Summary
Un standard Western blotting protocole a été optimisé pour analyser aussi peu que 500 souches hématopoïétiques ou de cellules progénitrices. Optimisation implique attention manipulation de l’échantillon cellulaire, limiter les transferts entre les tubes et lyse directement les cellules de la mémoire tampon de Laemmli témoin.
Abstract
Les cellules souches hématopoïétiques (CSH) sont des cellules rares, avec la moelle osseuse de souris contenant seulement ~ 25 000 phénotypique long terme autorenouveler repopulation. Un protocole Western Blot a été optimisé et adapté à l’analyse d’un petit nombre de CSH (500-15 000 cellules). Autorenouveler phénotypiques ont été purifiés, compté avec précision et lysées directement dans la mémoire tampon de Laemmli témoin. Lysats contenant un nombre égal de cellules ont été analysés par électrophorèse en gel de polyacrylamide sodium dodécyl sulfate (SDS-PAGE), et la tache a été préparée et traitées suite à la série Western blotting protocoles. Utilisant ce protocole, 2 000-5 000 CSH peut être systématiquement analysée, et dans certains cas peuvent être tirées d’aussi peu que 500 cellules, par rapport à des cellules de 20 000 à 40 000 rapportés dans la plupart des publications. Ce protocole devrait être généralement applicable à d’autres cellules hématopoïétiques et permet l’analyse de routine d’un petit nombre de cellules à l’aide de procédures standard de laboratoire.
Introduction
Les cellules souches hématopoïétiques (CSH) sont autorenouvellement des cellules qui peuvent donner lieu à toutes les lignées de sang. Ils sont relativement rares cellules dans la moelle osseuse, analyses biochimiques de rendu difficile. Approprié pour l’analyse des cellules rares, comme la cytométrie en flux, des approches ont été très utiles pour quantifier les quantités relatives des marqueurs de surface de cellules et de protéines intracellulaires. Cependant, l’analyse des protéines intracellulaires nécessite l’utilisation de procédures de perméabilisation de cellules pour permettre l’accès d’anticorps, et pas tous les épitopes de surface survivent ces procédures1,2. En outre, les anticorps qui établissent une discrimination entre les produits de différentes protéines isoformes ou de clivage ne sont pas souvent disponibles pour cytométrie en flux, et donc enquêteurs comptent encore sur les transferts Western pour certains types d’analyses.
Analyse par Western blot des lysats cellulaires est une procédure de routine dans la plupart des laboratoires. Cellules peuvent être épurées dans des conditions natives qui préservent les épitopes de molécules de surface de cellules, et par la suite, lysats cellulaires peuvent être préparés et analysés. Cependant, l’analyse des protéines dans des cellules primaires rares populations par Western blot peut exiger euthanasier un grand nombre d’animaux pour obtenir suffisamment de cellules. En faisant de petits ajustements à plusieurs étapes, un protocole épongeant occidental conventionnel a été en mesure de détecter les protéines dans un relativement petit nombre de CSH (500-15 000, selon la protéine d’intérêt). Les réglages comprennent exactement compter les cellules, manipuler avec précaution le culot cellulaire, réduisant les transferts de cellules entre tubes pour minimiser la perte de cellules, et lyse un nombre défini de cellules avec une charge concentrée de la mémoire tampon contenant du protéasome et inhibiteurs de la phosphatase. Plusieurs rapports publiés incluent des Western blots obtenus avec 20 000 ou plusieurs CSS3,4,5,6,7; Cette procédure très simple permettra de réduire le nombre de cellules et les animaux de laboratoire nécessaires pour produire les données équivalentes d’entre 4 et 40 fois. Le protocole vise à normaliser les résultats sur une base par cellule, plutôt qu’à un contrôle interne. Cela permet de détecter une réduction globale des taux de protéines qui peut être négligée si les données sont normalisées à un contrôle interne. L’importance de la normalisation sur une base par cellule a été décrit pour l’analyse du gène expression données8, et le même principe s’applique à la quantification des protéines par Western blot. Ce protocole optimisé devrait être utile pour tous ceux qui ont besoin d’analyser un petit nombre de cellules.
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Protocol
Toutes les opérations doivent être exécutées conformément aux directives de soins et de l’utilisation institutionnelle des animaux. La procédure a été développée pour l’analyse de des cellules hématopoïétiques souches et progénitrices (CSH et HPs), mais peut être adaptée pour l’analyse des autres populations de cellules.
