Summary
Стандартный западной blotting протокол был оптимизирован для анализа всего лишь 500 гемопоэтических стволовых и прогениторных клеток. Оптимизация предполагает тщательной обработки ячейки выборки, ограничивая передачу между трубами и непосредственно лизировать клетки в буфер Лэмли образца.
Abstract
Гемопоэтических стволовых клеток (СКК) являются редкие клетки, с костного мозга мыши, содержащие только ~ 25000 фенотипические долго срок заселив СКК. Западный blotting протокол был оптимизирован и подходит для анализа небольшого числа СКК (500-15 000 клеток). Фенотипические СКК были очищенный, точно подсчитать и непосредственно лизированы в буфер Лэмли образца. Лизатов, содержащие одинаковое количество клеток были проанализированы электрофорез геля полиакриламида сульфата натрия Додециловый (SDS-PAGE), и пятно был подготовлен и обрабатываются следующие стандартные западной blotting протоколы. Используя этот протокол, 2000-5000 СКК может регулярно анализируются, и в некоторых случаях данные могут быть получены от всего лишь 500 клеток, по сравнению с 20 000 до 40 000 ячеек, сообщили в большинстве публикаций. Этот протокол должен быть в целом применимы для других гемопоэтических клеток и позволяет рутинной анализа небольшого числа клеток с использованием стандартных лабораторных процедур.
Introduction
Гемопоэтические стволовые клетки (СКК) являются самостоятельной возобновление клетки, которые могут привести к крови всех линий. Они являются относительно редкими клеток в костном мозге, затрудняя биохимические анализы. Подходы для анализа редких клеток, таких как проточной цитометрии, оказались чрезвычайно полезными для количественной оценки относительное количество клеток поверхностных маркеров и внутриклеточные белки. Однако анализ внутриклеточных белков требует использования клеток permeabilization процедуры для включения доступа антитела, и не все клетки epitopes поверхности выжить эти процедуры1,2. Кроме того антитела, которые дискриминацию между различными белками изоформ или расщепления продуктов не часто доступны для проточной цитометрии, и поэтому следователи по-прежнему полагаться на западных помарках для определенных видов анализа.
Вестерн-блот анализ lysates клетки является обычной процедурой в большинстве лабораторий. Клетки могут быть очищены в родной условиях, которые сохраняют epitopes клеток поверхности молекул, и lysates клетки впоследствии могут быть подготовлены и проанализированы. Однако может потребовать анализ белков в редких первичной ячейке населения западной помарки, euthanizing большое количество животных, чтобы получить достаточное количество клеток. Делая небольшие изменения в несколько шагов, обычных западных blotting протокол смог обнаружить белков в относительно небольшом количестве СКК (500-15 000, в зависимости от протеина интереса). Корректировки включают точного подсчета клеток, тщательно обработки клеток Пелле, сокращение передачи ячеек между трубы к минимуму потери клеток, и лизировать определенное количество клеток с концентрированной нагрузки буфера содержащие протеасом и битор фосфатазы. Многие опубликованные отчеты включают в себя западные помарки, полученные с 20 000 или более СКК3,4,5,6,7; Эта простая процедура позволит сократить количество клеток и экспериментальных животных, необходимых для производства эквивалентных данных между 4 и 40 раз. Протокол призван нормализовать результаты на основе в ячейке, а не для внутреннего контроля. Это позволяет обнаружение общего сокращения уровня белков, которые могут быть пропущены, если данные нормализованы внутреннего контроля. Важность нормализации на основе в ячейку был описан для анализа данных выражение гена8, и тот же принцип применяется для количественной оценки белков на западную помарку. Это оптимизированный протокол должны быть полезны для тех, кто нужно анализировать небольшое количество клеток.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры должны выполняться в соответствии с институциональной использование животных и ухода за руководящие принципы. Эта процедура была разработана для анализа мышиных гемопоэтических стволовых и прогениторных клеток (СКК и ГЭС), но может быть адаптирована для анализа других клеточных популяций.
1. поток цитометрии изоляции мышиных СКК и ГЭС
- Урожай клеток костного мозга мышиных, как описано в литературе6.
Примечание: Данные представлены на рисунке 1 и на рисунке 2, костного было собрано от мышей C57BL/6J. - Выполняйте истощение линии клеток костного мозга с помощью мыши линии истощения kit, следуя инструкциям производителя.
