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Biochemistry

Waschmittel-freie ultraschnelle Rekonstitution von Membranproteinen in Lipid Bilayer mit Fusogenic ergänzende Rechnung Proteoliposomes.

Published: April 5, 2018 doi: 10.3791/56909
Automatic Translation
1, 2, 3, 2, 2
1First Pavlov State Medical University, 2Clarendon Laboratory, Department of Physics, Oxford University, 3Department of Biological Sciences, Southern Methodist University

Summary

Hier präsentieren wir zwei ultraschnelle Protokolle zur Rekonstitution von Membranproteinen in Fusogenic Proteoliposomes und Verschmelzung von solchen Proteoliposomes mit Ziel Lipid Bilayer für Waschmittel-freie Lieferung dieser Membran Proteine in der postfusion Bilayer. Die Kombination dieser Ansätze ermöglicht schnelle und leichtführig Montage von komplexen Mehrkomponenten Membransystemen.

Abstract

Reinigungsmittel sind unverzichtbar für die Lieferung von Membranproteinen in 30-100 nm kleine Unilamellar Vesikel, während komplexere und größere Modell Lipid Bilayer mit Waschmittel weniger kompatibel sind.

Hier beschreiben wir eine Strategie für die Umgehung dieses grundlegende Beschränkung mit Fusogenic entgegengesetzt geladenen Liposomen, die mit einer Membranprotein des Interesses. Fusion zwischen solchen Vesikel erfolgt innerhalb von 5 min in einem Puffer geringer Ionenstärke. Positiv geladenen Fusogenic Liposomen können als einfache Shuttle-Vektoren für Waschmittel-freie Lieferung von Membranproteinen in biomimetischen Ziel Lipid Bilayer, verwendet werden, die negativ geladen sind. Wir zeigen auch, wie Membranproteine in Fusogenic Proteoliposomes mit einem schnell 30-min-Protokoll zu rekonstruieren.

Die Kombination dieser beiden Ansätze, wir zeigen eine schnelle Montage einer Elektronentransport-Kette, bestehend aus zwei Membranproteine aus E. Coli, eine primäre Proton Pumpe Bo3-Oxidase und F1Fo ATP Synthase in Membranen der Vesikel verschiedene Größen von 0,1 bis > 10 µm sowie ATP-Produktion von dieser Kette.

Introduction

Funktionalisierung der künstlichen Lipid Bilayer mit Membranproteine ist ein wichtiger Schritt bei der Montage der Membran Modellsystemen. Das einfachste Modell, Proteoliposomes (PL), besteht aus kleinen (30-200 nm Durchmesser) Unilamellar Vesikeln (SUV, auch genannt Liposomen), mit Proteinen in ihren Membranen integriert. PL bilden sich traditionell in zwei Schritte1. Erste, vorgeformten SUV sind gemischt mit einem Membranprotein des Interesses und ein Waschmittel in einer Konzentration über seine kritischen Micelle Konzentration (CMC). Zweitens wird das Waschmittel mit verschiedenen Dialyse, "Bio-Perlen" oder Gel Filtration-Techniken, so dass das Protein in der Membran entfernt. Der zweite Ansatz ist viel schneller (~ 30 min1) und wird daher bevorzugt für Rekonstitution der Membranproteine, zerbrechlich und empfindlich, während der ersten beiden Ansätze durch Reinigungsmittel entfernen Geschwindigkeit begrenzt sind, dauert viele Stunden und kann dazu führen, dass ein erheblichen Verlust von Aktivität und Verlust der strukturellen Integrität der Proteine. Funktionalisierung der größeren Bläschen (große Unilamellar Vesikel, LUV, bis zu 1 µm Durchmesser) von dieser Vorgehensweise ist eine größere Herausforderung, als Vesikel wird verkleinert nach Reinigungsmittel entfernen und es ist nicht möglich für giant Unilamellar Vesikel (GUV, > 1 µm), so wie sie sind destabilisiert durch Reinigungsmittel (aber siehe Johnson Et al. 2 für langsame 2D-Kristallisation von Membranproteinen in großen Bilayer). Alternative Ansätze für GUV Membran Funktionalisierung3,4,5 existieren aber sind mühsam, zeitaufwendig und erfordern noch etwas Spülmittel bei Konzentrationen unter CMC. Mehr komplexe oder zerbrechliche Lipid-Modelle (z. B. Tröpfchen Hydrogel Bilayer6 und 3D druckbare Tröpfchen Schnittstelle Bilayer-basierte künstliche Gewebe7) verträgt keine Reinigungsmittel. Schnell neue synthetische Biologie Anwendungen8,hängen9,10 kritisch Funktionalisierung von solch komplexe membranstrukturen. Daher ist eine einfache und robuste Methode ermöglicht schnelle und schonende Lieferung von Membranproteinen in das Ziel fragile Bilayer in hohem Grade im Feld gesucht.

Eine Alternative ist Waschmittel-freie Protein Übermittlungsmethode Vesikel Fusion, wo interagierenden Vesikel Membranen in den intakten postfusion Bilayer vereinen, während ihre intravesicular wässrige Inhalt durcheinander geraten, ohne in den externen freigesetzt, Umgebung. Vesicle Fusion ist aktiviert und gesteuert entweder durch Konformationsänderungen Umstellungen innerhalb von komplementären Fusogenic Agenten (einige Proteine11,12 und Peptide13 oder speziell modifizierte DNA-14) befindet sich in der Kontaktaufnahme Bilayer oder Coulomb Wechselwirkungen zwischen Lipid Bilayer komplementär geladenen anionischen und kationischen Lipide15,16, gebildet oder kationischen Bilayer und negativ geladenen Proteine17.

Der ehemalige Ansatz erfordert die Anwesenheit von Fusogenic Agenten in den interagierenden Membranen vor der Fusion, ist relativ langsam (~ 30 min bis halb-maximal Fusion12,18), sondern können auch auf natürliche und künstliche Membranen.

