Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

خالية من المنظفات فائق السرعة إعادة تشكيل بروتينات الغشاء إلى بليرس الدهن باستخدام فوسوجينيك بروتيوليبوسوميس تكميلية مشحونة.

Published: April 5, 2018 doi: 10.3791/56909
Automatic Translation
1, 2, 3, 2, 2
1First Pavlov State Medical University, 2Clarendon Laboratory, Department of Physics, Oxford University, 3Department of Biological Sciences, Southern Methodist University

Summary

نقدم هنا البروتوكولين فائق السرعة لإعادة تشكيل بروتينات الغشاء في بروتيوليبوسوميس فوسوجينيك، ومزيج من هذه بروتيوليبوسوميس مع بليرس الدهون المستهدفة لتوصيلها المنظفات خالية من هذه البروتينات الغشاء إلى بلير بوستفوسيون. أن الجمع بين هذين النهجين يمكن الجمعية التي تسيطر عليها بسهولة وسرعة من أنظمة الأغشية المتعددة العناصر المعقدة.

Abstract

المنظفات لا غنى عنها لإيصال بروتينات الغشاء إلى 30-100 نانومتر الحويصلات أونيلاميلار الصغيرة، بينما بليرس الدهن نموذج أكثر تعقيداً وأكبر أقل توافقاً مع المنظفات.

هنا يصف لنا استراتيجية لتجاوز هذا القيد الأساسي استخدام فوسوجينيك اتهم معاكس الدهنية تحمل بروتين غشائي للفائدة. يحدث الانصهار بين هذه الحويصلات داخل 5 دقيقة في المخزن مؤقت منخفضة قوة الأيونية. يمكن استخدام الدهنية فوسوجينيك مشحونة بشكل إيجابي كمتجهات مكوك البسيط لتوصيلها خالية من المنظفات البروتينات الغشاء إلى المحاكاة البيولوجية المستهدفة دهن بليرس، الذي يتوجب سلبا. ونحن كما تظهر كيفية إعادة تشكيل بروتينات الغشاء في بروتيوليبوسوميس فوسوجينيك مع بروتوكول سريع 30 دقيقة.

الجمع بين هذين النهجين، نظهر جمعية بسرعة الإلكترون النقل سلسلة تتألف من اثنين من البروتينات الغشاء من كولاي، مضخة بروتون الابتدائي بو3-أوكسيديز وو1وس ATP synthase، في أغشية من الحويصلات من مختلف الأحجام، تتراوح ما بين 0.1 إلى > 10 ميكرون، فضلا عن إنتاج ATP بهذه السلسلة.

Introduction

الروغان من الدهن الاصطناعي بليرس مع بروتينات الغشاء خطوة أساسية في الجمعية للغشاء نظم نموذجية. النموذج الأبسط، بروتيوليبوسوميس (رر)، يتكون من الصغيرة (قطرها 30-200 نانومتر) إدماج الحويصلات أونيلاميلار (سيارات الدفع الرباعي، كما دعا الدهنية)، مع البروتينات على أغشية. وتشكل تقليديا رر في اثنين خطوات1. سيارات الدفع الرباعي أولاً، بريفورميد مختلطة مع بروتين غشائي الفائدة ومطهر بتركيز أعلى تركيز مذيل الحرجة (CMC). ثانيا، يتم إزالة مواد التنظيف مع مختلف تقنيات الترشيح الغسيل الكلوي أو "بيو-الخرز" أو هلام، تاركاً البروتين في الغشاء. هذا النهج الأخير هو كثير أسرع (~ 30 دقيقة1) وهو الأفضل لإعادة تشكيل بروتينات الغشاء الهشة والحساسة، ولذلك حين النهجين أولاً محدودة بسرعة إزالة المنظفات، والتي تستغرق عدة ساعات، وقد يسبب خسارة كبيرة للنشاط وفقدان السلامة الهيكلية للبروتينات. الروغان من أكبر حويصلات (أونيلاميلار كبير الحويصلات، لوف، ما يصل إلى 1 ميكرومتر القطر) من هذا النهج أكثر صعوبة، حويصلة يحصل على تخفيض حجم بعد إزالة مواد التنظيف، ومن غير الممكن للحويصلات أونيلاميلار العملاقة (جوف، > 1 ميكرومتر)، فضلا عن أنها تؤدي إلى زعزعة المنظفات (ولكن انظر جونسون et al. 2 لبطء 2D-بلورة البروتينات الغشاء في بليرس كبيرة). النهج البديلة جيوف غشاء الروغان3،،من45 موجودة بل هي شاقة وتستغرق وقتاً طويلاً، ولا تزال تتطلب بعض المنظفات بتركيزات أقل CMC. لا يمكن أن تتسامح أكثر تعقيداً أو الهشة الدهن نماذج (على سبيل المثال، "بليرس المائية الحبرية"6 و 3D أنسجة اصطناعية للطباعة المستندة إلى "واجهة الحبرية بلير"7) المنظفات. الناشئة بسرعة تطبيقات البيولوجيا التركيبية8،9،10 خطيرة تعتمد على الروغان من هذه الهياكل غشاء معقدة. ولذلك يلتمس طريقة سهلة وقوية مما يتيح تسليم سريع ولطيف بروتينات الغشاء بيلاييرس الهشة الهدف عاليا في الميدان.

بديل، هو أسلوب التسليم البروتين خالية من المنظفات حويصلة الانصهار، حيث توحد الأغشية المتفاعلة حويصلات إلى بلير بوستفوسيون سليمة، بينما يحصل مختلطة محتوياتها المائية إينترافيسيكولار، دون أن يطلق سراحه في الخارجية البيئة. يتم تمكين حويصلة الانصهار ومدفوعة أما بترتيبات جديدة conformational ضمن عوامل مكملة فوسوجينيك (بعض البروتينات11،12 والببتيدات13 أو تعديل خصيصا الحمض الخلوي الصبغي14) يقع في الاتصال بيلاييرس، أو كولومبيك التفاعلات بين بيلاييرس الدهون تشكل الدهون أنيونى والموجبة مشحونة بالتكامل15،16، أو بيلاييرس الموجبة وبروتينات مشحونة سلبا على17.

النهج السابق الذي يتطلب وجود عوامل فوسوجينيك في أغشية متفاعلة فيما بينها قبل الانصهار، بطيئة نسبيا (~ 30 دقيقة للوصول إلى النصف-الحد الأقصى من الانصهار12،18)، ولكن يمكن تطبيقها على سواء الطبيعية أو الاصطناعية الأغشية.

ميزة نهج استخدام الدهون فوسوجينيك (الشكل 1) أنه يمكن الكثير أسرع من الانصهار غشاء (~ 1 دقيقة تصل إلى نصف الحد الأقصى، و 5-10 دقيقة للانتهاء من رد فعل). بالإضافة إلى ذلك، يمكن التحكم في مدى الانصهار التي ط) وسيلة سهلة لصياغة المحتوى النسبي الدهون مشحونة في بليرس فوسوجينيك، والثاني) الأيونية، وبصفة عامة، ناضح وقوة رد الفعل المتوسطة (أملاح في أعلاه 50 ملم، وعلى سبيل المثال، السكروز15 يتم عرض لوقف الانصهار)، أو مزيج من كليهما. للشروع في الانصهار، تختلط الحويصلات فوسوجينيك المشحونة معاكس في متوسط قوة الأيونية منخفض (عادة 10-20 مم الملح) لمدة 5-10 دقائق. عيب نسبي للأسلوب هو أن الدهون الموجبة قد تمارس تأثيراً سلبيا على الأداء الوظيفي للبروتينات الغشاء في بروتيوليبوسوميس الموجبة قبل الانصهار، لا سيما في قوة الأيونية ضعيفة، ولكن هذا التأثير يتم عكسها وتخفيفها بطبيعية تكوين الدهن الغشاء بعد الانصهار وعودتها إلى متوسطة القوة الأيونية العادي.