- Инкубируйте клетки с антителами против клеток поверхностных маркеров, представляющих интерес как описано7. В экспериментах показано на рис.1 и рис.2используются антител к Sca-1, комплект, Flt3 и маркеров родословной (Lin) Mac1, Gr1, CD3e, B220 и Ter119.
- Сортировать 2000-20000 Лин– Sca1++ Flt3 Kit– клетки (СКК) или Линь–Sca1–клетки (HPs) Комплект+ в 1,5 мл Eppendorf пробирки, содержащие 0,1 мл фосфата буфер солевой раствор (PBS) с 2% плода говядину сыворотка (ФБС).
Примечание: Для данных показано на рисунке 1 и на рисунке 2, клетки были отсортированы с помощью потока цитометр с насадкой 70 мкм. Максимальная коллекции объем составляет 1.4 мл.
2. Пробоподготовка
Примечание: Этот шаг очень важен. Процесс образец очень тщательно. При удалении супернатанта, будьте очень осторожны, чтобы не нарушить Пелле ячейки.
- 1,5 мл пробирок содержащий отсортированный клетки в размахивая ведро ротора при температуре 4 ° C, 500 x g, для 5 минут удалить все, но примерно 100 мкл супернатант из ячейки окатышей, очень аккуратно с помощью пипетки и 20 мкл наконечник пипетки. Не беспокоить гранулы.
- Если образец содержит менее 5000 клетки, и общий объем отсортированных образца составляет менее 0,2 мл, передать клетки сначала низкой привязки 0.2 мл ПЦР трубы перед центрифугированием.
- Если образец содержит менее 5000 клетки и объём более 0,2 мл, спина клетки вниз с центрифуги на 4 ° C, 500 x g, при 5 мин и удалите все, кроме 200 мкл супернатант. Вновь приостановить гранулированных ячейки в остальные 200 мкл супернатанта, а затем передать 0.2 мл ПЦР пробирок клетки и спин вниз снова. Удалите все но 20-30 мкл из гранул после второго отжима и вновь приостановить клетки.
- Ресуспензируйте клетки в левом супернатант в трубе. При необходимости добавьте дополнительные PBS в 2% FBS/PBS (вы можете также использовать 2% бычьим сывороточным альбумином (БСА) / PBS, или PBS только) для получения концентрации 5 x104 -5 x 105 кл/мл.
Примечание: Использование клеток собранные цитометрии для оценки объема используется для приостановки клетки. - Используйте 2-5 мкл вновь приостановлено клеток для определения концентрации Точная ячейки, используя счетчик автоматизированных клеток (следуя инструкциям производителя) или Горяева9.
- Передача объем вновь приостановлено клетки, содержащие требуемое количество клеток для новых 1.5 мл пробирок. Для эксперимента на рисунке 12000, 1000, 500 СКК или HPs были переведены. Требуемое количество клеток зависит от силы сигнала, полученные Западная помарка и определяется эмпирически. Выполните передачу с помощью 20 мкл или 100 мкл Eppendorf наконечник пипетки.
- Центрифуга для ячеек в размахивая ведро ротора на 4 ° C, 500 x g, 5 мин.
- Для создания 100 x акций решения, Растворите ингибиторы протеасом и фосфатазы в ДМСО согласно инструкциям производителя.
- Готовить 2 буфер образца x Laemmli путем разбавления 4 x Laemmli образца буфер, предоставленный изготовителем с эквивалентное количество дистиллированной воды. Добавьте необходимое количество акций 100 x протеасом и фосфатазы ингибиторов для получения окончательного концентрацию ингибиторов 2 x 2 x Laemmli пример буфера.
Примечание: 2 буфер образца x Laemmli могут быть сделаны заранее, но протеасом и фосфатазы ингибиторы должны быть добавлены непосредственно перед добавлением 2 x Laemmli буфер образца (плюс ингибиторы) клетки Пелле Лизируйте клетки, как описано в следующем шаге. - Тщательно удалить часть супернатант из клеток Пелле и супернатанта, оставшиеся в трубку с Пелле клеток, добавить равное количество 2 буфер образца x Laemmli плюс протеасом и фосфатазы ингибиторов для достижения конечной концентрации 500 клеток/мкл в 1 буфер образца x Laemmli.
Примечание: К примеру, если вы переводите 2000 клеток в общем объеме 20 мкл трубку в шаг 2.5, после центрифугирования клетки (шаг 2.6) 18 мкл супернатант следует удалить из Пелле и 2 мкл супернатанта, остается добавьте равным объемом (2 мкл) 2 x буфер Лэмли образца для достижения конечной концентрации 500 клеток/мкл в 1 буфер образца x Laemmli. - Ресуспензируйте гранулы для создания lysate как можно скорее. На данный момент образцы могут быть немедленно electrophoresed через гелях SDS-PAGE, или может быть оснастки, замороженные в жидкости N2 и температуре-80 ° C для использования в будущем.
3. электрофорез
- Тепло лизатов в блоке тепла на 95 ° C или в кипящей воде в течение 5 мин.
- Electrophorese 1-40 мкл лизатов (содержащие от 500 до 20 000 клеток эквиваленты) через гелях SDS-PAGE на 100V с использованием стандартных протоколов10.
Примечание: Объем lysate загружается в гель определяется количество клеток, необходимых для создания желаемого сигнала и будет зависеть от обилием протеина интереса и качество антитела. С 2000, 1000 и 500 клеток эквиваленты lysate получены данные на рисунке 1 . Ширина скважины должны быть в диапазоне от 3 мм до 1,5 мм. 1,5 мм, зубы могут быть сокращены от коммерчески доступных гребень с широкой зубов с помощью ножниц.
4. Передача и блокировать
Примечание: Выполните следующие стандартные протоколы11западную помарку. Здесь кратко изложены шаги:
- Предварительной обработки винилидена фторид (PVDF) мембрану с метанолом, для 10 s, а затем вымыть мембраны кратко с дистиллированной водой.
- Передать белка из геля SDS-PAGE мембраны следуя инструкциям в руководстве, предоставляемых производителем аппарата передачи.
- После передачи, блокировать мембраны с 2 мл 5% бычьим сывороточным альбумином (БСА) в PBST (PBS с 0.1% анимации) на ночь при 4 ° C, после11стандартных протоколов.
5. антитела маркировки
- Проинкубируйте мембрану с антител на шейкер на ночь при 4 ° C, с помощью разбавления антитела, рекомендованный поставщик.
Примечание: В таблице материалов, антитела, которые мы проверены для СКК и ГЭС и соответствующих разведений антитела, показаны. Выполните антитела маркировки с помощью стандартных процедур8.
6. определение
- Промойте мембрану 3 раза, 5 минут для каждого мытья в PBST при комнатной температуре.
- Проинкубируйте мембрану с 2 мл увеличенная хемолюминесценция буфера 1 мин при комнатной температуре. Обнаруживать сигналы, с помощью изображений системы после инструкции, или авторадиографии фильм и фильм процессор производителя.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Представитель результаты от 500-2000 очищенный СКК и ГЭС показаны на рисунке 1 и на рисунке 2. Β-актина сигнал на рисунке 1 можно обнаружить от всего лишь 500 СКК и ГЭС очищенного от костного мозга одним нажатием. Обратите внимание, что загрузка лизатов в 1,5 мм скважин производится гораздо сильнее сигнал от 500 ГЭС, чем загрузка в 3,0 мм скважин. Рисунок 2 -Западная помарка EIF4G и фосфорилирование Rps6 (p-Rps6), оба из которых участвуют в регуляции белка перевод12, в СКК и в ГЭС с и без стимуляции стволовых клеток фактора (SCF) в пробирке.
Рисунок 1: западную помарку для β-актина выступал с лизатов из мышиных СКК и HPs. СКК были отсортированы от клеток костного мозга мышиных линии в исчерпаны как Линь–Sca1++ Flt3 Kit– клетки и ГЭС были Лин–Sca1–комплект+. Лизатов, приготовленный из различных количество клеток были electrophoresed через 12% геля SDS-PAGE, подготовлен с использованием мини-стеклянные пластины с распорки 1 мм. Блот был исследован с антителами к β-миозина. Пятно показывает сравнительный β-актина сигналов от 500 до 2000 ГЭС, когда лизатов были загружены в 1,5 мм скважин (4-6 полос) по сравнению с 3 мм скважин (дорожки 1 - 2). Лизатов от 2,000 до 500 клеток были погружены полосы 7 до 9. M, молекулярный вес маркеров. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: Западный анализ помаркой свежевыделенных СКК, и ГЭС стимулируется в пробирке с цитокина стволовых клеток фактора (SCF). ГЭС были очищены от клеток активированных флуоресцированием сортируя (FACS), центрифугируют, высокомобильна в 2% FBS/PBS, подсчитан, затем разбивается на две трубы. ГЭС в первой трубе были стимулируется с SCF (10 нг/мл) на 5 минут при 37 ° C (+ SCF) и ГЭС в второй трубки были культивированный за 5 мин в отсутствие SCF (-SCF). Клетки были затем центрифугировали и Пелле клетки лизированы с буфер Лэмли образца. СКК были очищены и непосредственно лизированы с буфер Лэмли образца без культивирования. Лизатов были загружены в 1,5 мм скважин и electrophoresed через гелях SDS-PAGE 12%. Блот был разработан с антителами к удлинение инициирующего фактора 4G (EIF4G), β-актина и фосфорилированных малых рибосома Субблок S6 (p-Rps6). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Западный Blotting — это общий метод для обнаружения специфических белков и активации сигнальных путей в ткани или клетки. Путем внесения небольших изменений в часто используемые процедуры, мы смогли регулярно обнаружить 15 различных белков (Таблица материалов) в 15000 СКК и в некоторых случаях в качестве лишь 500 СКК. The Most критические шаги в этом протоколе являются: 1) точно подсчитывать клетки, 2) свести к минимуму количество передач между трубами и 3) лизировать клетки непосредственно с буфер Лэмли образца. Когда лизировать клетки лепешка с буфер Лэмли образца, мы обнаружили, что вместо удаления всех супернатант из клеток Пелле и повторно приостановив его в буфер Лэмли образца, если мы вместо этого оставил небольшой объем супернатант в трубе и добавил эквивалент объем 2 x буфер Лэмли образца, мы могли бы избежать потери клеток. Центрифугирование клетки в размахивая ведро ротора также уменьшенный риск потери клеток. Сокращения ширины скважины путем обрезки гребень зубы улучшена чувствительность обнаружения.
С этих простых корректировок к процедуре мы смогли получить воспроизводимые результаты, эквивалентные тем в опубликованных документах, которые использовал 10 - 20 раз больше клеток3,4,5,6, 7. Кроме того, могут быть лишены помарки для повторного blotting следующие стандартные процедуры13, увеличивая количество информации, которая может быть получена из небольшого числа клеток. Способность обнаруживать протеинов интереса будет ограничена качество антитела и протеина изобилия. Этот измененный метод следует значительно уменьшить количество животных, необходимых для получения данных белков из редких клеточных популяций.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы имеют никакого конфликта интересов объявить.
Acknowledgments
Национальные институты здравоохранения предоставлять R01 CA149976 (N.A.S) поддержал эту работу.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| sodium dodecyl sulfate (SDS) | Fisher Scientific | BP166-500 | SDS-PAGE |
| TEMED | Fisher Scientific | BP150-20 | SDS-PAGE |
| 30% Acrylamidel Bis solution | Bio-Rad | 1610158 | SDS-PAGE |
| 1.5M Tris-HCl pH8.8 | TEKNOVA | T1588 | SDS-PAGE |
| 1.0M Tris-HCl pH6.8 | TEKNOVA | T1068 | SDS-PAGE |
| Ammonium Persulfate | Fisher Scientific | BP179-25 | SDS-PAGE |
| mini-protean 3 comb | Bio-Rad | 1653360 | SDS-PAGE |
| Mini-PROTEAN Tetra Cell | Bio-Rad | 1658005EDU | SDS-PAGE |
| Transfer System | Bio-Rad | 1704155EDU | transfer |
| PowerPac HC Power Supply | Bio-Rad | 1645052EDU | electrophoresis |
| Imaging System | Bio-Rad | 1708195 | signal detection |
| 4x Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 1610747EDU | sample preparation |
| 10x Tris/Glycine/SDS Electrophoresis Buffer | Bio-Rad | 1610732EDU | electrophoresis |
| 2-Mercaptoethanol | Bio-Rad | 1610710EDU | sample preparation |
| RTA Mini PVDF Transfer Kit, for 40 blots | Bio-Rad | 1704272 | transfer |
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma | 11697498001 | sample preparation |
| Phosphatase Inhibitor Cocktailrs | Gold Biotechnology | GB-450-1 | sample preparation |
| EIF4G | Cell signaling | 2469 | WB antibody, validated in 1000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): Fig2 |
| p-Rps6 | Cell signaling | 4858 | WB antibody,validated in 1000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): Fig2 |
| actin(HRP conjugated) | abcam | ab49900 | WB antibody,validated in 500 cells antibody concentration: 1:5000 reference(figure): Fig1, Fig2 |
| LC-3 | Abcam | ab48394 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig5) |
| S6 | Cell Signaling | 2317 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig4) |
| 4EBP1 | Cell Signaling | 9644 | WB antibody, validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig4) |
| p-4EBP1 | Cell Signaling | 2855 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig4) |
| TSC2 | Cell Signaling | 4308 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig4) |
| HSP90 | Cell Signaling | 4877 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig5) |
| PTEN | Cell Signaling | 9188 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (FigS1) |
| mTOR | Cell Signaling | 2983 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (FigS1) |
| p-mTOR | Cell Signaling | 5536 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (FigS1) |
| PP2AB | Cell Signaling | 4953 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (FigS1) |
| p-AMPKa | Cell Signaling | 2535 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (FigS1) |
| actin | Santa Cruz | sc-47778 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:3000 reference(figure): ref5 (Fig4) |
| lineage depletion kit (mouse) | Miltenyi Biotec | 130-090-858 | hematopoietic stem and progenitor cells purification |
| LS columns | Miltenyi Biotec | 130-041-305 | hematopoietic stem and progenitor cells purification |
| SCF | PeproTech | 250-03 | phosphorylation stimulation |
| APC-Cy7 c-kit antibody | ThermoFisher | A15423 | cell sorting |
| anti-B220 | ThermoFisher | 48-0452-82 | cell sorting |
| anti-CD3e | ThermoFisher | 48-0031-82 | cell sorting |
| anti-Mac1 | ThermoFisher | 48-0112-82 | cell sorting |
| anti-Gr1 | ThermoFisher | 48-5931-82 | cell sorting |
| anti-Ter119 | ThermoFisher | 48-5921-82 | cell sorting |
| Spacer Plates with 1.0 mm Integrated Spacers | Bio-Rad | 1653311 | SDS-PAGE |
| BSA | Research Products International | A30075 | membrane blocking |
| serum | Atlanta Biologicals | A12450 | medium supplement |
| cell counter | Invitrogen | AMQAF1000 | cell counting |
| hemocytometer | ThermoFisher | S17040 | cell counting |
| flim | Denville Scientific | E3012 | signal detection |
| medical film processor | Konica | SRC-101A | signal detection |
| Supersignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate | Therom Scientific | 34096 | signal detection |
| Allegra X-15R Centrifuge (Rotor SX4750A) | Beckman Coulter | X-15R | sample preparation |
| BLUEstain protein ladder | Gold Biotechnology | P007-500 | electrophoresis |
| cell sorter | BD | FACSAria II | sample preparation |
| Incublock | Denville Scientific | I0510 | electrophoresis |
References
- Krutzik, P. O., Clutter, M. R., Nolan, G. P. Coordinate analysis of murine immune cell surface markers and intracellular phosphoproteins by flow cytometry. J Immunol. 175 (4), 2357-2365 (2005).
- Du, J., et al. Signaling profiling at the single-cell level identifies a distinct signaling signature in murine hematopoietic stem cells. Stem Cells. 30 (7), 1447-1454 (2012).
- Signer, R. A., Magee, J. A., Salic, A., Morrison, S. J. Haematopoietic stem cells require a highly regulated protein synthesis rate. Nature. 509 (7498), 49-54 (2014).
- Wang, J., et al. A differentiation checkpoint limits hematopoietic stem cell self-renewal in response to DNA damage. Cell. 148 (5), 1001-1014 (2012).
- Hoshii, T., et al. mTORC1 is essential for leukemia propagation but not stem cell self-renewal. J Clin Invest. 122 (6), 2114-2129 (2012).
- Signer, R. A., et al. The rate of protein synthesis in hematopoietic stem cells is limited partly by 4E-BPs. Genes Dev. 30 (15), 1698-1703 (2016).
- Cai, X., et al. Runx1 deficiency decreases ribosome biogenesis and confers stress resistance to hematopoietic stem and progenitor cells. Cell Stem Cell. , (2015).
- Loven, J., et al. Revisiting global gene expression analysis. Cell. 151 (3), 476-482 (2012).
- JoVE Science Education Database. Using a Hemoacytometer to Count Cells. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2017).
- JoVE Science Education Database. Separating Protein with SDS-PAGE. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2017).
- JoVE Science Education Database. The Western Blot. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2017).
- Jackson, R. J., Hellen, C. U., Pestova, T. V. The mechanism of eukaryotic translation initiation and principles of its regulation. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (2), 113-127 (2010).
- Eaton, S. L., et al. A guide to modern quantitative fluorescent western blotting with troubleshooting strategies. J Vis Exp. (93), e52099 (2014).