1. écoulement Cytometry isolement d’autorenouveler murin et HPs
- Récolter les murins de la moelle osseuse des cellules comme décrit dans la littérature6.
Remarque : Dans les données présentées au tableau 1 et Figure 2, la moelle osseuse a été récoltée de souris C57BL/6J. - Effectuer l’appauvrissement de la lignée de cellules de moelle osseuse à l’aide d’un kit souris de lignée épuisement, suivant les instructions du fabricant.
- Incuber les cellules avec des anticorps dirigés contre les marqueurs de surface de cellules d’intérêt comme décrit7. Dans les expériences illustrés à la Figure 1 et Figure 2, anticorps anti-Sca-1, Kit, Flt3 et marqueurs de la lignée (Lin) Mac1, Gr1, CD3e, B220 et Ter119 est utilisées.
- Trier 2 000-20 000 Sca1 de Lin– +Kit+ Flt3 cellules– (CSH) ou Lin–Sca1–cellules Kit+ (HPs) dans des tubes Eppendorf 1,5 mL contenant 0,1 mL de phosphate buffered saline (PBS) avec 2 % fœtale bovine sérum (FBS).
Remarque : Pour les données indiquées dans la Figure 1 et Figure 2, cellules étaient triés à l’aide d’un cytomètre de flux avec un gicleur de 70 µM. Le volume de la collection maximale est de 1,4 mL.
2. préparation de l’échantillon
Remarque : Cette étape est critique. Traiter l’échantillon très soigneusement. Lorsque vous retirez le surnageant, faites très attention à ne pas déranger le culot cellulaire.
- Centrifuger le 1.5 mL tubes contenant des cellules triées dans un rotor oscillant de seau à 4 ° C, 500 g, pendant 5 min. retirer tout sauf environ 100 µL de surnageant de la cellule a granulé très délicatement à l’aide d’une pipette et une pointe de pipette 20 µL. Ne pas déranger le culot.
- Si l’échantillon contient moins de 5 000 cellules, et le volume total de l’échantillon trié est inférieur à 0,2 mL, transférer les cellules tout d’abord à tubes PCR de 0,2 mL de liaison faible avant la centrifugation.
- Si l’échantillon contient moins de 5 000 cellules et le volume est de plus de 0,2 mL, tourner les cellules vers le bas avec une centrifugeuse à 4 ° C, 500 x g, pendant 5 min et supprimer tout sauf 200 µL du liquide surnageant. Remettre en suspension les cellules granulés dans le restant de 200 µL de surnageant, puis transférer les cellules dans les tubes PCR de 0,2 mL et tourner de nouveau vers le bas. Retirer la pastille, mais tous les 20-30 µL après le deuxième tour et remettre en suspension les cellules.
- Remettre en suspension les cellules dans la gauche surnageante dans le tube. Si nécessaire, ajouter PBS supplémentaires chez 2 % FBS/PBS (vous pouvez également utiliser 2 % d’albumine sérique bovine (BSA) / PBS, ou PBS seul) pour obtenir une concentration de 5 x104 à 5 x 105 cellules/mL.
NOTE : Utiliser la numération des lymphocytes collectés par cytométrie de flux pour estimer le volume utilisé pour suspendre des cellules. - 2 à 5 µL de cellules remises en suspension permet de déterminer une concentration de cellules précises à l’aide d’un compteur de cellules automatisées (suivant les instructions du fabricant) ou un hémocytomètre9.
- Transférer un volume de cellules remises en suspension contenant le nombre de cellules dans de nouveaux tubes de 1,5 mL. Pour l’expérience à la Figure 1, 500, 1 000 ou 2 000 csh ou HPs ont été transférés. Le nombre de cellules dépend de la puissance du signal obtenu par Western blot et est déterminé empiriquement. Effectuer le transfert à l’aide d’un 20 µL ou pointe de pipette 100 µL Eppendorf.
- Centrifuger les cellules dans un rotor oscillant de seau à 4 ° C, 500 x g, pendant 5 min.
- Pour générer 100 x solutions courantes, dissoudre les inhibiteurs du protéasome et phosphatase dans le DMSO selon les instructions du fabricant.
- Préparer 2 x Laemmli solution tampon en diluant la 4 x Laemmli solution tampon fourni par le fabricant avec une quantité équivalente d’eau distillée. Ajouter une quantité appropriée de l’encours de 100 x des inhibiteurs du protéasome et phosphatase pour obtenir une concentration finale de 2 inhibiteurs de x à 2 x Laemmli solution tampon.