Protocol

1-إعداد فوسوجينيك سيارات الدفع الرباعي ولوف

  1. إعداد خليط الدهن فوسوجينيك
    1. إعداد الحلول المخزون من الدهون محايدة والأيوني، أنيونى ونيون في كلوروفورم في 25-50 مغ/مل (على سبيل المثال، محايدة دوبك (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)، إيثيل الأيوني-كمبيوتر (1، 2- ديميريستوليويل--sn-جليسيرو-3-اثيلفوسفوتشوليني)، أنيونى بوبا (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphate)، ونيون تشوليستيريل-بوديبي-FL12، على التوالي) بوزن الكميات المناسبة من الدهون الجافة وتذويب لهم بنسبة 100% كلوروفورم (تنبيه! القيام بذلك تحت غطاء دخان)، أو تمييع المخزونات المتوفرة تجارياً كلوروفورم الدهون مع كلوروفورم.
      ملاحظة: كل تستخرج الدهون الطبيعية والدهون الاصطناعية نقية يمكن استخدامها وإظهار نتائج مماثلة.
    2. ميكس 2.5 ملغم الموجبة و 2.5 ملغم دهن محايد في الأسهم كلوروفورم (1.1.1) في قنينة زجاج.
      ملاحظة: هذه الخطوة تعطي 5 ملغ خليط الدهن الأيوني في كلوروفورم، يحتوي على كسر الوزن 50% من الدهون الموجبة. عند الحاجة، إضافة 0.5% وزن الكسر دهن الفلورية إلى الخليط.
    3. مزيج من 1 ملغ من أنيونى و 4 ملغ من الدهون محايدة في مخزونات كلوروفورم (1.1.1) في قنينة زجاج. وهذا يعطي 5 ملغ خليط الدهن أنيونى المحتوية على كسر الوزن 20% من الدهون أنيونى.
    4. تتبخر كلوروفورم تحت تيار نيتروجين تشكل طبقة رقيقة من الدهن الجاف.
    5. إزالة كلوروفورم المتبقية تحت الفراغ لمدة 10 دقائق.
      ملاحظة: عادة يأخذ هذه الخطوة الكثير أطول (ح 1-12)، ولكن وجدنا أن يوفر علاج أطول أي تحسن واضح في الربط بين خصائص لسيارات الدفع الرباعي.
    6. هيدرات الفيلم الدهن الجاف بإضافة 0.5 مل المخزن المؤقت A (100 مم بوكل، 1 مم مجكل2، والمماسح 50 مم، الرقم الهيدروجيني 7.4) لكل قنينة وتركهم للترشح في درجة حرارة الغرفة 30 دقيقة، ومن ثم دوامة حتى الفيلم الدهن بعيدة تماما عن سطح الزجاج وب اكوميس تعليق دهن متجانسة. وينبغي أن يأخذ عن 20-40 ثانية.
  2. تشكيل من سيارات الدفع الرباعي ولوف بقذف
    1. تجميع نظام بثق (انظر الجدول للمواد) مع اثنين الحقن 1 مل باستخدام عامل تصفية البولي مع أحد الإجراءات التالية المسام الأحجام: نانومتر 100 أو 200 على شكل سيارات الدفع الرباعي، و 400 أو 800 نانومتر إلى شكل لوف.
    2. نقل تعليق المادة الدهنية في محقن.
    3. بثق التعليق بتمرير من خلال عامل تصفية 21 مرة، كما هو موضح في مكان آخر من18،19.
      ملاحظة: مطلوب عدد فردي من الممرات لتقليل نقل إلى الحل حويصلة من كتل الدهن كبيرة عالقة إلى جانب تصفية تواجه تعليق الدهن الأصلي.
    4. نقل الحل حويصلة إلى 1.5 مل ميكروسينتريفوجي الأنابيب.

2-تشكيل فوسوجينيك جوف بأسلوب مستحلب مقلوب

ملاحظة: هذا الإجراء هو موضح في الرسم 2.

  1. إعداد حل الدهن في زيت
    1. خلط الأوراق المالية كلوروفورم (راجع الخطوة 1.1.1) دهن محايد (2 ملغ) ودهن أنيونى (0.5 ملغ) مع 1 مل هيكساديكان في أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل.
    2. تتبخر كلوروفورم من الخليط تحت خلط مستمر والتدفئة في 80 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة حفظ الأنبوبة مفتوحة. إغلاق الأنبوب والسماح لتبرد بدرجة حرارة الغرفة.
  2. تشكيل أحادي الطبقة الدهنية في واجهة المخزن المؤقت للدهن-في-النفط/مائي
    1. مكان 200 ميليلتر من الحل الدهن في النفط على رأس 0.5 مل المخزن المؤقت ب (20 ملم بوكل، 0.1 مم مجكل2، 10 مم والمماسح الأس الهيدروجيني 7.4) في أنبوب الطرد مركزي 1.5 مل. ملاحظة الشكل المحدب الحدود مرحلة الانفصال بسبب عدم تطابق التوتر السطحي بين النفط والمخزن المؤقت مائي (الشكل 2A).
    2. انتظر حتى الحدود الفاصلة المرحلة يسطح، ويدل على تشكيل أحادي الطبقة الدهنية على ذلك. وهذا يستغرق عادة 30-60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  3. إعداد مستحلب الماء في النفط
    1. تعد حلاً السكاريد غير الأيونية للذوبان في الماء في المخزن المؤقت ب، مع كثافة أعلى من كثافة الماء (مثلاً 15% فيكول-400 (w/v)، مع كثافة 1.05 g/mL)
      ملاحظة: بشكل اختياري، أحد إضافة الأصباغ الفلورية للذوبان في الماء إلى المخزن المؤقت للتصور أفضل من جيوف، وأي محتوى مائي المرجوة الأخرى جوفس.
    2. نقل 0.5 ميليلتر الخليط أعلاه إلى أنبوب الطرد مركزي 1.5 مل منفصلة مع 100 ميليلتر من الحل الدهن في النفط من 2.1.2.
    3. Sonicate (44 كيلو هرتز في 14 ث) المخلوط لمدة 30 ثانية في حمام الماء بالموجات فوق الصوتية. ثم، بقوة دوامة لمدة 45 دقيقة لتشكيل مستحلب الماء في النفط، حيث سوف تكون مغلفة كل قطره من دهن أحادي الطبقة (الشكل 2).
  4. تحويل مستحلب الماء في النفط في جوف
    1. ضع مستحلب الناتجة على رأس واجهة الدهن في-النفط/المائية، وفورا الطرد المركزي الأنبوب في أعلى الجدول--أجهزة الطرد مركزي في 10,000 س ز لمدة 2 دقيقة. بيليه الناتجة من جيوف يجب أن تكون مرئية بوضوح (الشكل 2).
    2. تبريد الأنبوب إلى 4 درجات مئوية في ثلاجة ترسيخ خليط الدهن في النفط (الشكل 2D، هيكساديكان يتصلب أقل من 18 درجة مئوية)، بعناية إزالة النفط المجمدة، وثم سحب المرحلة مائي.
      ملاحظة: استخدمت لتسهيل النفط تجميد إزالة سلك عازمة على شكل ارتساء.
    3. ريسوسبيند بيليه جيوف في 50 ميليلتر من المخزن المؤقت الطازجة ب، نقل إلى أنبوب طازجة، وفحص تحت مجهر فلورية استخدام هدف غمر نفط (الشكل 2E) X 100.

