Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Deterjan-Alerjik membran proteinlerinin Ultrafast sulandırma tamamlayıcı-Proteoliposomes ücret Fusogenic kullanarak Lipid Bilayers içine.

Published: April 5, 2018 doi: 10.3791/56909
Automatic Translation
1, 2, 3, 2, 2
1First Pavlov State Medical University, 2Clarendon Laboratory, Department of Physics, Oxford University, 3Department of Biological Sciences, Southern Methodist University

Summary

Burada hedef lipid bilayers postfusion bilayer içine bu membran proteinlerinin deterjan ücretsiz teslim etmek için ile ultrafast protokollerinden membran proteinlerinin fusogenic proteoliposomes içine sulandırma ve böyle proteoliposomes füzyonu için mevcut. Bu yaklaşımlardan birleşimini karmaşık çok bileşenli Membran sistemleri hızlı ve kolayca kontrollü montaj sağlar.

Abstract

Daha karmaşık, daha büyük modeli lipid bilayers deterjanlar ile daha az uyumlu iken deterjanlar 30-100 nm küçük unilamellar veziküller, içine zar proteinleri, teslimi için vazgeçilmezdir.

Burada ters bir membran protein ilgi taşıyan lipozomlar tahsil fusogenic kullanarak bu temel sınırlama yan yol için bir strateji tanımlarlar. Füzyon böyle veziküller arasında düşük iyonik gücü arabellekte 5 dk içinde oluşur. Pozitif yüklü fusogenic lipozomlar basit Servisi vektör olarak olumsuz ücret biomimetic hedef lipid bilayers içine zar proteinleri deterjan ücretsiz teslim etmek için kullanılabilir. Biz de zar proteinleri fusogenic proteoliposomes hızlı 30 dk protokolü ile içine yeniden oluşturmak nasıl gösterir.

Bu iki yaklaşım birleştirerek, biz iki membran proteinlerinin E. colidan oluşan bir elektron taşıma zinciri hızlı Meclisi göstermek, birincil bir proton pompa bo3-oksidaz ve F1Fo ATP sentaz, zarı veziküller 0.1 kadar irili ufaklı > ATP üretimi bu zinciri tarafından yanı sıra 10 mikron.

Introduction

Yapay lipid bilayers zar proteinleri ile functionalization Membran sistemleri modellemek Meclisi önemli bir adımdır. En basit modeli, proteoliposomes (PL), küçük (30-200 nm çapında) oluşur unilamellar veziküller (SUV, ayrıca denilen lipozomlar), protein ile onların membranlar entegre. PL geleneksel olarak kurulan iki içinde1adım. İlk, ön şekillendirilmesi SUV bir membran protein faiz ve onun kritik micelle konsantrasyonu (CMC) yukarıda bir konsantrasyon, bir deterjan ile karıştırılır. İkinci olarak, deterjan çeşitli diyaliz, "biyo-boncuk" veya jel filtrasyon teknikleri, membran protein bırakarak kaldırılır. İkinci yaklaşımı çok daha hızlı (~ 30 dk1) ve ilk iki yaklaşımlar ölçülmesinin birçok saat neden olabilir deterjan kaldırma hızı ile sınırlı iken bu nedenle kırılgan ve hassas membran proteinlerinin, sulandırma için tercih edilir bir etkinlik ve proteinlerin yapısal bütünlüğü kaybı önemli kaybı. Daha büyük bir functionalization veziküller (büyük unilamellar veziküller, LUV, 1 µm çapı kadar) bu yaklaşım tarafından mı daha zor, vezikül boyutu deterjan kaldırıldıktan sonra düşük olur ve dev unilamellar veziküller için mümkün değildir (Şef, > 1 µm), oldukları gibi Deterjanlar (ama görürsem Johnson ve ark. dengeleri bozdu 2 yavaş 2D-kristalleşme membran proteinlerinin büyük bilayers için). Şef membran functionalization3,4,5 için alternatif yaklaşımlar var ama zahmetli, zaman alıcı ve hala bazı deterjan CMC aşağıda konsantrasyonlarda gerektirir. Daha karmaşık veya kırılgan lipid modelleri (örneğin, damlacık hidrojel Bilayers6 ve 3D yazdırılabilir damlacık arabirimi Bilayer tabanlı yapay doku7) deterjanlar tahammül edemez. Hızlı bir şekilde sentetik Biyoloji uygulamaları8,ortaya çıkan9,10 , böyle karmaşık membran yapılar functionalization üzerinde eleştirel bağlıdır. Bu nedenle, bir kolay ve sağlam yöntemi membran proteinlerinin hızlı ve nazik teslimini hedef kırılgan bilayers içine sağlayan son derece alanında aranır.

Alternatif, deterjan-Alerjik protein teslim yöntemi vezikül fusion, nerede intravesicular sulu içeriklerini olmadan varlık serbest bırakmak dış karışık olsun iken etkileşen veziküller membranlar sağlam postfusion bilayer birleştirmek olduğunu çevre. Vezikül füzyon etkin ve temas içinde bulunan tamamlayıcı fusogenic ajanlar (bazı proteinler11,12 ve peptidler13 ya da özel olarak değiştirilmiş DNA14) içinde konformasyon düzenlemeler tarafından tahrik bilayers veya Coulombic lipid bilayers Hofstede tamamlayıcı dolu Anyonik ve Katyonik lipidler15,16, veya Katyonik bilayers ve olumsuz şarj edilmiş proteinlerin17kurdu.

Fusogenic ajanlar etkileşen membranlarda füzyon önce varlığı nispeten yavaş (~ 30 yarı-maksimum füzyon12,18ulaşmak için min) ama hem doğal ve yapay için uygulanabilir eski yaklaşım gerektirir membranlar.

Fusogenic lipidler (şekil 1) kullanarak yaklaşım bir avantajı çok daha hızlı membran füzyon (~ 1 yarı-maksimum ve reaksiyon bitirmek için 5-10 dk ulaşmak için min) sağlar olduğunu. Ayrıca, füzyon verdiği ölçüde kolay i) bir göreli içerik dolu lipidler fusogenic bilayers ve II) iyonik ve reaksiyon orta (tuzları, 50 mM ve örneğin, sukroz15 yukarıda genel, ozmotik gücünü formüle etmek tarafından kontrol edilebilir füzyon durdurmak için gösterilir), ya da her ikisinin bir birleşimi. Füzyon başlatmak için 5-10 dk için düşük (genellikle 10-20 mM tuz) iyonik gücü ortamda karşılıklı dolu fusogenic veziküller karıştırılır. Katyonik lipidler fusion, özellikle de düşük iyonik gücü, önce Katyonik proteoliposomes membran proteinlerinin işlevselliğini üzerinde olumsuz bir etkisi uygulamak ama bu etkiyi tersine çevrilebilir ve hafifletilmiş tarafından doğal bir yöntem göreli bir dezavantaj olduğunu lipid bileşimi sonrası füzyon membran ve onun dönüş normal iyonik gücü orta.

Protocol

1. fusogenic hazırlanması SUV ve LUV

  1. Fusogenic lipid karışımı hazırlanması
    1. Kloroform 25-50 mg/mL, tarafsız, Katyonik, Anyonik ve floresan lipidler hisse senedi çözümler hazırlamak (örneğin, tarafsız DOPC (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), Katyonik etil-PC (1,2- dimyristoleoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine), Anyonik POPA (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphate) ve FL12 Kolesteril Bodipy Floresan, sırasıyla) uygun miktarda kuru lipitler tartma ve onları % 100 eriterek tarafından Kloroform (dikkat! Bunu bir duman başlık altında), ya da ticari olarak mevcut kloroform stokları lipidler kloroform ile sulandrarak.
      Not: Hem doğal lipid ayıklar ve saf sentetik yağlar kullanılabilir ve benzer sonuçlar gösterilmektedir.
    2. Mix 2.5 mg bir Katyonik ve tarafsız bir lipid kloroform hisse senedi (1.1.1) bir cam şişe içinde 2.5 mg.
      Not: Bu adım 5 mg % 50 ağırlık Katyonik lipidler kısmını içeren kloroform, Katyonik lipit karışımı verir. Gerektiğinde, %0,5 ağırlık bir floresan lipid kısmını karışıma ekleyin.
    3. 1 mg Anyonik ve nötr lipitler kloroform stokları (1.1.1) bir cam şişe içinde 4 mg karıştırın. Bu 5 mg % 20 kilo Anyonik lipidler kısmını içeren Anyonik lipid karışımı verir.
    4. Kloroform azot kuru lipid ince bir tabaka oluşturmak için bir akarsuyun altında buharlaşır.
    5. 10 dk için vakum altında kalan kloroform kaldırmak.
      Not: Geleneksel olarak çok daha uzun (1-12 h) bu adımı alır ama daha uzun bir tedavi özellikleri SUV kaplin hiçbir belirgin düzelme sağlar bulduk.
    6. Her şişe 0.5 mL arabellek A (100 mM KCl, 1 mM MgCl2, 50 mM BEZLERİ, pH 7,4) ekleyerek ve gideriş onları kadar lipit filmin cam yüzey ve b tamamen müstakil oda sıcaklığında 30 dk ve sonra girdap durmak için Kuru lipit filmin hidrat ecomes homojen lipid süspansiyon. Bu konuda almalısınız 20-40 s.
  2. SUV ve LUV oluşumu ile ekstrüzyon
    1. Bir ekstrüzyon sistemini monte ( Tablo reçetesigörmek) polikarbonat filtre aşağıdakilerden birini kullanarak iki 1 mL şırınga ile gözenek boyutları: form SUV için 100 ya da 200 nm ve 400 veya 800 nm forma LUV.
    2. Lipid süspansiyon bir şırınga aktarın.
    3. Süspansiyon filtreden 21 kez, başka bir yerde18,19gösterildiği gibi geçen A'ya.
      Not: Geçişleri tek sayıda transfer büyük lipid kümeleri orijinal lipid süspansiyon karşı karşıya filtre tarafa sıkışmış vezikül çözüm içine en aza indirmek için gereklidir.
    4. Vezikül çözüm 1.5 mL microcentrifuge tüpler içine aktarın.

2. Fusogenic Şef ters emülsiyon yöntemi tarafından oluşumu

Not: Bu yordam Şekil 2' de gösterilmiştir.

  1. Petrol lipid çözüm hazırlanması
    1. Kloroform hisse senedi mix (bkz. Adım 1.1.1) tarafsız lipid (2 mg) ve 1 mL hexadecane 1.5 mL microcentrifuge tüp ile Anyonik bir lipid (0.5 mg).
    2. Kloroform sürekli karıştırma ve 30 dk tüpü açık tutmak için 80 ° C'de Isıtma altında karışımından buharlaşır. Tüp kapatın ve oda sıcaklığında soğumaya bırakın.
  2. Lipid monolayer lipid-içinde-petrol/sulu tampon arayüzüne oluşumu
    1. Yer 200 µL üstünde tepe-in 0.5 mL arabellek B (20 mM KCl, 0,1 mM MgCl2, 10 mM BEZLERİ pH 7,4) 1,5 mL santrifüj tüpü petrol lipid çözüm. Faz ayrımı sınır petrol ve sulu tampon (şekil 2A) arasındaki yüzey gerilimini uyumsuzluğu nedeniyle dışbükey şeklinde Not.
    2. Faz ayrımı sınır düzleştirir, lipid monolayer oluşumu üzerine göstergesi olduğu kadar bekleyin. Bu genellikle oda sıcaklığında 30-60 dakika sürer.
  3. Petrol su emülsiyon hazırlanması
    1. Suda çözünen bir iyonik olmayan polisakkarit tampon B, daha su yoğunluğu yüksek yoğunluklu çözüm hazırlamak (örneğin % 15 Ficoll-400 (w/v), yoğunluğu ile 1.05 g/mL)
      Not: İsteğe bağlı olarak, bir floresan boyalar suda çözünen Şef daha iyi görselleştirme için arabellek ve GUVs diğer herhangi bir istenen sulu içeriği ekleyebilirsiniz.
    2. Ayrı 1.5 mL santrifüj tüpü yukarıdaki karışıma 0.5 µL petrol lipid çözeltinin 100 µL ile 2.1.2 aktarmak.
    3. Karışımı 30 (14 W 44 kHz) solüsyon içeren temizleyicide s bir ultrasonik su banyosunda. O zaman, şiddetle bir petrol su emülsiyon oluşturmak 45 dk için girdap nerede her damlacık bir lipid monolayer (şekil 2B) kaplı olması.
  4. Şef içine yağ su emülsiyon dönüşüm
    1. Sonuç emülsiyon lipid-içinde-petrol/sulu arabirimi üstüne yerleştirin ve hemen 2 min için 10.000 x g de masa üstü santrifüj tüpü santrifüj kapasitesi. Şef sonuç Pelet açıkça görülebilir (şekil 2C) olmalıdır.
    2. Tüp 4 ° C lipit-içinde-yağ karışımı kuvvetlendirmek için bir buzdolabı için serin (şekil 2B, hexadecane katılaşır 18 ° C altında), donmuş yağ dikkatli bir şekilde çıkarın ve sulu faz tutar.
      Not: bir tel bir çapa şeklinde bükülmüş kaldırma donma petrol kolaylaştırmak için kullanıldı.
    3. Şef Pelet 50 µL taze arabelleği B, transfer için taze bir tüp içinde resuspend ve bir 100 X yağı daldırma hedefi (şekil 2E) kullanarak bir floresan mikroskop altında incelemek.

3. izleme vezikül Fusion kobalt-Calcein yöntemi ile

  1. Bir jel-filtrasyon yerçekimi sütun hazırlanması.
    1. ~ 10 g jel-filtrasyon reçine (örneğin superfine sephadex G-50) 100 mL deiyonize suyla ıslatın ve gecede şişmesine izin.
    2. Reçine 3 mL tek kullanımlık plastik yerçekimi akışı sütuna topla, ultrasaf su ile yıkayın ve arabellek C (100 mM KCl, 10 mM BEZLERİ, pH 7,4) oda sıcaklığında ile equilibrate.
  2. SUV+ veya SUV0 hazırlanması kobalt-calcein ile dolu.
    1. 1 mM calcein, 1 mM CoCl2, 98 mM NaCl, 10 mM BEZLERİ, içeren bir çözüm hazırlamak sonra pH 7.4 için getirmek.
      Not: Bu ücretsiz floresan calcein bir floresan kompleks ile Co2 +formlar yöntemi özüdür. Yine EDTA, saatleri eklenmesi floresan olur için Co2 +, daha yüksek ilgi yerinden calcein kobalt-calcein kompleksi (şekil 3A) üzerinden.
    2. Bu çözümün 500 µL Katyonik veya nötr lipitler 1. 1'açıklandığı gibi hazır kuru bir film ekleyin.
    3. 100 hazırlamak nm SUV 1.2 ile açıklandığı gibi ekstrüzyon tarafından.
    4. Masa üstü ultracentrifuge içinde 20 dk için 1.000.000 x g de haddelenmiş SUV cips ve arabellek C1 mL resuspend. Peletleme ve resuspension üç kez tekrarlayın; Arabellek C 0.6 mL için son resuspension kullanın.
      Not: Aşağıdaki adımları dış kobalt calcein çoğunu kaldırın.
    5. Kalan dış kobalt-calcein tarafından geçen SUV üzerinden adım 3.1.2 için açıklandığı gibi C önbellekle equilibrated jel-filtrasyon reçine ile yüklenen tek kullanımlık yerçekimi-akışı sütun kaldırmak.
      Not: Genellikle ilk mililitre hacmi akışı aracılığıyla atın ve dış kobalt-calcein ücretsiz SUV içeren ikinci mililitre toplamak.
  3. EDTA ile yüklenen hazırlanması SUV-
    1. Çözüm 10 mm EDTA, 80 mM NaCl, 10 mM BEZLERİ, pH 7.4 hazırlayın.
    2. Bu çözümün 500 µL Anyonik lipidler 1. 1'açıklandığı gibi hazır kuru bir film ekleyin.
    3. 1. 2'açıklandığı gibi ekstrüzyon SUV- hazırlayın.
    4. Cips ve 3.2.4 içinde açıklandığı gibi SUV- resuspend.
    5. Kalan EDTA ile 3.2.5 içinde açıklandığı gibi jel-filtrasyon sütun SUV- geçirerek kaldırın.
  4. SUV fusion için hazırlanıyor
    1. SUV0, SUV+ve SUV- 0.2 mM CoCl2 ve KCl. kullanım 5 µL SUV arabellek d. 1 mL başına her tür istenen konsantrasyonu ile takıma arabellek D (1 mM BEZLERİ, pH 7,4) ile sulandırmak
    2. Karışım en az 1 h için kuluçkaya.
      Not: Bu adımı arka plan Floresans düzeyi bu yüzey SUV+bağlı calcein engelleyerek en aza indirmek olacaktır.
  5. Vezikül füzyon
    1. Bu füzyon reaksiyonunu SUV+ veya SUV0 1 mL (yukarıda açıklandığı gibi D arabellekte seyreltilmiş) SUV− 1 mL ile karıştırılarak bir 2 mL fluorimeter küvet ve 480 nm uyarma ve 510 nm emisyon kullanarak calcein floresan artan monitör başlatmak (Şekil 3B).
    2. Reaksiyon tamamlanması gelene kadar bekle.
    3. Deterjan Triton X-100 ve EDTA karışımı ekleyin (% 0.05 son konsantrasyon ve 7 mM, sırasıyla) calcein veziküller dışarı serbest bırakmak ve maksimum Floresans sinyal almak için.
    4. Şekil 3 ciçinde gösterildiği gibi deterjan yanı sıra takip maksimum Floresans sinyal yüzdesi olarak tanımlanan füzyon kapsamını belirlemek.

4. hızlı membran proteinlerinin sulandırma Fusogenic Proteoliposomes içine

Not: Bu yordam şekil 4Agösterilmektedir.

  1. 3. 1'açıklandığı gibi jel-filtrasyon reçine ile yerçekimi akışı sütun hazırlamak ve arabellek A oda sıcaklığında ile equilibrate.
    Not: Tüm diğer manipülasyonlar, protein aktivite kaybı en aza indirmek için belirtilmedikçe kesinlikle ≤ 4 ° C, yapılmalıdır.
  2. 0.7 mg/ml saf membran protein konsantrasyonu protein yalıtımı için kullanılan aynı ayıklama arabellek ile sulandrarak ayarlayın.
  3. Ön şekillendirilmesi SUV, 160 µL arabellek A ve 60 µL % 10 cholate arabelleği A, 300 µL ile Mix 140 µL protein; Bu 1:30 verir protein: lipid ağırlık oranı son 660 µL birimindeki.
  4. Yavaşça 15dk için sallanan bir platformda karışımı sallayın.
    Not: Aşağıdaki adımları oda sıcaklığında yapılabilir.
  5. Jel-filtrasyon reçine ile karışımı geçmek ve proteoliposomes içeren bulanık kesirleri toplamak.
  6. Proteoliposomes ile bir masa üstü ultracentrifuge 15dk için 400.000 x g de cips.
  7. Sigara yeniden protein içeren süpernatant atmak ve Pelet 1 mL taze arabellek A. resuspend
  8. PL ve20Amido-siyah yöntemi kullanarak süpernatant protein içeriği belirleyin.
  9. Sulandırma, verim genellikle yaklaşık % 50-70 olan belirlemek.
    Not: PL solution'ı 1 mL tek kullanımlık yerçekimi sütuna Paketli ve arabellek ile A 3.1.2 içinde açıklandığı gibi yıkanmış Ni-NTA reçine geçirerek adımları 4.6-4.8 isteğe bağlı olarak değiştirilebilir. Böyle geçen tercihen reçine için PL en hangi akış-aracılığıyla olacak, üzerinden bağlı olmayan yeniden protein ayıracak.

5. Proteoliposomes Protein faaliyet işlevsel testleri

Not: Bu çalışmada kullanılan her iki güçlü proton pompa, pompa H+ proteoliposomes onların yüzeylerde eklenmesi üzerine içine proteinlerdir (koenzim Q1 bo3-oksidaz ve ATP için F1Fo, sırasıyla), böylece bina proton degrade boyunca membran (ΔpH). Fusion başarılı co sulandırma durumunda böyle asitleştirme rutin olarak kullanılan bu tür görevleri () için bir pH duyarlı sonda ACMA (9-Amino-6-Chloro-2-Methoxyacridine)12,15, floresan bir düşüş olarak görülebilir Şekil 4B -c). Ayrıca substrat özel etkinlik proteinlerin (koenzim Q1 oksidasyon bo3-oksidaz22 ve ATP hidroliz F1Fo23,24tarafından) izlenebilir spectrophotometrically çeşitli yöntemlerle. Burada, F1Fo PL tahlil (şekil 4 d), iki yerde yenileyici bir ATP kullanarak ATP hidroliz etkinliği göstermektedir enzimler (pyruvate kinaz (PK) ve laktat dehidrogenaz (karaciğer) korumak ATP sürekli konsantrasyon aşağıdaki gibi. PK geri içine onun substrat phosphoenolpyruvate (moral) pahasına ATP F1Fo tarafından üretilen ADP dönüştürerek ATP geri dönüştürür. Bu reaksiyon, ürünü, pyruvate laktat karaciğer NADH, hangi oksidasyonunu izlenen 340, optik yoğunluğu azalan olarak pahasına tarafından dönüştürülmüş nm.

  1. Kimyasallar hazırlanması
    1. 1 mM etanol ACMA stokta hazır olun.
    2. Nigericin 1 mM stokunun (veya herhangi bir diğer uncoupler) etanol hazırlayın.
    3. Etanol stokta 25 mM koenzim Q1 ve 1 M DTT stok arabelleği A. hazırlamak
    4. Bir stok arabelleği A 100 mm ATP hazırlamak ve onun pH 7.4 için ayarlayın.
    5. Stokları sistem bileşenlerinde arabellek A: 100 mM PEP, 1 mM NADH ve PK ve karaciğer Solutions'da konsantrasyon ~ 500-1000 Yenileyici ATP hazırlamak adet/mL.
  2. Bo3tarafından pompalama koenzim Q1 oksidasyon tahrik proton-oksidaz PL
    1. 0.5 µM ACMA huzurunda fluorimeter küvet ile 2 mL arabellek A 20 µL pl eklemek ve 430 nm uyarma ve 515 nm emisyon kullanarak kararlı sinyali kadar bekleyin.
    2. 40 µM koenzim Q1 küvet için ekleyin.
    3. PL (şekil 4B) 2 mM DTT ekleyerek proton pompalama başlasın.
      Not: DTT oksitlenmiş koenzim Q1 azaltır ve bo3için kullanılabilir hale getirir-oksidaz.
    4. Kurulan ΔpH 2 µM uncoupler (örneğin nigericin) ekleyerek dağıtmak. ACMA Floresans sinyal hızlı bir şekilde neredeyse orijinal seviyeye döndürmelidir.
      Not: Olmalı yok ACMA belgili tanımlık substrate eklenmesi Şoklama uncoupler reaksiyon karışımı başlangıçta varsa.
  3. ATP hidroliz tahrik proton pompalama F1Fotarafından PL
    1. 40 µL pl bir fluorimeter küvet 5,2 açıklandığı gibi ekleyin.
    2. PL (şekil 4 c) 0.2 mM ATP ekleyerek proton pompalama başlasın.
    3. ΔpH 5.2.4'ten içinde açıklandığı gibi dağıtmak.
  4. ATP hidroliz F1FoPL ve onun stimülasyon uncoupler tarafından
    1. PL 40 µL 2 mL arabellek A, içeren 1 mM ATP, 0.2 mM NADH, 2 mM PEP, ile Spektrofotometre küvet için ve 15 µL her PK ve karaciğer ekleyin.
    2. 340, NADH Absorbans azalma ölçerek reaksiyon izleyin nm. 3-4 dk sonra ΔpH ATP hidroliz üzerinde backpressure serbest bırakmak için küvet için 2 µM uncoupler ekleyin. Reaksiyon hızı hemen yükseltmeniz gerekir.
      Not: 4.10 içinde açıklandığı gibi Ni-NTA reçine geçtiğini PL uncoupler (şekil 4 d, kırmızı izle), tarafından en güçlü stimülasyon koyacak eluate zar zor uyarılmış (Mavi izle) olacak iken.

6. Fusogenic Proteoliposomes Lipid çevre ve iyonik gücü etkisi membran proteinlerinin işlevselliğini test

  1. Tarafından 40 µL proton pompalama değerlendirmek PL+,- PL ve PL0 ACMA 2 mL su verme tahlil ile 1 mM MgCl2 ve 20 (5 rakam, Panel A) veya 100 mM KCl (Masası 5.2 veya 5.3 (şekil 5 tanımlandığı şekliyle B) ile takıma D tampon kırmızı, siyah ve mavi izler).
  2. Pl+ 40 µL LUV- aynı birim arabellek 20 mM KCl ve ACMA su verme (yeşil izle) için test ile takıma D 2 ml ile sigorta.
  3. Adım 2 gibi kontrol deneyleri, örneğin, PL ve SUV aynı ücret (gri izle) karıştırarak çalıştırın.
    Not: Proton pompalama tarafından postfusion PL. geliştirilmiş

7. teslim membran proteinlerinin LUV ve Şef Fusogenic Proteoliposomes tarafından

  1. PL+ 50 µL 50 µL 800 ile sigorta nm LUV- arabellek 1 mM MgCl2ve 5 min için 20 mM KCl D 1 ml.
  2. Veziküller 6.000 x g 5 min için de cips ve süpernatant içeren unreacted PL+atın. Pelet arabellek D 1 mM MgCl2 ve 100 mM KCl ile 1 ml resuspend ve peletleme ve iki kez daha fazla resuspending tekrarlayın.
  3. 5.2 veya 5,4 tanımlandığı şekliyle tahlil Şoklama ACMA çalıştırın.
  4. Yüksek tuz (200 mM KCl) tamamlayıcı dolu veziküller kombinasyonları, Sigara fusogenic veziküller ve sadece boş LUV- PL+olmadan kullanarak adımları 1-3, olduğu gibi kontrol deneyleri çalıştırın.
    Not: sadece tamamlayıcı dolu veziküller şekil 6' da gösterildiği gibi kullanılan zaman postfusion tarafından LUV Proton pompalama tespit edilmelidir.

8. elektron taşıma zinciri LUV membranlar ve Şef ve ATP üretimi bu zinciri tarafından bireysel bileşenlerden Meclisi.

Not: Bu yordamın bir şematik şekil 7Agösterilmektedir. Bu deneyde üretilen ATP nerede sentezlenen ATP luciferase tarafından dönüşüm pirofosfat ve AMP içine ışık emisyon bir luminometer ile kayıtlı ardından biyoluminesans-luciferase sistemi tarafından kayıtlı olacak. Bir tek tüp luminometer yerine daha az duyarlı Mikroplaka Luminometreler kullanmanızı öneririz.

  1. Mix 3 µL bo3-oksidaz PL+ ve 5 µL F1Fo PL+ oluşan bölüm 4'te açıklandığı gibi.
  2. Onlarla 3 µL LUV ya da Şef- (Bölüm 2'de açıklandığı gibi oluşan) arabelleği 20 mM KCl ve 5 min için 1 mM MgCl2 ile takıma D 800 µL sigorta.
  3. Yüksek konsantrasyon hisse senetleri kullanarak, KCl ve SÜPÜRGEYİ 100 mM ve 50 mM son konsantrasyon postfusion membranlar için ekleyin.
    Not: sonrası füzyon LUV durumunda onların şişlik (a tampon) dış arasında ozmotik uzaklığı nedeniyle bu adımı engeller ve intravesicular (arabellek D) konsantrasyon tuzlar.
    1. İsteğe bağlı olarak, postfusion membran unreacted SUV+ayırmak için 7.2 içinde açıklandığı gibi cips ve Pelet arabellek A. 800 µL içinde resuspend
  4. Bir biyoluminesans-luciferase-ADP kokteyl içeren 400 µM ADP, 50 µM biyoluminesans ve 2,5 µg luciferase tampon A 200 µL hazırlamak
  5. Kokteyl Step8.3 postfusion karışıma ekleyin.
  6. Postfusion membranlar enerjileme bo3tarafından harekete geçirip, 40 µM okside koenzim Q1eklemek-oksidaz 2 mM DTT ekleyerek. 1 dakika bekle.
  7. ATP sentezi için enerjik veziküller 5 mM potasyum fosfat (KPben, pH 7,4) ekleyerek başlatmak ve ATP üretimi ile bir luminometer (şekil 7B) algılamak. Reaksiyon ~ 3 dakika çalıştırın.
    Not: ATP sentezi tepki için 5-7 dk bo3tarafından tüketilen oksijen tükenmesi kadar devam eder-oksidaz ve luciferase.
  8. ATP referans standardı (0.5 nmol ATP) iki kez tepki karışıma ekleyin. Ölçü ATP üretilen.
  9. ATP sentezi tepki sinyali ATP referans standart sinyal bölerek tepki olarak üretilen ATP gerçek miktarı elde etmek. F1Fo tepki olarak kullanılan toplam miktarı bu değere ayarlamak ve sonunda ATP sentezi µmol ATP oranının hızlı / (mg F1Fo* min).

Representative Results

Fusogenic kullanımını tamamlayıcı-ücret proteoliposomes içine hedef bilayer membranları membran proteinlerinin hızlı deterjan ücretsiz teslim etmek için üç adım (şekil 1) içerir: A, fusogenic SUV lipid karışımları yüksek gelen oluşumu şarj edilmiş lipidler içeriğini; Bu SUV isteğe bağlı olarak intravesicular bir yük taşıyabilir; B, bizim hızlı membran protein sulandırma kullanarak PL içine fusogenic SUV dönüşüm; C, fusogenic PL ile hedef bilayers düşük tuz ortamda füzyonu füzyon reaksiyonu durdurmak için yüksek tuz ilavesi ile izledi. (D) büyük veziküller durumunda tercih edilebilir bir strateji membran protein membran proteinlerinin etkinlik için daha iyi bir lipid ortam sağlayan Anyonik hedef bilayer teslim etmektir (metin daha fazla tartışılan).

Şef oluşumu Protokolü ters emülsiyon yöntemi ile ayrıntılı olarak Şekil 2vurgulanır. Lipid-yağ karışımı nedeniyle nispeten yüksek hexadecane kullanmayı tercih kolay katılaşmış petrol sonra Şef peletleme izin verir (18 ° C) donma sıcaklığı.

Şekil 3 . sivilce füzyon kobalt-calcein-EDTA yöntemini kullanarak gösterir. Füzyon sadece tamamlayıcı dolu veziküller ise daha yüksek tuz konsantrasyonları düşük tuz arabellekleri kullanıldığında görülür (> 50 mM14) ya da sigara fusogenic veziküller kullanımını gösteren hiçbir füzyon.

Membran proteinlerinin sulandırma fusogenic SUV içine hızlı bu protokolü şekil 4Agösterilmektedir. Bu iletişim kuralını kullanan, biz hızlı göstermek sulandırma birincil proton pompa bo3-oksidaz ve F1Fo ATP sentaz PL ve belirli faaliyetlerini bu membranlarda değerlendirilmesi. Protein sulandırma verimi kullanılan lipid15 şarjla bağlı değildir ve yaklaşık 50-%75 söz önemlidir25,12ve PL içine sulandırma sonra protein için en az üç saklanabilir ki gün, protein faaliyet bariz kaybı olmadan oda sıcaklığında bile. Bu yordam Ayrıca ATP sentaz, fazla % 95, hidrofilik yan F1 odaklı dışa doğru15,26bulunduğu tek yönlü yönlendirmesini sağlar.

Şekil 5 gösterir bu etkinlik F1Fo (Masası'nda) ve bo3pompalama proton-oksidaz (Masası B) Katyonik lipidler içinde azaltılmış ve Anyonik ve tarafsız lipid çevre, kıyasla düşük iyonik gücü duyarlı ama Bu etkiyi postfusion membranlar PL+ Anyonik LUV-ile eritme sonra hafifletilmiş.

Şekil 6 F1Fo ATP sentaz teslimini büyük veziküller zarı içine gösterir. Bu deney, PL+ ve 800 nm LUV- erimiş 20 mM KCl 5 min için ve reaksiyon ürünü unfused PL+kaldırmak için pelleted, resuspended ve proton pompalama için denetlesinler. Kontrol deneyleri hiçbir proton LUV0 yerine LUV- kullanılan füzyon reaksiyonu (siyah izle), veya boş LUV- yalnız bölümü (Mavi izle) pompalama gösterdi.

Hızlı işleyen bir elektron taşıma zinciri fusogenic PL aracılığıyla büyük veziküller membranlarda Meclisi Şekil 7' de gösterilmiştir. F1Fo SUV+ kullanılan ve bo3 SUV+ için füzyon ile 800 nm LUV-ve sırayla koenzim Q1 ve enerji için DTT ekleyerek bu zinciri postfusion veziküller içinde ATP üretimi gösterilmiştir membranlar ve fosfat ATP sentezi tarafından F1Fotetiklemek için ekleme.

Figure 1
Şekil 1: ultrafast deterjan ücretsiz teslim membran proteinlerinin hedef lipid bilayers unilamellar veziküller füzyonu ile içine anlayışı oluşan tamamlayıcı dolu lipidler. İsteğe bağlı olarak intravesicular yükleri ile yüklü Anyonik ve Katyonik fusogenic küçük unilamellar veziküller (SUV+, SUV-)(a)oluşumu. (B) fusogenic SUV fusogenic proteoliposomes (PL) membran proteinlerinin sulandırma tarafından içine çevrimi. (C) deterjan-Alerjik membran proteinlerinin teslim postfusion membran fusogenic PL. (D) tercih strateji'membran proteinlerinin dır 100 nm PL+ arasında Fusion resimli büyük veziküller zarı içine içine ve 800 nm LUV-. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Resim 2: bir ters emülsiyon yöntemi ile Şef oluşumu protokolü. (A)oluşumu bir lipid monolayer petrol-lipid karışımı ve su arasındaki sınırda. (B) bir ters (su, yağ) emülsiyon oluşumu. Santrifüjü aracılığıyla emülsiyon yağ-su sınır üzerinden geçirerek (C) Şef oluşumu. (D) Soğutma boru aşağıdaki < kuvvetlendirmek ve petrol çıkarmak için 18 ° C. (E) A floresan mikroskobu görüntüsü onun membran (yeşil) ve vezikül'ın Lümen (kırmızı) içinde kutup fluorophore (1 mM Sulforhodamine 101) floresan lipid (%1 ağırlık kesir Kolesteril-Bodipy-FL12) içeren bir şef. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: Lipid veziküller füzyon kobalt-calcein-EDTA yöntemiyle okudu. (A)şeması yönteminin nerede ücretsiz calcein floresan kobalt-calcein kompleksi EDTA tarafından yayımlanır. (B) Fusion SUV çeşitli KCl konsantrasyonlarda. (C) serbest bırakmak-in postfusion veziküller B metinde açıklandığı gibi gösterildiği için EDTA ve Triton X-100 deterjan eklenmesi tarafından intravesicular calcein. Kırmızı iz için füzyon ölçüde (%) maksimal arka plan-düzeltilmiş füzyon sinyal bölünerek hesaplanır (1 - 2) ve 100 ile çarpımı aşağıdaki kapsüllenmiş calcein (3-2) sürümü arka plan-düzeltilmiş maksimal sinyal. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4: Ultrafast sulandırma bo3-oksidaz ve F1Fo fusogenic proteoliposomes ve protein etkinlik ölçümler de böyle proteoliposomes. Sulandırma Protokolü'nün(a)şeması. (B) koenzim Q1 oksidasyon bo3tarafından Proton pompa tahrik-oksidaz pl ölçülen ACMA ile Şoklama (metin olarak açıklanmıştır). F1Fo pl tarafından pompa (C) ATP hidroliz tahrik proton (metin açıklanmıştır) ACMA Şoklama ile ölçülür. (D) ATP hidroliz F1Fo pl tarafından ATP rejenere sistemi (metin açıklanmıştır) ve onun stimülasyon uncoupler tarafından ölçülmüştür. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 5
Şekil 5: lipid çevre ve iyonik gücü zar proteinleri etkinliği üzerindeki etkisi. Proton pompalama F1Fo (a)ve bo3-oksidaz (B) Katyonik PL (kırmızı izle), Anyonik PL (Mavi izle), nötr PL (siyah izleme) ve Katyonik PL erimiş Anyonik LUV (yeşil izle) 20 ve 100 mm KCl. denetim izleme () ile gri) proton pompalama F1tarafından karıştırma üzerine Fo PL- SUV-ile herhangi bir değişiklik gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 6
Şekil 6: F1Fo ATP sentaz teslim içine membranlar 800 nm LUV- yolu ile füzyon ile PL+. (A)şematik deneyin amacı: PL+ ve 800 nm LUV- 1 mm BEZLERİ (pH 7,4), 1 mM MgCl2, 20 mM KCl 5 kaldırmak için pelleted min için erimiş unfused PL ve aynı arabellekte resuspended. (B) Proton postfusion LUV (kırmızı izle) tarafından pompa. Kontrol deneyleri hiçbir ACMA PL0 ile LUV- (siyah izle), karışık veya boş LUV- yalnız bölümü (Mavi izle) Şoklama gösterdi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 7
Şekil 7: 5-dak deterjan-Alerjik Meclisi bir elektron taşıma zinciri membranlarda 800 nm LUV- PL+ile füzyon yoluyla. (A)şematik deneyin amacı: 100 nm F1Fo PL+ ve 100 nm bo3-oksidaz PL+ şekil 6' da açıklandığı gibi LUV ile-, erimiş. Füzyon KCl ve SÜPÜRGEYİ 100 ve 50 mM için sırasıyla ekleyerek durduruldu. Membranlar ADP-biyoluminesans-luciferase kokteyl ile karışık ve buna ek olarak DTT ve Q1, tarafından metinde açıklandığı gibi enerjik. ATP üretimi 1 mM fosfat (Pben) ve metinde açıklandığı gibi luciferase-biyoluminesans sistemi ile izlenen gerçek zamanlı eklenmesi tarafından başlatıldı. (B) ATP sentezi postfusion veziküller (kırmızı izle) tarafından. Kontrol deneyleri hiçbir ATP üretim PL+ yüksek tuz (gri) LUV- ile karışık veya PL0 ile LUV- (siyah) karışık gösterdi. ATP sentezi oranı metin (Adım 8,8-8,9) açıklandığı şekilde hesaplanır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Discussion

Aşağıda bazı sorunlar bu deneysel yaklaşımın başarı için dikkat edilmesi gereken:

Seçim lipid ücretten proteoliposomes ve hedef bilayers için: Anyonik lipidler biyolojik membranlar, örneğin, ~ 25, 35 ve % 20'coli E. coli, plazma zarı S. cerevisiaeMaya ve mitokondriyal iç zarı iç zar ulaşan bol miktarda ise Katyonik lipidler doğada bulunmayan birçok tür, sırasıyla27,28,29. Membran proteinlerinin pl+ işlevselliğini Katyonik lipit bilayer ve dış iyonik göreli bir içeriğe göre sırayla değişir bilayer olumlu bir şarj gücü tarafından etkilenebilir beklemek mantıklı ol gücü. Bu nedenle, deneysel olarak ne ölçüde ilgi membran proteinlerinin işlevselliğini Katyonik lipit çevre şarjla bağlı olacaktır gidermek önemlidir. İşte, bu her iki F1Fo ATP sentaz ve bo3göstermektedir-oksidaz Katyonik lipit çevreye duyarlı, ama biz modüle ve ilk proteinler PL+ yerleştirip bunlara teslim bu etkiyi ters başardı Anyonik bilayers kabul ve sonra füzyon reaksiyonu orta iyonik gücü artan bitti.

Belirli bir Katyonik lipit seçimi: Çoğu ticari olarak mevcut Katyonik lipidler triacylglyceride sigara doğası vardır; Bu nedenle potansiyel bir aday lipid membran proteinlerinin ilgi ile uyumluluk için test edilmelidir. Biz daha önce15 etil-PC, doğal triacylglyceride lipidler DOTAP (sigara triacylglyceride içinde en yüksek yapısal benzerliği olan en iyi performansı pl+ oluşan bu çalışmada kullanılan ATP sentaz gösterdi bulundu lipid) PL+ bu protein daha az aktif.

Vezikül füzyon deneyleri: (İntravesicular sıvı içeriği karıştırdığında) doğru vezikül füzyon veziküller birbirine sulu içeriklerini karıştırma olmadan uygun, ancak kolayca onların dış veya her iki lipid içeriğini karıştırmak ara hemi-füzyon Amerika'dan ayrıştırılan gerekiyor 30broşürler. Suboptimal lipid karışımları veya belirli koşullar, veziküller belirgin sıvı içerik sızıntı füzyon31sırasında da göstermektedir. Asgari ücret lipidler fusogenic karışımlar gerçek fusion etkinleştirme konsantrasyonları her lipid türler için deneysel olarak bulunan gerekiyor, ancak genel olarak, bu membran ile az % 10 lipidler fusogenic 32işlenir ücret bulunur.

Bu hemen topaklanma ve lipidler agregasyon Bu iyonlar tarafından neden olabilir fusogenic SUV multi-valent iyonlarının varlığında şekillendirme sırasında karşılıklı şarj edilmiş bileşenleri karıştırmak değil önemlidir. Örneğin, SUV kobalt-calcein-EDTA yöntemi için hazırlarken, bu olmalı bileşenleri tarafından polikarbonat filtre tıkanma EDTA ile Katyonik lipit karışımı karıştırma önlemek önemlidir.

Kobalt-calcein-EDTA yöntemi, çok hassas ve gerçek zamanlı füzyon kontrolü, uygun olurken hala fusion 1 nedeniyle ölçüde hafife ki söz önemlidir) içinde ücretsiz calcein Floresan, kendi kendine Şoklama kendi kendine su verme eşik yaklaşık 20 µM33ve 2 rapor ederken 1 mM, ulaşması bekleniyor postfusion veziküller) yüzey bağlı kobalt-hangi bile jel-filtrasyon reçine geçtikten sonra SUV+ bağlı kalır calcein, ve SUV0 bir soluk portakal rengi varken veziküller parlak turuncu renk renkler. Ayrıca serbest bırakmak-in ilişkili kobalt calcein deterjan Triton X-100 EDTA huzurunda eklenmesi üzerine SUV0 (gri izle)'dan SUV+ (şekil 3 c, kırmızı izleme) için çok daha güçlü sinyaller oluşturur unutmayın.

Bakış açıları: Biz burada açıklanan hızlı yaklaşımlar büyük ölçüde kolaylaştırmak ve sentetik Biyoloji uygulamaları ortaya çıkan ihtiyaçları için karmaşık membranlar Meclisi hızlandırmak bekliyoruz. Bizim membran protein sulandırma Protokolü kırılgan büyük membran proteinlerinin sulandırma için sadece yarım saat bu fusogenic yaklaşım sadece teslim için 5-10 dakika sürer iken uzun sulandırma diyaliz tabanlı teknikleri için duyarlı olmak bilinen alır büyük lipid bilayers böyle protein. Burada, kırılgan bir protein örneği olan E. coli F1Fo ATP sentaz, manipüle ederek bu yaklaşımlar avantajları göstermektedir. 23 alt birimleri yapılır ve kolayca suboptimal koşulları (örneğin, ısı) sırasında/sonra solubilization maruz Eğer bütünlüğünü kaybedecek bilinen, ama bu yordamlarda kullanılan, protein proton pompalama tekrarlanarak yüksek etkinliğini göstermektedir.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

Yazarlar müteşekkir Robert Gennis Illinois Üniversitesi ve Christoph von Ballmoos Bern Üniversitesi için-mek şartıyla bir Plazmid ve bo3ifade etmek için büyük bir yük-oksidaz. Proje BBSRC tarafından desteklenen BB/L01985X/1 R.I. ve R.B. vermek

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DOPC neutral lipid Avanti Lipids 850375
POPA anionic lipid Avanti Lipids 840857
E-PC cationic lipid Avanti Lipids 890704
Cholesteryl-Bodipy-FL12 Thermofisher C3927MP
Sephadex G-50, Super Fine Sigma G5050
Ficoll 400, Type 400-DL Sigma F8016
ACMA Sigma A5806
Nigericin Sigma N7143
ATP Sigma A26209
Q1 Sigma C7956
DTT Sigma D0632
PEP Sigma 860077
NADH Sigma N8129
PK Sigma P9136-1KU
LDH Sigma L1254-1KU
Luciferin Sigma L6882
Luciferase Sigma/Roche 10411523001
Calcein Insight Biotechnology sc-202090
CoCl2 Sigma C8661
EDTA Sigma E6758
Sulforhodamine 101 Sigma S7635
Extrusion system Avanti Extruder
Single tube luminometer, model Sirius L Titertek Berthold
Polycarbonate filter, D19 mm Sigma, Whatman NucleporeTrack-Etched Membranes WHA800309, WHA800284 100 or 200 nm to form SUV, and 400 or 800 nm for LUV
Name Company Catalog Number Comments
Buffers used in the paper
Buffer A 100 mM KCl, 50 mM MOPS pH 7.4, 1 mM MgCl2
Buffer B 20 mM KCl, 10 mM MOPS pH 7.4, 0.1 mM MgCl2
Buffer C 100 mM KCl, 10 mM MOPS pH 7.4
Buffer D 1 mM MOPS pH 7.4
Various concentrations of KCl

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rigaud, J. L., Levy, D. Reconstitution of membrane proteins into liposomes. Liposomes, Pt B. 372, 65-86 (2003).
  2. Johnson, M., et al. Two-dimensional crystallization of membrane proteins by reconstitution through dialysis. Methods Mol Biol. 955 (31-58), 31 (2013).
  3. Dezi, M., et al. Detergent-mediated incorporation of transmembrane proteins in giant unilamellar vesicles with controlled physiological contents. Proc Nat Acad Sci U S A. 110 (18), 7276-7281 (2013).
  4. Girard, P., et al. A new method for the reconstitution of membrane proteins into giant unilamellar vesicles. Biophys J. 87 (1), 419-429 (2004).
  5. Angelova, M., et al. Preparation of Giant Vesicles by External Ac Electric-Fields - Kinetics and Applications. Trends in Colloid and Interface Science Vi. 89, 127-131 (1992).
  6. Leptihn, S., et al. Constructing droplet interface bilayers from the contact of aqueous droplets in oil. Nature Protocols. 8 (6), 1048-1057 (2013).
  7. Villar, G., Graham, A. D., Bayley, H. A Tissue-Like Printed Material. Science. 340 (6128), 48-52 (2013).
  8. Khalil, A. S., Collins, J. J. Synthetic biology: applications come of age. Nat Rev Genet. 11 (5), 367-379 (2010).
  9. Smith, M. T., Wilding, K. M., Hunt, J. M., Bennett, A. M., Bundy, B. C. The emerging age of cell-free synthetic biology. FEBS Lett. 588 (17), 2755-2761 (2014).
  10. Church, G., et al. Realizing the potential of synthetic biology. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (4), 289-294 (2014).
  11. Gao, Y., et al. Single reconstituted neuronal SNARE complexes zipper in three distinct stages. Science. 337 (6100), 1340-1343 (2012).
  12. Nordlund, G., Brzezinski, P., von Ballmoos, C. SNARE-fusion mediated insertion of membrane proteins into native and artificial membranes. Nat Commun. 5, 4303 (2014).
  13. Decout, A., et al. Enhanced efficiency of a targeted fusogenic peptide. Biochimica Et Biophysica Acta-Biomembranes. 1372 (1), 102-116 (1998).
  14. Chan, Y. H., van Lengerich, B., Boxer, S. G. Effects of linker sequences on vesicle fusion mediated by lipid-anchored DNA oligonucleotides. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (4), 979-984 (2009).
  15. Ishmukhametov, R. R., Russell, A. N., Berry, R. M. A modular platform for one-step assembly of multi-component membrane systems by fusion of charged proteoliposomes. Nat Commun. 7, 13025 (2016).
  16. Biner, O., et al. Delivery of membrane proteins into small and giant unilamellar vesicles by charge-mediated fusion. FEBS Lett. 590 (14), 2051-2062 (2016).
  17. Bian, T., et al. Direct detection of SERCA calcium transport and small-molecule inhibition in giant unilamellar vesicles. Biochem Biophys Res Commun. 481 (3-4), 206-211 (2016).
  18. Schuette, C. G., et al. Determinants of liposome fusion mediated by synaptic SNARE proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (9), 2858-2863 (2004).
  19. Spencer, A. C., Torre, P., Mansy, S. S. The encapsulation of cell-free transcription and translation machinery in vesicles for the construction of cellular mimics. J Vis Exp. (80), e51304 (2013).
  20. Verchere, A., et al. In vitro investigation of the MexAB efflux pump from Pseudomonas aeruginosa. J Vis Exp. (84), e50894 (2014).
  21. Kaplan, R. S., Pedersen, P. L. Determination of Microgram Quantities of Protein in the Presence of Milligram Levels of Lipid with Amido Black B-10. Analytical Biochemistry. 150 (1), 97-104 (1985).
  22. Rumbley, J., et al. One-step purification of histidine-tagged cytochrome bo3 from Escherichia coli and demonstration that associated quinone is not required for the structural integrity of the oxidase. Biochim Biophys Acta. 1340 (1), 131-142 (1997).
  23. Taussky, H. H., Shorr, E. A Microcolorimetric Method for the Determination of Inorganic Phosphorus. Journal of Biological Chemistry. 202 (2), 675-685 (1953).
  24. Galkin, M. A., Ishmukhametov, R. R., Vik, S. B. A functionally inactive, cold-stabilized form of the Escherichia coli F1Fo ATP synthase. Biochimica Et Biophysica Acta-Bioenergetics. 1757 (3), 206-214 (2006).
  25. Ishmukhametov, R. R., Galkin, M. A., Vik, S. B. Ultrafast purification and reconstitution of His-tagged cysteine-less Escherichia coli F1Fo ATP synthase. Biochim Biophys Acta. 1706 (1-2), 110-116 (2005).
  26. Wiedenmann, A., Dimroth, P., von Ballmoos, C. Deltapsi and DeltapH are equivalent driving forces for proton transport through isolated F(0) complexes of ATP synthases. Biochim Biophys Acta. 1777 (10), 1301-1310 (2008).
  27. Morein, S., et al. Wild-type Escherichia coli cells regulate the membrane lipid composition in a "window" between gel and non-lamellar structures. J Biol Chem. 271 (12), 6801-6809 (1996).
  28. Zinser, E., et al. Phospholipid synthesis and lipid composition of subcellular membranes in the unicellular eukaryote Saccharomyces cerevisiae. J Bacteriol. 173 (6), 2026-2034 (1991).
  29. Daum, G., Vance, J. E. Import of lipids into mitochondria. Prog Lipid Res. 36 (2-3), 103-130 (1997).
  30. Pantazatos, D. P., MacDonald, R. C. Directly observed membrane fusion between oppositely charged phospholipid bilayers. J Membr Biol. 170 (1), 27-38 (1999).
  31. Pantazatos, D. P., Pantazatos, S. P., MacDonald, R. C. Bilayer mixing, fusion, and lysis following the interaction of populations of cationic and anionic phospholipid bilayer vesicles. J Membr Biol. 194 (2), 129-139 (2003).
  32. Sunami, T., et al. Detection of association and fusion of giant vesicles using a fluorescence-activated cell sorter. Langmuir. 26 (19), 15098-15103 (2010).
  33. Memoli, A., et al. Effects of surfactants on the spectral behaviour of calcein (II): a method of evaluation. J Pharm Biomed Anal. 19 (3-4), 627-632 (1999).

Tags

Biyokimya sayı: 134 membran proteinlerinin sulandırma proteoliposomes LUV Şef membran füzyon elektron taşıma zinciri ATP sentaz ATP üretimi sentetik Biyoloji
Deterjan-Alerjik membran proteinlerinin Ultrafast sulandırma tamamlayıcı-Proteoliposomes ücret Fusogenic kullanarak Lipid Bilayers içine.
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Galkin, M. A., Russell, A. N., Vik,… More

Galkin, M. A., Russell, A. N., Vik, S. B., Berry, R. M., Ishmukhametov, R. R. Detergent-free Ultrafast Reconstitution of Membrane Proteins into Lipid Bilayers Using Fusogenic Complementary-charged Proteoliposomes.. J. Vis. Exp. (134), e56909, doi:10.3791/56909 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter