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Biochemistry

세제 없는 보완 청구 Proteoliposomes Fusogenic를 사용 하 여 지질 Bilayers에 막 단백질의 초고속 재구성.

Published: April 5, 2018 doi: 10.3791/56909
Automatic Translation
1, 2, 3, 2, 2
1First Pavlov State Medical University, 2Clarendon Laboratory, Department of Physics, Oxford University, 3Department of Biological Sciences, Southern Methodist University

Summary

여기 postfusion bilayer에이 막 단백질의 세제 무료 배달 대상 지질 bilayers와 fusogenic proteoliposomes에 막 단백질의 재구성 및 같은 proteoliposomes의 융합에 대 한 두 개의 초고속 프로토콜 선물이. 이러한 방법의 복잡 한 다중 구성 요소 막 시스템의 신속 하 고 쉽게 제어 조립이 있습니다.

Abstract

더 복잡 한, 더 큰 모델 지질 bilayers는 세제와 덜 호환 세제 30-100 nm 작은 unilamellar 소포에 막 단백질의 납품을 위한 불가결 하지 않습니다.

여기는 반대로 리 베어링의 막 단백질을 청구 하는 fusogenic를 사용 하 여이 근본적인 한계를 우회에 대 한 전략에 설명 합니다. 이러한 vesicles 사이의 융합 낮은 이온 강도 버퍼에서 5 분 이내에 발생합니다. 긍정적으로 위탁된 한 fusogenic 리 부정 청구 biomimetic 대상 지질 bilayers에 막 단백질의 세제 무료 배달에 대 한 간단한 셔틀 벡터로 사용할 수 있습니다. 우리는 또한 fusogenic proteoliposomes 빠른 30 분 프로토콜에 막 단백질을 다시 구성 하는 방법을 보여줍니다.

이러한 두 가지 방식을 결합 하 여, 대장균에서 두 막 단백질의 구성 하는 전자 전송 체인의 빠른 어셈블리 설명, 기본 양성자 펌프 보3-산화 효소와 F1Fo ATP synthase의 세포 막에서 0.1에서 배열 하는 다양 한 크기의 소포 >이 체인에 의해 ATP 생산 뿐 아니라 10 미크론.

Introduction

막 단백질을 함께 인공 지질 bilayers의 기능화 막 모델 시스템의 어셈블리에서 핵심적인 단계입니다. 가장 간단한 모델, proteoliposomes (PL), 소형 (30-200 nm 직경)의 구성 단백질 unilamellar 소포 (SUV, 또한 전화 리), 그들의 막에 통합. PL은 전통적으로 형성 된 2 단계1. 첫째, 미리 형성한 SUV는 막 단백질의 관심, 임계 micelle 농도 (CMC)의 위 농도에 세제와 혼합 됩니다. 둘째, 세제는 다양 한 투 석, "바이오-비즈" 또는 젤 여과 기법, 막에 있는 단백질을 떠나 함께 제거 됩니다. 후자의 접근 방식을 훨씬 빠른 (~ 30 분1) 이며 따라서 연 약하고 민감한 막 단백질의 재구성 하는 것이 좋습니다 동안 처음 두 가지 방법 많은 시간을 소요 하 고 발생할 수 있습니다 세제 제거 속도 의해 제한 되는 활동 및 단백질의 구조적 무결성의 손실의 상당한 손실. 더 큰의 기능화 소포 (큰 unilamellar 소포, LUV, 1 µ m 직경까지)이이 접근에 의해 더 도전 소포 크기 세제 제거 후 감소 되 면 이며, 그것은 거 대 한 unilamellar 소포 불가능 (우두머리, > 1 µ m), 그들은 세제 (하지만 참조 존슨 그 외 여러분 에 의해 불안정 2 큰 bilayers에 있는 막 단백질의 느린 2D-결정에 대 한). 우두머리 막 기능화3,,45 에 대 한 대체 방법을 존재 하지만 힘 드는, 시간 소모, 그리고 일부 세제 농도 CMC 아래에서 해야. 더 복잡 한 또는 허약한 지질 모델 (예를 들어 물방울 히드로 Bilayers6 및 3D 인쇄 방울 인터페이스 Bilayer 기반 인공 조직7) 세제를 참을 수 없습니다. 신속 하 게 합성 생물학 응용 프로그램8,신흥9,10 비판적으로 의존 같은 복잡 한 막 구조의 기능화. 따라서, 대상 연약한 bilayers에 막 단백질의 신속 하 고 부드러운 배달 수 있도록 쉽고 강력한 방법 높은 필드에 전과 있다.

대신, 세제 무료 단백질 전달 방법이 이다 소포 융해, 어디 상호 작용 소포 막 단결 그대로 postfusion bilayer에 그들의 intravesicular 수성 내용, 외부에 발표 되 고 없이 혼합 하는 동안 환경입니다. 소포 융해 활성화는 연락에 있는 보완 fusogenic 에이전트 (일부 단백질11,12 , 펩 티 드13 또는 특별히 수정 된 DNA14) 내에서 구조적 재배열에 의해 구동 bilayers, 또는 지질 bilayers 간의 Coulombic 상호 작용 complementarily 충전된 양이온 및 음이온 지질15,16또는 양이온 bilayers 및 부정 청구 단백질17의 형성.

전 접근 필요 퓨전, 이전 상호 작용 세포 막의 fusogenic 요원의 존재 이지만 상대적으로 느린 (~ 30 분 퓨전12,18의 절반 최대에 도달), 모두 자연과 인공에 적용할 수 있습니다. 막입니다.