Remarque : La x Laemmli solution tampon 2 peut être faite à l’avance, mais les inhibiteurs du protéasome et phosphatase devraient être ajoutés immédiatement avant d’ajouter le 2 x Laemmli solution tampon (plus inhibiteurs) pour le culot cellulaire pour lyser les cellules, comme décrit dans l’étape suivante. - Soigneusement, enlever une partie du liquide surnageant du culot cellulaire et le surnageant restant dans le tube avec le culot cellulaire, ajouter un volume égal de 2 x Laemmli solution tampon plus inhibiteurs du protéasome et phosphatase pour obtenir une concentration finale de 500 cellules/µL dans 1 x Laemmli solution tampon.
NOTE : par exemple, si vous passez 2 000 cellules dans un volume total de 20 µL à un tube en étape 2.5, après centrifugation des cellules (étape 2.6), vous devez supprimer 18 µL de surnageant de la pastille et à la 2 µL de liquide surnageant qui est restant ajouter un volume égal (2 µL) de 2 x Laemmli solution tampon pour obtenir une concentration finale de 500 cellules/µL dans 1 x Laemmli solution tampon. - Resuspendre le culot pour générer le lysat dès que possible. À ce stade, les échantillons peuvent être immédiatement PST1 par des gels SDS-PAGE, ou peut être snap figé dans le liquide N2 et stockée à-80 ° C pour une utilisation future.
3. électrophorèse
- Faire chauffer les lysats dans un bloc chauffant à 95 ° C ou dans l’eau bouillante pendant 5 min.
- ELECTROPHORESE 1-40 µL des lysats (contenant de 500 jusqu'à 20 000 équivalents de cellule) par des gels SDS-PAGE à 100V à l’aide de protocoles standard10.
Remarque : Le volume du lysat chargé dans le gel est déterminé par le nombre de cellules nécessaires pour générer le signal souhaitable et dépendra de l’abondance de la protéine d’intérêt et la qualité de l’anticorps. Les données à la Figure 1 ont été obtenues avec 500 équivalents de cellule de lysat, 1 000 et 2 000. La largeur du puits sont de l’ordre de 3 mm à 1,5 mm. 1,5 mm dents peuvent être coupée dans un peigne disponible dans le commerce avec des dents plus larges à l’aide de ciseaux.
4. transfert et bloquer
Remarque : Effectuez une suite de protocoles standard11la tache occidentale. Les étapes sont brièvement décrites ici :
- Pré-traiter une polyvinylidène difluoride (PVDF) membrane avec du méthanol pendant 10 s, puis laver la membrane brièvement avec d’eau distillée.
- La protéine de transfert du gel SDS-PAGE à la membrane en suivant les instructions dans le manuel fourni par le fabricant de l’appareil de transfert.
- Après transfert, bloquer la membrane avec 2 mL de 5 % sérum d’albumine bovine (BSA) dans du PBST (PBS avec 0,1 % Tween) durant la nuit à 4 ° C à la suite de protocoles standard11.
5. anticorps étiquetage
- Incuber la membrane avec des anticorps sur un agitateur pendant une nuit à 4 ° C, en utilisant des dilutions d’anticorps recommandées par le vendeur.
NOTE : Dans la Table des matières, des anticorps, qui nous avons validé pour CSH et HPs et les dilutions d’anticorps correspondants, sont montrées. Effectuer l’étiquetage d’anticorps à l’aide de procédures standard8.
6. détection
- Laver la membrane 3 fois, 5 min pour chaque lavage dans le PBST à température ambiante.
- Incuber la membrane avec 2 mL de tampon de chimiluminescence améliorée pendant 1 min à température ambiante. Détecter les signaux à l’aide d’un système d’imagerie, les instructions, ou film d’autoradiographie et processeur de film du fabricant.
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Representative Results
Des résultats représentatifs de 500-2 000 purifiée autorenouveler et HPs sont indiquées dans la Figure 1 et Figure 2. Le signal de β-actine dans la Figure 1 peut être détecté aussi peu que 500 autorenouveler et HPs purifiée à partir de la moelle osseuse de souris. Notez que les lysats de chargement dans les puits de 1,5 mm produit un signal beaucoup plus fort de 500 HPs chargement dans les puits de 3,0 mm. La figure 2 est une tache occidentale de EIF4G et la phosphorylation de Rps6 (p-Rps6), qui sont impliqués dans la régulation de la traduction protéique12, en CSS et en HPs avec ou sans stimulation par cellules souches factor (SCF) in vitro.