Ein Vorteil des Ansatzes mit Fusogenic Lipide (Abbildung 1) ist, dass es viel schneller Membranfusion (~ 1 min, Hälfte-Maximum und ca. 5-10 min zu beenden die Reaktion zu erreichen) ermöglicht. Darüber hinaus kann das Ausmaß der Fusion i) ein einfach zu formulieren, relative Inhalt der geladenen Lipide in Fusogenic Bilayer und (Ii) ionische und im Allgemeinen, osmotische Kraft des reaktionsmediums (Salze in über 50 mM und z. B. Saccharose15 gesteuert werden werden angezeigt, Fusion zu stoppen), oder eine Kombination aus beidem. Um die Fusion zu starten sind entgegengesetzt geladenen Fusogenic Vesikel in einem niedrig (in der Regel 10-20 mM Salz) Ionenstärke Medium für 5-10 Minuten gemischt. Ein relative Nachteil der Methode ist, dass die kationischen Lipide können wirkt sich negativ auf die Funktionalität von Membranproteinen in kationischen Proteoliposomes vor der Fusion, vor allem in niedrigen Ionenstärke ausüben, aber dieser Effekt ist reversibel und mildere durch eine natürliche lipidzusammensetzung der Post-fusion Membran und seine Rückkehr zum normalen Ionenstärke Medium.

Protocol

1. Vorbereitung des Fusogenic SUV und LUV

  1. Vorbereitung der Fusogenic Lipid-Mischung
    1. Vorbereiten der Stammlösungen der neutralen, kationischen anionischen und fluoreszierende Lipide in Chloroform bei 25-50 mg/mL (z. B. neutrale DOPC (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), kationischen Ethyl-PC (1,2- Dimyristoleoyl-sn-Glycero-3-Ethylphosphocholine), anionischen POPA (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphate), und fluoreszierende Cholesteryl-Bodipy-FL12, beziehungsweise) durch entsprechende Mengen an trockenen Lipide wiegen und in 100 % Auflösung Chloroform (Achtung!) Hierzu unter einem Abzug), oder verdünnen handelsübliches Chloroform Bestände der Lipide mit Chloroform.
      Hinweis: Sowohl natürliche Lipid-Extrakte und rein synthetische Lipide eingesetzt werden und zeigen ähnliche Ergebnisse.
    2. Eine kationische Mix 2,5 mg und 2,5 mg ein neutrales Lipid vorrätig Chloroform (1.1.1) in einer Glasflasche.
      Hinweis: Dieser Schritt ergibt 5 mg des kationischen Lipid-Gemisches in Chloroform, mit 50 % Gewichtsanteil der kationischen Lipide. Bei Bedarf fügen Sie 0,5 % Gewichtsanteil von fluoreszierenden Lipid auf die Mischung.
    3. Mischen Sie 1 mg anionischen und 4 mg von neutralen Lipiden in Chloroform Aktien (1.1.1) in einer Glasflasche. Dadurch werden 5 mg anionischen Lipid-Gemisch mit 20 % Gewichtsanteil von anionischen Lipiden.
    4. Verdunsten Sie Chloroform unter dem Strahl des Stickstoff bilden eine dünne Schicht trocken Lipid.
    5. Entfernen Sie die restlichen Chloroform unter Vakuum für 10 min.
      Hinweis: Traditionell dieser Schritt dauert viel länger (1-12 h), aber wir fanden, dass eine längere Behandlung keine offensichtlichen Verbesserung der Kupplung Eigenschaften des SUV bietet.
    6. Hydrat trockene Lipid-Film indem jedes Fläschchen 0,5 mL Puffer A (100 mM KCl, 1 mM MgCl2, 50 mM MOPS, pH 7,4) hinzufügen und so dass sie bei Raumtemperatur für 30 min und dann Wirbel stehen, bis der Lipid-Film völlig losgelöst von der Glasoberfläche und b ist Jelka eine homogene Lipid-Suspension. Dies dauert über 20-40 s.
  2. Bildung von SUV und LUV durch extrusion
    1. Montieren Sie eine Extrusion Systems (siehe Tabelle der Materialien) mit zwei 1 mL Spritzen mit einem Polycarbonat-Filter mit einer der folgenden pore Größen: 100 oder 200 nm zu bilden SUV und 400 oder 800 nm bis Form LUV.
    2. Übertragen Sie die Lipid-Suspension in eine Spritze.
    3. Extrudieren Sie die Aussetzung, indem man es durch den Filter 21mal, wie an anderer Stelle18,19gezeigt.
      Hinweis: Eine ungerade Anzahl von Passagen wird benötigt zur Übertragung in die Vesikel-Lösung von großen Lipid Klumpen klebte an der Filter zugewandten die ursprüngliche Lipid-Aussetzung zu minimieren.
    4. Übertragen Sie Vesikel-Lösung in 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen.

2. Zustandekommen des Fusogenic GUV durch invertierte Emulsion Methode

Hinweis: Dieses Verfahren ist in Abbildung 2dargestellt.

  1. Vorbereitung der Lipid-in-Öl-Lösung
    1. Mischen Sie einen Chloroform bestand (siehe Schritt 1.1.1) ein neutrales Lipid (2 mg) und einem anionischen Lipid (0,5 mg) mit 1 mL Hexadecan in 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch.
    2. Verdunsten Sie Chloroform aus der Mischung unter Konstanten mischen und Erhitzen auf 80 ° C für 30 min die Röhre offen zu halten. Das Röhrchen verschließen und auf Raumtemperatur abkühlen lassen.
  2. Bildung von einer Lipid monomolekularen Film an der Schnittstelle von Lipid-in-Öl/wässrigen Puffer
    1. Platz 200 µL der Lipid-in-Öl-Lösung auf 0,5 mL Puffer B (20 mM KCl, MgCl2, 0, 1 mM 10 mM MOPS pH-Wert 7,4) in einer 1,5 mL Zentrifugenröhrchen. Beachten Sie die konvexe Form der Phase Trennung Grenze aufgrund der Oberflächenspannung Missverhältnis zwischen dem Öl und der wässrigen Puffer (Abbildung 2A).
    2. Warten Sie, bis die Phase Trennung Grenze das ist bezeichnend für Lipid Monolage Bildung drauf flacht. Dies dauert in der Regel 30-60 min bei Raumtemperatur.
  3. Vorbereitung einer Wasser-in-Öl-Emulsion
    1. Bereiten Sie eine Lösung für eine wasserlösliche nichtionischen Polysaccharid in Puffer B, mit einer höheren Dichte als Dichte des Wassers (z. B. 15 % Ficoll-400 (w/V), mit Dichte 1,05 g/mL)
      Hinweis: Optional kann eine fluoreszierende wasserlösliche Farbstoffe der Puffer zur besseren Visualisierung der GUV und jede andere gewünschte wässrigen Inhalt die GUVs hinzufügen.
    2. 2.1.2 übertragen Sie 0,5 µL der obigen Mischung zu einem separaten 1,5 mL Zentrifugenröhrchen mit 100 µL der Lipid-in-Öl-Lösung.
    3. Beschallen (44 kHz bei 14 W) die Mischung für 30 s in ein Ultraschall-Wasserbad. Dann kräftig Vortexen 45 min um eine Wasser-in-Öl-Emulsion bilden wo jedes Tröpfchen durch ein Lipid-Monolayer (Abb. 2 b) beschichtet werden.
  4. Umwandlung von Wasser-in-Öl-Emulsion in GUV
    1. Legen Sie die resultierende Emulsion auf die Lipid-in-Öl/wässrigen Schnittstelle, und sofort Zentrifugieren Sie das Rohr in eine Tischplatte Zentrifuge bei 10.000 x g 2 min. lang. Die daraus resultierende Pellet der GUV sollte deutlich sichtbar (Abbildung 2).
    2. Cool das Rohr auf 4 ° C im Kühlschrank, die Lipid-in-Öl-Gemisch zu festigen (Abb. 2D, Hexadecan erstarrt unter 18 ° C), gefrorene Öl vorsichtig entfernen, und dann zurückziehen die wässrige Phase.
      Hinweis: Um Öl zu erleichtern wurde Entfernung Einfrieren ein Draht in der Form eines Ankers gebogen verwendet.
    3. Die GUV Pellet in 50 µL frische Puffer B, Transfer zu einem frischen Schlauch aufzuwirbeln und unter dem Fluoreszenzmikroskop mit einem 100 X Öl Immersion Ziel (Abb. 2E) untersuchen.

3. Überwachung Vesicle Fusion mit Kobalt-Calcein Methode

  1. Vorbereitung einer Gel-Filtration-Schwerkraft-Spalte.
    1. ~ 10 g eines Harzes Gel-Filtration (z.B. superfine Sephadex G50) in 100 mL entionisiertem Wasser einweichen und über Nacht Quellen lassen.
    2. 3 mL des Harzes in einer Einweg-Kunststoff-Schwerkraft fließen Spalte packen, waschen Sie es mit Reinstwasser und equilibrate mit Puffer C (100 mM KCl, 10 mM MOPS, pH 7,4) bei Raumtemperatur.
  2. Vorbereitung von+ Geländewagen oder SUV0 geladen mit Kobalt-Calcein.
    1. Bereiten Sie eine Lösung mit 1 mM Calcein, 1 mM CoCl2, 98 mM NaCl, 10 mM MOPS, dann bringen Sie pH auf 7,4.
      Hinweis: Das Wesen der Methode ist, dass freie fluoreszierende Calcein nicht fluoreszierenden Komplex mit Co2 +bildet. Es wird wieder nach Zugabe von EDTA, welche mit fluoreszierenden höherer Affinität für Co2 +, verdrängt Calcein vom Kobalt-Calcein Komplex (Abb. 3A).
    2. Einen trockenen Film von kationischen oder neutralen Lipiden wie in 1.1 beschrieben fügen Sie 500 µL dieser Lösung hinzu.
    3. Bereiten Sie 100 nm SUV durch Extrusion wie unter 1.2 beschrieben.
    4. Pellet-extrudierte SUV bei 1.000.000 x g für 20 min in eine Tischplatte Ultrazentrifugen und in 1 mL des Puffers Caufzuwirbeln. Wiederholen Sie Pelletierung und Wiederfreisetzung dreimal; Verwenden Sie 0,6 mL Puffer C für die letzten Wiederfreisetzung.
      Hinweis: Diese Schritte entfernt die meisten externen Kobalt-Calcein.
    5. Entfernen Sie die restlichen externen Kobalt-Calcein indem man SUV durch eine Einweg-Schwerkraft-Flow-Spalte mit dem Gel-Filtration-Harz, equilibriert mit Puffer C beschriebenen Schritt 3.1.2 geladen.
      Hinweis: Wir in der Regel die ersten Milliliter Band der durchströmten verwerfen und sammeln die zweite Milliliter, enthält externe Kobalt-Calcein kostenlos SUV.
  3. Vorbereitung der SUV– geladen mit EDTA
    1. Lösung von 10 mM EDTA, 80 mM NaCl, 10 mM MOPS, pH 7.4 vorbereiten.
    2. Einen trockenen Film von anionischen Lipiden wie in 1.1 beschrieben fügen Sie 500 µL dieser Lösung hinzu.
    3. Bereiten Sie SUV– durch Extrusion wie unter 1.2 beschrieben.
    4. Pellet und Aufschwemmen SUV– , wie in 3.2.4 beschrieben.
    5. Entfernen Sie die restlichen EDTA indem man SUV– durch die Gel-Filtration-Spalte wie in 3.2.5 beschrieben.
  4. SUV vorbereiten für fusion
    1. Verdünnen Sie SUV0,+Geländewagen und SUV– mit Puffer D (1 mM MOPS, pH 7,4) ergänzt mit 0,2 mM CoCl2 und die gewünschte Konzentration von KCl. Verwendung 5 µL jeder Art von SUV pro 1 mL Puffer D.
    2. Inkubieren Sie die Mischung für mindestens 1 h.
      Hinweis: Dieser Schritt wird minimiert die Hintergrundkonzentration Fluoreszenz durch die Blockierung von Calcein, die Oberfläche SUV+gebunden ist.
  5. Vesicle fusion
    1. Starten Sie Fusionsreaktion durch das Mischen von 1 mL+ Geländewagen oder SUV0 mit 1 mL SUV− (verdünnt im Puffer D wie oben beschrieben) in einem 2-mL-Fluorimeter Küvette und Erhöhung der Fluoreszenz von Calcein mit 480 nm Anregung und 510 nm Emission monitor (Abb. 3 b).
    2. Warten Sie, bis die Reaktion zum Abschluss kommt.
    3. Fügen Sie eine Mischung aus Spülmittel Triton x-100 und EDTA (0,05 % Endkonzentration und 7 mM bzw.) Calcein aus Vesikeln und das maximale Fluoreszenzsignal zu erhalten.
    4. Bestimmen Sie den Umfang der Fusion definiert als prozentualer Anteil der maximale Fluoreszenzsignal nach dem Waschmittel hinzufügen, wie in Abbildung 3dargestellt.

4. schnelle Wiederherstellung von Membranproteinen in Fusogenic Proteoliposomes

Hinweis: Dieses Verfahren ist in Abbildung 4Adargestellt.

  1. Bereiten Sie eine Schwerkraft fließen Spalte mit dem Gel-Filtration-Harz wie unter 3.1 beschrieben, und equilibrate es mit Puffer A bei Raumtemperatur.
    Hinweis: Alle weiteren Manipulationen müssen streng auf ≤ 4 ° C, durchgeführt werden, sofern nicht anders angegeben, um Verlust der proteinaktivität zu minimieren.
  2. Einstellen Sie Konzentration des gereinigten Membran Proteins bis 0,7 mg/mL durch Verdünnen es mit dem gleichen Extraktionspuffer verwendet für Protein isoliert.
  3. Mix-140 µL des Proteins mit 300 µL der vorgeformten SUV, 160 µL Puffer A und 60 µL 10 % Cholate in Puffer A; Dies gibt 01:30 Protein: Lipid-Gewichts-Verhältnis in einem 660 µL Endvolumen.
  4. Schütteln Sie die Mischung auf einer rockigen Plattform für 15 Minuten.
    Hinweis: Die folgenden Schritte können bei Raumtemperatur erfolgen.
  5. Die Mischung durch Gel-Filtration Harz übergeben, und trübe Brüche mit Proteoliposomes zu sammeln.
  6. Pellet-Proteoliposomes mit einer Tischplatte Ultrazentrifugen 400.000 x g für 15 Minuten.
  7. Verwerfen des Überstands enthält nicht rekonstituiert Protein und Aufschwemmen das Pellet in 1 mL frische Puffer A.
  8. Bestimmen Sie den Proteingehalt in PL und der Überstand mit Amido Black Methode20.
  9. Bestimmen Sie den Ertrag der Rekonstitution, das ist in der Regel rund 50-70 %.
    Hinweis: Schritte 4,6-4,8 können optional ersetzt werden, indem man PL Lösung durch 1 mL Ni-NTA-Harz in einer Einweg-Schwerkraft-Spalte verpackt und mit Puffer A gewaschen, wie unter 3.1.2 beschrieben. Diese Weitergabe wird nicht rekonstituiert Protein trennen, die bevorzugt an das Harz gebunden sein wird, von PL, wovon in der durchströmten sein werden.

5. Funktionsprüfungen der Proteinaktivität in Proteoliposomes

Hinweis: Beide Proteine, die in dieser Studie verwendeten sind leistungsstarke Protonenpumpen, die H+ in Proteoliposomes bei Zugabe von ihrer Substrate zu Pumpen (Coenzym Q1 für Bo3-Oxidase und ATP für F1Fo, beziehungsweise), damit Gebäude ein Proton Gradienten durch die Membran (ΔpH). Im Falle einer erfolgreichen Co Rekonstitution von Fusion kann solche Versauerung als eine Abnahme der Fluoreszenz eines pH-Sensitive Sonde ACMA (9-Amino-6-Chloro-2-Methoxyacridine)12,15, beobachtet werden, die routinemäßig, für solche Aufgaben verwendet wird ( Abbildung 4 b -C). Zusätzlich Substrat-spezifische Aktivität der Proteine (Coenzym Q1 Oxidation durch Bo3-Oxidase22 und ATP Hydrolyse durch F1Fo23,24) können überwacht werden spektralphotometrisch mittels verschiedener Methoden. Hier zeigen wir ATP Hydrolyse Aktivität der F1Fo PL mit einer ATP regeneriert Assay (Abbildung 4), wo zwei Enzyme (Pyruvat-Kinase (PK) und Laktat-Dehydrogenase (LDH) pflegen Sie wie folgt eine Konstante Konzentration von ATP. PK recycelt ATP von ADP produziert von F1Fo wieder in ATP auf Kosten seiner Substrat Phosphoenolpyruvat (PEP) konvertieren. Pyruvat, die ein Produkt dieser Reaktion, in Laktat umgewandelt wird, von LDH auf Kosten von NADH, die Oxidation von denen lässt sich vermindernden optische Dichte bei 340 nm.

  1. Vorbereitung von Chemikalien
    1. Bereiten Sie 1 mM ACMA Lager in Ethanol.
    2. Bereiten Sie einen 1 mM bestand von Nigericin (oder andere Entkuppler) in Ethanol.
    3. 25 mM Coenzym Q1 Lager in Ethanol und 1 M DVB-t-Aktie im Puffer A. vorbereiten
    4. Bereiten Sie einen Bestand von 100 mM ATP in Puffer A und stellen Sie den pH-Wert auf 7,4.
    5. Bereiten Sie Vorräte an ATP regeneriert Systemkomponenten im Puffer A: 100 mM PEP, 1 mM NADH und Lösungen von PK und LDH in Konzentration von ca. 500-1.000 Einheiten/mL.
  2. Coenzym Q1 Oxidation-driven Proton durch Bo3Pumpen-Oxidase PL
    1. Ein Fluorimeter Küvette mit 2 mL Puffer A in Gegenwart von 0,5 µM ACMA 20 µL PL hinzu, und warten Sie, bis stabiles Signal mit 430 nm Anregung und 515 nm Emission.
    2. Die Küvette 40 µM Coenzym Q1 hinzufügen.
    3. Proton Pumpen durch Zugabe von 2 mM DTT, PL (Abbildung 4 b) zu initiieren.
      Hinweis: DVB-t reduziert oxidierte Coenzym Q1 und stellt es zur Verfügung Bo3-Oxidase.
    4. Zerstreuen Sie gebildeten ΔpH durch Zugabe von 2 µM Entkuppler (z. B. Nigericin). ACMA Fluoreszenzsignal sollte schnell auf fast das ursprüngliche Niveau zurückkehren.
      Hinweis: Es sollte keine ACMA abschrecken nach Zugabe des Substrates, wenn die Entkuppler zunächst in das Reaktionsgemisch vorhanden ist.
  3. ATP Hydrolyse angetriebenen Proton Pumpen von F1FoPL
    1. Fügen Sie 40 µL PL zu einem Fluorimeter Küvette wie unter 5.2 beschrieben hinzu.
    2. Initiieren Sie, Proton Pumpen durch Zugabe von 0,2 mM ATP, PL (Abbildung 4).
    3. ΔpH zu zerstreuen, wie in 5.2.4 beschrieben.
  4. ATP-Hydrolyse durch F1FoPL und seine Stimulation durch die Entkuppler
    1. 40 µL PL, ein Spektrofotometer Küvetten mit 2 mL Puffer A, mit 1 mM ATP, 0,2 mM NADH, PEP, 2 mM und 15 µL PK und LDH hinzufügen.
    2. Folgen Sie die Reaktion durch Messung der Extinktion Abnahme von NADH bei 340 nm. ca. 3-4 min später hinzufügen 2 µM Entkuppler auf die Küvette den Gegendruck des ΔpH auf der ATP-Hydrolyse zu veröffentlichen. Die Reaktionsgeschwindigkeit sollte sofort erhöhen.
      Hinweis: PL Ni-NTA Harz siehe 4.10 durchlaufen zeigen die stärkste Stimulierung durch die Entkuppler (Abbildung 4, rote Spur), während das Eluat wird kaum stimuliert (blaue Spur).

6. Prüfung eine Beeinflussung der Lipid-Umwelt und Ionenstärke Funktionalität von Membranproteinen in Fusogenic Proteoliposomes

  1. Bewerten, Proton Pumpen von 40 µL PL+, PL– und PL0 mit ACMA abschrecken Assay in 2 mL Puffer D ergänzt mit 1 mM MgCl2 und 20 (Abbildung 5, zentrale A) oder 100 mM KCl (Gruppe B) wie unter 5.2 oder 5.3 (Abbildung 5 rot, schwarz und blau Spuren).
  2. Sicherung 40 µL PL+ mit gleichen Volumen von LUV– in 2 mL des Puffers D mit 20 mM KCl und Test für ACMA abschrecken (grüne Spur) ergänzt.
  3. Führen Sie Experimente wie in Schritt2 durch Mischen, z. B. PL und SUV die gleiche Ladung (graue Spur).
    Hinweis: Proton Pumpen sollten durch postfusion pl verbessert werden

7. Lieferung von Membranproteinen in LUV und GUV durch Fusogenic Proteoliposomes

  1. Sicherung von 50 µL PL+ mit 50 µL von 800 nm LUV– in 1 mL des Puffers D ergänzt mit 1 mM MgCl2und 20 mM KCl für 5 Minuten.
  2. Pellet-Vesikel bei 6.000 x g für 5 min, und entsorgen Sie überstand enthaltenden nicht umgesetztes PL+. Das Pellet in 1 mL des Puffers D ergänzt mit 1 mM MgCl2 und 100 mM KCl aufschwemmen und Pelletierung und resuspending zweimal mehr wiederholen.
  3. Führen Sie ACMA Assay abschrecken, wie in 5.2 oder 5.4 beschrieben aus.
  4. Führen Sie Experimente, wie in den Schritten 1-3, mit Kombinationen von ergänzenden geladenen Vesikel in hohen Salz (200 mM KCl), nicht Fusogenic Vesikel und nur leere LUV– ohne PL+.
    Hinweis: Proton Pumpen durch Postfusion LUV sollte erkannt werden nur ergänzend geladenen Vesikel verwendet wurden, wie in Abbildung 6dargestellt.

8. Montage der Elektronentransport-Kette aus Einzelkomponenten in Membranen von LUV und GUV und ATP-Produktion von dieser Kette.

Hinweis: Eine schematische Darstellung dieser Verfahren ist in Abbildung 7Adargestellt. ATP produziert in diesem Experiment wird durch das Luciferin-Luciferase-System registriert werden, wo Umwandlung von synthetisiert ATP zu AMP und Pyrophosphat durch Luciferase von Lichtemission bei einem Luminometer registriert gefolgt. Wir empfehlen die Verwendung einer einzigen Röhre Luminometer statt unempfindlicher Mikrotestplatte Luminometer.

  1. Mix 3 µL Bo3-Oxidase PL+ und 5 µL F1Fo PL+ gebildet, wie in Abschnitt 4 beschrieben.
  2. Verschmelzen sie mit 3 µL LUV oder GUV– (gebildet wie in Abschnitt 2 beschrieben) in 800 µL Puffer D mit 20 mM KCl und 1 mM MgCl2 für 5 min ergänzt.
  3. Mit hoher Konzentration Lager, KCl und MOPS fügen Sie 100 mM und 50 mM Endkonzentration in die postfusion Membranen hinzu.
    Hinweis: Bei Post-fusion LUV, diesen Schritt wird verhindert, dass die Schwellung durch osmotische Versatz zwischen der externen (Puffer A) und intravesicular (Puffer D) Salze Konzentration.
    1. Optional, pellet postfusion Membranen wie unter 7.2 nicht umgesetztes SUV+zu trennen, und das Pellet in 800 µL Puffer A. Aufschwemmen
  4. Bereiten Sie ein Luciferin-Luciferase-ADP cocktail mit 400 µM ADP, 50 µM Luciferin und 2,5 µg Luciferase in Puffer A 200 µL
  5. Fügen Sie den Cocktail in der postfusion Mischung aus Step8.3.
  6. Hinzufügen von 40 µM oxidierte Coenzym Q1und auslösen Bestromung der postfusion Membranen von Bo3-Oxidase durch Zugabe von 2 mM DTT. 1 min. warten.
  7. Initiieren Sie ATP-Synthese zu, indem Sie erregt Vesikel 5 mM Kalium Phosphat (KPich, pH 7,4) hinzufügen und erkennen Sie ATP-Produktion mit einem Luminometer (Abb. 7 b) zu. Laufen Sie die Reaktion für ~ 3 min.
    Hinweis: ATP Synthese Reaktion verläuft für 5-7 min bis Erschöpfung der Sauerstoff verbraucht durch Bo3-Oxidase und Luciferase.
  8. Das Reaktionsgemisch zweimal ATP Referenzstandard (0,5 Nmol ATP) hinzufügen. Maßnahme ATP produziert.
  9. Erhalten Sie die tatsächliche Menge von ATP in der Reaktion produziert, indem man das Signal vom ATP Synthese Reaktion durch die ATP-Referenz-standard-Signal. Passen Sie diesen Wert auf den Gesamtbetrag der F1Fo in der Reaktion verwendet, und schließlich ausdrücklich die Rate der ATP-Synthese in µmol ATP / (mg F1Fo* min).

Representative Results

Die Verwendung von Fusogenic ergänzende aufgeladenen Proteoliposomes für schnell Reinigungsmittel-freie Lieferung von Membranproteinen ins Ziel Bilayer Membranen umfasst drei Schritte (Abbildung 1): A, Bildung von Fusogenic SUV von Lipid-Mischungen mit hohem Inhalt der geladenen Lipide; Diese SUV kann optional eine intravesicular Last zu tragen; B, Umrechnung von Fusogenic SUV mit unserem schnellen Membrane Protein Rekonstitution PL; C, Verschmelzung von Fusogenic PL mit Ziel Bilayer in einem Niedrig-Salz-Medium, gefolgt von hohen Salzzusatz, die Fusionsreaktion zu stoppen. Im Falle einer großen Bläschen (D), ist eine vorzuziehene Strategie, Membranprotein in den anionischen Ziel Bilayer zu liefern, die eine bessere Lipid-Umgebung für Aktivität von Membranproteinen bietet (diskutiert weiter im Text).

Das GUV-Bildung-Protokoll mit invertierten Emulsion Methode wird ausführlich in Abbildung 2hervorgehoben. Wir bevorzugen Hexadecan in der Lipid-Ölmischung aufgrund seiner relativ hohen Gefriertemperatur (18 ° C), die einfache Entfernung des erstarrten Öl nach GUV ermöglicht Pelletierung.

Abbildung 3 zeigt die Fusion der Vesikel mit Kobalt-Calcein-EDTA-Methode. Fusion gilt nur, wenn ergänzende geladenen Vesikel in niedrigen Salz Puffern, während höhere Salzkonzentrationen verwendet werden (> 50 mM14) oder die Verwendung von nicht-Fusogenic Vesikeln zeigen keine Fusion.

Dieses schnelle Protokoll der Rekonstitution von Membranproteinen in Fusogenic SUV ist in Abbildung 4Adargestellt. Unter Verwendung dieses Protokolls, demonstrieren wir schnelle Wiederherstellung des primären Proton Pumpe Bo3-Oxidase und F1Fo ATP-Synthase in PL und Bewertung ihrer spezifischen Tätigkeit in diesen Membranen. Es ist wichtig zu erwähnen, dass die Ausbeute an Protein Rekonstitution nicht von der Ladung eines Lipid verwendet15 hängt und etwa 50-75 ist %25,12, und dass nach der Rekonstitution in PL, das Protein mindestens drei gespeichert werden kann Tage, sogar bei Raumtemperatur ohne offensichtlichen Verlust der proteinaktivität. Diese Prozedur liefert auch unidirektional Ausrichtung der ATP-Synthase, wo mehr als 95 % davon seine hydrophile Glyko-F1 orientierte nach außen15,26 hat.

Abbildung 5 zeigt, dass das Proton Pumpen Aktivität der F1Fo (zentrale A) und Bo3-Oxidase (Gruppe B) in kationischen Lipide ist reduziert und empfindlich auf niedrige Ionenstärke, verglichen mit anionischen und neutral Lipid-Umgebung, aber Dieser Effekt wird in postfusion Membranen nach Verschmelzung PL+ mit anionischen LUV–gemildert.

Abbildung 6 zeigt die Lieferung von F-1F-o -ATP-Synthase in Membranen der große Vesikel. In diesem Experiment, PL+ und 800 nm LUV– wurden in 20 mM KCl für 5 min und das Reaktionsprodukt verschmolzen war entfernen fusionierter PL+oelletiert, Nukleinsäuretablette und für das Pumpen von Proton untersucht. Control-Experimente zeigten keine Protonen-Pumpen, wenn LUV0 stattdessen Luv– verwendet wurden in Fusionsreaktion (schwarze Spur), oder leere LUV– allein waren vermutlich (blaue Spur).

Schnelle Montage einer funktionierenden Elektronentransport-Kette in Membranen der große Vesikel durch Fusogenic PL ist in Abbildung 7dargestellt. Wir verwendeten F1Fo SUV+ und Bo3 SUV+ für Fusion mit 800 nm LUV-, und demonstrierte ATP-Produktion von dieser Kette in der postfusion Vesikel indem sequenziell Coenzym Q1 und DVB-t zur Energetisierung Membranen und dann hinzufügen Phosphat ATP-Synthese von F1Foauslösen.

Figure 1
Abbildung 1: Konzeption der ultraschnellen Waschmittel-freie Lieferung von Membranproteinen ins Ziel Lipid Bilayer über Fusion von Vesikeln Unilamellar gebildet von ergänzenden geladenen Lipiden. (A) Bildung von anionischen und kationischen Fusogenic kleine Unilamellar Vesikel (+SUV, SUV-–) optional mit intravesicular Ladungen geladen. (B) Umwandlung von Fusogenic SUV in Fusogenic Proteoliposomes (PL) nach Rekonstitution von Membranproteinen. (C) Waschmittel-freie Lieferung von Membranproteinen in postfusion Membranen mit Fusogenic PL. (D) vorzuziehen Strategie für die Lieferung von Membranproteinen in Membranen von großen Vesikeln, illustriert durch die Fusion zwischen 100 nm PL+ und 800 nm LUV–. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: GUV-Bildung-Protokoll mit einer invertierten Emulsion. (A) Bildung von einem Lipid Monolage auf der Grenze zwischen Wasser und Öl-Lipid-Mischung. (B) Bildung einer invertierten Emulsion (Wasser-in-Öl). (C) GUV-Bildung durch die Übergabe der Emulsion durch die Öl-Wasser-Grenze mittels Zentrifugation. (D) Kühlung des Rohres unten < 18 ° C zu festigen und das Öl zu entfernen. (E) ein Fluoreszenz-Mikroskopie Bild einer GUV mit fluoreszierenden Lipid (1 % Gewicht Bruchteil Cholesteryl-Bodipy-FL12) in seine Membran (grün) und eine polare Fluorophor (1 mM Sulforhodamine 101) in die Vesikel Lumen (rot). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3: Lipid Vesicles Fusion mit der Kobalt-Calcein-EDTA-Methode untersucht. (A) schematische Darstellung der Methode, wo freie Calcein aus einem nicht-fluoreszierende Kobalt-Calcein-Komplex von EDTA freigegeben wird. (B) Fusion der SUV in verschiedenen KCl-Konzentration. (C) Freisetzung von intravesicular Calcein durch Zugabe von EDTA und Triton x-100 Reinigungsmittel zu postfusion Vesikel in B gezeigt, wie im Text beschrieben. Fusion-Umfang (%) für rote Spur errechnet sich durch Division der maximalen Hintergrund korrigiert Fusion-Signal (1-2) durch das Hintergrund-korrigierte maximale Signal nach der Veröffentlichung des gekapselten Calcein (3-2) und mit 100 multipliziert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4: Ultraschnelle Rekonstitution von Bo3-Oxidase und F1Fo in Fusogenic Proteoliposomes und Protein Aktivität Messungen in solchen Proteoliposomes. (A) schematische Darstellung der Rekonstitution Protokoll. (B) Coenzym Q1 Oxidation getrieben Proton Pumpen von Bo3-Oxidase in PL gemessen mit ACMA abschrecken (Erklärung im Text). (C) ATP Hydrolyse angetriebenen Proton Pumpen von F1Fo in PL gemessen mit ACMA abschrecken (Erklärung im Text). (D) ATP Hydrolyse durch F1Fo in PL mit ATP-Regeneration-System (Erklärung im Text) und seine Stimulation durch die Entkuppler gemessen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 5
Abbildung 5: Einfluss der Lipid-Umwelt und der Ionenstärke auf die Aktivität von Membranproteinen. Protonen-Pumpen von F1Fo (A) und Bo3-Oxidase (B) im kationischen PL (rote Spur), anionische PL (blaue Spur), neutrale PL (schwarze Spur) und kationischen PL verschmolzen mit anionischen LUV (grüne Spur) in 20 bis 100 mM KCl. Control Spur ( Gray) zeigt keine Veränderung der Proton Pumpen von F1Fo PL– beim Mischen mit SUV–. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 6
Abbildung 6: Lieferung von F1Fo ATP-Synthase in Membranen von 800 nm LUV– über Fusion mit PL+. (A) schematische Darstellung des Experiments: PL+ und 800 nm LUV– in 1 mM MOPS (pH-Wert 7,4), 1 mM MgCl2, 20 mM KCl für 5 min, um zu entfernen pelleted verschmolzen wurden fusionierter PL und Nukleinsäuretablette in den gleichen Puffer. (B) Proton Pumpen von postfusion LUV (rote Spur). Control-Experimente zeigten keine ACMA abschrecken, wenn PL0 wurden mit LUV– (schwarze Spur), gemischt oder leere LUV– allein waren vermutlich (blaue Spur). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 7
Abbildung 7: 5-min Waschmittel-freie Montage einer Elektronentransport-Kette in den Membranen von 800 nm LUV– über Fusion mit PL+. (A) schematische Darstellung des Experiments: 100 nm F1Fo PL+ und 100 nm Bo3-Oxidase PL+ wurden fusioniert mit LUV-, wie in Abbildung 6beschrieben. Fusion wurde durch Hinzufügen von KCl und MOPS zu 100 und 50 mM bzw. gestoppt. Die Membranen wurden mit ADP-Luciferin-Luciferase Cocktail vermischt und unter Spannung durch Zugabe von DVB-t und Q1, wie im Text beschrieben. ATP-Produktion wurde durch Zugabe von 1 mM Phosphat (Pich) und überwachten Echtzeit mit Luciferase-Luciferin-System wie im Text beschrieben eingeleitet. (B) ATP Synthese durch postfusion Vesikel (rote Spur). Experimente zeigten keine ATP-Produktion, wenn PL+ mischte mit LUV– in hohen Salz (grau) oder PL0 wurden mit LUV– (schwarz) gemischt. ATP-Synthese-Rate wurde berechnet, wie im Text (Schritte 8,8 8,9) erläutert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Discussion

Im folgenden einige Punkte für den Erfolg dieser experimentellen Ansatz berücksichtigt werden müssen:

Wahl für Proteoliposomes und Ziel Bilayer Lipid kostenlos: Kationische Lipide sind nicht in der Natur gefunden, während anionische Lipide reich an biologischen Membranen erreichen sind, z. B. ~ 25, 35 und 20 % in der inneren Membran von E. Coli, Plasmamembran der Hefe S. Cerevisiaeund inneren mitochondrialen Membranen viele Arten, bzw.27,28,29. Es wäre zu erwarten, dass die Funktionalität von Membranproteinen in PL+ von der Stärke eine positive Ladung der Bilayer betroffen sein könnten, die wiederum auf eine relative Inhalt von kationischen Lipid in der Bilayer und externen Ionischen abhängen würde Stärke. Daher ist es wichtig, experimentell zu adressieren, in welchem Umfang die Ladung der kationischen Lipid Umwelt Funktionalität von Membranproteinen interessant abhängen würde. Hier zeigen wir, dass beide F1Fo ATP-Synthase und Bo3-Oxidase reagieren empfindlich auf kationischen Lipid-Umgebung, aber wir haben zu modulieren und diesen Effekt umzukehren, indem erste Platzierung der Proteine in PL+ und liefern sie in anionischen Bilayer zu akzeptieren, und dann Erhöhung der Ionenstärke des reaktionsmediums nach der Verschmelzung ist fertig.

Auswahl an einem bestimmten kationischen Lipid: Die meisten im Handel erhältlichen kationischen Lipide sind nicht Triacylglyceride Natur; Daher muss ein potenzieller Kandidat Lipid für Kompatibilität mit interessierender Membranproteine getestet werden. Wir fanden bisher15 , die die ATP-Synthase verwendet in dieser Studie zeigte, dass seine beste Leistung in PL+ von Ethyl-PC, gebildet, die die höchste strukturelle Ähnlichkeit mit den natürlichen Triacylglyceride Lipide, während in DOTAP (nicht-Triacylglyceride hat Lipid) PL+ dieses Protein war weniger aktiv.

Vesicle Fusion Assays: Wahre Vesicle Fusion (wenn intravesicular flüssigen Inhalt mischen) muss von Hemi-Fusion Zwischenzustände, unterschieden werden, wenn Vesikel miteinander ohne mischen ihre wässrigen Inhalt halten, aber ohne weiteres Inhalt ihrer externen oder beide Lipid mischen 30Broschüren. Bei suboptimalen Lipid-Mischungen oder bestimmten Bedingungen zeigen Vesikel auch ausgeprägte flüssigen Inhalt Leckage während Fusion31. Minimale Konzentrationen von geladenen Lipide in Fusogenic Mischungen ermöglicht wahre Fusion für jede Art von Lipid experimentell gefunden werden müssen, aber es wird im allgemeinen festgestellt, dass Membranen mit weniger als 10 % in Rechnung gestellt, dass Fette nicht Fusogenic 32gerendert werden.

Während Fusogenic SUV in Anwesenheit von Multi-Valent Ionen bilden, ist es wichtig, entgegengesetzt geladene Komponenten zu mischen, da dies sofort verklumpen und Aggregation von Lipiden durch diese Ionen führen kann. Zum Beispiel während der Vorbereitung SUV für die Kobalt-Calcein-EDTA-Methode, ist es wichtig, zu vermeiden, mischen eine kationischen Lipid-Mischung mit EDTA gegen Verstopfung des Filters Polycarbonat durch aufgehäuften Komponenten.

Es ist auch wichtig zu erwähnen, dass die Kobalt-Calcein-EDTA-Methode, wobei sehr empfindlich und bequem für die Überwachung der Echtzeit-Fusion noch das Ausmaß der Fusion wegen 1 unterschätzen kann) selbst abschrecken der Fluoreszenz des freien Calcein innen Postfusion Vesikel, die erwartet wird, um 1 mM zu erreichen, während die selbst abschrecken Schwelle berichtet wird, soll rund 20 µM33und 2) Oberfläche gebundene Kobalt-Calcein, die an SUV+ gebunden bleibt auch nach dem Durchgang durch das Gel-Filtration-Harz und Vesikel, eine helle orange Farbe, Farben, während SUV0 haben eine blasse orange Farbe. Auch beachten Sie, dass die Freisetzung der gebundenen Kobalt-Calcein bei Zugabe von Waschmittel Triton x-100 im Beisein von EDTA viel stärkere Signale für SUV+ (Abbildung 3, rote Spur) als SUV0 (graue Spur) erzeugt.

Perspektiven: Wir erwarten, dass die schnelle Ansätze, die hier beschriebenen können erheblich erleichtern und Montage von komplexen Membranen für die Bedürfnisse beschleunigen der synthetischen Biologie Anwendungen. Unsere Membrane Protein Rekonstitution Protokoll nimmt nur eine halbe Stunde für Wiederherstellung des fragilen große Membranproteine bekannt empfindlich zu längeren Dialyse-basierte Wiederherstellung Techniken sein, während dieser Fusogenic-Ansatz nur ca. 5-10 min nimmt zu liefern solche Proteine in großen Lipid Bilayer. Hier zeigen wir die Vorteile dieser Ansätze durch die Manipulation von E. Coli F1Fo ATP-Synthase, die ein Beispiel für eine zerbrechliche Protein ist. Es besteht aus 23 Untereinheiten und bekannt, um seine Integrität leicht verlieren, wenn suboptimalen Bedingungen (z. B. Wärme) während/nach der Solubilisierung ausgesetzt, aber in diesen Verfahren verwendet wird, zeigt das Protein reproduzierbar hohen Aktivität in Protonen Pumpen.

Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

Autoren sind dankbar für Robert Gennis von University of Illinois und Christoph von Ballmoos Universität Bern für die Bereitstellung ein Plasmid und eine Belastung, Bo3auszudrücken-Oxidase. Das Projekt wurde unterstützt durch BBSRC BB/L01985X/1 gewähren, R.I. und r.b.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DOPC neutral lipid Avanti Lipids 850375
POPA anionic lipid Avanti Lipids 840857
E-PC cationic lipid Avanti Lipids 890704
Cholesteryl-Bodipy-FL12 Thermofisher C3927MP
Sephadex G-50, Super Fine Sigma G5050
Ficoll 400, Type 400-DL Sigma F8016
ACMA Sigma A5806
Nigericin Sigma N7143
ATP Sigma A26209
Q1 Sigma C7956
DTT Sigma D0632
PEP Sigma 860077
NADH Sigma N8129
PK Sigma P9136-1KU
LDH Sigma L1254-1KU
Luciferin Sigma L6882
Luciferase Sigma/Roche 10411523001
Calcein Insight Biotechnology sc-202090
CoCl2 Sigma C8661
EDTA Sigma E6758
Sulforhodamine 101 Sigma S7635
Extrusion system Avanti Extruder
Single tube luminometer, model Sirius L Titertek Berthold
Polycarbonate filter, D19 mm Sigma, Whatman NucleporeTrack-Etched Membranes WHA800309, WHA800284 100 or 200 nm to form SUV, and 400 or 800 nm for LUV
Name Company Catalog Number Comments
Buffers used in the paper
Buffer A 100 mM KCl, 50 mM MOPS pH 7.4, 1 mM MgCl2
Buffer B 20 mM KCl, 10 mM MOPS pH 7.4, 0.1 mM MgCl2
Buffer C 100 mM KCl, 10 mM MOPS pH 7.4
Buffer D 1 mM MOPS pH 7.4
Various concentrations of KCl

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