3-رصد حويصلة الانصهار مع أسلوب الكوبالت-كالسين

  1. إعداد عمود الجاذبية هلام الترشيح.
    1. نقع ~ 10 غ راتنج هلام الترشيح (مثل رقيق سيفاديكس G-50) في 100 مل مياه، واسمحوا تضخم بين عشية وضحاها.
    2. حزمة 3 مل الراتنج في عمود تدفق خطورة بلاستيك القابل للصرف وغسله بالماء عالي النقاوة، وحجته مع المخزن المؤقت ج (100 ملم بوكل، والمماسح 10 مم، الرقم الهيدروجيني 7.4) في درجة حرارة الغرفة.
  2. إعداد سيارات الدفع الرباعي+ أو سيارات الدفع الرباعي0 محملة بالكوبالت-كالسين.
    1. تحضير محلول يحتوي على 1 مم كالسين، 1 مم كوكل2، 98 مم كلوريد الصوديوم، والمماسح 10 ملم، ثم جعل pH إلى 7.4.
      ملاحظة: جوهر الأسلوب أن كالسين نيون الحرة أشكال معقدة غير الفلورية مع شركة2 +. يصبح الفلورسنت مرة أخرى عند إضافة يدتا، التي لها أعلى النسب لشركة2 +، يزيح كالسين من المجمع الكوبالت-كالسين (الشكل 3A).
    2. إضافة 500 ميليلتر لهذا الحل إلى فيلم جافة من الدهون الموجبة أو محايدة إعداد كما هو موضح في 1-1.
    3. إعداد 100 نانومتر سيارات الدفع الرباعي بقذف كما هو موضح في 1.2.
    4. بيليه مقذوف سيارات الدفع الرباعي في 1,000,000 ز x لمدة 20 دقيقة في أولتراسينتريفوجي أعلى الجدول وريسوسبيند في 1 مل من المخزن المؤقت ج. كرر التكوير واستثارة ثلاث مرات؛ استخدام 0.6 مل من المخزن المؤقت ج لاستثارة الماضي.
      ملاحظة: هذه الخطوات إزالة معظم الكوبالت-كالسين الخارجية.
    5. إزالة القشور الخارجية المتبقية-كالسين بتمرير سيارات الدفع الرباعي عن طريق عمود تدفق جاذبية المتاح تحميلها مع الراتنج هلام الترشيح اكويليبراتيد مع المخزن المؤقت ج كما هو موضح للخطوة 3.1.2.
      ملاحظة: نحن عادة تجاهل حجم المليلتر الأولى من خلال التدفق وجمع المليلتر الثاني، الذي يحتوي على كالسين القشور الخارجية الحرة سيارات الدفع الرباعي.
  3. إعداد سيارات الدفع الرباعي– محملة يدتا
    1. إعداد الحل 10 مم يدتا، 80 مم كلوريد الصوديوم، والمماسح 10 مم، الرقم الهيدروجيني 7.4.
    2. إضافة 500 ميليلتر لهذا الحل إلى فيلم جافة من الدهون أنيونى إعداد كما هو موضح في 1-1.
    3. تعد سيارات الدفع الرباعي– بقذف كما هو موضح في 1.2.
    4. بيليه وريسوسبيند سيارات الدفع الرباعي– كما هو موضح في 3.2.4.
    5. إزالة يدتا المتبقية عن طريق تمرير سيارات الدفع الرباعي– من خلال الترشيح جل العمود كما هو موضح في 3.2.5.
  4. إعداد سيارات الدفع الرباعي للانصهار
    1. تمييع سيارات الدفع الرباعي0،+سيارات الدفع الرباعي، وسيارات الدفع الرباعي– مع المخزن المؤقت د (والمماسح 1 ملم، ودرجة الحموضة 7.4) تستكمل مع 0.2 مم كوكل2 وتركيز بوكل. استخدام 5 ميليلتر لكل نوع من سيارات الدفع الرباعي كل مل 1 دال المخزن المؤقت المطلوب
    2. احتضان هذا الخليط على الأقل 1 ح.
      ملاحظة: هذه الخطوة سيتم تصغير مستوى الأسفار الخلفية عن طريق حظر كالسين الذي هو سطح متجهة إلى سيارات الدفع الرباعي+.
  5. حويصلة الانصهار
    1. بدء رد فعل الانصهار بخلط 1 مل من سيارات الدفع الرباعي+ أو سيارات الدفع الرباعي0 مع 1 مل من سيارات الدفع الرباعي− (مخففة في المخزن المؤقت د كما هو موضح أعلاه) ومبومو فلوريميتير 2 مل، ورصد تزايد الأسفار كالسين باستخدام 480 نانومتر الإثارة و 510 نانومتر الانبعاثات (الشكل 3).
    2. انتظر حتى يأتي رد فعل للإنجاز.
    3. إضافة خليط من المنظفات Triton X-100 ويدتا (تركيز 0.05% النهائي و 7 ملم، على التوالي) للإفراج عن كالسين من الحويصلات والحصول على إشارة الأسفار كحد أقصى.
    4. تحديد مدى الانصهار يعرف بأنه النسبة المئوية للإشارة الأسفار كحد أقصى بعد إضافة مسحوق الغسيل كما هو مبين في الشكل 3.

4-سرعة إعادة تشكيل بروتينات الغشاء إلى بروتيوليبوسوميس فوسوجينيك

ملاحظة: يوضح هذا الإجراء في الشكل 4A.

  1. إعداد عمود تدفق جاذبية مع الراتنج هلام الترشيح كما هو موضح في 3.1، وحجته أنه مع مخزن مؤقت أ في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: يجب أن يتم التلاعب زيادة كل دقة في ≤ 4 درجة مئوية، ما لم يشر إلى خلاف ذلك، تقليل الخسائر في نشاط البروتين.
  2. ضبط تركيز بروتين غشائي المنقي إلى 0.7 ملغ/مل باذابته مع نفس استخراج المخزن المؤقت المستخدم لعزل البروتين.
  3. ميليلتر 140 مزيج من البروتين مع 300 ميليلتر بريفورميد سيارات الدفع الرباعي و 160 ألف المخزن المؤقت ميليلتر 60 ميليلتر من تشولاتي 10% في المخزن المؤقت A؛ وهذا يعطي 01:30 البروتين: نسبة وزن الدهن في وحدة تخزين ميليلتر 660 نهائي.
  4. بلطف يهز المخلوط على منصة هزاز لمدة 15 دقيقة.
    ملاحظة: الخطوات التالية التي يمكن أن يتم في درجة حرارة الغرفة.
  5. تمرير هذا الخليط من خلال راتنج هلام الترشيح، وجمع عكره الكسور التي تحتوي على بروتيوليبوسوميس.
  6. بيليه بروتيوليبوسوميس مع أولتراسينتريفوجي أعلى الجدول في 400,000 س ز لمدة 15 دقيقة.
  7. تجاهل المادة طافية يحتوي على بروتين غير تشكيلها، وريسوسبيند بيليه في 1 مل من المخزن المؤقت الطازجة أ
  8. تحديد محتوى البروتين في رر والمادة طافية باستخدام أسلوب الأسود اميدو20.
  9. تحديد العائد من إعادة تشكيل، وهو عادة حوالي 50-70%.
    ملاحظة: قد يتم استبدال الخطوات 4.6-4.8 اختيارياً بتمرير رر الحل عن طريق 1 مل راتنج ني-جاتا معبأة في عمود جاذبية المتاح وغسلها مع المخزن المؤقت A كما هو موضح في 3.1.2. تمرير هذه سوف منفصلة غير تشكيل البروتين، التي ستكون ملزمة تفضيلي إلى الراتنج، من رر، ستكون الأكثر في التدفق عبر.

5-وظيفية الاختبارات من نشاط البروتين في بروتيوليبوسوميس

ملاحظة: كل البروتينات المستخدمة في هذه الدراسة هي مضخات البروتون قوية، الذي ضخ ح+ إلى بروتيوليبوسوميس عند إضافة على ركائز (Q إنزيم1 بو3-أوكسيديز، و ATP و1وس، على التوالي)، ومن ثم بناء بروتون تدرج عبر الغشاء (ΔpH). في حالة نجاح إعادة تشكيل المشارك بالانصهار، يمكن ملاحظة هذه التحمض كانخفاض في الأسفار مسبار حساسة لدرجة الحموضة ACMA (9-Amino-6-Chloro-2-Methoxyacridine)12،15، التي تستخدم بشكل روتيني لمثل هذه المهام ( الشكل 4B --ج). الركيزة الخاصة بالإضافة إلى ذلك النشاط من البروتينات (Q إنزيم الأكسدة1 بو3-أوكسيديز22 والتحلل ATP و1وس23،24) يمكن رصدها سبيكتروفوتوميتريكالي باستخدام أساليب مختلفة. هنا، علينا أن نبدي نشاط ATP التحلل و1وس رر استخدام ATP تجديد المقايسة (الشكل 4)، حيث الإنزيمات (بيروفات كيناز (PK) ونازعه لاكتات (رابطة حقوق الإنسان) الحفاظ على تركيز ثابت من ATP كما يلي. بتدوير PK ATP عن طريق تحويل ADP التي تنتجها و1وس يعود إلى ATP على حساب ما فوسفونولبيروفاتي الركازة (بيب). بيروفات، الذي نتاج لرد الفعل هذا، يتم تحويلها إلى لاكتات برابطة حقوق الإنسان على حساب NADH، أكسدة التي يمكن رصدها كانخفاض الكثافة البصرية على 340 نانومتر.

  1. إعداد المواد الكيميائية
    1. إعداد 1 مم ACMA الأسهم في الإيثانول.
    2. إعداد مخزون 1 مم من نيجيريسين (أو أي أونكوبلير أخرى) في الإيثانول.
    3. إعداد المخزون 25 مم Q إنزيم1 في الإيثانول، والأسهم DTT م 1 في المخزن المؤقت أ
    4. إعداد مخزون من 100 ملم ATP في المخزن المؤقت A، وضبط الأس الهيدروجيني لها إلى 7.4.
    5. إعداد مخزون ATP تجديد مكونات النظام في المخزن المؤقت ج: 100 مم بيب، NADH 1 مم، وحلول PK ورابطة حقوق الإنسان بتركيز ~ 500-1000 وحدة/مل.
  2. Q إنزيم بروتون يحركها أكسدة1 ضخ بو3-أوكسيديز رر
    1. إضافة 20 ميليلتر من رر ومبومو فلوريميتير مع 2 مل المخزن المؤقت A في الوجود من 0.5 ميكرومتر ACMA، والانتظار حتى إشارة مستقرة باستخدام 430 نانومتر الإثارة و 515 نانومتر الانبعاثات.
    2. إضافة 40 ميكرومتر Q إنزيم1 إلى ومبومو.
    3. بدء ضخ البروتون بإضافة 2 مم DTT رر (الشكل 4 باء).
      ملاحظة: القيمة يقلل Q إنزيم المؤكسد1 ويجعله متوفراً بو3-أوكسيديز.
    4. تبدد ΔpH المشكلة بإضافة 2 ميكرومتر أونكوبلير (على سبيل المثال نيجيريسين). ACMA fluorescence إشارة ينبغي العودة بسرعة إلى المستوى الأصلي تقريبا.
      ملاحظة: ينبغي أن لا ACMA تبريد عند إضافة الركازة، إذا أونكوبلير غير موجودة في الخليط رد الفعل في البداية.
  3. بروتون يحركها التحلل ATP الضخ من و1وسرر
    1. إضافة 40 ميليلتر من رر ومبومو فلوريميتير كما هو موضح في 5.2.
    2. بدء ضخ البروتون بإضافة 0.2 مم ATP رر (الشكل 4).
    3. تبدد ΔpH كما هو موضح في 5.2.4.
  4. التحلل المائي ATP و1وسرر، وتحفيز به قبل أونكوبلير
    1. إضافة 40 ميليلتر من رر إلى ومبومو جهاز المطياف الضوئي مع 2 مل المخزن المؤقت A، التي تحتوي على 1 مم ATP، NADH 0.2 مم، 2 مم بيب، و 15 ميليلتر من كل كيه ورابطة حقوق الإنسان.
    2. يتبع رد فعل عن طريق قياس انخفاض امتصاص من NADH في 340 نانومتر. في وقت لاحق، إضافة 3-4 دقيقة 2 ميكرومتر أونكوبلير إلى ومبومو للإفراج عن باكبريسوري ΔpH على التحلل ATP. وينبغي زيادة سرعة رد الفعل فورا.
      ملاحظة: سوف تظهر رر مرت راتنج ني-الإدارة الوطنية للسياحة كما هو موضح في 4.10 تحفيز أقوى من أونكوبلير (تتبعالشكل 4، أحمر)، بينما سيكون النذرة الكاد تحفز (تتبع الأزرق).

6-اختبار تأثير البيئة الدهن والقوة الأيونية في الأداء الوظيفي للبروتينات الغشاء في بروتيوليبوسوميس فوسوجينيك

  1. تقييم بروتون ضخ 40 ميكروليتر رر+ورر– رر0 مع الإنزيم ACMA التبريد في 2 مل المخزن المؤقت د تستكمل مع 1 مم مجكل2 و 20 (الشكل 5، الفريق A) أو 100 ملم بوكل (فريق ب) كما هو موضح في 5.2 أو 5.3 (الشكل 5 ، آثار حمراء وسوداء وزرقاء).
  2. الصمامات 40 ميليلتر من رر+ مع نفس الحجم من لوف– في 2 مل من المخزن المؤقت د تستكمل مع 20 مم بوكل، واختبار ل ACMA التبريد (تتبع الخضراء).
  3. تشغيل تجارب التحكم كما هو الحال في الخطوة 2 من الاختلاط، وعلى سبيل المثال، رر وسيارات الدفع الرباعي بنفس التهمة (تتبع الرمادية).
    ملاحظة: ضخ البروتون ينبغي تحسين طريق pl بوستفوسيون.

7-تسليم بروتينات الغشاء لوف وجيوف قبل بروتيوليبوسوميس فوسوجينيك

  1. فتيل 50 ميليلتر من رر+ مع 50 ميليلتر من 800 نانومتر لوف– في 1 مل من المخزن المؤقت د تستكمل مع مجكل 1 مم2و 20 مم بوكل لمدة 5 دقائق.
  2. بيليه الحويصلات في 6,000 س ز لمدة 5 دقائق، وتجاهل رر طافية الممتص المحتوية على+. ريسوسبيند بيليه في 1 مل من المخزن المؤقت د تستكمل مع مجكل2 1 و 100 ملم بوكل، وكرر التكوير وريسوسبيندينج مرتين أكثر.
  3. قم بتشغيل ACMA تبريد المقايسة كما هو موضح في 5.2 أو 5.4.
  4. تشغيل تجارب التحكم، كما هو الحال في الخطوات 1-3، باستخدام تركيبات من حويصلات مشحونة تكميلية في الملح عالية (200 ملم بوكل) وحويصلات غير فوسوجينيك ولوف– الفارغة فقط دون رر+.
    ملاحظة: ضخ البروتون بوستفوسيون لوف ينبغي الكشف عنها إلا عندما استخدمت حويصلات مشحونة بالتكامل كما هو موضح في الشكل 6.