Figure 1 : Western Blot pour β-actine réalisée avec des lysats de murin autorenouveler et HPs. CSH ont été triées de lignée épuisée murine moelle cellules comme Sca1 Lin–+Kit+ Flt3– cellules et HPs ont été Sca1 Lin––Kit+. Lysats préparées à partir d’un nombre différent de cellules ont été plusieurs à travers un gel SDS-PAGE de 12 % préparé à l’aide de plaques de verre mini avec des entretoises de 1 mm. La tache a été sondée avec anticorps anti β-actine. La tache montre les signaux de β-actine comparative de 500 à 2 000 HPs lorsque les lysats ont été chargées dans le puits de 1,5 mm (4-6 voies) par rapport aux puits de 3 mm (voies 1 - 2). Lysats de 2 000 à 500 cellules ont été chargées sur les voies 7 à 9. M, marqueurs de poids moléculaire. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : analyse par Western Blot de CSH fraîchement isolées et HPs stimulée in vitro avec la cytokine Stem Cell Factor (SCF). HPs ont été purifiées par cellule à fluorescence activé triant (FACS), centrifugés, resuspendues dans 2 % FBS/PBS, compté, puis divisée en deux tubes. L’EPS dans le premier tube ont été stimulés par le SCF (10 ng/mL) pendant 5 min à 37 ° C (+ SCF) et HPs dans le second tube ont été cultivés pendant 5 min, en l’absence du SCF (-SCF). Les cellules ont été ensuite centrifugés et le culot de cellules lysées avec tampon de Laemmli sample. CSH ont été purifiés et lysées directement avec tampon de Laemmli échantillon sans culture. Les lysats ont été chargés dans des puits de 1,5 mm et électrophorèse par 12 % des gels SDS-PAGE. La tache a été développée avec des anticorps au facteur déclencheur élongation 4G (EIF4G), β-actine et phosphorylée ribosome petite sous-unité S6 (p-Rps6). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Western Blot est une technique courante pour détecter les protéines spécifiques et l’activation des voies de signalisation dans les tissus ou cellules. Par l’introduction de petits ajustements à une procédure couramment utilisée, nous avons pu détecter systématiquement 15 différentes protéines (Table des matières) dans 15 000 GPX et dans certains cas en aussi peu que 500 CSH. The Most des étapes cruciales dans le présent protocole sont : 1) exactement compter les cellules 2) minimiser le nombre de transferts entre tubes et 3) lyser les cellules directement avec tampon de Laemmli sample. Lorsque lyse le culot cellulaire avec tampon de Laemmli échantillon, nous avons trouvé qui plutôt que d’enlever tout le surnageant du culot cellulaire et re-suspendant dans la solution tampon de Laemmli, si au lieu de cela, nous a laissé un petit volume de liquide surnageant dans le tube et ajouté un équivalent volume de 2 x solution tampon de Laemmli, nous pourrions éviter la perte de cellules. Centrifugation des cellules dans un rotor oscillant de seau diminue aussi le risque de perte de cellules. Réduire la largeur du puits en taillant les dents du peigne a amélioré la sensibilité de détection.
Avec ces réglages simples sur la procédure, nous avons pu obtenir des résultats reproductibles équivalentes à celles des articles publiés qui avaient utilisé des 10 - 20 fois plus cellules3,4,5,6, 7. en outre, les taches peuvent être dépouillés pour re-buvard suit des procédures standard13, augmentant la quantité d’informations pouvant être obtenues d’un petit nombre de cellules. La capacité à détecter des protéines d’intérêt sera limitée par la qualité de l’anticorps et l’abondance de la protéine. Cette technique modifiée devrait considérablement réduire le nombre d’animaux nécessaires à l’obtention de données de protéine de populations cellulaires rares.
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Disclosures
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.
Acknowledgments
National Institutes of Health accorder R01 CA149976 (Nada) prise en charge de ce travail.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| sodium dodecyl sulfate (SDS) | Fisher Scientific | BP166-500 | SDS-PAGE |
| TEMED | Fisher Scientific | BP150-20 | SDS-PAGE |
| 30% Acrylamidel Bis solution | Bio-Rad | 1610158 | SDS-PAGE |
| 1.5M Tris-HCl pH8.8 | TEKNOVA | T1588 | SDS-PAGE |
| 1.0M Tris-HCl pH6.8 | TEKNOVA | T1068 | SDS-PAGE |
| Ammonium Persulfate | Fisher Scientific | BP179-25 | SDS-PAGE |
| mini-protean 3 comb | Bio-Rad | 1653360 | SDS-PAGE |
| Mini-PROTEAN Tetra Cell | Bio-Rad | 1658005EDU | SDS-PAGE |
| Transfer System | Bio-Rad | 1704155EDU | transfer |
| PowerPac HC Power Supply | Bio-Rad | 1645052EDU | electrophoresis |
| Imaging System | Bio-Rad | 1708195 | signal detection |
| 4x Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 1610747EDU | sample preparation |
| 10x Tris/Glycine/SDS Electrophoresis Buffer | Bio-Rad | 1610732EDU | electrophoresis |
| 2-Mercaptoethanol | Bio-Rad | 1610710EDU | sample preparation |
| RTA Mini PVDF Transfer Kit, for 40 blots | Bio-Rad | 1704272 | transfer |
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma | 11697498001 | sample preparation |
| Phosphatase Inhibitor Cocktailrs | Gold Biotechnology | GB-450-1 | sample preparation |
| EIF4G | Cell signaling | 2469 | WB antibody, validated in 1000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): Fig2 |
| p-Rps6 | Cell signaling | 4858 | WB antibody,validated in 1000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): Fig2 |
| actin(HRP conjugated) | abcam | ab49900 | WB antibody,validated in 500 cells antibody concentration: 1:5000 reference(figure): Fig1, Fig2 |
| LC-3 | Abcam | ab48394 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig5) |
| S6 | Cell Signaling | 2317 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig4) |
| 4EBP1 | Cell Signaling | 9644 | WB antibody, validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig4) |
| p-4EBP1 | Cell Signaling | 2855 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig4) |
| TSC2 | Cell Signaling | 4308 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig4) |
| HSP90 | Cell Signaling | 4877 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig5) |
| PTEN | Cell Signaling | 9188 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (FigS1) |
| mTOR | Cell Signaling | 2983 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (FigS1) |
| p-mTOR | Cell Signaling | 5536 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (FigS1) |
| PP2AB | Cell Signaling | 4953 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (FigS1) |
| p-AMPKa | Cell Signaling | 2535 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (FigS1) |
| actin | Santa Cruz | sc-47778 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:3000 reference(figure): ref5 (Fig4) |
| lineage depletion kit (mouse) | Miltenyi Biotec | 130-090-858 | hematopoietic stem and progenitor cells purification |
| LS columns | Miltenyi Biotec | 130-041-305 | hematopoietic stem and progenitor cells purification |
| SCF | PeproTech | 250-03 | phosphorylation stimulation |
| APC-Cy7 c-kit antibody | ThermoFisher | A15423 | cell sorting |
| anti-B220 | ThermoFisher | 48-0452-82 | cell sorting |
| anti-CD3e | ThermoFisher | 48-0031-82 | cell sorting |
| anti-Mac1 | ThermoFisher | 48-0112-82 | cell sorting |
| anti-Gr1 | ThermoFisher | 48-5931-82 | cell sorting |
| anti-Ter119 | ThermoFisher | 48-5921-82 | cell sorting |
| Spacer Plates with 1.0 mm Integrated Spacers | Bio-Rad | 1653311 | SDS-PAGE |
| BSA | Research Products International | A30075 | membrane blocking |
| serum | Atlanta Biologicals | A12450 | medium supplement |
| cell counter | Invitrogen | AMQAF1000 | cell counting |
| hemocytometer | ThermoFisher | S17040 | cell counting |
| flim | Denville Scientific | E3012 | signal detection |
| medical film processor | Konica | SRC-101A | signal detection |
| Supersignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate | Therom Scientific | 34096 | signal detection |
| Allegra X-15R Centrifuge (Rotor SX4750A) | Beckman Coulter | X-15R | sample preparation |
| BLUEstain protein ladder | Gold Biotechnology | P007-500 | electrophoresis |
| cell sorter | BD | FACSAria II | sample preparation |
| Incublock | Denville Scientific | I0510 | electrophoresis |
References
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