige for at opnå protein data fra sjældne cellepopulationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikt at erklære.
Acknowledgments
National Institutes of Health give R01 CA149976 (Nielsen) støttet dette arbejde.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| sodium dodecyl sulfate (SDS) | Fisher Scientific | BP166-500 | SDS-PAGE |
| TEMED | Fisher Scientific | BP150-20 | SDS-PAGE |
| 30% Acrylamidel Bis solution | Bio-Rad | 1610158 | SDS-PAGE |
| 1.5M Tris-HCl pH8.8 | TEKNOVA | T1588 | SDS-PAGE |
| 1.0M Tris-HCl pH6.8 | TEKNOVA | T1068 | SDS-PAGE |
| Ammonium Persulfate | Fisher Scientific | BP179-25 | SDS-PAGE |
| mini-protean 3 comb | Bio-Rad | 1653360 | SDS-PAGE |
| Mini-PROTEAN Tetra Cell | Bio-Rad | 1658005EDU | SDS-PAGE |
| Transfer System | Bio-Rad | 1704155EDU | transfer |
| PowerPac HC Power Supply | Bio-Rad | 1645052EDU | electrophoresis |
| Imaging System | Bio-Rad | 1708195 | signal detection |
| 4x Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 1610747EDU | sample preparation |
| 10x Tris/Glycine/SDS Electrophoresis Buffer | Bio-Rad | 1610732EDU | electrophoresis |
| 2-Mercaptoethanol | Bio-Rad | 1610710EDU | sample preparation |
| RTA Mini PVDF Transfer Kit, for 40 blots | Bio-Rad | 1704272 | transfer |
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma | 11697498001 | sample preparation |
| Phosphatase Inhibitor Cocktailrs | Gold Biotechnology | GB-450-1 | sample preparation |
| EIF4G | Cell signaling | 2469 | WB antibody, validated in 1000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): Fig2 |
| p-Rps6 | Cell signaling | 4858 | WB antibody,validated in 1000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): Fig2 |
| actin(HRP conjugated) | abcam | ab49900 | WB antibody,validated in 500 cells antibody concentration: 1:5000 reference(figure): Fig1, Fig2 |
| LC-3 | Abcam | ab48394 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig5) |
| S6 | Cell Signaling | 2317 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig4) |
| 4EBP1 | Cell Signaling | 9644 | WB antibody, validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig4) |
| p-4EBP1 | Cell Signaling | 2855 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig4) |
| TSC2 | Cell Signaling | 4308 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig4) |
| HSP90 | Cell Signaling | 4877 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig5) |
| PTEN | Cell Signaling | 9188 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (FigS1) |
| mTOR | Cell Signaling | 2983 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (FigS1) |
| p-mTOR | Cell Signaling | 5536 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (FigS1) |
| PP2AB | Cell Signaling | 4953 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (FigS1) |
| p-AMPKa | Cell Signaling | 2535 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (FigS1) |
| actin | Santa Cruz | sc-47778 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:3000 reference(figure): ref5 (Fig4) |
| lineage depletion kit (mouse) | Miltenyi Biotec | 130-090-858 | hematopoietic stem and progenitor cells purification |
| LS columns | Miltenyi Biotec | 130-041-305 | hematopoietic stem and progenitor cells purification |
| SCF | PeproTech | 250-03 | phosphorylation stimulation |
| APC-Cy7 c-kit antibody | ThermoFisher | A15423 | cell sorting |
| anti-B220 | ThermoFisher | 48-0452-82 | cell sorting |
| anti-CD3e | ThermoFisher | 48-0031-82 | cell sorting |
| anti-Mac1 | ThermoFisher | 48-0112-82 | cell sorting |
| anti-Gr1 | ThermoFisher | 48-5931-82 | cell sorting |
| anti-Ter119 | ThermoFisher | 48-5921-82 | cell sorting |
| Spacer Plates with 1.0 mm Integrated Spacers | Bio-Rad | 1653311 | SDS-PAGE |
| BSA | Research Products International | A30075 | membrane blocking |
| serum | Atlanta Biologicals | A12450 | medium supplement |
| cell counter | Invitrogen | AMQAF1000 | cell counting |
| hemocytometer | ThermoFisher | S17040 | cell counting |
| flim | Denville Scientific | E3012 | signal detection |
| medical film processor | Konica | SRC-101A | signal detection |
| Supersignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate | Therom Scientific | 34096 | signal detection |
| Allegra X-15R Centrifuge (Rotor SX4750A) | Beckman Coulter | X-15R | sample preparation |
| BLUEstain protein ladder | Gold Biotechnology | P007-500 | electrophoresis |
| cell sorter | BD | FACSAria II | sample preparation |
| Incublock | Denville Scientific | I0510 | electrophoresis |
References
- Krutzik, P. O., Clutter, M. R., Nolan, G. P. Coordinate analysis of murine immune cell surface markers and intracellular phosphoproteins by flow cytometry. J Immunol. 175 (4), 2357-2365 (2005).
- Du, J., et al. Signaling profiling at the single-cell level identifies a distinct signaling signature in murine hematopoietic stem cells. Stem Cells. 30 (7), 1447-1454 (2012).
- Signer, R. A., Magee, J. A., Salic, A., Morrison, S. J. Haematopoietic stem cells require a highly regulated protein synthesis rate. Nature. 509 (7498), 49-54 (2014).
- Wang, J., et al. A differentiation checkpoint limits hematopoietic stem cell self-renewal in response to DNA damage. Cell. 148 (5), 1001-1014 (2012).
- Hoshii, T., et al. mTORC1 is essential for leukemia propagation but not stem cell self-renewal. J Clin Invest. 122 (6), 2114-2129 (2012).
- Signer, R. A., et al. The rate of protein synthesis in hematopoietic stem cells is limited partly by 4E-BPs. Genes Dev. 30 (15), 1698-1703 (2016).
- Cai, X., et al. Runx1 deficiency decreases ribosome biogenesis and confers stress resistance to hematopoietic stem and progenitor cells. Cell Stem Cell. , (2015).
- Loven, J., et al. Revisiting global gene expression analysis. Cell. 151 (3), 476-482 (2012).
- JoVE Science Education Database. Using a Hemoacytometer to Count Cells. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2017).
- JoVE Science Education Database. Separating Protein with SDS-PAGE. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2017).
- JoVE Science Education Database. The Western Blot. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2017).
- Jackson, R. J., Hellen, C. U., Pestova, T. V. The mechanism of eukaryotic translation initiation and principles of its regulation. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (2), 113-127 (2010).
- Eaton, S. L., et al. A guide to modern quantitative fluorescent western blotting with troubleshooting strategies. J Vis Exp. (93), e52099 (2014).