Fusogenic 지질 (그림 1)를 사용 하 여 접근의 장점은 훨씬 빠른 막 융합 (반-최대, 및 반응 완료 5-10 분 ~ 1 분)는 이다. 또한, 융합의 범위 i) 하기 쉬운 상대 콘텐츠 청구 지질 bilayers fusogenic, 및 ii) 이온의 일반, 삼투성 강도 50 m m 및, 예를 들어, 자당15 위 (소금에서 반응 매체의 공식화에 의해 통제 될 수 있다 같습니다 퓨전 중지), 또는 둘 다의 조합. 퓨전을 시작 하려면 반대로 충전된 fusogenic 소포는 5-10 분에 대 한 낮은 (일반적으로 10-20 밀리미터 소금) 이온 강도 매체에 혼합 됩니다. 한 상대는 방법의 단점은 양이온 지질 양이온 proteoliposomes 퓨전, 특히 낮은 이온 강도에서 이전에 막 단백질의 기능에 부정적인 영향을 발휘할 수 있습니다 하지만이 효과 가역과 자연에 의해 완화 융해 후 막과 정상 이온 강도 매체에 그것의 반환의 지질 구성.

Protocol

1. 준비 fusogenic의 SUV, LUV

  1. Fusogenic 지질 혼합물의 준비
    1. 25-50 mg/mL에서 클로 프롬에 중립, 양이온, 음이온, 및 형광 지질 재고 솔루션을 준비 (중립 DOPC (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), 예를 들어 양이온 에틸-PC (1, 2- dimyristoleoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine), 음이온 POPA (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphate), 및 형광 cholesteryl-Bodipy-FL12, 각각) 건조 지질 적절 한 양의 무게와 100%에 그들을 해산 하 여 클로 프롬 (주의! 이렇게 연기 후드), 또는 클로 프롬과 lipids의 상용 클로 프롬 주식을 diluting.
      참고: 모두 자연 지질 추출 및 순수 합성 지질 이용 될 수 있고 유사한 결과 보여 줍니다.
    2. 믹스 2.5 mg는 양이온 그리고 클로 프롬 주식 (1.1.1) 유리 유리병에서에 중립 지질 2.5 밀리 그램.
      참고:이 단계는 5 mg에 클로 프롬, 양이온 지질의 50% 무게 분 율을 포함 하는 양이온 지질 혼합물의 생성 합니다. 필요한 경우, 혼합물에 형광 지질의 0.5% 무게 분수를 추가 합니다.
    3. 1 mg의 음이온 및 클로 프롬 주식 (1.1.1) 유리 유리병에에서 중립 지질 4 mg을 혼합. 이 음이온 지질 20% 무게 분 율을 포함 하는 음이온 지질 혼합물의 5 밀리 그램을 제공 합니다.
    4. 증발 건조 지질의 얇은 층을 형성 하는 질소의 흐름에서 클로 프롬.
    5. 10 분 동안 진공에서 잔여 클로 프롬을 제거 합니다.
      참고: 전통적으로이 단계는 훨씬 더 긴 (1-12 h), 하지만 우리는 더 이상 치료 속성 SUV의 커플링에 명백한 개선을 제공 발견.
    6. 각 유리병에 0.5 mL 버퍼 A (100 m m KCl, 1 mM MgCl2, 50 m m MOPS, pH 7.4)을 추가 하 고 서 서 실 온에서 30 분, 그리고 소용돌이 지질 영화 유리 표면 및 b에서 완전히 분리 될 때까지 그들을 떠나 여 건조 지질 영화 화 ecomes 균질 성 지질 정지입니다. 이 대해 취해야 20-40 s.
  2. 밀어 남에 의해 SUV LUV의 형성
    1. 압출 시스템 조립 ( 재료의 표참조) 폴 리카 보 네이트 필터는 다음 중 하나를 사용 하는 두 개의 1 mL 주사기로 기 공 크기: 양식 SUV, 100 또는 200 nm와 400 또는 800 nm 양식 LUV.
    2. 주사기로 지질 정지를 전송 합니다.
    3. 전달 하 여 필터를 통해 21 번 같이 다른18,19정지를 압출 성형.
      참고: 홀수 구절의 원래의 지질 현 탁 액을 직면 하 고 필터 쪽에 붙어 큰 지질 덩어리의 소포 솔루션으로 전송 최소화 하기 위해 필요 합니다.
    4. 1.5 mL microcentrifuge 튜브로 소포 솔루션을 전송 합니다.

2. Fusogenic 거꾸로 유제 메서드에서 우두머리의 형성

참고:이 절차는 그림 2에 나와 있는데.

  1. 지질에 오일 솔루션의 준비
    1. 클로 프롬 주식 혼합 (단계 1.1.1 참조) 중립 지질 (2mg), microcentrifuge 1.5 mL 튜브에 hexadecane의 1 mL와 함께 음이온 지질 (0.5 mg)의.
    2. 지속적인 혼합 및 튜브를 열어 30 분 동안 80 ° C에가 열 혼합물에서 클로 프롬을 증발. 튜브를 닫고 실내 온도에 차가운 시키십시오.
  2. 지질-에서-오일/수성 버퍼 인터페이스에서 지질 단층의 형성
    1. 0.5 mL 버퍼 B (20 m m KCl, 0.1 m m MgCl2, 10 m m MOPS pH 7.4) 1.5 mL 원심 분리기 튜브에서 위에 기름에서 지질 솔루션의 장소 200 µ L. 표면 장력 일치 하지 않아 오일과 수성 버퍼 (그림 2A) 사이 단계 분리 테두리의 볼록 모양 note
    2. 단계 분리 테두리 병합, 지표 지질 단층 형성에는 때까지 기다립니다. 이 일반적으로 실 온에서 30-60 분 걸립니다.
  3. 물에서 기름 유화 액의 준비
    1. 준비 물의 밀도 보다 높은 밀도와 버퍼 B에에서 수용 성 비 이온 다 당 류의 솔루션 (예: 15 %Ficoll-400 (w/v), 밀도 1.05 g/mL)
      참고: 필요에 따라 하나 추가할 수 형광 수용 성 염료 우두머리의 더 나은 시각화를 위한 버퍼 및 어떤 다른 원하는 수는 GUVs의.
    2. 2.1.2에서 지질에 오일 솔루션의 100 µ L로 별도 1.5 mL 원심 분리기 튜브를 위의 혼합물의 0.5 µ L를 전송 합니다.
    3. Sonicate (14 W 44 kHz) 30 혼합 초음파 물 욕조에 s. 그럼, 적극적으로 소용돌이 45 분 물에서 기름 유화 액을 형성 각 방울 지질 단층 (그림 2B)에 의해 코팅 하는 것입니다 어디.
  4. 우두머리로 물에서 기름 유화 액의 변환
    1. 지질-에서-오일/수성 인터페이스 위에 결과 유제를 배치 하 고 즉시 튜브 2 분 10000 x g에서 탁상 원심 분리기에 원심. 우두머리의 결과 펠 릿은 명확 하 게 보이는 (그림 2C) 해야 합니다.
    2. 냉각 튜브 지질에서 기름 혼합물을 강화 하기 위해 냉장고에 4 ° C를 (그림 2D, hexadecane 굳은 18 ° c), 냉동된 오일, 조심 스럽게 제거 하 고 다음 수성 단계 철회.
      참고: 석유를 촉진 하는 와이어 앵커의 모양에서 구부려 제거 동결 사용 되었다.
    3. 신선한 버퍼 B, 신선한 튜브에 50 µ L에서 우두머리 펠 릿을 resuspend 하 고 100 X 기름 침수 목표 (그림 2E)를 사용 하 여 형광 현미경 검사.

