Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Vaskemiddel-fri ultrahurtig rekonstituering af membranproteiner i Lipid dobbeltlag ved hjælp af Fusogenic komplementære-ladet Proteoliposomes.

Published: April 5, 2018 doi: 10.3791/56909
Automatic Translation
1, 2, 3, 2, 2
1First Pavlov State Medical University, 2Clarendon Laboratory, Department of Physics, Oxford University, 3Department of Biological Sciences, Southern Methodist University

Summary

Her præsenterer vi to ultrahurtig protokoller til rekonstitution af membranproteiner i fusogenic proteoliposomes og fusion af sådanne proteoliposomes med target lipid dobbeltlag for vaskemiddel-gratis levering af disse Membranproteiner i den postfusion tolagede. Kombinationen af disse tilgange muliggør hurtig og let kontrolleret forsamling af komplekse multi-komponent membran systemer.

Abstract

Vaske-og rengøringsmidler er nødvendige for levering af membranproteiner i 30-100 nm små unilamellar vesikler, mens mere kompleks, større model lipid dobbeltlag er mindre kompatible med vaske-og rengøringsmidler.

Her beskriver vi en strategi for omgåelse denne grundlæggende begrænsning ved hjælp af fusogenic oppositely opkrævet Liposomer forsynet med en membran protein af interesse. Fusion mellem sådanne blærer opstår indenfor 5 min i en lav ionisk styrke buffer. Positivt ladede fusogenic Liposomer kan bruges som simple shuttle vektorer for vaskemiddel-gratis levering af membranproteiner i biomimetiske target lipid dobbeltlag, som er negativt ladede. Vi viser også hvordan du rekonstruere Membranproteiner i fusogenic proteoliposomes med en fast 30-min protokol.

Ved at kombinere disse to tilgange, vi viser en hurtig montage af en elektron transportkæde bestående af to Membranproteiner fra E. coli, en primær proton pumpe bo3-oxidase og F1Fo ATP syntase, i membraner i vesikler i forskellige størrelser, lige fra 0,1 til > 10 mikron, samt ATP produktion af denne kæde.

Introduction

Functionalization af kunstige lipid dobbeltlag med Membranproteiner er et vigtigt skridt i forsamlingen af membran modelsystemer. Den enkleste model, proteoliposomes (PL), består af lille (30-200 nm diameter) unilamellar vesikler (SUV, også kaldet Liposomer), med proteiner integreret i deres membraner. PL dannes traditionelt i to trin1. Første, præfabrikerede SUV er blandet med en membran protein af interesse og et rengøringsmiddel på en koncentration over sin kritiske micelle koncentration (CMC). For det andet er vaskemidlet fjernet med forskellige dialyse, "bio-perler" eller gel filtrering teknikker, forlader proteinet i membranen. Den sidstnævnte metode er meget hurtigere (~ 30 min1) og er derfor at foretrække til rekonstitution af skrøbelige og følsomme Membranproteiner, mens de første to tilgange er begrænset af vaskemiddel fjernelse hastighed, der tager mange timer og kan medføre en betydeligt tab af aktivitet og tab af strukturelle integritet af proteiner. Functionalization af større vesikler (store unilamellar vesikler, LUV, op til 1 µm diameter) af denne tilgang er mere udfordrende, som vesikel størrelse bliver reduceret efter vaskemiddel fjernelse, og det er ikke muligt for giant unilamellar vesikler (GUV, > 1 µm), som de er destabiliseret af vaske-og rengøringsmidler (men se Johnson et al. 2 for langsom 2D-krystallisering af membranproteiner i store dobbeltlag). Alternative tilgange til GUV membran functionalization3,4,5 findes men er besværligt, tidskrævende og kræver stadig nogle vaskemiddel ved koncentrationer under CMC. Mere komplicerede eller skrøbelige lipid modeller (for eksempel Droplet Hydrogel dobbeltlag6 og 3D printable Droplet Interface tolagede-baserede kunstige væv7) kan ikke tåle rengøringsmidler. Hurtigt opstå syntetisk biologi applikationer8,afhænger9,10 kritisk functionalization af sådanne komplekse membran strukturer. Derfor, en let og robust metode muliggør hurtig og skånsom levering af membranproteiner i target skrøbelige dobbeltlag er meget efterspurgt i feltet.

Et alternativ, vaskemiddel-fri protein leveringsmetode er vesikel fusion, hvor interagerende vesikler membraner forenes i den intakte postfusion tolagede, mens deres intravesicular vandige indhold får blandet, uden at blive frigivet i eksterne miljø. Vesikel fusion er aktiveret og drevet enten af konformationelle rearrangementer inden for supplerende fusogenic agenter (nogle proteiner11,12 og peptider13 eller specielt modificerede DNA14) placeret i den henvendelse dobbeltlag eller Coulombic interaktioner mellem lipid dobbeltlag dannet af supplerer opladet kation- og anionbyttere lipider15,16, eller kationiske dobbeltlag og negativt ladede proteiner17.

Den tidligere tilgang kræver tilstedeværelsen af fusogenic agenter i de vekselvirkende membraner før fusion, er relativt langsom (~ 30 min til nå halv-maksimalt fusion12,18), men kan anvendes til både naturlige og kunstige membraner.

En fordel ved metoden ved hjælp af fusogenic lipider (figur 1) er at det giver mulighed for meget hurtigere membran fusion (~ 1 min. at nå halv-maksimum, og 5-10 min til slut reaktionen). Derudover kan omfanget af fusion styres ved jeg) en nemt at formulere relative indhold af ladede lipider i fusogenic dobbeltlag, og ii) Ioniske og generelle, osmotisk styrken af reaktion medium (salte på over 50 mM, og for eksempel saccharose15 er vist at stoppe fusion), eller en kombination af begge. For at starte fusion, er oppositely ladede fusogenic vesikler blandet i en lav (typisk 10-20 mM salt) ionic styrke medium for 5-10 min. En relativ Ulempen ved metoden er at kationiske lipider kan øve en negativ indflydelse på funktionaliteten af membranproteiner i kationiske proteoliposomes før fusion, især i lav ionisk styrke, men denne virkning er reversible og blandet med en naturlig lipid sammensætning efter fusion membranen og vender tilbage til normal ionisk styrke medium.

Protocol

1. forberedelse af fusogenic SUV og LUV

  1. Forberedelse af fusogenic lipid blanding
    1. Forberede stamopløsninger af neutrale, kationiske, anioniske og fluorescerende lipider i chloroform på 25-50 mg/mL (for eksempel, neutral DOPC (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), kationiske ethyl-PC (1,2- dimyristoleoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine), anioniske POPA (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphate), og fluorescerende cholesteryl-Bodipy-FL12, henholdsvis) ved vejning passende mængder af tørre lipider og opløse dem i 100% chloroform (forsigtighed! Gøre dette under et stinkskab), eller fortynding kommercielt tilgængelige chloroform bestande af lipider med chloroform.
      Bemærk: Både naturlige lipid ekstrakter og ren syntetiske lipider kan bruges og viser lignende resultater.
    2. Mix 2,5 mg en kationiske og 2,5 mg af en neutral lipid i chloroform stock (1.1.1) i et hætteglas.
      Bemærk: Dette trin giver 5 mg af kationiske lipid blanding i chloroform, der indeholder 50% vægt brøkdel af kationiske lipider. Når det er nødvendigt, tilsættes 0,5% vægt brøkdel af en fluorescerende lipid til blandingen.
    3. Bland 1 mg af anioniske og 4 mg af neutrale lipider i chloroform bestande (1.1.1) i et hætteglas. Dette giver 5 mg af anioniske lipid blanding indeholdende 20% vægt brøkdel af anioniske lipider.
    4. Fordampe chloroform under en strøm af kvælstof til at danne et tyndt lag af tør lipid.
    5. Fjern de resterende chloroform under vakuum i 10 min.
      Bemærk: Dette trin tager traditionelt meget længere tid (1-12 h), men vi fandt, at en længere behandling giver ingen indlysende forbedring i kobling egenskaber af SUV.
    6. Hydrat tør lipid film ved at tilføje 0,5 mL buffer A (100 mM KCl, 1 mM MgCl2, 50 mM MOPS, pH 7,4) til hvert hætteglas og lade dem stå ved stuetemperatur i 30 min, og derefter vortex indtil lipid filmen er helt løsrevet fra glasoverfladen og b ecomes en homogen lipid suspension. Dette bør tage omkring 20-40 s.
  2. Dannelsen af SUV og LUV ved ekstrudering
    1. Samle en ekstrudering system (Se Tabel af materialer) med to 1 mL sprøjter ved hjælp af et polycarbonat-filter med en af følgende pore størrelser: 100 eller 200 nm til form SUV og 400 eller 800 nm til form LUV.
    2. Overføre lipid suspension i en sprøjte.
    3. Presse suspensionen af går det gennem filteret 21 gange, som det fremgår andetsteds18,19.
      Bemærk: Et ulige antal passager er nødvendig for at minimere overførslen til vesikel løsning af store lipid klumper fast til den filter side vender den oprindelige lipid suspension.
    4. Overføre vesikel løsning til 1,5 mL microcentrifuge rør.

2. dannelse af Fusogenic GUV af inverteret Emulsion metode

Bemærk: Denne procedure er illustreret i figur 2.

  1. Forberedelse af lipid-i-olie løsning
    1. Bland en chloroform bestand (Se trin 1.1.1) af en neutral lipid (2 mg) og en anioniske lipid (0,5 mg) med 1 mL af hexadecane i 1,5 mL microcentrifuge tube.
    2. Fordampe chloroform fra blanding under konstant blande og varme ved 80 ° C i 30 min at holde røret åbent. Luk røret og lad afkøle til stuetemperatur.
  2. Dannelsen af en lipid éncellelag på grænsefladen lipid-i-olie/vandig buffer
    1. Sted 200 µL af opløsningen lipid-i-olie oven på 0,5 mL buffer B (20 mM KCl, 0.1 mM MgCl2, 10 mM MOPS pH 7,4) i et 1,5 mL centrifugeglas. Bemærk den konvekse form af grænsen fase separation på grund af overfladespænding uoverensstemmelse mellem olie og det vandige buffer (figur 2A).
    2. Vent, indtil grænsen fase adskillelse flader, som er vejledende for lipid éncellelag dannelse på den. Det tager typisk 30-60 min. ved stuetemperatur.
  3. Forberedelse af en vand-i-olie emulsion
    1. Der fremstilles en opløsning af et vandopløseligt nonioniske polysaccharid i buffer B, med en massefylde større end vands massefylde (f.eks. 15% Ficoll-400 (w/v), med densitet 1,05 g/mL)
      Bemærk: Valgfrit, kan man tilføje fluorescerende vandopløselige farvestoffer til buffer for bedre visualisering af GUV, og eventuelle andre ønskede vandig indholdet af GUVs.
    2. Overføre 0,5 µL af den ovennævnte blanding til en separat 1,5 mL centrifugeglas med 100 µL af opløsningen lipid-i-olie fra 2.1.2.
    3. Læg instrumenterne i ultralydsbad (44 kHz på 14 W) blanding til 30 s i en ultralyds vandbad. Så energisk vortex for 45 min til at danne et vand i olie emulsion, hvor hver dråbe vil blive belagt med en lipid éncellelag (figur 2B).
  4. Konvertering af vand i olie emulsion i GUV
    1. Placere den resulterende emulsion på toppen af lipid-i-olie/vand-grænseflade, og straks centrifugeres røret i en tabel-top centrifuger på 10.000 x g i 2 min. Den resulterende pellet af GUV skal være klart synlige (fig. 2 c).
    2. Cool tube til 4 ° C i et køleskab størkne lipid-i-olie blanding (figur 2D, hexadecane størkner under 18 ° C), skal du forsigtigt fjerne frosne olie, og derefter trække den vandige fase.
      Bemærk: for at lette olie fjernelse fryse en wire bøjet i form af et anker blev brugt.
    3. GUV resuspenderes i 50 µL af frisk buffer B, overførsel til en ny tube, og inspicere under et fluorescens mikroskop ved hjælp af en 100 X oliebestandighedsobjektet (figur 2E).

3. overvågning vesikel Fusion med kobolt-Calcein metode

  1. Forberedelse af en gel-filtrering tyngdekraften kolonne.
    1. Blød ~ 10 g af en gel-filtrering harpiks (fx superfine sephadex G-50) i 100 mL deioniseret vand og lad svulme natten over.
    2. Pakke 3 mL af harpiksen i en engangs plast tyngdekraften flow kolonne og vaske det med ultrarent vand reagensglasset med buffer C (100 mM KCl, 10 mM MOPS, pH 7,4) ved stuetemperatur.
  2. Forberedelse af SUV+ eller SUV0 fyldt med kobolt-calcein.
    1. Forberede en opløsning indeholdende 1 mM calcein, 1 mM CoCl2, 98 mM NaCl, 10 mM MOPPER, så bringe pH 7,4.
      Bemærk: Essensen af metoden er, at gratis fluorescerende calcein danner en ikke-fluorescerende kompleks med Co2 +. Det bliver fluorescerende igen ved tilsætning af EDTA, som har højere affinitet for Co2 +, fortrænger calcein fra kobolt-calcein kompleks (figur 3A).
    2. Tilføje 500 µL af denne opløsning til en tør film af kationiske eller neutral lipider forberedt som beskrevet i punkt 1.1.
    3. Forberede 100 nm SUV ved ekstrudering som beskrevet i punkt 1.2.
    4. Pellet ekstruderet SUV på 1.000.000 x g i 20 min. i en tabel-top ultracentrifuge og resuspend i 1 mL buffer C. Gentag pelleringsmidler og resuspension tre gange; bruge 0,6 mL buffer C for sidste ophvirvling.
      Bemærk: Disse trin fjerner de fleste af de eksterne kobolt-calcein.
    5. Fjern de resterende eksterne kobolt-calcein af passerer en engangs tyngdekraft-flow kolonne fyldt med gel-filtrering harpiks ekvilibreres med buffer C som beskrevet for trin 3.1.2 SUV.
      Bemærk: Vi typisk kassere de første milliliter bind af gennemstrømnings- og indsamle den anden milliliter, som indeholder eksterne kobolt-calcein gratis SUV.
  3. Forberedelse af SUV- fyldt med EDTA
    1. Forberede løsning af 10 mM EDTA, 80 mM NaCl, 10 mM MOPS, pH 7,4.
    2. Tilføje 500 µL af denne opløsning til en tør film af anioniske lipider forberedt som beskrevet i punkt 1.1.
    3. Forberede SUV- ved ekstrudering som beskrevet i punkt 1.2.
    4. Pellet og resuspend SUV- som beskrevet i 3.2.4.
    5. Fjern de resterende EDTA ved at passere SUV- gennem kolonnen gel-filtrering som beskrevet i punkt 3.2.5.
  4. Forberede fusion SUV
    1. Fortynd SUV0, SUV+og SUV- med buffer D (1 mM MOPS, pH 7,4) suppleret med 0,2 mM CoCl2 og den ønskede koncentration af KCl. Brug 5 µL af hver type af SUV per 1 mL af buffer D.
    2. Inkuber blandingen i mindst 1 time.
      Bemærk: Dette trin vil minimere baggrund fluorescens niveau ved at blokere calcein, der er overfladen-bundet til SUV+.
  5. Vesikel fusion
    1. Start fusion reaktion ved at blande 1 mL af SUV+ eller SUV0 med 1 mL af SUV− (fortyndet i buffer D som beskrevet ovenfor) i en 2-mL fluorimeter kuvette, og øge fluorescens af calcein ved hjælp af 480 nm excitations- og 510 nm-skærm (Figur 3B).
    2. Vent, indtil reaktionen kommer til afslutningen.
    3. Tilføj en blanding af vaskemiddel Triton X-100 og EDTA (0,05% slutkoncentration og 7 mM, henholdsvis) at frigive calcein ud af vesikler og opnå maksimal fluorescens signal.
    4. Bestemme omfanget af fusion defineres som procentdelen af den maksimale fluorescens signal efter vaskemiddel tilsætning, som vist i figur 3 c.

4. hurtig rekonstituering af membranproteiner i Fusogenic Proteoliposomes

Bemærk: Denne procedure er illustreret i figur 4A.

  1. Forberede en tyngdekraft flow kolonne med gel-filtrering harpiks som beskrevet i punkt 3.1, og Blandingen henstår det med buffer A ved stuetemperatur.
    Bemærk: Alle yderligere manipulationer skal gøres strengt på ≤ 4 ° C, medmindre andet er angivet, for at minimere tab af protein aktivitet.
  2. Justere koncentrationen af renset membran protein til 0,7 mg/mL ved at fortynde det med det samme ekstraktionsbuffer bruges til protein isolation.
  3. Mix 140 µL af protein med 300 µL af præfabrikerede SUV, 160 µL buffer A og 60 µL af 10% cholat i Buffer A; Dette giver 1:30 protein: lipid vægtforhold i en endelige 660 µL volumen.
  4. Ryst forsigtigt blandingen på en vuggende platform for 15 min.
    Bemærk: Følgende trin kan gøres ved stuetemperatur.
  5. Passere blandingen gennem gel-filtrering harpiks, og indsamle grumset fraktioner der indeholder proteoliposomes.
  6. Pellet proteoliposomes med en tabel-top ultracentrifuge på 400.000 x g i 15 min.
  7. Supernatanten ikke rekonstitueret proteinholdige, og resuspenderes i 1 mL frisk buffer A.
  8. Bestemme proteinindhold i PL og supernatanten ved hjælp af Amido black metode20.
  9. Bestemme udbyttet af rekonstitution, som er typisk omkring 50-70%.
    Bemærk: Trin 4.6-4.8 kan eventuelt erstattes af passerer PL løsning gennem 1 mL af Ni-NTA harpiks pakket ind i en engangs tyngdekraften kolonne og derefter vaskes med Buffer A som beskrevet i 3.1.2. Sådan aflevering vil adskille ikke rekonstitueret protein, som fortrinsvis vil være bundet til harpiks, fra PL, mest vil være i gennemstrømnings.

5. funktionelle Tests af Protein aktivitet i Proteoliposomes

Bemærk: Begge proteiner anvendt i denne undersøgelse er kraftfulde proton pumper, som pumpe H+ i proteoliposomes ved tilsætning af deres substrater (coenzym Q1 for bo3-oxidase og ATP for F1Fo, henholdsvis), dermed bygning en proton forløb på tværs af membranen (ΔpH). I tilfælde af vellykket Co rekonstituering af fusion, kan sådan forsuring iagttages som et fald i fluorescens af en pH-følsom sonde ACMA (9-Amino-6-Chloro-2-Methoxyacridine)12,15, der anvendes rutinemæssigt til sådanne opgaver ( Figur 4B -C). Desuden substrat-specifikke aktivitet af proteiner (coenzym Q1 oxidation af bo3-oxidase22 og ATP hydrolyse af F1Fo23,24) kan overvåges spektrofotometrisk ved hjælp af forskellige metoder. Her, vi vise ATP hydrolyse aktivitet af F1Fo PL ved hjælp af en ATP regenererende assay (figur 4D), hvor to enzymer (pyruvat kinase (PK) og laktat dehydrogenase (LDH) opretholde en konstant koncentration af ATP som følger. PK genbruger ATP ved at konvertere ADP produceret af F1Fo tilbage i ATP på bekostning af sit Bæremateriale phosphoenolpyruvat (PEP). Pyruvat, som er et produkt af denne reaktion, omdannes til laktat af LDH på bekostning af NADH, oxidation af som kan overvåges som faldende optisk tæthed på 340 nm.

  1. Forberedelse af kemikalier
    1. Forberede 1 mM ACMA lager i ethanol.
    2. Forbered en 1 mM bestand af nigericin (eller nogen andre uncoupler) i ethanol.
    3. Forberede 25 mM coenzym Q1 i ethanol, og 1 M DTT materiel i buffer A.
    4. Forberede et lager af 100 mM ATP i Buffer A, og justere dets pH-værdi på 7,4.
    5. Forberede bestande af ATP regenererende systemkomponenter i Buffer A: 100 mM PEP, 1 mM NADH og løsninger af PK og LDH i koncentration på ~ 500-1.000 enheder/mL.
  2. Coenzym Q1 oxidation-drevet proton pumpe af bo3-oxidase PL
    1. Tilføjes en fluorimeter kuvette med 2 mL buffer A 20 µL af PL i tilstedeværelse af 0,5 µM ACMA, og vent indtil stabilt signal ved hjælp af 430 nm excitations- og 515 nm.
    2. Tilføje 40 µM coenzym Q1 til kuvette.
    3. Indlede en proton pumpe ved at tilføje 2 mM DTT PL (figur 4B).
      Bemærk: DTT reducerer oxideret coenzym Q1 og gør det tilgængeligt for bo3-oxidase.
    4. Sprede dannet ΔpH ved at tilføje 2 µM uncoupler (for eksempel nigericin). ACMA fluorescens signal skal hurtigt vende tilbage til næsten det oprindelige niveau.
      Bemærk: Bør der ingen ACMA dæmper ved tilsætning af substrat, hvis uncoupler er til stede i reaktionsblandingen i første omgang.
  3. ATP hydrolyse-drevet proton pumpe af F1FoPL
    1. Tilføje 40 µL af PL til en fluorimeter kuvette som beskrevet i 5.2.
    2. Indlede en proton pumpe ved at tilføje 0,2 mM ATP til PL (figur 4 c).
    3. Sprede ΔpH som beskrevet i 5.2.4.
  4. ATP hydrolyse af F1FoPL og dens stimulation af uncoupler
    1. Tilføje 40 µL af PL til et spektrofotometer kuvette med 2 mL buffer A, indeholdende 1 mM ATP, 0,2 mM NADH, 2 mM PEP, og 15 µL af PK og LDH.
    2. Følg reaktionen ved måling af absorbans nedgang af NADH ved 340 nm. 3-4 min. senere, tilføjer 2 µM uncoupler til kuvette at frigive modtryk i ΔpH på ATP hydrolyse. Reaktionshastighed bør øge straks.
      Bemærk: PL passerede gennem Ni-NTA harpiks som beskrevet i 4.10 vil demonstrere den stærkeste stimulation af uncoupler (figur 4D, røde spor), mens eluatet bliver næppe stimuleret (blå trace).

6. test indflydelse af Lipid miljø og ioniske styrke på funktionaliteten af membranproteiner i Fusogenic Proteoliposomes

  1. Vurdere proton pumpe af 40 µL af PL+, PL- og PL0 med ACMA quenching assay i 2 mL buffer D suppleret med 1 mM MgCl2 og 20 (figur 5, bedømmelseskomite A) eller 100 mM KCl (Panel B) som beskrevet i 5.2 eller 5,3 (figur 5 rød, sort og blå spor).
  2. Fuse 40 µL af PL+ med samme mængde LUV- i 2 mL buffer D suppleret med 20 mM KCl og prøven til ACMA quenching (grøn trace).
  3. Køre kontrol eksperimenter som i trin 2 af blanding, for eksempel, PL og SUV den samme afgift (grå trace).
    Bemærk: Proton pumpe bør forbedres ved postfusion PL.

7. levering af membranproteiner i LUV og GUV af Fusogenic Proteoliposomes

  1. Fuse 50 µL af PL+ med 50 µL af 800 nm LUV- i 1 mL buffer D suppleret med 1 mM MgCl2og 20 mM KCl i 5 min.
  2. Pellet vesikler på 6.000 x g i 5 min, og kassér supernatanten indeholdende ureageret PL+. Resuspenderes i 1 mL buffer D suppleret med 1 mM MgCl2 og 100 mM KCl, og Gentag pelleringsmidler og resuspending to gange mere.
  3. Køre ACMA quenching analyse som beskrevet i 5.2 eller 5.4.
  4. Køre kontrol eksperimenter, som i trin 1-3, ved hjælp af kombinationer af supplerende opladet vesikler i højt saltindhold (200 mM KCl), ikke-fusogenic vesikler og tomme LUV- uden PL+.
    Bemærk: Proton pumpe af postfusion LUV bør påvises kun når supplerer opladet vesikler blev brugt som vist i figur 6.

8. montage af elektron transportkæde fra individuelle komponenter i membraner af LUV og GUV og ATP produktion af denne kæde.

Bemærk: En skematisk af denne procedure er illustreret i figur 7A. ATP produceret i dette eksperiment vil blive registreret af luciferin-luciferase system, hvor omdannelse af syntetiserede ATP til pyrofosfat og AMP af luciferase efterfølges af lys emission registreret med en luminometrisk. Vi anbefaler at bruge en single-tube luminometrisk, i stedet for de mindre følsomme mikrotiterplade luminometers.

  1. Mix 3 µL af bo3-oxidase PL+ og 5 µL af F1Fo PL+ dannet som beskrevet i afsnit 4.
  2. Sammensmelte dem med 3 µL af LUV eller GUV- (dannet som beskrevet i afsnit 2) i 800 µL af buffer D suppleret med 20 mM KCl og 1 mM MgCl2 i 5 min.
  3. Ved hjælp af høj koncentration bestande, tilføje KCl og MOPPER til 100 mM og 50 mM slutkoncentration til postfusion membraner.
    Bemærk: I tilfælde af efterfølgende fusion LUV, dette trin vil forhindre deres hævelse på grund af osmotisk forskydning mellem eksterne (buffer A) og intravesicular (buffer D) salte koncentration.
    1. Valgfrit, pellet postfusion membraner, som beskrevet under punkt 7.2 at adskille ureageret SUV+, og resuspenderes i 800 µL af buffer A.
  4. Forberede 200 µL af en luciferin-luciferase-ADP cocktail indeholdende 400 µM ADP, 50 µM luciferin og 2,5 µg luciferase i buffer A
  5. Tilføje cocktail til en postfusion blanding fra Step8.3.
  6. Tilføje 40 µM af oxideret coenzym Q1, og udløse udkobling af postfusion membraner af bo3-oxidase ved at tilføje 2 mM DTT. Vente på 1 min.
  7. Indlede ATPsyntesen ved at tilføje 5 mM kalium fosfat (KP,jeg, pH 7,4) til energisk vesikler, og opdage ATP produktion med en luminometrisk (figur 7B). Køre reaktion i ~ 3 min.
    Bemærk: ATP syntesen reaktion provenuet i 5-7 min. indtil udtømningen af ilt, der forbruges af bo3-oxidase og luciferase.
  8. Tilføje ATP-standardopløsningen (0,5 nmol ATP) til reaktionsmiljøet to gange. Foranstaltning ATP produceret.
  9. Få den faktiske mængde af ATP produceret i reaktionen ved at dividere signal fra ATP syntesen reaktion af ATP reference standard signal. Juster denne værdi til den samlede F1Fo anvendes i reaktionen, og endelig udtrykke sats for ATPsyntesen i µmol ATP / (mg F1Fo* min).

Representative Results

Brugen af fusogenic komplementære-opkrævet proteoliposomes for hurtig vaskemiddel-fri levering af membranproteiner i target tolagede membraner omfatter tre trin (figur 1): A, dannelsen af fusogenic SUV fra lipid blandinger med høj indhold af ladede lipider; disse SUV kan eventuelt foretage en intravesicular belastning; B, konvertering af fusogenic SUV i PL ved hjælp af vores hurtige membran protein rekonstitution; C, fusion af fusogenic PL med target dobbeltlag i et lavt saltindhold medium, efterfulgt af tilsætning af høje salt til at stoppe fusion reaktionen. I tilfælde af store vesikler (D), en bedre strategi er at levere membran protein i anioniske target tolagede, som giver en bedre lipid miljø for aktivitet på Membranproteiner (behandles yderligere i teksten).

GUV dannelse protokol med omvendt emulsion metode er fremhævet i detaljer i figur 2. Vi foretrækker at bruge hexadecane i lipid-olie blandingen på grund af sin relativt høj (18 ° C) indefrysning temperatur, som giver mulighed for nem fjernelse af størknet olie efter GUV pelleringsmidler.

Figur 3 viser vesikel fusion med kobolt-calcein-EDTA metode. Fusion ses kun når supplerende opladet vesikler bruges i lav salt buffere, mens højere salt koncentration (> 50 mM14) eller brug af ikke-fusogenic blærer viser ingen fusion.

Denne hurtige protokol af rekonstituering af membranproteiner i fusogenic SUV er illustreret i figur 4A. Ved hjælp af denne protokol, vi vise hurtig rekonstituering af primære proton pumpe bo3-oxidase og F1Fo ATP syntase i PL, og vurdering af deres specifikke aktivitet i disse membraner. Det er vigtigt at nævne, at udbyttet af protein rekonstitution afhænger ikke af afgiften af et lipid brugt15 og er ca. 50-75%25,12, og kan opbevares i mindst tre efter rekonstituering i PL, protein dage, selv ved stuetemperatur uden åbenlyse tab af protein aktivitet. Denne procedure giver også ensrettet orientering af ATPsyntase, hvor mere end 95% af det har sin hydrofile gruppe F1 orienterede udad15,26.

Figur 5 viser, at den proton pumpe aktivitet af F1Fo (Panel A) og bo3-oxidase (Panel B) i kationiske lipider er reduceret og følsom over for lave ionisk styrke, i forhold til anioniske og neutral lipid miljø, men denne effekt er mildnet i postfusion membraner efter fusing PL+ med anioniske LUV-.

Figur 6 viser levering af F1Fo ATPsyntase i membraner i store vesikler. I dette eksperiment, PL+ og 800 nm LUV- var smeltet i 20 mM KCl i 5 min, og reaktionsprodukt var pelleted for at fjerne billedet er ikke fikseret PL+, genopslemmes og analyseres for proton pumpe. Kontrol eksperimenter viste ingen proton pumpe når LUV0 i stedet for LUV- blev brugt i fusion reaktion (sort trace), eller tom LUV- alene var analyserede (blå trace).

Hurtig montage af en fungerende elektron transportkæde i membraner i store blærer ved fusogenic PL er vist i figur 7. Vi brugte F1Fo SUV+ og bo3 SUV+ til fusion med 800 nm LUV-, og vist ATP produktion af denne kæde i de postfusion blærer ved at tilføje fortløbende coenzym Q1 og DTT at energize membraner, og derefter tilføje fosfat for at udløse ATPsyntesen af F1Fo.

Figure 1
Figur 1: opfattelse af ultrahurtig vaskemiddel-gratis levering af membranproteiner i target lipid dobbeltlag via fusion af unilamellar vesikler dannet af supplerende opladet lipider. (A) dannelsen af kation- og anionbyttere fusogenic lille unilamellar vesikler (SUV+, SUV-) eventuelt læsset med intravesicular ladninger. (B) konvertering af fusogenic SUV i fusogenic proteoliposomes (PL) ved rekonstituering af membranproteiner. (C) vaskemiddel-gratis levering af membranproteiner i postfusion membraner med fusogenic PL. (D) at foretrække strategi for levering af membranproteiner i membraner i store vesikler, illustreret af fusion mellem 100 nm PL+ og 800 nm LUV-. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: GUV dannelse protokol med en inverteret emulsion metode. (A) dannelsen af en lipid éncellelag på grænsen mellem den olie-lipid blanding og vand. (B) dannelsen af en inverteret (vand-i-olie) emulsion. (C) GUV dannelsen af passerer gennem grænsen olie-vand emulsion ved centrifugering. (D) køling af røret nedenfor < 18 ° C til at størkne og fjerne olien. (E) A fluorescerende mikroskopi billede af en GUV, der indeholder fluorescerende lipid (1% vægt brøkdel cholesteryl-Bodipy-FL12) i sin membran (grøn) og en polar fluorophore (1 mM Sulforhodamine 101) i vesikels lumen (rød). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Lipid vesikler fusion studerede med metoden kobolt-calcein-EDTA. (A) skematisk af metoden, hvor gratis calcein er frigivet fra en ikke-fluorescerende kobolt-calcein kompleks af EDTA. (B) Fusion af SUV i forskellige koncentrationer, KCl. (C) frigivelse af den intravesicular calcein ved tilsætning af EDTA og Triton X-100 vaskemiddel til postfusion vesikler vist i B som beskrevet i teksten. Fusion omfang (%) for røde spor beregnes ved at dividere maksimal baggrundskorrigeret fusion signalet (1 - 2) af de baggrundskorrigerede maksimal signal efter udgivelsen af indkapslede calcein (3-2) og gange med 100. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Ultrahurtig rekonstituering af bo3-oxidase og F1Fo fusogenic proteoliposomes, og protein aktivitet målinger i sådanne proteoliposomes. (A) skematisk af rekonstituering protokol. (B) coenzym Q1 oxidation drevet proton pumpe af bo3-oxidase i PL målt med ACMA dæmper (forklaret i teksten). (C) ATP hydrolyse-drevet proton pumpe af F1Fo i PL målt med ACMA dæmper (forklaret i teksten). (D) ATP hydrolyse af F1Fo i PL målt med ATP-regenererende system (forklaret i tekst), og dens stimulering af uncoupler. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: påvirkning af lipid miljø og ioniske styrke aktivitet af membranproteiner. Proton pumpe af F1Fo (A) og bo3-oxidase (B) i kationiske PL (røde spor), anioniske PL (blå trace), neutral PL (sort trace) og kationiske PL sammensmeltet med anioniske LUV (grønne spor) i 20 og 100 mM KCl. kontrol trace ( grå) viser ingen ændring i proton pumpe af F1Fo PL- ved blanding med SUV-. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: Levering af F1Fo ATP syntase i membraner af 800 nm LUV- via fusion med PL+. (A) skematisk af eksperimentet: PL+ og 800 nm LUV- var smeltet i 1 mM MOPPER (pH 7,4), 1 mM MgCl2, 20 mM KCl i 5 min, pelleted for at fjerne hvis PL, og genopslemmes i den samme buffer. (B) Proton pumpe af postfusion LUV (røde spor). Kontrol eksperimenter viste ingen ACMA quenching når PL0 blev blandet med LUV- (sort trace), eller tom LUV- alene var analyserede (blå trace). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 7
Figur 7: 5-min vaskemiddel-gratis samling af en elektron transportkæde i membraner af 800 nm LUV- via fusion med PL+. (A) skematisk af eksperimentet: 100 nm F1Fo PL+ og 100 nm bo3-oxidase PL+ blev sammensmeltet med LUV-, som beskrevet i figur 6. Fusion blev stoppet ved at tilføje KCl og MOPPER til 100 og 50 mM, henholdsvis. Membraner var blandet med ADP-luciferin-luciferase cocktail og energi ved tilsætning af DTT og Q1, som beskrevet i teksten. ATP produktion blev indledt ved tilsætning af 1 mM fosfat (Pjeg) og overvågede realtid med luciferase-luciferin system som beskrevet i teksten. (B) ATP syntesen af postfusion vesikler (røde spor). Kontrol eksperimenter viste ingen ATP produktion når PL+ blev blandet med LUV- i høje salt (grå), eller PL0 blev blandet med LUV- (sort). ATP proteinsyntese sats blev beregnet som beskrevet i teksten (skridt 8,8-8,9). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Følgende emner skal overvejes for succes af denne eksperimentelle tilgang:

Valg af lipid gebyr for proteoliposomes og target dobbeltlag: Kationiske lipider findes ikke i naturen, mens anioniske lipider er rigelige i biologiske membraner at nå f.eks ~ 25, 35 og 20% i indre membran af E. coli, plasma membran af gær S. cerevisiae, og indre mitokondrie membraner i mange arter, henholdsvis27,28,29. Det ville være rimeligt at forvente, at funktionaliteten af membranproteiner i PL+ kan blive påvirket af styrken af en positiv ladning af tolagede, som igen vil afhænge en relative indhold af kationiske lipid i tolagede og eksterne ionisk styrke. Det er derfor vigtigt at behandle eksperimentelt, i hvilket omfang funktionalitet af membranproteiner af interesse vil afhænge af afgiften af kationiske lipid miljø. Her viser vi, at begge F1Fo ATP syntase og bo3-oxidase er følsomme over for kationiske lipid miljø, men det lykkedes os at modulere og vende denne effekt ved første markedsføring proteinerne i PL+ og levere dem i anioniske accepterer dobbeltlag, og derefter øge den ioniske styrken af reaktion medium efter fusion er færdig.

Valg af en bestemt kationiske lipid: De fleste kommercielt tilgængelige kationiske lipider er af ikke-triacylglyceride karakter; Derfor skal en potentiel kandidat lipid være testet for kompatibilitet med Membranproteiner af interesse. Vi fandt tidligere15 ATPsyntase anvendes i denne undersøgelse viste sin bedste ydelse i PL+ dannet af ethyl-PC, der har den højeste strukturelle lighed med naturlige triacylglyceride lipider, mens i DOTAP (ikke-triacylglyceride lipid) PL+ dette protein var mindre aktive.

Vesikel fusion assays: Ægte vesikel fusion (når intravesicular flydende indholdet blandes) skal differentieres fra mellemliggende hemi-fusion stater, når vesikler overholde hinanden uden at blande deres vandige indhold, men let blande indholdet af deres eksterne eller begge lipid Småbladene er30. Suboptimal lipid blandinger eller visse betingelser påvise blærer også udtalt flydende indhold lækage under fusion31. Minimal koncentrationer af ladede lipider i fusogenic blandinger muliggør ægte fusion skal findes eksperimentelt for hver lipid arter, men generelt er det fundet at membraner med mindre end 10% opkrævet lipider gengives ikke-fusogenic 32.

Samtidig danner fusogenic SUV i tilstedeværelse af multi-valent ioner, er det vigtigt ikke at blande oppositely opladet komponenter, da dette kan medføre øjeblikkelig sammenklumpning og sammenlægning af lipider af disse ioner. For eksempel, mens forberede metoden kobolt-calcein-EDTA SUV, er det vigtigt at undgå at blande en kationiske lipid blanding med EDTA at forhindre tilstopning af filteret polycarbonat af klumpet komponenter.

Det er også vigtigt at nævne, at metoden kobolt-calcein-EDTA samtidig være meget følsomme og bekvemt for real-time fusion overvågning, stadig kan undervurdere omfanget af fusion på grund af 1) selvstændige quenching af fluorescens af gratis calcein inde postfusion vesikler, som forventes at nå 1 mM, mens de selvstændige quenching tærskel er rapporteret til at være omkring 20 µM33, og 2) overflade-bundet kobolt-calcein, som er forbundet med SUV+ selv efter at have passeret gennem gel-filtrering harpiks og farver vesikler til en lys orange farve, mens SUV0 har en bleg orange farve. Bemærk også, at frigivelsen af den bundne kobolt-calcein ved tilsætning af rengøringsmiddel Triton X-100 i nærværelse af EDTA genererer meget stærkere signaler for SUV+ (figur 3 c, røde spor) end SUV0 (grå trace).

Perspektiver: vi forventer, at de hurtige tilgange beskrevet her høj grad kan lette og fremskynde forsamling af komplekse membraner til brug af nye syntetiske biologi applikationer. Vores membran protein rekonstituering protokol tager kun en halv time til rekonstitution af skrøbelige store Membranproteiner kendt for at være følsomme over for langvarige dialyse-baserede rekonstitution teknikker, mens denne fusogenic tilgang tager kun 5-10 min til at levere sådanne proteiner i store lipid dobbeltlag. Her, demonstrere vi fordelene ved disse tilgange ved at manipulere med E. coli F1Fo ATPsyntase, som er et eksempel på en skrøbelig protein. Det er lavet af 23 underenheder og kendes let mister sin integritet, hvis de udsættes for suboptimal betingelser (for eksempel, varme) under/efter oploesning, men bliver brugt i disse procedurer, proteinet viser reproducerbar høj aktivitet i proton pumpe.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Forfatterne er taknemmelige at Robert Gennis fra University of Illinois og Christoph von Ballmoos fra Berns universitet for at give et plasmid og en stamme at udtrykke bo3-oxidase. Projektet blev støttet af BBSRC give R.I. og R.B. BB/L01985X/1

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DOPC neutral lipid Avanti Lipids 850375
POPA anionic lipid Avanti Lipids 840857
E-PC cationic lipid Avanti Lipids 890704
Cholesteryl-Bodipy-FL12 Thermofisher C3927MP
Sephadex G-50, Super Fine Sigma G5050
Ficoll 400, Type 400-DL Sigma F8016
ACMA Sigma A5806
Nigericin Sigma N7143
ATP Sigma A26209
Q1 Sigma C7956
DTT Sigma D0632
PEP Sigma 860077
NADH Sigma N8129
PK Sigma P9136-1KU
LDH Sigma L1254-1KU
Luciferin Sigma L6882
Luciferase Sigma/Roche 10411523001
Calcein Insight Biotechnology sc-202090
CoCl2 Sigma C8661
EDTA Sigma E6758
Sulforhodamine 101 Sigma S7635
Extrusion system Avanti Extruder
Single tube luminometer, model Sirius L Titertek Berthold
Polycarbonate filter, D19 mm Sigma, Whatman NucleporeTrack-Etched Membranes WHA800309, WHA800284 100 or 200 nm to form SUV, and 400 or 800 nm for LUV
Name Company Catalog Number Comments
Buffers used in the paper
Buffer A 100 mM KCl, 50 mM MOPS pH 7.4, 1 mM MgCl2
Buffer B 20 mM KCl, 10 mM MOPS pH 7.4, 0.1 mM MgCl2
Buffer C 100 mM KCl, 10 mM MOPS pH 7.4
Buffer D 1 mM MOPS pH 7.4
Various concentrations of KCl

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rigaud, J. L., Levy, D. Reconstitution of membrane proteins into liposomes. Liposomes, Pt B. 372, 65-86 (2003).
  2. Johnson, M., et al. Two-dimensional crystallization of membrane proteins by reconstitution through dialysis. Methods Mol Biol. 955 (31-58), 31 (2013).
  3. Dezi, M., et al. Detergent-mediated incorporation of transmembrane proteins in giant unilamellar vesicles with controlled physiological contents. Proc Nat Acad Sci U S A. 110 (18), 7276-7281 (2013).
  4. Girard, P., et al. A new method for the reconstitution of membrane proteins into giant unilamellar vesicles. Biophys J. 87 (1), 419-429 (2004).
  5. Angelova, M., et al. Preparation of Giant Vesicles by External Ac Electric-Fields - Kinetics and Applications. Trends in Colloid and Interface Science Vi. 89, 127-131 (1992).
  6. Leptihn, S., et al. Constructing droplet interface bilayers from the contact of aqueous droplets in oil. Nature Protocols. 8 (6), 1048-1057 (2013).
  7. Villar, G., Graham, A. D., Bayley, H. A Tissue-Like Printed Material. Science. 340 (6128), 48-52 (2013).
  8. Khalil, A. S., Collins, J. J. Synthetic biology: applications come of age. Nat Rev Genet. 11 (5), 367-379 (2010).
  9. Smith, M. T., Wilding, K. M., Hunt, J. M., Bennett, A. M., Bundy, B. C. The emerging age of cell-free synthetic biology. FEBS Lett. 588 (17), 2755-2761 (2014).
  10. Church, G., et al. Realizing the potential of synthetic biology. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (4), 289-294 (2014).
  11. Gao, Y., et al. Single reconstituted neuronal SNARE complexes zipper in three distinct stages. Science. 337 (6100), 1340-1343 (2012).
  12. Nordlund, G., Brzezinski, P., von Ballmoos, C. SNARE-fusion mediated insertion of membrane proteins into native and artificial membranes. Nat Commun. 5, 4303 (2014).
  13. Decout, A., et al. Enhanced efficiency of a targeted fusogenic peptide. Biochimica Et Biophysica Acta-Biomembranes. 1372 (1), 102-116 (1998).
  14. Chan, Y. H., van Lengerich, B., Boxer, S. G. Effects of linker sequences on vesicle fusion mediated by lipid-anchored DNA oligonucleotides. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (4), 979-984 (2009).
  15. Ishmukhametov, R. R., Russell, A. N., Berry, R. M. A modular platform for one-step assembly of multi-component membrane systems by fusion of charged proteoliposomes. Nat Commun. 7, 13025 (2016).
  16. Biner, O., et al. Delivery of membrane proteins into small and giant unilamellar vesicles by charge-mediated fusion. FEBS Lett. 590 (14), 2051-2062 (2016).
  17. Bian, T., et al. Direct detection of SERCA calcium transport and small-molecule inhibition in giant unilamellar vesicles. Biochem Biophys Res Commun. 481 (3-4), 206-211 (2016).
  18. Schuette, C. G., et al. Determinants of liposome fusion mediated by synaptic SNARE proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (9), 2858-2863 (2004).
  19. Spencer, A. C., Torre, P., Mansy, S. S. The encapsulation of cell-free transcription and translation machinery in vesicles for the construction of cellular mimics. J Vis Exp. (80), e51304 (2013).
  20. Verchere, A., et al. In vitro investigation of the MexAB efflux pump from Pseudomonas aeruginosa. J Vis Exp. (84), e50894 (2014).
  21. Kaplan, R. S., Pedersen, P. L. Determination of Microgram Quantities of Protein in the Presence of Milligram Levels of Lipid with Amido Black B-10. Analytical Biochemistry. 150 (1), 97-104 (1985).
  22. Rumbley, J., et al. One-step purification of histidine-tagged cytochrome bo3 from Escherichia coli and demonstration that associated quinone is not required for the structural integrity of the oxidase. Biochim Biophys Acta. 1340 (1), 131-142 (1997).
  23. Taussky, H. H., Shorr, E. A Microcolorimetric Method for the Determination of Inorganic Phosphorus. Journal of Biological Chemistry. 202 (2), 675-685 (1953).
  24. Galkin, M. A., Ishmukhametov, R. R., Vik, S. B. A functionally inactive, cold-stabilized form of the Escherichia coli F1Fo ATP synthase. Biochimica Et Biophysica Acta-Bioenergetics. 1757 (3), 206-214 (2006).
  25. Ishmukhametov, R. R., Galkin, M. A., Vik, S. B. Ultrafast purification and reconstitution of His-tagged cysteine-less Escherichia coli F1Fo ATP synthase. Biochim Biophys Acta. 1706 (1-2), 110-116 (2005).
  26. Wiedenmann, A., Dimroth, P., von Ballmoos, C. Deltapsi and DeltapH are equivalent driving forces for proton transport through isolated F(0) complexes of ATP synthases. Biochim Biophys Acta. 1777 (10), 1301-1310 (2008).
  27. Morein, S., et al. Wild-type Escherichia coli cells regulate the membrane lipid composition in a "window" between gel and non-lamellar structures. J Biol Chem. 271 (12), 6801-6809 (1996).
  28. Zinser, E., et al. Phospholipid synthesis and lipid composition of subcellular membranes in the unicellular eukaryote Saccharomyces cerevisiae. J Bacteriol. 173 (6), 2026-2034 (1991).
  29. Daum, G., Vance, J. E. Import of lipids into mitochondria. Prog Lipid Res. 36 (2-3), 103-130 (1997).
  30. Pantazatos, D. P., MacDonald, R. C. Directly observed membrane fusion between oppositely charged phospholipid bilayers. J Membr Biol. 170 (1), 27-38 (1999).
  31. Pantazatos, D. P., Pantazatos, S. P., MacDonald, R. C. Bilayer mixing, fusion, and lysis following the interaction of populations of cationic and anionic phospholipid bilayer vesicles. J Membr Biol. 194 (2), 129-139 (2003).
  32. Sunami, T., et al. Detection of association and fusion of giant vesicles using a fluorescence-activated cell sorter. Langmuir. 26 (19), 15098-15103 (2010).
  33. Memoli, A., et al. Effects of surfactants on the spectral behaviour of calcein (II): a method of evaluation. J Pharm Biomed Anal. 19 (3-4), 627-632 (1999).

Tags

Biokemi spørgsmål 134 Membranproteiner rekonstitution proteoliposomes LUV GUV membran fusion elektron transportkæde ATPsyntase ATP produktion syntetisk biologi
Vaskemiddel-fri ultrahurtig rekonstituering af membranproteiner i Lipid dobbeltlag ved hjælp af Fusogenic komplementære-ladet Proteoliposomes.
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Galkin, M. A., Russell, A. N., Vik,… More

Galkin, M. A., Russell, A. N., Vik, S. B., Berry, R. M., Ishmukhametov, R. R. Detergent-free Ultrafast Reconstitution of Membrane Proteins into Lipid Bilayers Using Fusogenic Complementary-charged Proteoliposomes.. J. Vis. Exp. (134), e56909, doi:10.3791/56909 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter