Summary
Un standard Western blotting protocollo è stato ottimizzato per analizzare come pochi come 500 ematopoietiche staminali o cellule progenitrici. Ottimizzazione comporta un'attenta manipolazione del campione cellulare, limitando i trasferimenti tra tubi e Lisi direttamente le cellule in tampone di Laemmli.
Abstract
Cellule staminali ematopoietiche (HSCs) sono cellule rare, con il midollo osseo di topo contenente solo ~ 25.000 fenotipica lungo termine repopulating HSCs. Un protocollo macchiante occidentale è stata ottimizzata e adatta per l'analisi di un piccolo numero di HSCs (500-15.000 cellule). Fenotipica HSCs sono stati purificati, accuratamente contati e direttamente lisate nel tampone di Laemmli. Lisati contenente un numero uguale di cellule sono stati analizzati mediante elettroforesi del gel di poliacrilammide del sodio dodecil solfato (SDS-PAGE) e la macchia è stata preparata ed elaborato seguendo standard Western blotting protocolli. Usando questo protocollo, 2.000-5.000 HSCs può essere analizzato sistematicamente, e in alcuni casi i dati possono essere ottenuti da poco più di 500 cellule, confrontate alle cellule 20.000 a 40.000 segnalate nella maggior parte delle pubblicazioni. Questo protocollo dovrebbe essere generalmente applicabile ad altre cellule ematopoietiche e consente l'analisi di routine di un piccolo numero di celle utilizzando le procedure standard di laboratorio.
Introduction
Cellule staminali ematopoietiche (HSCs) sono cellule autorinnovabile che possono dare origine a tutti i lignaggi di sangue. Essi sono relativamente rare cellule nel midollo osseo, rendendo difficile analisi biochimiche. Adatto per l'analisi di cellule rare, come la citometria a flusso, gli approcci sono stati estremamente utili per quantificare la quantità relativa di marcatori di superficie delle cellule e proteine intracellulari. Tuttavia, l'analisi delle proteine intracellulari richiede l'uso di procedure di permeabilizzazione delle cellule per consentire l'accesso dell'anticorpo, e non tutte le superficie epitopi sopravvivono queste procedure1,2. Inoltre, gli anticorpi che discriminano tra prodotti di isoforme o scissione di diverse proteine non sono spesso disponibili per citometria a flusso, e quindi gli investigatori si basano ancora su Western blot per determinati tipi di analisi.
L'analisi Western blot dei lisati cellulari è una procedura di routine nella maggior parte dei laboratori. Le cellule possono essere purificate in condizioni native che conservano gli epitopi di molecole della superficie cellulare e lisati cellulari possono successivamente essere preparati ed analizzati. Tuttavia, l'analisi delle proteine nella cellula primaria rara popolazioni mediante Western blot può richiedere gran numero di animali per ottenere abbastanza cellule di eutanasia. Apportando piccole modifiche a diversi passi, un protocollo macchiante occidentale convenzionale è stato in grado di rilevare le proteine in un relativamente piccolo numero di HSCs (500-15.000, a seconda della proteina di interesse). Le regolazioni sono accuratamente contando le cellule, gestire attentamente il pellet cellulare, riducendo i trasferimenti delle cellule fra tubi per ridurre al minimo la perdita delle cellule, e un numero definito di cellule con un carico concentrato di lisi del buffer contenente proteasoma e inibitori delle fosfatasi. Molti rapporti pubblicati includono Western blot ottenuti con 20.000 o più HSCs3,4,5,6,7; Questa semplice procedura ridurrà il numero delle cellule e animali da esperimento necessari per produrre dati equivalenti di compreso tra 4 e 40 volte. Il protocollo è progettato per normalizzare i risultati su base per cella, piuttosto che ad un controllo interno. Questo consente il rilevamento di riduzioni complessive nei livelli della proteina che possono essere trascurati se i dati sono normalizzati ad un controllo interno. L'importanza della normalizzazione su base per cellula è stato descritto per l'analisi dei dati di espressione genica8, e lo stesso principio si applica a quantificare le proteine mediante Western blot. Questo protocollo ottimizzato dovrebbe essere utile per chiunque abbia bisogno di analizzare un piccolo numero di cellule.
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Protocol
Tutte le procedure devono essere eseguite conformemente all'uso animale istituzionale e orientamenti di cura. La procedura è stata sviluppata per l'analisi di murine cellule ematopoietiche staminali e progenitrici (HSCs e HPs), ma può essere adattata per l'analisi di altre popolazioni cellulari.
1. flusso Cytometry isolamento di HSCs murino e HPs
- Raccogliere le cellule del midollo osseo murino come descritto in letteratura6.
Nota: Nei dati presentati in Figura 1 e Figura 2, midollo osseo è stato raccolto da topi C57BL/6J. - Eseguire svuotamento di stirpe delle cellule di midollo osseo utilizzando un kit di svuotamento lignaggio di mouse, seguendo le istruzioni del produttore.
- Incubare le cellule con gli anticorpi contro i marcatori di superficie delle cellule di interesse come descritto7. Negli esperimenti illustrati nella Figura 1 e Figura 2, sono utilizzati anticorpi Sca-1, Kit, Flt3, e dei marcatori di lignaggio (Lin) Mac1, Gr1, CD3e, B220 e Ter119.
- Ordinare le 2.000-20.000 Lin– Sca1+Kit+ Flt3– le cellule (HSCs) o Lin–Sca1–cellule Kit+ (HPs) in una provetta Eppendorf da 1,5 mL contenente 0,1 mL di fosfato tampone salino (PBS) con 2% fetale bovino siero (FBS).
Nota: Per i dati mostrati nella Figura 1 e Figura 2, le cellule erano ordinate utilizzando un citometro a flusso con un ugello di 70 µM. Il volume massimo collezione è 1,4 mL.
2. preparazione del campione
Nota: Questo passaggio è fondamentale. Elaborare il campione molto attentamente. Quando si rimuove il supernatante, essere molto attenti a non disturbare il pellet cellulare.
- Il 1.5 mL provette contenenti cellule ordinate in un rotore oscillante a 4 ° C, 500 x g, per 5 min. Rimuovi tutti, ma circa 100 µ l del surnatante dalla cella a pellet molto delicatamente utilizzando una pipetta e una punta di dispensare 20 µ l. Non disturbare il pellet.
- Se il campione contiene meno di 5000 cellule e il volume totale del campione ordinato è inferiore a 0,2 mL, trasferire le cellule prima di provette per PCR 0,2 mL obbligatoria bassa prima centrifugazione.
- Se il campione contiene meno di 5000 cellule e il volume è superiore a 0,2 mL, rallentare le cellule con una centrifuga a 4 ° C, 500 x g, per 5 min e rimuovete tutti ma 200 µ l del surnatante. Risospendere le cellule pellettate nei restanti 200 µ l di supernatante, poi trasferire le cellule per le provette per PCR 0,2 mL e girare di nuovo verso il basso. Rimuovere tutti i ma 20-30 µ l dal pellet dopo il secondo giro e risospendere le cellule.
- Risospendere le cellule in surnatante a sinistra nel tubo. Se necessario, aggiungere ulteriori PBS nel 2% FBS/PBS (è anche possibile utilizzare 2% albumina di siero bovino (BSA) / PBS, o PBS da solo) per ottenere una concentrazione 5 x104 a 5 x 105 cellule/mL.
Nota: Utilizzare la cella conta raccolti mediante citometria a stimare il volume utilizzato per sospendere le cellule. - Utilizzare 2-5 µ l delle cellule ri-sospensione per determinare una concentrazione di cellule accurato utilizzando un contatore di cellule automatizzato (seguendo le istruzioni del produttore) o un emocitometro9.
- Trasferire un volume di ri-sospensione celle contenenti il numero desiderato di cellule in nuove provette da 1,5 mL. Per l'esperimento in Figura 1, 500, 1.000 o 2.000 HSCs o HPs sono stati trasferiti. Il numero di celle desiderato dipende dalla forza del segnale ottenuto mediante Western blot e viene determinato empiricamente. Eseguire il trasferimento utilizzando un 20 µ l o 100 µ l Eppendorf pipetta.
- Centrifugare le cellule in un rotore oscillante a 4 ° C, 500 x g, per 5 min.
- Per generare soluzioni di riserva: 100x, sciogliere gli inibitori del proteasoma e fosfatasi in DMSO secondo le istruzioni del produttore.
- Preparare 2 x Laemmli tampone diluendo la 4 x Laemmli sample buffer fornito dal produttore con una quantità equivalente di acqua distillata. Aggiungere una quantità appropriata di stock 100x di inibitori del proteasoma e fosfatasi per ottenere una concentrazione finale di 2 inibitori di x nel 2 buffer del campione di x Laemmli.
Nota: Il tampone del campione x Laemmli 2 può essere fatta in anticipo, ma gli inibitori del proteasoma e fosfatasi devono essere aggiunto immediatamente prima di aggiungere il 2 x Laemmli tampone (più inibitori) per il pellet cellulare per lisare le cellule, come descritto nel passaggio seguente. - Con attenzione rimuovere una porzione del supernatante dal pellet e al supernatante restanti nel tubo con il pellet cellulare, aggiungere un volume equivalente di tampone del campione x Laemmli 2 più inibitori del proteasoma e fosfatasi per ottenere una concentrazione finale di 500 cellule / µ l in 1 tampone del campione x Laemmli.
Nota: ad esempio, se si trasferiscono 2.000 cellule in un volume totale di 20 µ l per un tubo nel punto 2.5, dopo centrifugazione le cellule (passo 2.6) si dovrebbe rimuovere 18 µ l del supernatante dal pellet e per i 2 µ l di supernatante che rimane aggiungere un volume uguale (2 µ l) di 2 x Laemmli buffer del campione per ottenere una concentrazione finale di 500 cellule / µ l in 1 tampone del campione x Laemmli. - Risospendere il pellet per generare il lisato appena possibile. A questo punto, i campioni possono essere immediatamente electrophoresed attraverso i gel di SDS-PAGE, oppure può essere snap congelato nel liquido N2 e conservati a-80 ° C per un uso futuro.
3. elettroforesi
- Riscaldare i lisati in un blocco di calore a 95 ° C o in acqua bollente per 5 min.
- Electrophorese 1-40 µ l dei lisati (contenente da 500 a 20.000 equivalenti di cella) attraverso gel SDS-PAGE, a 100V, utilizzando protocolli standard10.
Nota: Il volume di lisato caricati nel gel è determinato dal numero di cellule necessarie per generare il segnale desiderabile e dipenderà l'abbondanza della proteina di interesse e la qualità dell'anticorpo. I dati nella Figura 1 sono stati ottenuti con 2.000, 1.000 e 500 equivalenti di cella di lisato. La larghezza del pozzo dovrebbe essere nella gamma di 3 mm a 1,5 mm. 1,5 mm denti possono essere tagliata da un pettine di commercialmente disponibile con denti più ampia con le forbici.
4. trasferimento e bloccare
Nota: Eseguire un Western blot seguendo protocolli standard11. I passaggi sono brevemente descritte qui:
- Pretrattare una membrana di polivinilidene difluoruro (PVDF) con metanolo per 10 s, quindi lavare la membrana brevemente con acqua distillata.
- Trasferire le proteine dal gel SDS-PAGE alla membrana seguendo le istruzioni riportate nel manuale fornito dal costruttore dell'apparato di trasferimento.
- Dopo il trasferimento, bloccare la membrana con 2 mL di 5% di albumina di siero bovino (BSA) in PBST (PBS con 0,1% Tween) overnight a 4 ° C, seguendo protocolli standard11.
5. anticorpo etichettatura
- Incubare la membrana con anticorpi su un agitatore durante la notte a 4 ° C, utilizzando diluizioni di anticorpo consigliati dal fornitore.
Nota: Nella tabella materiali, gli anticorpi, che abbiamo convalidato per HSCs e HPs e le diluizioni di anticorpo corrispondente, sono indicati. Eseguire l'anticorpo etichettatura utilizzando le procedure standard8.
6. rilevazione
- Lavare la membrana 3 volte, 5 min per ogni lavaggio in PBST a temperatura ambiente.
- Incubare la membrana con 2 mL di tampone di chemiluminescenza per 1 min a temperatura ambiente. Rilevare i segnali utilizzando un sistema di imaging seguendo le istruzioni, o pellicola di autoradiografia e sviluppatrice pellicola del fabbricante.
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Representative Results
Risultati rappresentativi da 500-2.000 purificata HSCs e HPs sono mostrati nella Figura 1 e Figura 2. Il segnale di β-actina nella Figura 1 può essere rilevato da poco più di 500 HSCs e HPs purificate dal midollo osseo di un mouse. Si noti che i lisati di caricamento nei pozzetti di 1,5 mm prodotto un segnale molto più forte da 500 HPs di caricamento nei pozzetti di 3,0 mm. Figura 2 è un Western blot di EIF4G e la fosforilazione di Rps6 (p-Rps6), entrambi i quali sono coinvolti nella regolazione della traduzione della proteina12, nelle HSC e fattore di in HPs con e senza stimolazione di cellule staminali (SCF) in vitro.
Figura 1: Western Blot per la β-actina eseguito con lisati da murino HSCs e HPs. HSC sono state ordinate dalle cellule del midollo osseo murino lignaggio impoverito come Sca1 Lin–+Kit+ Flt3– cellule e HPs sono stati Sca1 Lin––Kit+. Lisati preparati da numeri diversi di celle erano electrophoresed attraverso un gel di SDS-PAGE 12% preparato utilizzando vetro mini piastre con spessori di 1 mm. La macchia è stata sondata con anticorpo β-actina. Il blot Mostra i segnali di β-actina comparativa da 500 a 2.000 HPs quando i lisati sono stati caricati nei pozzetti di 1,5 mm (corsie 4-6) rispetto ai pozzi di 3mm (corsie 1 - 2). Lisati da 2.000 a 500 cellule erano caricati su corsie da 7 a 9. M, marcatori di peso molecolare. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: analisi di Western Blot di recente isolate HSCs e HPs stimolate in vitro con la citochina fattore della cellula formativa (SCF). HPs sono stati purificati da cellule attivate la fluorescenza che ordinano (FACS), centrifugato, risospesi in 2% FBS/PBS, contati, quindi dividere in due tubi. L'HPs nel primo tubo sono stati stimolati con SCF (10 ng/mL) per 5 min a 37 ° C (+ SCF) e HPs nel secondo tubo sono state coltivate per 5 min in assenza di SCF (-SCF). Le cellule sono state poi centrifugate e il pellet di cellule lisate con tampone di Laemmli. HSCs sono stati purificati e lisate direttamente con tampone di Laemmli senza coltura. I lisati venivano caricati in pozzi di 1,5 mm ed electrophoresed attraverso i gel di SDS-PAGE 12%. La macchia è stata sviluppata con gli anticorpi al fattore d'inizio allungamento 4G (EIF4G), β-actina e fosforilato ribosoma piccole subunità S6 (p-Rps6). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Western Blotting è una tecnica comune per la rilevazione di proteine specifiche e l'attivazione di vie di segnalazione in tessuti o cellule. Con l'introduzione di piccole modifiche ad una procedura comunemente utilizzata, siamo stati in grado di rilevare ordinariamente 15 proteine diverse (Tabella materiali) a 15.000 HSCs e in alcuni casi in appena 500 HSCs. Le fasi critiche in questo protocollo sono: 1) accuratamente contando le cellule, 2) riducendo al minimo il numero di trasferimenti tra tubi e 3) le cellule direttamente con tampone di Laemmli di lisi. Quando fare l'elettrolisi del pellet con tampone di Laemmli, abbiamo trovato che piuttosto che rimuovere tutto il supernatante dal pellet e ri-sospendendolo nel Laemmli Buffer del campione, se abbiamo invece lasciato un piccolo volume del surnatante nel tubo e aggiunto un equivalente volume di tampone di Laemmli: 2x, potremmo evitare la perdita delle cellule. Centrifugazione le cellule in un rotore oscillante inoltre ha fatto diminuire il rischio di perdita delle cellule. Ridurre la larghezza del pozzo assettando i denti del pettine migliorata la sensibilità del rilevamento.
Con questi semplici regolazioni per la procedura, siamo stati in grado di ottenere risultati riproducibili equivalenti a quelle in articoli pubblicati che avevano usato 10 - 20 volte più cellule3,4,5,6, 7. più ulteriormente, le macchie possono essere rimossi per ri-macchiare seguendo le procedure standard13, aumentando la quantità di informazioni che possono essere ottenute da un piccolo numero di cellule. La capacità di rilevare le proteine di interesse sarà limitata dalla qualità dell'anticorpo e l'abbondanza di proteine. Questa tecnica modificata dovrebbe ridurre notevolmente il numero di animali necessari per ottenere dati di proteina da popolazioni di cellule rare.
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Disclosures
Gli autori non hanno alcun conflitto di interessi per dichiarare.
Acknowledgments
National Institutes of Health concedere R01 CA149976 (ale) sostenuto questo lavoro.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| sodium dodecyl sulfate (SDS) | Fisher Scientific | BP166-500 | SDS-PAGE |
| TEMED | Fisher Scientific | BP150-20 | SDS-PAGE |
| 30% Acrylamidel Bis solution | Bio-Rad | 1610158 | SDS-PAGE |
| 1.5M Tris-HCl pH8.8 | TEKNOVA | T1588 | SDS-PAGE |
| 1.0M Tris-HCl pH6.8 | TEKNOVA | T1068 | SDS-PAGE |
| Ammonium Persulfate | Fisher Scientific | BP179-25 | SDS-PAGE |
| mini-protean 3 comb | Bio-Rad | 1653360 | SDS-PAGE |
| Mini-PROTEAN Tetra Cell | Bio-Rad | 1658005EDU | SDS-PAGE |
| Transfer System | Bio-Rad | 1704155EDU | transfer |
| PowerPac HC Power Supply | Bio-Rad | 1645052EDU | electrophoresis |
| Imaging System | Bio-Rad | 1708195 | signal detection |
| 4x Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 1610747EDU | sample preparation |
| 10x Tris/Glycine/SDS Electrophoresis Buffer | Bio-Rad | 1610732EDU | electrophoresis |
| 2-Mercaptoethanol | Bio-Rad | 1610710EDU | sample preparation |
| RTA Mini PVDF Transfer Kit, for 40 blots | Bio-Rad | 1704272 | transfer |
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma | 11697498001 | sample preparation |
| Phosphatase Inhibitor Cocktailrs | Gold Biotechnology | GB-450-1 | sample preparation |
| EIF4G | Cell signaling | 2469 | WB antibody, validated in 1000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): Fig2 |
| p-Rps6 | Cell signaling | 4858 | WB antibody,validated in 1000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): Fig2 |
| actin(HRP conjugated) | abcam | ab49900 | WB antibody,validated in 500 cells antibody concentration: 1:5000 reference(figure): Fig1, Fig2 |
| LC-3 | Abcam | ab48394 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig5) |
| S6 | Cell Signaling | 2317 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig4) |
| 4EBP1 | Cell Signaling | 9644 | WB antibody, validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig4) |
| p-4EBP1 | Cell Signaling | 2855 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig4) |
| TSC2 | Cell Signaling | 4308 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig4) |
| HSP90 | Cell Signaling | 4877 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig5) |
| PTEN | Cell Signaling | 9188 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (FigS1) |
| mTOR | Cell Signaling | 2983 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (FigS1) |
| p-mTOR | Cell Signaling | 5536 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (FigS1) |
| PP2AB | Cell Signaling | 4953 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (FigS1) |
| p-AMPKa | Cell Signaling | 2535 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (FigS1) |
| actin | Santa Cruz | sc-47778 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:3000 reference(figure): ref5 (Fig4) |
| lineage depletion kit (mouse) | Miltenyi Biotec | 130-090-858 | hematopoietic stem and progenitor cells purification |
| LS columns | Miltenyi Biotec | 130-041-305 | hematopoietic stem and progenitor cells purification |
| SCF | PeproTech | 250-03 | phosphorylation stimulation |
| APC-Cy7 c-kit antibody | ThermoFisher | A15423 | cell sorting |
| anti-B220 | ThermoFisher | 48-0452-82 | cell sorting |
| anti-CD3e | ThermoFisher | 48-0031-82 | cell sorting |
| anti-Mac1 | ThermoFisher | 48-0112-82 | cell sorting |
| anti-Gr1 | ThermoFisher | 48-5931-82 | cell sorting |
| anti-Ter119 | ThermoFisher | 48-5921-82 | cell sorting |
| Spacer Plates with 1.0 mm Integrated Spacers | Bio-Rad | 1653311 | SDS-PAGE |
| BSA | Research Products International | A30075 | membrane blocking |
| serum | Atlanta Biologicals | A12450 | medium supplement |
| cell counter | Invitrogen | AMQAF1000 | cell counting |
| hemocytometer | ThermoFisher | S17040 | cell counting |
| flim | Denville Scientific | E3012 | signal detection |
| medical film processor | Konica | SRC-101A | signal detection |
| Supersignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate | Therom Scientific | 34096 | signal detection |
| Allegra X-15R Centrifuge (Rotor SX4750A) | Beckman Coulter | X-15R | sample preparation |
| BLUEstain protein ladder | Gold Biotechnology | P007-500 | electrophoresis |
| cell sorter | BD | FACSAria II | sample preparation |
| Incublock | Denville Scientific | I0510 | electrophoresis |
References
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