3. 모니터링 코발트 Calcein 방법으로 소포 융해

  1. 젤 여과 중력 열 준비 합니다.
    1. 이온을 제거 된 물 100 mL에 젤 여과 수 지 (예: 극상 sephadex G-50)의 ~ 10 g을 흡수 하 고 하룻밤 팽창.
    2. 일회용 플라스틱 중력 흐름 열에 수 지의 3 mL을 포장 하 고 초순 물으로 씻어 실 온에서 버퍼 C (100 m m KCl, 10mm MOPS, pH 7.4) equilibrate.
  2. + SUV 또는 SUV0 의 준비 코발트 calcein 함께 로드 됩니다.
    1. 1 m m calcein, 1mm CoCl2, 98 mM NaCl, 10mm MOPS를 포함 하는 솔루션을 준비 다음 pH 7.4를가지고.
      참고: 방법의 본질은 그 무료 형광 calcein Co2 +비 형광 복잡 한 형성. 그것은 EDTA, 어떤 것의 추가 따라 다시 형광 된다 Co2 +에 대 한 높은 선호도 배 수량 calcein에서 코발트 calcein 복잡 한 (그림 3A).
    2. 양이온 또는 중립 지질 1.1에 설명 된 대로 준비의 드라이 필름을이 솔루션의 500 µ L를 추가 합니다.
    3. 준비 하는 100 nm SUV 1.2에 설명 된 대로 밀어 남에 의해.
    4. 작은 테이블 탑 ultracentrifuge에서 20 분 1000000 x g에서 밀어낸된 SUV와 버퍼 C의1 mL에 resuspend. 반복 산 및 물의 resuspension 3 번; 버퍼 C의 0.6 mL를 사용 하 여 마지막 물의 resuspension에 대 한.
      참고:이 단계 외부 코발트-calcein의 대부분을 제거합니다.
    5. 일회용 중력 흐름 열 단계 3.1.2에 설명 된 대로 버퍼 C equilibrated 젤 여과 수 지와 함께 로드 된 SUV를 통과 하 여 나머지 외부 코발트-calcein를 제거 합니다.
      참고: 우리가 일반적으로 통해 흐름의 첫 번째 밀리 볼륨 삭제 고 외부 코발트-calcein 무료 SUV를 포함 하는 두 번째 밀리 리터를 수집 합니다.
  3. EDTA와 로드 SUV- 의 준비
    1. 10 mM EDTA, 80 m m NaCl, 10mm MOPS, pH 7.4의 솔루션을 준비 합니다.
    2. 음이온 지질 1.1에 설명 된 대로 준비의 드라이 필름을이 솔루션의 500 µ L를 추가 합니다.
    3. 1.2에 설명 된 대로 밀어 남에 의해 SUV- 를 준비 합니다.
    4. 작은 고 3.2.4에 설명 된 대로 SUV- resuspend.
    5. 젤 여과 열 3.2.5에 설명 된 대로 통해 SUV- 를 전달 하 여 나머지 EDTA를 제거 합니다.
  4. 퓨전에 대 한 SUV를 준비
    1. SUV0, SUV+, 그리고 SUV- 와 버퍼 D (1mm MOPS, pH 7.4) KCl. 사용 5 µ L의 각 유형의 버퍼 D의 1 mL 당 SUV의 원하는 농도와 0.2 m m CoCl2 보충을 희석합니다
    2. 적어도 1 시간에 대 한 혼합물을 품 어.
      참고:이 단계는 표면에 바인딩된 SUV+calcein를 차단 하 여 배경 형광 수준을 최소화 됩니다.
  5. 소포 융해
    1. 2 mL fluorimeter 멧, 및 모니터 calcein 480 nm 여기를 사용 하 여 510 nm 방출의 형광 증가 SUV− (버퍼 위에서 설명한 대로 D에에서 희석)의 1 mL와+ SUV 또는 SUV0 의 1 mL를 혼합 하 여 융해 반응을 시작합니다 (그림 3B)입니다.
    2. 반응이 완료에 온다 때까지 기다립니다.
    3. 추가 세제 Triton X-100 EDTA의 혼합물 (0.05% 최종 농도 7mm, 각각)를 소포에서 calcein를 최대 형광 신호를 얻을.
    4. 최대 형광 신호 그림 3C와 같이 세제 추가 다음의 백분율로 정의 하는 융합의 범위를 결정 합니다.

4. Fusogenic Proteoliposomes에 막 단백질의 빠른 재구성

참고:이 절차는 그림 4A에 그림입니다.

  1. 3.1에 설명 된 대로 젤 여과 수 지와 중력 흐름 열 준비 하 고 실 온에서 버퍼 A와 equilibrate.
    참고: 모든 추가 조작에서 ≤ 4 ° C에서 엄격 하 게명시 되지 않는 한, 단백질 활동의 감소를 최소화 하기 위해 수행 합니다.
  2. 단백질 분리에 사용 되는 동일한 추출 버퍼와 그것을 diluting 하 여 순화 된 막 단백질 0.7 mg/mL의 농도 조정 합니다.
  3. 미리 형성한 SUV, 160 µ L 버퍼 A 및 버퍼 A; 10 %cholate 60 µ L의 300 µ L로 단백질의 믹스 140 µ L 그러면 1시 30분 단백질: 지질 최종 660 µ L 볼륨에 무게 비율.
  4. 부드럽게 15 분 락 플랫폼에 혼합물을 흔들어.
    참고: 다음 단계는 상 온에서 할 수 있습니다.
  5. 젤 여과 지를 통해 혼합물을 통과 하 고 proteoliposomes를 포함 하는 혼 탁 한 분수를 수집.
  6. 400000 x g 15 분 동안에 테이블 탑 ultracentrifuge와 proteoliposomes 작은
  7. 버리고 상쾌한 재구성 비 단백질을 포함 하 고 신선한 버퍼 a.의 1 mL에 펠 릿 resuspend
  8. PL에20Amido 블랙 메서드 사용 하 여 상쾌한 단백질 콘텐츠를 결정 합니다.
  9. 일반적으로 약 50-70%의 재구성, 수익률을 결정 합니다.
    참고: 단계 4.6 4.8 선택적으로 Ni NTA 수 지 일회용 중력 열으로 포장 하 고 3.1.2에 설명 된 대로 버퍼 A로 세척의 1 mL를 통해 PL 솔루션을 전달 하 여 대체 될 수 있습니다. 이러한 전달 재구성 비 단백질, 우선적으로 바인딩될 수 지, PL, 가장의 통해 흐름에 있을 것입니다에서 별도 것입니다.

5. 기능 테스트의 Proteoliposomes 단백질 활동

참고:이 연구에 사용 된 두 단백질은 그들의 기판의 추가 따라 proteoliposomes에 H+ 펌프 강력한 양성자 펌프 (코엔자임 Q1 보3-산화 효소, 및 ATP F1Fo, 각각), 따라서 건물 막 (ΔpH)에 걸쳐 양성자 그라데이션. 퓨전에 의해 성공적인 공동 재구성, 시 같은 산성화 감소는 pH에 민감한 프로브 ACMA (9-Amino-6-Chloro-2-Methoxyacridine)12,15, 같은 작업 (일상적으로 사용 되는 형광으로 관찰 될 수 있다 그림 4B -C)입니다. 또한 기판 관련 단백질의 활동 (코엔자임 Q1 산화 보3-산화 효소22 와 F1Fo23,24에 의해 ATP 가수분해) 모니터링할 수 있습니다 spectrophotometrically 다양 한 방법을 사용 하 여. 여기, 우리는 F1Fo 어디 두 분석 (그림 4D), 결과 다시 생성 하는 ATP를 사용 하 여 PL의 ATP 가수분해 활동 보여 효소 (pyruvate 키 니 아 제 (PK) 젖 산 효소 (LDH) 유지와 ATP의 일정 농도 다음과 같습니다. PK ATP를 ADP ATP의 기판 phosphoenolpyruvate (PEP) 비용으로 다시 F1Fo 생산 변환 하 여 재생 합니다. 이 반응의 제품 이다, pyruvate NADH의 산화 감소 하는 340 광학 밀도 모니터링 할 수 있습니다 비용 LDH에 의해 젖 산으로 변환 됩니다 nm.

  1. 화학 물질의 준비
    1. 1mm 에탄올에 ACMA 재고를 준비 합니다.
    2. 에탄올에 nigericin의 1 m m 재고 (또는 다른 uncoupler)를 준비 합니다.
    3. 에탄올에 25 mM 코엔자임 Q1 재고 및 버퍼 a.에서에서 1 M DTT 재고 준비
    4. 버퍼, 100 mM ATP의 재고를 준비 하 고 그것의 pH 7.4에 조정.
    5. 버퍼 a: 100 mM 흠, 1mm NADH 및 ~ 500-1000의 농도에서 PK와 LDH의 솔루션에서 시스템 구성 요소를 다시 생성 하는 ATP의 주식 준비 단위/mL.
  2. 코엔자임 Q1 산화 기반 양성자 보3에 의해 펌핑-산화 효소 PL
    1. 0.5 µ M, ACMA의 존재에 2 mL 버퍼 A와 fluorimeter 베트에 PL의 20 µ L를 추가 하 고 안정적인 신호 430 nm 여기와 515 nm 방출 사용 하 여 때까지 기다립니다.
    2. 에 베트를 40 µ M 코엔자임 Q1 을 추가 합니다.
    3. 2mm DTT PL (그림 4B)에 추가 하 여 양성자를 펌핑을 시작 합니다.
      참고: DTT 산화 코엔자임 Q1 을 감소 시킨다 고 보3를 사용할 수 있습니다-산화 효소.
    4. 2 µ M uncoupler (예: nigericin)를 추가 하 여 구성 된 ΔpH를 낭비. ACMA 형광 신호는 거의 원래의 수준으로 신속 하 게 반환 해야 합니다.
      참고: 이어야 한다 아무 ACMA 냉각 시 기판의 추가 uncoupler는 처음에 반응 혼합물에 존재 하는 경우.
  3. ATP 가수분해 기반 양성자 F1FoPL 펌핑
    1. 5.2에서 설명한 대로 fluorimeter 베트를 PL의 40 µ L를 추가 합니다.
    2. PL (그림 4C)을 0.2 m m ATP를 추가 하 여 양성자를 펌핑을 시작 합니다.
    3. 5.2.4에 설명 된 대로 ΔpH를 낭비.
  4. F1FoPL, 그리고는 uncoupler에 의해 그것의 자극에 의해 ATP 가수분해
    1. 2 mL 버퍼 A, 포함 1mm ATP, 0.2 m m NADH, 2 mM, PEP와 분 광 광도 계 베트에 PL의 40 µ L 및 15 µ L 각 PK와 LDH의 추가 합니다.
    2. 340 NADH의 흡 광도 감소를 측정 하 여 반응에 따라 nm. 3-4 분 후, ATP 가수분해에 ΔpH의 배 압 출시 베트를 2 µ M uncoupler을 추가 합니다. 반응 속도 즉시 증가 합니다.
      참고: Ni NTA 수 지 4.10에 설명 된 대로 통과 PL (그림 4D, 빨간 추적), uncoupler에 의해 강한 자극을 시연할 예정 이다는 eluate 간신히 자극된 (블루 추적) 됩니다.

6. Fusogenic Proteoliposomes 막 단백질의 기능에 지질 환경 및 이온 강도 영향 테스트

  1. 양성자 펌프 40 µ L에 의해 평가의 PL+,- PL 및 PL0 2 mL에 ACMA 냉각 분석 결과 D 1 m m MgCl2 와 20 (그림 5, 패널 A) 또는 100 m m KCl (패널 B) 5.2 또는 5.3 (그림 5 에 설명 된 대로 보충 버퍼 빨강, 검정 및 파랑 추적).
  2. 버퍼 D 20 m m KCl, 그리고 ACMA 냉각 (녹색 추적)에 대 한 테스트와 보충의 2 mL에 LUV- 의 동일한 양으로 PL+ 의 40 µ L을 퓨즈.
  3. PL과 동일한 요금 (회색 추적)의 SUV 등을 혼합 하 여 2 단계에서 제어 실험을 실행 합니다.
    참고: 양성자 펌핑 해야 하 여 향상 시킬 postfusion와 줘.

7. 배달 LUV와 Fusogenic Proteoliposomes에 의해 우두머리로 막 단백질의

  1. 800의 50 µ L와 PL+ 의 50 µ L 퓨즈 버퍼 D 1 mM MgCl2, 그리고 5 분 동안 20 m m KCl 보충의 1 mL에 nm LUV- .
  2. 5 분, 6000 x g에서 소포를 펠 렛 하 고 표면에 뜨는 포함 unreacted PL+을 삭제. 버퍼 1 m m MgCl2 와 100 m m KCl, 보충 하는 D의 1 mL에 펠 릿을 resuspend 하 고 산 및 resuspending 두 번 더 반복 합니다.
  3. ACMA 5.2 나 5.4에 설명 된 대로 분석 결과 냉각을 실행 합니다.
  4. 보완 청구 소포 높은 소금 (200mm KCl)의 조합, 비 fusogenic 소포, PL+없이 그냥 빈 LUV- 를 사용 하 여 1-3 단계에서 제어 실험을 실행 합니다.
    참고: postfusion LUV에 의해 양성자 펌핑 해야 검출 될 complementarily 충전된 소포는 그림 6과 같이 사용 되었다 하는 경우에.

8. 세포 막의 LUV 및 우두머리,이 체인에 의해 ATP 생산 개별 구성 요소에서 전자 전송 체인의 어셈블리입니다.

참고:이 절차의 개략은 그림 7A에서 나와 있습니다. 이 실험에서 생산 하는 ATP luciferase 여 파이 인산 및 앰프에 ATP 합성된의 변환 발광을 루미 노 등록를 이어서 소 luciferase 시스템에 의해 등록 됩니다. 단일 튜브 루미 노 덜 민감한 microplate luminometers 대신 사용 하는 것이 좋습니다.

  1. 보3의 µ L 믹스 3-산화 PL+ 효소 및 5 µ L F1Fo PL의+ 형성 섹션 4에서 설명한 대로.
  2. 버퍼 D 20 m KCl m와 1 m m MgCl2 5 분에 대 한 보충의 800 µ L에서 3 µ L의 LUV 또는 우두머리- (제 2에 설명 된 대로 형성) 그들을 퓨즈.
  3. 고 농도 주식을 사용 하 여, KCl와 MOPS postfusion 막 100mm 및 50mm 최종 농도를 추가 합니다.
    참고: 포스트 퓨전 LUV의 경우이 단계는 방지 외부 (버퍼 A) 사이의 삼 투 오프셋으로 인해 그들의 붓기 하 고 intravesicular (버퍼 D) 소금 농도.
    1. 필요에 따라 7.2 unreacted SUV+, 분리에 설명 된 대로 postfusion 막 펠 렛 및 버퍼 a.의 800 µ L에서 펠 릿 resuspend
  4. 소-luciferase-ADP 칵테일 포함 400 μ M ADP, 50 µ M 소, 및 버퍼 A에에서 2.5 µ g luciferase 200 µ L를 준비
  5. Step8.3에서 postfusion 혼합물에 칵테일을 추가 합니다.
  6. 40 µ M의 산화 코엔자임 Q1을 추가 하 고 보3postfusion 막의 energization 트리거-2mm DTT를 추가 하 여 산화 효소. 1 분 기다립니다.
  7. 활성화 소포를 5 mM 칼륨 인산 염 (KP나, pH 7.4)을 추가 하 여 ATP 합성을 시작 하 고 루미 노 (그림 7B)와 ATP 생산을 감지. 3 분에 대 한 반응을 실행 합니다.
    참고: ATP 합성 반응 보3에 의해 소비 하는 산소의 고갈 될 때까지 5-7 분 진행-산화 효소와 luciferase.
  8. 반응 혼합물에 ATP 참조 표준 (0.5 nmol ATP)를 두 번 추가 합니다. 측정 ATP 생산.
  9. ATP 합성 반응에서 ATP 참조 표준 신호는 신호를 분할 하 여 반응에서 생산 되는 ATP의 실제 금액을 얻을. F1Fo 반응에 사용 된의 총 금액에이 값을 조정 하 고 마지막으로 µmol ATP에에서 ATP 합성의 속도 표현 / (mg F1Fo* 분).

Representative Results

Fusogenic 사용 하 여 무료 충전 3 단계 (그림 1)를 포함 하는 대상 bilayer 막으로 막 단백질의 빠른 세제 무료 배달에 대 한 proteoliposomes: A, fusogenic SUV 높은 지질 혼합물에서의 형성 충전된 지질;의 내용 이 SUV는 intravesicular 부하;을 선택적으로 있습니다. B, 우리의 빠른 막 단백질 재구성;를 사용 하 여 PL로 fusogenic SUV의 변환 C, fusogenic PL 대상 bilayers 낮은 소금 매체에서와 융합 융합 반응을 중지에 높은 소금의 추가 의해 따라. 큰 소포 (D) 일 경우 바람직 전략 음이온 대상 bilayer, 막 단백질의 활동에 대 한 더 나은 지질 환경 제공으로 막 단백질을 제공 하는 (토론 더 텍스트에서).

거꾸로 에멀젼 방법을 우두머리 형성 프로토콜은 그림 2에 자세히는 강조 표시 됩니다. 우리 때문에 상대적으로 높은 지질 오일 혼합물에 hexadecane를 사용 하는 것을 선호 판 우두머리 후 응고 기름 쉽게 제거 가능 (18 ° C) 냉동 온도.

그림 3 에서는 소포 융해를 코발트-calcein-EDTA 메서드를 사용 하 여 보여 줍니다. 퓨전 보완 청구 소포 높은 소금 농도 동안 낮은 소금 버퍼에 사용 됩니다 경우에 볼 수 있다 (> 50 m m14) 또는 비 fusogenic 소포를 사용 하 여 설명 없는 퓨전.

Fusogenic SUV로 막 단백질의 재구성의이 빠른 프로토콜은 그림 4A에 나와 있습니다. 우리 빨리 입증이 프로토콜을 사용 하 여 기본 양성자의 재구성 펌프 보3-산화 효소와 F1Fo ATP synthase PL, 그리고이 세포 막에 그들의 특정 활동의 평가에. 그것은 중요 한 단백질 재구성의 수익률 지질 사용15 의 책임에 의존 하지 않습니다 및 약 50-7525,12, 그리고 그 후에 PL로 재구성, 단백질 저장 될 수 있다 적어도 3 일 에서도 단백질 활동의 명백한 손실 없이 실내 온도. 이 절차는 또한 ATP synthase, 그것의 95%는 그것의 친수성 moiety F1 중심 바깥쪽15,26의 단방향 방향을 제공 합니다.

그림 5 는 F1Fo (패널 A)의 활동 및 보3를 양수 하는 양성자를 보여줍니다-양이온 지질에 산화 효소 (패널 B)은 감소 하 고 음이온과 중립 지질 환경에 비해 낮은 이온 강도에 민감 하지만 이 효과 음이온 LUV-+ PL 융합 후 postfusion 막에 완화 됩니다.

그림 6 의 큰 소포 막으로 F1Fo ATP synthase의 납품을 보여 줍니다. 이 실험, PL+ 에 800 nm LUV- 20 m m KCl 5 분, 그리고 반응 제품에 융합 했다 수송과 들뜬된 PL+를 제거 하려면, resuspended 이었고 양성자 펌프에 대 한 분석. 제어 실험 아무 양성자 펌핑 LUV0 대신 LUV- 의에서 사용 된 융해 반응 (검은 추적), 또는 빈 LUV- 혼자 분석 (블루 추적) 하는 때 보였다.

Fusogenic PL에 의하여 큰 소포 막에 작동 전자 전송 체인의 빠른 어셈블리는 그림 7에 표시 됩니다. F1Fo SUV+ 를 사용 하는 우리 보3 SUV+ 융해 800 nm LUV-, 코엔자임 Q1 과 정력적으로 DTT 순차적으로 추가 하 여이 체인 postfusion 소포에 의해 ATP 생산을 증명 막, 고 인산 염 ATP 합성 F1Fo트리거 추가.

Figure 1
그림 1: 개념의 초고속 세제 무료 배달 막 단백질의 unilamellar vesicles의 융합을 통해 대상 지질 bilayers에 보완 된 지질 형성. 선택적으로 intravesicular 화물 적재 양이온 및 음이온 fusogenic unilamellar 작은 소포 (+의 SUV, SUV-)의 (A) 형성. (B) fusogenic fusogenic proteoliposomes (PL) 막 단백질의 재구성에 의해에 SUV의 변환. (C) 세제 무료 큰 소포, 100 nm PL+ 사이의 융합에 의해 그림의 세포 막에 막 단백질의 배달에 대 한 fusogenic와 줘. (D) 바람직 전략 postfusion 막으로 막 단백질의 배달 그리고 800 nm LUV-입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2: 우두머리 형성 프로토콜 거꾸로 에멀젼 방법. (A) 석유 지질 혼합물 및 물 사이 국경에 지질 단층의 형성. (B)는 거꾸로 (물에서 기름) 유제의 형성. 원심 분리에 의하여 기름-물 국경을 통해 유제를 전달 하 여 (C) 우두머리 형성. (D) 냉각 튜브 아래의 < 18 ° C 고형화 하 고 기름을 제거 ~. 그것의 막 (녹색)와 기의 루멘 (레드)에서 북극 fluorophore (1 m m Sulforhodamine 101) 형광 지질 (1% 무게 분수 cholesteryl-Bodipy-FL12)를 포함 하는 우두머리의 (E) A 형광 현미경 이미지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3: 지질 소포 융해 코발트-calcein-EDTA 방법으로 공부 했습니다. 어디 무료 calcein 릴리스입니다 비 형광 코발트-calcein 복합물에서 EDTA에 의해 방법의 (A) 회로도 (B) 융합의 SUV 다양 한 KCl 농도에서. 텍스트에 설명 된 대로 B 에서처럼 postfusion 소포를 EDTA와 트라이 톤 X-100 세제의 추가 의해 intravesicular calcein의 (C) 자료. 붉은 추적에 대 한 융합 정도 (%)은 최대한 배경 수정 퓨전 신호를 나누어 계산 (1-2) 신호에 의해 배경 수정 최대한 캡슐화 된 calcein (3-2)의 출시에 따라 고 100을 곱한. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 4
그림 4: 보3의 초고속 재구성-산화 효소 및 fusogenic proteoliposomes와 같은 proteoliposomes에 단백질 활동 측정으로 F1Fo . (A) 도식 재구성 프로토콜의 (B) 코엔자임 Q1 산화 양성자 펌프 보3에 의해 구동-PL 산화 효소 (텍스트 설명)를 냉각 하는 ACMA로 측정. (C) ATP 가수분해 기반 양성자 펌핑 pl에서 F1Fo ACMA 냉각 (텍스트 설명)로 측정. F1Fo pl에서 (D) ATP 가수분해 ATP 회생 시스템 (텍스트 설명), 및 그것의 자극에는 uncoupler에 의해 측정. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 5
그림 5: 막 단백질의 활동에 지질 환경 및 이온 강도 영향. 양성자 펌프 F1Fo (A) 및 보3-20, 100 m m KCl. 제어 추적 (음이온 LUV (녹색 추적)와 융합 하는 양이온 PL (빨간 추적), 음이온 PL (블루 추적), 중립 PL (검은 추적), 그리고 양이온 PL에 산화 효소 (B) 회색) Fo PL- 혼합 시 SUV-와 F1에 의해 양수 하는 양성자의 변화를 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 6
그림 6: 배달 F1Fo ATP synthase의 800의 세포 막에 PL+와 융합을 통해 nm LUV- . 실험의 개략도 (A): PL+ 와 800 nm LUV- 1 mM MOPS (pH 7.4), 1 m m MgCl2, 20 m m KCl 5 분, 제거 수송과 융합 했다 PL, 들뜬 및 동일한 버퍼에서 resuspended. (B) 양성자 postfusion LUV (빨간 추적)에 의해 펌핑. 제어 실험 때 PL0 luv- (검은 추적), 혼합 했다 또는 빈 LUV- 혼자 분석 (블루 추적)에 냉각 하는 아무 ACMA 보였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 7
그림 7: 5-분 세제 무료 조립 800의 세포 막에서 전자 전송 체인의 PL+와 융합을 통해 nm LUV- . 실험의 개략도 (A): 100 nm F1Fo PL+ 와 100 nm 보3- 그림 6에서 설명한 대로 산화 효소 PL+ -, LUV로 융합 했다. 퓨전은 KCl MOPS 100, 50 mM에 각각 추가 하 여 중지 되었습니다. 세포 막 ADP-소-luciferase 칵테일 혼합 되었고 텍스트에 설명 된 대로 DTT와 Q1의 추가 의해 활성화. ATP 생산은 1 m m 인산 염 (Pi) 및 모니터링된 실시간으로 텍스트에 설명 된 대로 luciferase 소 시스템의 추가 의해 시작 되었다. Postfusion 소포 (빨간 추적)에 의해 (B) ATP 종합. 제어 실험 때 PL+ 높은 소금 (회색), LUV- 와 함께 혼합 했다 또는 PL0 LUV- (블랙)와 함께 혼합 했다 아니 ATP 생산을 보였다. ATP 합성 속도 텍스트 (단계 8.8 8.9)에 설명 된 대로 계산 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Discussion

다음과 같은 몇 가지 문제가이 실험 방법의 성공을 위해 고려해 야 할:

의 지질 bilayers proteoliposomes 및 대상에 대 한 선택: 양이온 지질에에서 없는 자연, 음이온 지질은 풍부한 생물 막 도달, 예를 들어, 25, 35, 대장균, 효 모 S. cerevisiae, 원형질 막 및의 안 미토 콘 드리 아 막의 내부 막에서 20%에 많은 종, 각각27,,2829. 그것은 합리적인 pl+ 막 단백질의 기능 양이온 지질 bilayer는에서 및 외부 이온의 상대적인 내용에 따라 차례로 bilayer의 포지티브 차지의 강도 의해 영향을 받을 수 있습니다 기대 하는 것 강도입니다. 따라서, 그것은 어느 정도 관심의 막 단백질의 기능에 따라 다르죠 양이온 지질 환경의 실험적으로 해결 하는 것이 중요. 여기, 우리는 둘 다 F1Fo ATP synthase와 보3보여줍니다-산화 효소 양이온 지질 환경에 민감 하지만 우리가 조절 하 고 관리 하 첫 pl+ 단백질을 배치 하 고에 그들을 제공 하 여이 효과 역방향 음이온 bilayers, 수락 하 고 다음 퓨전 후 반응 매체의 이온 강도 증가 완료.

특정 양이온 지질의 선택: 대부분 상용 양이온 지질은 비 triacylglyceride 자연; 따라서 잠재적인 후보 지질 막 단백질의 호환성에 대 한 테스트 되어야 한다. 우리가15 는이 연구에 사용 된 ATP synthase PL+ 에서 최상의 성능을 에틸-PC, DOTAP (triacylglyceride에에서 자연 triacylglyceride 지질 하 높은 구조 유사 했다의 형성 이전에 발견 지질) PL+ 이 단백질이 덜 활성화 했다.

소포 융해 분석 실험: 진정한 기 퓨전 (intravesicular 액체 내용을 믹스) 때 소포 그들의 수성 콘텐츠를 혼합 하지 않고 서로 준수 하지만 쉽게 그들의 외부 또는 둘 다 지질의 내용을 혼합 중간 hemi-퓨전 상태에서 분화 될 필요가 전단지30. 차선의 지질 혼합물 또는 특정 조건, 소포는 또한 퓨전31동안 발음된 액체 내용 누설을 보여줍니다. 진정한 퓨전을 사용 하는 fusogenic 혼합물에 충전된 지질의 최소 농도 각 지질 종족에 대 한 실험적으로 발견 될 필요가 있지만 일반적으로, 그것은 10% 미만으로 세포 막 지질은 비 fusogenic 32렌더링 청구 발견.

멀티-발렌타인 이온의 존재에 fusogenic SUV를 형성 하는 동안 그것은 중요 하다 반대로 충전된 구성 요소, 혼합에 아닙니다이 이온에 의해 즉시 응집 및 지질 집계 될 수 있습니다. 예를 들어 코발트-calcein-EDTA 메서드에 대 한 SUV를 준비 하는 동안 이멀전의 구성 요소 폴 리 카보 네이트 필터의 막힘을 방지 하기 위해 EDTA와 양이온 지질 혼합물을 혼합 하지 마십시오 중요 하다.

그것은 또한 그 코발트-calcein-EDTA 방법 매우 민감하고 실시간 퓨전 모니터링, 편리 하면서 수 여전히 과소 평가 1 인 융합의 범위를 언급 하는 것이 중요) 자체 내부 무료 calcein의 형광의 냉각 postfusion 소포, 자체 냉각 임계값은 약 20 µ M33, 고 2 보고 하는 동안 1 m m를 도달할 것으로 예상 되는) 표면 바인딩된 코발트-calcein, 젤 여과 지를 통과 후에 SUV+ 에 바인딩된 남아 있는 고 반면 SUV0 창백한 오렌지 색상 밝은 오렌지 색 소포를 색상. 또한 세제 Triton X-100 EDTA 존재의 추가에 바인딩된 코발트 calcein의 출시 SUV0 (회색 추적) 보다 SUV+ (그림 3C, 빨간 추적)에 대 한 훨씬 더 강력한 신호 생성 note.

관점: 우리는 여기에 설명 된 빠른 접근 수 있습니다 크게 용이 하 게 하 고 속도 신흥 합성 생물학 응용 프로그램의 요구에 대 한 복잡 한 막의 어셈블리를 기대. 우리의 막 단백질 재구성 프로토콜은 깨지기 쉬운 큰 막 단백질의 재구성에 대 한만 30 분이 fusogenic 접근 제공에 5-10 분 동안 긴 투 석 기반 재구성 기술에 민감한 것으로 알려져 큰 지질 bilayers에 같은 단백질. 여기, 대장균 F1Fo ATP synthase, 깨지기 쉬운 단백질의 예로 조작 하 여 이러한 접근 방법의 이점을 설명 합니다. 그것은 23 subunits 고 중/후 가용 화, 차선 조건 (예: 열)에 노출 하는 경우의 무결성을 쉽게 잃게 알려져 있다 하지만이 절차에서 사용 되 고, 단백질 양성자 펌프에 reproducibly 높은 활동을 보여줍니다.

Disclosures

저자는 공개 없다.

Acknowledgments

저자는 감사 로버트 Genn 일리노이 대학에서 크리스토프 폰 Ballmoos 베른 대학에서에서 제공 하는 플라스 미드와 보3를 표현 하는 스트레인-산화 효소. 프로젝트 BBSRC에 의해 지원 되었다 제공 RI와 R.B. BB/L01985X/1을 부여

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DOPC neutral lipid Avanti Lipids 850375
POPA anionic lipid Avanti Lipids 840857
E-PC cationic lipid Avanti Lipids 890704
Cholesteryl-Bodipy-FL12 Thermofisher C3927MP
Sephadex G-50, Super Fine Sigma G5050
Ficoll 400, Type 400-DL Sigma F8016
ACMA Sigma A5806
Nigericin Sigma N7143
ATP Sigma A26209
Q1 Sigma C7956
DTT Sigma D0632
PEP Sigma 860077
NADH Sigma N8129
PK Sigma P9136-1KU
LDH Sigma L1254-1KU
Luciferin Sigma L6882
Luciferase Sigma/Roche 10411523001
Calcein Insight Biotechnology sc-202090
CoCl2 Sigma C8661
EDTA Sigma E6758
Sulforhodamine 101 Sigma S7635
Extrusion system Avanti Extruder
Single tube luminometer, model Sirius L Titertek Berthold
Polycarbonate filter, D19 mm Sigma, Whatman NucleporeTrack-Etched Membranes WHA800309, WHA800284 100 or 200 nm to form SUV, and 400 or 800 nm for LUV
Name Company Catalog Number Comments
Buffers used in the paper
Buffer A 100 mM KCl, 50 mM MOPS pH 7.4, 1 mM MgCl2
Buffer B 20 mM KCl, 10 mM MOPS pH 7.4, 0.1 mM MgCl2
Buffer C 100 mM KCl, 10 mM MOPS pH 7.4
Buffer D 1 mM MOPS pH 7.4
Various concentrations of KCl

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생화학 문제점 134 막 단백질 재구성 proteoliposomes LUV 우두머리 막 융합 전자 전송 체인 ATP synthase ATP 생산 합성 생물학
세제 없는 보완 청구 Proteoliposomes Fusogenic를 사용 하 여 지질 Bilayers에 막 단백질의 초고속 재구성.
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