8-الجمعية سلسلة "نقل الإلكترون" من "المكونات الفردية" في الأغشية لوف جيوف وإنتاج ATP بهذه السلسلة.

ملاحظة: يبين الشكل 7 ألفتخطيطي لهذا الإجراء. سيتم تسجيل ATP المنتجة في هذه التجربة بنظام لوسيفرين-لوسيفراس، حيث تبعتها تحويل المركب ATP إلى بيروفوسفات وامبير من لوسيفراس الخفيفة الانبعاثات المسجلة مع luminometer. نوصي باستخدام luminometer أنبوب واحد، بدلاً من لومينوميتيرس الميكروسكوبية أقل حساسية.

  1. 3 مزيج ميليلتر من بو3-شكلت أوكسيديز رر+ وميليلتر 5 و1وس رر+ كما هو موضح في القسم 4.
  2. الصمامات لهم مع 3 ميليلتر من لوف أو جيوف– (شكلت كما هو موضح في المقطع 2) في 800 ميليلتر من المخزن المؤقت د تكملها بوكل 20 و 1 ملم مجكل2 لمدة 5 دقائق.
  3. استخدام مخزونات عالية التركيز، إضافة بوكل والممسحات إلى التركيز النهائي 100 و 50 ملم للأغشية بوستفوسيون.
    ملاحظة: في حالة لوف بعد الانصهار، سيمنع هذه الخطوة تورم بسبب إزاحة ناضح بين الخارجي (المخزن المؤقت A) وإينترافيسيكولار (المخزن المؤقت د) أملاح تركيز.
    1. بشكل اختياري، بيليه في الأغشية بوستفوسيون كما هو موضح في 7.2 فصل الممتص سيارات الدفع الرباعي+، وريسوسبيند بيليه في 800 ميليلتر من المخزن المؤقت أ
  4. إعداد 200 ميليلتر لوسيفرين-لوسيفراس-ADP كوكتيل يحتوي على 400 ميكرون ADP و 50 ميكرومتر لوسيفرين 2.5 ميكروغرام لوسيفراس في المخزن المؤقت A
  5. إضافة الكوكتيل إلى خليط بوستفوسيون من Step8.3.
  6. إضافة 40 ميكرومتر لتتأكسد Q إنزيم1، وتؤدي إلى تنشيط الأغشية بوستفوسيون بو3-أوكسيديز بإضافة 2 مم DTT. الانتظار لمدة 1 دقيقة.
  7. بدء توليف ATP بإضافة فوسفات البوتاسيوم 5 مم (KPأنا، درجة الحموضة 7.4) لتنشيط حويصلات، والكشف عن إنتاج ATP مع لومينوميتير (الشكل 7). تشغيل رد فعل لدقيقة ~ 3.
    ملاحظة: رد فعل التوليف ATP العائدات لمدة 5-7 دقائق حتى استنفاد الأكسجين التي يستهلكها بو3-أوكسيديز ولوسيفراس.
  8. إضافة معيار مرجعي ATP (0.5 نمول ATP) إلى الخليط الرد مرتين. قياس ATP المنتجة.
  9. الحصول على المبلغ الفعلي من ATP المنتجة في رد الفعل بتقسيم الإشارة من رد فعل التوليف ATP بالإشارات القياسية المرجعية ATP. ضبط هذه القيمة بمبلغ إجمالي قدرة و1وس المستخدمة في رد الفعل، وأخيراً التعبير عن معدل تخليق ATP في µmol ATP/(ملغ و1وس* دقيقة).

Representative Results

استخدام فوسوجينيك تكميلية مشحونة بروتيوليبوسوميس لتسليم سريعة خالية من المنظفات البروتينات الغشاء في الأغشية بيلايير المستهدفة تشمل ثلاث خطوات (الشكل 1): A، تشكيل فوسوجينيك سيارات الدفع الرباعي من الخلائط المادة الدهنية مع ارتفاع محتوى الدهون التهمة الموجهة إليه؛ قد تحمل هذه سيارات الدفع الرباعي بشكل اختياري تحميل إينترافيسيكولار؛ بتحويل فوسوجينيك سيارات الدفع الرباعي إلى PL استخدام لدينا تشكيل البروتين الغشاء بسرعة؛ ج، مزيج فوسوجينيك رر مع بليرس المستهدفة في متوسط المنخفض الملح، تليها إضافة الملح عالية إلى التوقف عن رد فعل الانصهار. في حالة حدوث حويصلات كبيرة (د)، هو استراتيجية أفضل لتقديم بروتين غشائي في bilayer أنيونى المستهدف، الذي يوفر بيئة دهن أفضل لنشاط البروتينات الغشاء (نوقشت كذلك في النص).

يتم تمييز بروتوكول تكوين جوف مع أسلوب مستحلب المقلوب بالتفصيل في الشكل 2. نحن نفضل استخدام هيكساديكان في خليط الدهن النفط مرتفعة نسبيا بسبب درجة حرارة التجميد (18 درجة مئوية)، مما يتيح سهولة إزالة النفط طدت بعد جوف التكوير.

يوضح الشكل 3 الانصهار حويصلة باستخدام الأسلوب الكوبالت-كالسين-يدتا. ويعتبر الانصهار فقط عندما يتم استخدام حويصلات مشحونة تكميلية في مخازن الملح منخفضة، بينما أعلى تركيزات الملح (> 50 مم14) أو استخدام حويصلات غير فوسوجينيك إثبات لا الانصهار.

ويتضح هذا البروتوكول بسرعة لإعادة تشكيل بروتينات الغشاء في فوسوجينيك سيارات الدفع الرباعي في الشكل 4A. باستخدام هذا البروتوكول، نبدي سريعة إعادة تشكيل الابتدائي بروتون مضخة بو3-أوكسيديز وو1وس ATP synthase رر، وتقييم أنشطتها المحددة في هذه الأغشية. من المهم أن نذكر أن العائد من إعادة تشكيل البروتين لا تعتمد على المسؤول عن المادة الدهنية المستخدمة15 وهو حوالي 50-75%25،12، وأنه بعد إعادة تشكيل في رر، يمكن تخزين البروتين لثلاثة على الأقل أيام، حتى في درجة حرارة الغرفة دون خسارة واضحة لنشاط البروتين. ويوفر هذا الإجراء أيضا الاتجاه أحادي الاتجاه من ATP synthase، فيها أكثر من 95% منه في الخارج15،1 الموجهة نحو النصف ماء و26.

الشكل 5 يوضح أن البروتون ضخ نشاط (الفريق A) و1وo وبو3-أوكسيديز (فريق ب) في الدهون الموجبة انخفاض والحساسة للقوة الأيونية منخفضة، بالمقارنة مع البيئة الدهن أنيونى ومحايدة، ولكن هو تخفيف هذا التأثير في أغشية بوستفوسيون بعد التفجير رر+ مع أنيونى لوف–.

الشكل 6 يوضح تسليم و1وس ATP synthase أغشية حويصلات كبيرة. في هذه التجربة، رر+ و 800 نانومتر لوف– كانت تنصهر في 20 مم بوكل لمدة 5 دقائق، ورد فعل لمنتج كان القريبون لإزالة أونفوسيد رر+وحراكه وجزيئي لضخ البروتون. وأظهرت تجارب التحكم لا ضخ البروتون عندما لوف0 بدلاً من ذلك لوف– واستخدمت كرد فعل الانصهار (trace الأسود)، أو كانت فارغة لوف– وحدها جزيئي (تتبع الأزرق).

الجمعية سريعة من سلسلة نقل الإلكترون عاملة في أغشية حويصلات كبيرة عن طريق PL فوسوجينيك يظهر في الشكل 7. قمنا باستخدام سيارات الدفع الرباعي+ و1وo وبو3 سيارات الدفع الرباعي+ للانصهار مع 800 نانومتر لوف-، وتجلى هذه السلسلة في الحويصلات بوستفوسيون إنتاج ATP بشكل تسلسلي إضافة Q إنزيم1 و DTT لتنشيط الأغشية، ومن ثم إضافة الفوسفات لتحريك التوليف ATP من و1وس.

Figure 1
رقم 1: مفهوم التسليم فائق السرعة خالية من المنظفات البروتينات الغشاء إلى بيلاييرس الدهون المستهدفة عن طريق الانصهار للحويصلات أونيلاميلار تشكل الدهون مشحونة مكملة. (أ) تشكيل فوسوجينيك أنيونى والموجبة أونيلاميلار الصغيرة حويصلات (+سيارات الدفع الرباعي، وسيارات الدفع الرباعي–) بشكل اختياري محملة بالبضائع إينترافيسيكولار. (ب) تحويل فوسوجينيك سيارات الدفع الرباعي في بروتيوليبوسوميس فوسوجينيك (رر) بإعادة تشكيل بروتينات الغشاء. (ج) خالية من المنظفات التسليم من غشاء بروتينات الأغشية بوستفوسيون مع فوسوجينيك pl. (د) الاستراتيجية الأفضل لإيصال بروتينات الغشاء في أغشية حويصلات كبيرة، يتضح من الانصهار بين 100 نانومتر رر+ و 800 نانومتر لوف–. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: جيوف تكوين البروتوكول مع أسلوب مستحلب مقلوب. (أ) تشكيل أحادي الطبقة الدهنية على الحدود بين خليط الدهن النفط والماء. (ب) تشكيل مستحلب (الماء في النفط) مقلوب. (ج) جيوف تشكيل بتمرير مستحلب عبر الحدود الزيت عن الماء عن طريق الطرد المركزي. (د) تبريد الأنبوب أدناه < 18 درجة مئوية إلى ترسيخ وإزالة النفط. (ﻫ) صورة مجهرية الفلورسنت جيوف المحتوية على الدهن الفلورسنت (1% الوزن كسر تشوليستيريل-بوديبي-FL12) لها غشاء (الأخضر) وفلوروفوري قطبية (1 ملم 101 سولفورهوداميني) في التجويف في حويصلة (أحمر). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: دراسة انصهار الحويصلات الدهنية مع أسلوب الكوبالت-كالسين-يدتا. (أ) التخطيطي للأسلوب، حيث كالسين الحرة هو صادر من مجمع غير الفلورية الكوبالت-كالسين يدتا. (ب) "الانصهار لسيارات الدفع الرباعي" في تركيزات بوكل المختلفة. (ج) الإفراج عن كالسين إينترافيسيكولار بالإضافة للمنظفات يدتا و X-100 تريتون للحويصلات بوستفوسيون سيظهر في ب كما هو موضح في النص. درجة الانصهار (%) لتتبع الأحمر يحسب بقسمة إشارة الانصهار القصوى لتصحيح معلومات أساسية (1-2) بإشارة القصوى لتصحيح الخلفية عقب الإفراج عن كالسين مغلفة (3-2)، وضرب 100. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4: إعادة تشكيل فائق السرعة بو3-أوكسيديز وو1وس إلى بروتيوليبوسوميس فوسوجينيك، وقياسات النشاط البروتين في هذه بروتيوليبوسوميس. (أ) التخطيطي بروتوكول إعادة تشكيل. أكسدة1 (ب) Q إنزيم مدفوعة ضخ البروتون بو3-قياس أوكسيديز في رر مع ACMA تبريد (الموضح في النص). (ج) ATP يحركها التحلل بروتون الضخ من و1وo في رر قياس مع ACMA تبريد (الموضح في النص). (د) ATP التحلل من و1وo في رر قياس مع نظام تجديد ATP (الموضح في النص)، وفي التحفيز قبل أونكوبلير. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
الرقم 5: تأثير البيئة الدهن وقوة الأيونية على نشاط البروتينات الغشاء. بروتون الضخ من (أ) و1وo وبو3-أوكسيديز (ب) في رر الأيوني (تتبع الحمراء)، رر أنيونى (تتبع الأزرق)، رر المحايدة (الأسود التتبع) ورر الموجبة تنصهر مع لوف أنيونى (تتبع الخضراء) في 20 و 100 ملم (تتبع عنصر تحكم بوكل. يظهر رمادي) أي تغيير في بروتون ضخ إف1وس رر– عند خلط مع سيارات الدفع الرباعي–. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 6
الشكل 6: إيصال و1وس ATP synthase في أغشية 800 نانومتر لوف– عن طريق الانصهار مع رر+- التخطيطي (A) من التجربة: رر+ و 800 نانومتر لوف– كانت تنصهر في 1 مم والمماسح (درجة الحموضة 7.4)، مم 1 MgCl2، 20 مم بوكل لمدة 5 دقائق، القريبون لإزالة أونفوسيد رر، وحراكه في نفس المخزن المؤقت. (ب) بروتون الضخ بلوف بوستفوسيون (تتبع أحمر). وأظهرت تجارب التحكم لا ACMA تبريد عند رر0 كانت مختلطة مع لوف– (تتبع السوداء)، أو كانت فارغة لوف– وحدها جزيئي (تتبع الأزرق). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 7
الشكل 7: 5-دقيقة خالية من المنظفات الجمعية سلسلة نقل الإلكترون في أغشية 800 نانومتر لوف– عن طريق الانصهار مع رر+. التخطيطي (A) من التجربة: 100 نانومتر و1وس رر+ و 100 نانومتر بو3-كانت تنصهر أوكسيديز رر+ بلوف-، كما هو موضح في الشكل 6. تم إيقاف الانصهار بإضافة بوكل والممسحات إلى 100 و 50 مم، على التوالي. كانت مختلطة مع الكوكتيل ADP-لوسيفرين-لوسيفراس الأغشية وتنشيط بإضافة القيمة وف1، كما هو موضح في النص. وبدأ إنتاج ATP بإضافة فوسفات 1 مم (فأنا) ورصد الوقت الحقيقي مع نظام لوسيفرين لوسيفراس كما هو موضح في النص. (ب) ATP التوليف من الحويصلات بوستفوسيون (تتبع أحمر). مراقبة التجارب أظهرت عدم وجود إنتاج ATP عندما رر+ كانت مختلطة مع لوف– في الملح عالية (رمادي)، أو كانت مختلطة رر0 مع لوف– (أسود). تم حساب معدل توليف ATP كما هو موضح في النص (خطوات 8.8-8.9). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Discussion

فيما يلي عدد قليل من القضايا بحاجة إلى النظر لنجاح هذا النهج التجريبي:

خيار للدهن بليرس بروتيوليبوسوميس والهدف: الدهون الموجبة ليست موجودة في الطبيعة، بينما الدهون أنيونى وفيرة في الأغشية البيولوجية التوصل إلى، على سبيل المثال، ~ 25 و 35 و 20% في الغشاء الداخلي كولاي، غشاء البلازما للخميرة S. cerevisiaeوأغشية الميتوكوندريا الداخلية العديد من الأنواع، على التوالي27،،من2829. أنه سيكون من المعقول أن نتوقع أن الأداء الوظيفي للبروتينات الغشاء في رر+ قد تتأثر بقوة شحنة موجبة لبلير، الذي يتوقف بدوره على محتوى نسبي من الدهن الأيوني في بلير والخارجية الأيونية القوة. ولذلك، من المهم أن تعالج تجريبيا إلى أي مدى سيتوقف الأداء الوظيفي للبروتينات الغشاء للفائدة على المسؤول عن البيئة الدهون الموجبة. هنا، نحن تبين أن كلا و1وo ATP synthase وبو3-أوكسيديز حساسة للبيئة الدهن الأيوني، ولكن استطعنا أن تعدل، وعكس هذا التأثير من خلال وضع البروتينات في رر+ الأولى وتسليمها إلى أنيونى قبول بيلاييرس ومن ثم زيادة القوة الأيونية للمتوسط رد فعل بعد الانصهار يتم الانتهاء.

الخيار دهن الموجبة خاصة: معظم الدهون الموجبة المتاحة تجارياً ذات طبيعة غير ترياسيلجليسيريدي؛ ولذلك يجب اختبارها دهن مرشح محتمل للتوافق مع بروتينات الغشاء للفائدة. لقد وجدنا سابقا15 التي أظهرت ATP synthase المستخدمة في هذه الدراسة تشكل أفضل أداء في رر+ إيثيل-جهاز الكمبيوتر، والتي لديها أعلى التشابه الهيكلي للدهون ترياسيلجليسيريدي الطبيعية، بينما في دوتاب (غير ترياسيلجليسيريدي دهن) رر+ هذا البروتين كانت أقل نشاطا.

فحوصات الانصهار حويصلة: الانصهار الحقيقي حويصلة (عند مزج المحتويات السائلة إينترافيسيكولار) يحتاج أن يكون ميزت من الدول هيمي-فيوجن الوسيطة، عندما حويصلات التقيد ببعضها البعض دون خلط محتواها المائي، ولكن سهولة خلط المحتويات الخارجية أو كلا الدهن منشورات30. في حالة المخاليط الدهن دون الحد الأمثل أو شروط معينة، تظهر حويصلات أيضا تسرب المحتويات السائلة وضوحاً خلال الانصهار31. تركيزات ضئيلة الدهون مشحونة في خلائط فوسوجينيك تمكين الانصهار الحقيقي بحاجة إلى الاطلاع على تجريبيا لكل أنواع الدهون، ولكن عموما، أنها وجدت أن الأغشية بأقل من 10% اتهم تستخرج الدهون غير فوسوجينيك 32.

بينما تشكل فوسوجينيك سيارات الدفع الرباعي في وجود أيونات متعددة-بالينت، من المهم لا لخلط مكونات المشحونة معاكس، كما قد يتسبب هذا التثاقل الفوري وتراكم للدهون بهذه الأيونات. على سبيل المثال، أثناء إعداد سيارات الدفع الرباعي لأسلوب الكوبالت-كالسين-يدتا، من المهم تجنب خلط خليط دهن الموجبة مع أدتا الحيلولة دون انسداد فلتر البولي بمكونات تحبب خفيف.

من المهم أيضا أن نذكر أن الأسلوب الكوبالت-كالسين-يدتا، بينما يجري حساسة جداً ومريحة للرصد في الوقت الحقيقي الانصهار، قد لا يزال يقلل من مدى الانصهار سبب 1) تبريد ذاتي للأسفار كالسين الحرة داخل حويصلات بوستفوسيون، التي من المتوقع أن تصل إلى 1 مم، بينما عتبة التبريد الذاتي وتفيد التقارير أن حوالي 20 ميكرومتر33، و 2) سطح زمنياً الكوبالت-كالسين، الذي يظل ملزما بالدفع الرباعي+ حتى بعد مرورها عبر الراتنج هلام الترشيح و ألوان الحويصلات إلى لون برتقالي مشرق، بينما سيارات الدفع الرباعي0 لها لون برتقالي شاحب. لاحظ أيضا أن الإفراج عن الكوبالت-كالسين منضم عند إضافة المنظفات X-100 تريتون حضور يدتا يولد إشارات أقوى بكثير لسيارات الدفع الرباعي+ (الشكل 3، تتبع الأحمر) من سيارات الدفع الرباعي0 (تتبع الرمادية).

وجهات النظر: أننا نتوقع أن النهج السريع الموصوفة هنا قد إلى حد كبير تيسير وتسريع الجمعية الأغشية المعقدة لتلبية الاحتياجات الناشئة في تطبيقات البيولوجيا التركيبية. لدينا بروتوكول إعادة تشكيل البروتين الغشاء يأخذ سوى نصف ساعة لإعادة تشكيل بروتينات الغشاء كبيرة الهشة المعروفة لتكون حساسة لتقنيات إعادة تشكيل مطولة المستندة إلى الغسيل الكلوي، وبينما يأخذ هذا النهج فوسوجينيك فقط 5-10 دقيقة لتسليم هذه البروتينات في بيلاييرس دهني كبير. هنا، نحن إثبات مزايا هذه النهج عن طريق التلاعب كولاي و1وس ATP synthase، الذي مثال للبروتين الهشة. أنها مصنوعة من مفارز 23 وهو معروف بسهولة تفقد سلامتها إذا ما تعرضوا لظروف دون المستوى الأمثل (على سبيل المثال، الحرارة) أثناء أو بعد solubilization، لكن المستخدمة في هذه الإجراءات، يوضح البروتين تكاثر عالية النشاط في ضخ البروتون.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

المؤلف شاكرون جينيس روبرت من جامعة إلينوي وكريستوف فون بالموس من جامعة بيرن لتوفير بلازميد وسلالة للتعبير عن بو3-أوكسيديز. المشروع وأيده BBSRC منحة BB/L01985X/1 R.I. وسنغ

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DOPC neutral lipid Avanti Lipids 850375
POPA anionic lipid Avanti Lipids 840857
E-PC cationic lipid Avanti Lipids 890704
Cholesteryl-Bodipy-FL12 Thermofisher C3927MP
Sephadex G-50, Super Fine Sigma G5050
Ficoll 400, Type 400-DL Sigma F8016
ACMA Sigma A5806
Nigericin Sigma N7143
ATP Sigma A26209
Q1 Sigma C7956
DTT Sigma D0632
PEP Sigma 860077
NADH Sigma N8129
PK Sigma P9136-1KU
LDH Sigma L1254-1KU
Luciferin Sigma L6882
Luciferase Sigma/Roche 10411523001
Calcein Insight Biotechnology sc-202090
CoCl2 Sigma C8661
EDTA Sigma E6758
Sulforhodamine 101 Sigma S7635
Extrusion system Avanti Extruder
Single tube luminometer, model Sirius L Titertek Berthold
Polycarbonate filter, D19 mm Sigma, Whatman NucleporeTrack-Etched Membranes WHA800309, WHA800284 100 or 200 nm to form SUV, and 400 or 800 nm for LUV
Name Company Catalog Number Comments
Buffers used in the paper
Buffer A 100 mM KCl, 50 mM MOPS pH 7.4, 1 mM MgCl2
Buffer B 20 mM KCl, 10 mM MOPS pH 7.4, 0.1 mM MgCl2
Buffer C 100 mM KCl, 10 mM MOPS pH 7.4
Buffer D 1 mM MOPS pH 7.4
Various concentrations of KCl

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rigaud, J. L., Levy, D. Reconstitution of membrane proteins into liposomes. Liposomes, Pt B. 372, 65-86 (2003).
  2. Johnson, M., et al. Two-dimensional crystallization of membrane proteins by reconstitution through dialysis. Methods Mol Biol. 955 (31-58), 31 (2013).
  3. Dezi, M., et al. Detergent-mediated incorporation of transmembrane proteins in giant unilamellar vesicles with controlled physiological contents. Proc Nat Acad Sci U S A. 110 (18), 7276-7281 (2013).
  4. Girard, P., et al. A new method for the reconstitution of membrane proteins into giant unilamellar vesicles. Biophys J. 87 (1), 419-429 (2004).
  5. Angelova, M., et al. Preparation of Giant Vesicles by External Ac Electric-Fields - Kinetics and Applications. Trends in Colloid and Interface Science Vi. 89, 127-131 (1992).
  6. Leptihn, S., et al. Constructing droplet interface bilayers from the contact of aqueous droplets in oil. Nature Protocols. 8 (6), 1048-1057 (2013).
  7. Villar, G., Graham, A. D., Bayley, H. A Tissue-Like Printed Material. Science. 340 (6128), 48-52 (2013).
  8. Khalil, A. S., Collins, J. J. Synthetic biology: applications come of age. Nat Rev Genet. 11 (5), 367-379 (2010).
  9. Smith, M. T., Wilding, K. M., Hunt, J. M., Bennett, A. M., Bundy, B. C. The emerging age of cell-free synthetic biology. FEBS Lett. 588 (17), 2755-2761 (2014).
  10. Church, G., et al. Realizing the potential of synthetic biology. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (4), 289-294 (2014).
  11. Gao, Y., et al. Single reconstituted neuronal SNARE complexes zipper in three distinct stages. Science. 337 (6100), 1340-1343 (2012).
  12. Nordlund, G., Brzezinski, P., von Ballmoos, C. SNARE-fusion mediated insertion of membrane proteins into native and artificial membranes. Nat Commun. 5, 4303 (2014).
  13. Decout, A., et al. Enhanced efficiency of a targeted fusogenic peptide. Biochimica Et Biophysica Acta-Biomembranes. 1372 (1), 102-116 (1998).
  14. Chan, Y. H., van Lengerich, B., Boxer, S. G. Effects of linker sequences on vesicle fusion mediated by lipid-anchored DNA oligonucleotides. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (4), 979-984 (2009).
  15. Ishmukhametov, R. R., Russell, A. N., Berry, R. M. A modular platform for one-step assembly of multi-component membrane systems by fusion of charged proteoliposomes. Nat Commun. 7, 13025 (2016).
  16. Biner, O., et al. Delivery of membrane proteins into small and giant unilamellar vesicles by charge-mediated fusion. FEBS Lett. 590 (14), 2051-2062 (2016).
  17. Bian, T., et al. Direct detection of SERCA calcium transport and small-molecule inhibition in giant unilamellar vesicles. Biochem Biophys Res Commun. 481 (3-4), 206-211 (2016).
  18. Schuette, C. G., et al. Determinants of liposome fusion mediated by synaptic SNARE proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (9), 2858-2863 (2004).
  19. Spencer, A. C., Torre, P., Mansy, S. S. The encapsulation of cell-free transcription and translation machinery in vesicles for the construction of cellular mimics. J Vis Exp. (80), e51304 (2013).
  20. Verchere, A., et al. In vitro investigation of the MexAB efflux pump from Pseudomonas aeruginosa. J Vis Exp. (84), e50894 (2014).
  21. Kaplan, R. S., Pedersen, P. L. Determination of Microgram Quantities of Protein in the Presence of Milligram Levels of Lipid with Amido Black B-10. Analytical Biochemistry. 150 (1), 97-104 (1985).
  22. Rumbley, J., et al. One-step purification of histidine-tagged cytochrome bo3 from Escherichia coli and demonstration that associated quinone is not required for the structural integrity of the oxidase. Biochim Biophys Acta. 1340 (1), 131-142 (1997).
  23. Taussky, H. H., Shorr, E. A Microcolorimetric Method for the Determination of Inorganic Phosphorus. Journal of Biological Chemistry. 202 (2), 675-685 (1953).
  24. Galkin, M. A., Ishmukhametov, R. R., Vik, S. B. A functionally inactive, cold-stabilized form of the Escherichia coli F1Fo ATP synthase. Biochimica Et Biophysica Acta-Bioenergetics. 1757 (3), 206-214 (2006).
  25. Ishmukhametov, R. R., Galkin, M. A., Vik, S. B. Ultrafast purification and reconstitution of His-tagged cysteine-less Escherichia coli F1Fo ATP synthase. Biochim Biophys Acta. 1706 (1-2), 110-116 (2005).
  26. Wiedenmann, A., Dimroth, P., von Ballmoos, C. Deltapsi and DeltapH are equivalent driving forces for proton transport through isolated F(0) complexes of ATP synthases. Biochim Biophys Acta. 1777 (10), 1301-1310 (2008).
  27. Morein, S., et al. Wild-type Escherichia coli cells regulate the membrane lipid composition in a "window" between gel and non-lamellar structures. J Biol Chem. 271 (12), 6801-6809 (1996).
  28. Zinser, E., et al. Phospholipid synthesis and lipid composition of subcellular membranes in the unicellular eukaryote Saccharomyces cerevisiae. J Bacteriol. 173 (6), 2026-2034 (1991).
  29. Daum, G., Vance, J. E. Import of lipids into mitochondria. Prog Lipid Res. 36 (2-3), 103-130 (1997).
  30. Pantazatos, D. P., MacDonald, R. C. Directly observed membrane fusion between oppositely charged phospholipid bilayers. J Membr Biol. 170 (1), 27-38 (1999).
  31. Pantazatos, D. P., Pantazatos, S. P., MacDonald, R. C. Bilayer mixing, fusion, and lysis following the interaction of populations of cationic and anionic phospholipid bilayer vesicles. J Membr Biol. 194 (2), 129-139 (2003).
  32. Sunami, T., et al. Detection of association and fusion of giant vesicles using a fluorescence-activated cell sorter. Langmuir. 26 (19), 15098-15103 (2010).
  33. Memoli, A., et al. Effects of surfactants on the spectral behaviour of calcein (II): a method of evaluation. J Pharm Biomed Anal. 19 (3-4), 627-632 (1999).

Tags

الكيمياء الحيوية، العدد 134، بروتينات الغشاء، وإعادة تشكيل، بروتيوليبوسوميس، لوف، جيوف، غشاء الانصهار، وسلسلة نقل الإلكترون، ATP synthase، وإنتاج ATP، والبيولوجيا التركيبية
خالية من المنظفات فائق السرعة إعادة تشكيل بروتينات الغشاء إلى بليرس الدهن باستخدام فوسوجينيك بروتيوليبوسوميس تكميلية مشحونة.
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Galkin, M. A., Russell, A. N., Vik,… More

Galkin, M. A., Russell, A. N., Vik, S. B., Berry, R. M., Ishmukhametov, R. R. Detergent-free Ultrafast Reconstitution of Membrane Proteins into Lipid Bilayers Using Fusogenic Complementary-charged Proteoliposomes.. J. Vis. Exp. (134), e56909, doi:10.3791/56909 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter