Summary
فهم التعديلات تشكيل وممكن المينا يتطلب دراسة النشاط أميلوبلاست. وهنا يصف لنا طريقة موثوقة ومتسقة للصغير-تشريح المينا الأجهزة التي تحتوي على أميلوبلاستس إفراز ومرحلة النضج التي يمكن استخدامها لمزيد من الإجراءات التجريبية الكمية والنوعية.
Abstract
المينا العيوب الناتجة عن الظروف البيئية وسبل الحياة من شواغل الصحة العامة بسبب انتشارها عالية. هذه العيوب نتيجة لتغير نشاط الخلايا المسؤولة عن توليف المينا المسمى أميلوبلاستس، الذي يقدم في هيئة المينا. أثناء أميلوجينيسيس، اتبع أميلوبلاستس تسلسل محددة ودقيقة للأحداث من الانتشار، والتمايز، والموت. فأر باستمرار تزايد القواطع نموذج تجريبي مناسب لدراسة مراحل النشاط والتمايز أميلوبلاست في الظروف الفسيولوجية والمرضية. وهنا يصف لنا طريقة موثوقة ومتسقة للصغير-تشريح الجهاز المينا في الفئران المعرضة إلى سميات البيئية. Epithelia الأسنان تشريح الصغيرة تحتوي على أميلوبلاستس إفراز ومرحلة النضج التي يمكن استخدامها للتجارب النوعية، مثل فحوصات إيمونوهيستوتشيميستري والتهجين في الموقع ، فضلا عن التحليلات الكمية مثل RT-قبكر، وتسلسل الحمض النووي الريبي، والنشاف الغربية.
Introduction
عيوب المينا إنمائية كثيرة قد تنجم عن التعرض للسموم البيئية و/أو نمط الحياة غير مناسبة1،2،،من34. توصيف لإفساد الأحداث وجزيئات من أميلوجينيسيس استخدام الإجراء الموصوفة حاليا سيتم الترويج لاستخدام الناتج المينا العيوب كعلامات مبكرة للتعرض سميات عدة، وقد يساعد على إعادة تشكيل تاريخ الصحة من كل مريض خلال فترة ما حول الولادة عند المينا سينثيتيزيد1،2. ويمكن تقسيم توليف المينا أربع مراحل رئيسية اعتماداً على أميلوبلاست النشاط5. الخطوة الأولى تجمع السلائف الخلية وأميلوبلاست ما قبل الانتشار. أثناء الخطوة الثانية، تفرز ameloblasts المتباينة المينا مصفوفة البروتينات (EMPs)، أساسا أميلوجينين واناميلين وأميلوبلاستين، التي تحدد سماكة المينا النهائي. وهكذا، وأي تعطيل لتوليف EMP يؤدي إلى عيوب الكمية من المينا. بعد ترسب سماكة المينا كاملة، تبدأ مرحلة النضج. وخلال هذه المرحلة، يسمح الاباتيت كريستاليتي النمو في العرض وسمك المينا للوصول إلى أعلى نسبة التمعدن، وجدت في أنسجة بيولوجية، مع يصل إلى 96% بالوزن. المينا تحريف الأحداث التي تحدث أثناء مرحلة النضج يؤدي إلى نوعية العيوب. وأخيراً، أميلوبلاستس الدخول في مرحلة نضج بعد، كما دعا تصبغ في القوارض، والخضوع للمبرمج أثناء اندلاع الأسنان مما يجعل عيوب المينا (أن وجدت) لا يمكن إصلاحه ولا رجعة فيها، وبالتالي توفير العيوب المحتملة تسجيل أثر رجعي من وتشدد على أميلوبلاست. في القوارض، يتبع amelogenesis تسلسل الأحداث مع خصوصية التي تنمو بشكل مستمر على القواطع، مما يجعلها نموذجا مناسباً لدراسة العملية العامة ل amelogenesis مماثلة. وهكذا، ينتج أي اضطراب amelogenesis التعديلات المينا النوعية و/أو الكمية، اعتماداً على الإطار الزمني لهذا الحدث تحريف. وبهذا المعني، أظهرت التعرض إلى الديوكسين والرصاص، والصماء المواد الكيميائية (EDCs) مثل جينيستين، bisphenol A (BPA) والفينكلوزولين، توليد المينا هيبومينيراليزيشنز1،2،3 6، ،،من78. وحددت بقع معتمة بيضاء غير متماثلة في القواطع الفئران المعرضة إلى جرعة BPA جرعة منخفضة خلال الفترة الجنينية والشهر الأول بعد الولادة1. هذه العيوب المينا في الفئران، وتلك التي هيبومينيراليزيشن البشرية القاطعة المولى (تفيد)، لها نفس الخصائص السريرية والهيكلية، والكيمياء الحيوية. تفيد علم أمراض مؤخرا وصف مينا أسنان، للذي المسببات لا يزال غير واضح9،10 على الرغم من العديد من العوامل السببية وقد تم الافتراض9،10،11 ،12.
المينا هام آخر هيبومينيراليزيشن أمراض بسبب العوامل البيئية هو طب الأسنان بالفلور (مدافع)، الذي هو نتيجة لامتصاص فلوريد المفرط (> 0.1 مغ/كغ/يوم)13،14. المصدر الرئيسي للفلوريد من مياه الشرب التي يتم استكمالها أو اليورانيوم الطبيعي مع فلوريد. فلوريد هو المنصوص عليها أيضا في كثير من الأحيان لمنع تسوس الأسنان، ولكن جرعة وقائية فقط 50% أقل من واحد السامة (≤0.05 مغ/كغ/يوم). تفيد ومدافع، اثنين من الأمراض المتكررة الناجمة عن التعرض للعوامل البيئية، قد يقدم السمات المشتركة التي تحتاج إلى أن توصف نظراً للتقوية آثار هيبومينيراليزينج من فلوريد جنبا إلى جنب مع سائر سميات مثل يشكل2 أو أموكسيسيلين15.
الصغرى-تشريح فأر المينا الجهاز الذي يحتوي على أميلوبلاستس في التمييز بين مختلف مراحل سوف يساعد على فهم إليه العمل من جزيئات قادرة على تعطيل نشاط أميلوبلاست ويسبب تشوهات المينا تشخيص بعد اندلاع الأسنان. وبعبارة أخرى، وصف التغييرات من المينا الجينات التعبير المينا مصفوفة التكوين وسبب سميات البيئية يسمح إعادة تشكيل تاريخ التعرض للسموم، ويسهل رصد السلامة البيئية للجمهور الصحة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وأبقى على جميع الحيوانات المستخدمة في هذه الدراسة وفقا للمبادئ التوجيهية لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية من الوزارة الفرنسية للزراعة (ألف-75-06-12).
1-الحيوان التعرض إلى سميات
- قبل تنفيذ هذا البروتوكول، الحصول على موافقة المؤسسية اللازمة والتأكد من الامتثال لجميع المبادئ التوجيهية لرعاية الحيوان.
- تطبيق تصميم بروتوكول البحث يسمح الدستور لمختلف المجموعات التجريبية من أجل اختبار تأثير molecule(s) للتحقيق في مرحلة إفراز أميلوبلاست ومرحلة النضج أميلوبلاست. هنا، تم تشكيل أربع مجموعات من ذكور الفئران ويستار تبعاً لتعرضها للفلوريد (NaF) في تركيبة أو لا مع منهاج عمل بيجين (الشكل 1A)2. لاحظ جميع الحيوانات وتشريح اليوم 65 (الشكل 1B).
2-تشريح هيمي-Mandibles من الفئران الكبار
- Euthanize الفئران CO2 خنقاً، اختيارياً تليها قطع الرأس في الرأس منفصلة عن بقية الجسم ب. تعريض الفئران إلى CO2 لمدة 5 دقائق في مربع مخصص16.
- إزالة كل الجلد من الشفاه السفلي باستخدام مشرط #11 من أجل الحصول على الوصول بسهولة إلى القواطع السفلي.
- مع مشرط نفسه، جعل شق بين القواطع السفلي اثنين مع ضغط طفيف والفك السفلي سوف تقسم إلى نصفين.
- قص الزمنية المشتركة الفك السفلي مع مشرط لفصل الفك، وعقد هيمي-الفك السفلي مع ملاقط غرامة.
- قطع الأنسجة الرخوة المحيطة مشرط وإزالة جميع العضلات والاوتار والأربطة باستخدام مكشطة حتى العظم نظيفة تماما.
3-عزل17،القاطعة18
- يحلق بعناية قبالة العظام بوضع الشفرة موازية للمحور الطولاني الرئيسية القاطعة. ابدأ في ريدج عظمى قرب نصائح القاطعة (نهاية الدانية) حتى نهاية القاطعة القرب من حلقة عنق الرحم. وعائدات الحركة شق الدانية باتجاه الأعلى.
- جعل قطع أولى ديستالي إلى حلقة عنق الرحم مع مشرط إزالة جونايون من هيمي-الفك السفلي والسماح باقلاع القاطعة سهولة دون إلحاق الضرر بحلقة عنق الرحم أو في المرحلة الافرازية من أميلوبلاستس (الخط الأحمر في الشكل 2).
- جعل قطع ثاني أدناه الثاني المولى، وإدراج مشرط بين العظم والسطح الآنسي القاطعة. عندما يتم رفع جميع العظام القاعدية، استدارة إلى الخارج القاطعة وخلعه بعناية لتجنب المينا الأنسجة الجهاز تعوق استخدام الملقط غرامة.
4-مايكرو-تشريح الجهاز المينا تحت عدسة مجهر
- قطره 200 ميليلتر العازلة الفوسفات المالحة (PBS 1 X) على القاطعة استخدام ماصة. تأخذ القاطعة مع غرامة ملاقط مع السطح الشفوية التي تواجه. جعل مشرط مارك بين عديم اللون وأجزاء البرتقال من الأنسجة. ويناظر هذا علامة بقعة بيضاء الكامنة التي يمكن ملاحظته بعد ذلك (الشكل 2).
- كشط، مع حفارة أو أداة مماثلة، سطح الخلية من علامة مشرط لنهاية قمي المقابلة لإفراز أميلوبلاستس المرحلة (عديم اللون)، ومن علامة مشرط للحافة القاطعة أميلوبلاستس (برتقالي) مرحلة النضج.
- إزالة الأنسجة 2 مم المقابلة لمرحلة الانتقال، وفي وقت سابق وصف19. لا تقم بفتح القاطعة في أثناء تشريح الجهاز المينا لتفادي التلوث قبل ميسينتشيمي.
- قطع حلقة عنق الرحم يقع فورا في الجزء قمي من القاطعة (الشكل 2) كما هو موضح سابقا20.
- أنه جمع في 10% محلول الفورمالين أو تحلل لإجراء مزيد من التحقيقات (انظر الجدول للمواد).
5-جمع الأنسجة الجهاز المينا المنفصلين عن ذويهم لإجراء مزيد من التحقيقات
- قطره 200 ميليلتر PBS 1 X المخزن المؤقت على القاطعة.
- مع شفرة المبضع #11، بعناية فصل الخلايا الظهارية الأسنان تدريجيا في المخزن المؤقت، كل على حدة لكل مرحلة من المراحل بمساعدة علامة مشرط المقدمة سابقا.
- لخلية الجيش الملكي النيبالي، والبروتينات المستخرجة، وضع الأنسجة في حل تحلل يسمح استخراج البروتينات والكشف (انظر الجدول للمواد).
ملاحظة: إعداد الكشف عالية الجودة بتحول الأنسجة-الحفارة في الأنبوب ومن ثم طحن الخلايا حتى الحصول على خليط متجانس. الخليط جاهز للجيش الملكي النيبالي والبروتين الاستخراج وفقا للإجراء الخاص بالشركة المصنعة، الذي تم وصفه سابقا2،،من817. عادة، نحو 5-10 ميكروغرام المجموع تم الحصول على الكشف و 150 ميكروغرام مجموع البروتينات لكل إعداد. - للتحليل النسيجي، إيمونوهيستوتشيميستري (المدينة)، و في الموقع التهجين (العش)، وضع طبقة الخلية في الفورمالين 10% لح 2، ثم مخزن في 4 درجات مئوية في برنامج تلفزيوني 1 X. الأنسجة يمكن ثم تضمينها في الشمع/البارافين أو الأنسجة OCT للمقاطع المجمدة.
- للاستخراج الشراكة الأورو-متوسطية، تأخذ القاطعة مع ملاقط غرامة. بعد تعرض لفترة قصيرة للهواء (جفاف طفيف)، ستكون بقعة بيضاء مرئية حول الجزء الأوسط من سطح القاطعة، التي تمثل بدء تمعدن المينا الشفوية. يقابل هذا بقعة بيضاء للانتقال/أوائل مرحلة النضج من أميلوبلاستس، حتى استخدامه كمؤشر لاستخراج EMPs21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
المينا العديد من العيوب، مثل طب الأسنان بالفلور12،13، قد تنجم عن الظروف البيئية بسبب امتصاص فلوريد المفرط أو المينا مشابهة لتفيد بسبب التعرض لبعض يشكل1، هيبومينيراليزيشن 7،22. قد تكون هذه العيوب المينا الإنمائية مستنسخة تجريبيا في الفئران (الشكل 1)1،2،7،،من2324. هيمي الفئران-الفك السفلي يتضمن القاطعة واحد يفصل بين الأضراس الثلاثة بفجوة تسمى دياستيما. يحتوي القاطعة المتزايد باستمرار على الأنسجة غضاريف اثنين وعاج تنتجها أودونتوبلاستس والمينا التي تنتجها أميلوبلاستس الموجودة في الجهاز المينا مع الخلايا الظهارية الأخرى (الشكل 2). القاطعة القوارض، على ما يبدو، نموذج مناسب للدراسة في أميلوجينيسيس، كما يتعارض مع الأضراس، فإنه يحتوي على جميع مراحل الانتشار/التمايز أميلوبلاست طوال حياة الحيوان.
يمكن فصل الجهاز المينا تشريح الصغرى من الفئران القاطعة وفقا لمرحلة التمايز أميلوبلاست مع المساعدة من بقعة بيضاء تظهر بعد جفاف طفيف، وهذا يمكن أن تستخدم كمؤشر لمرحلة الانتقالية بين إفراز-و مراحل النضج19،،من2125. تلطيخ نوعية المينا الصغرى تشريح الأنسجة يمكن التحقق من خلال "تريتشرومي ماسون" (الشكل 3A). وتبين الملاحظة المجهرية الخلايا الظهارية المينا النموذجية وأميلوبلاست [بليسد]. وكان يشهد غياب التلوث الوسيطة بغياب الأخضر الكولاجين تلطيخ (الشكل 3A) والتعبير (الشكل 3B). يمكن استخدام هذه الأنسجة الدقيقة تشريح qualitative analyses مثل المدينة (الشكل 3) والعش، والتحليلات الكمية مثل RT-قبكر (الشكل 3B) والحمض النووي الريبي seq النشاف الغربية. على سبيل المثال، كان على وجه التحديد المترجمة مستقبلات الاندروجين في أميلوبلاستس مرحلة النضج باستخدام جسم محددة موجهة ضد هذا البروتين (انظر الجدول للمواد) (الشكل 3)8. مراحل التمايز أميلوبلاست الرئيسية تتميز بأنماط التعبير جين معين26 التي يمكن التعرف على الجهاز المينا تشريح الصغرى. على سبيل المثال، مرحلة إفراز أميلوبلاستس إكسبريس اناميلين2 ومرحلة النضج ameloblasts التعبير عن كاليكرين 4 (KLK4) (الشكل 3). أنها تحتوي على مستويات عالية من فيريتين التي تمنح القدرة على تخزين كميات كبيرة من الحديد، والمسؤولة عن اللون البرتقالي من المينا27.
فلوريد تعطل amelogenesis يمكن أن تتبعها بسهولة مراقبة الخلية ليساتيس لاستخراج الحمض النووي الريبي: التحكم ليساتيس مرحلة النضج باللون البرتقالي، بينما كانت تلك المعالجة الفلوريد الضوء الأصفر إلى عديم اللون (الشكل 4 أ). وذكرت تحليل مستويات الحمض النووي الريبي المستخرج من الجهاز المينا مرحلة النضوج تشريح مايكرو KLK4 أسفل التنظيم عند معاملة فلوريد (الشكل 4 باء)، الذي يتضح أيضا من تحليل ترانسكريبتوميك على نطاق واسع وأظهر مؤخرا2. وأعرب بروتينات محددة أما بإفراز أو النضج-المرحلة أميلوبلاستس قد تكون مترجمة أيضا استخدام الجهاز المينا تشريح الدقيقة28. على سبيل المثال، كان على وجه التحديد المترجمة مستقبلات الاندروجين استخدام المينا الصغرى تشريح الجهاز8،28.
رقم 1: المينا العيوب لوحظ في الفئران المعرضة إلى الفلوريد (NaF) في تركيبة أو لا مع bisphenol A (BPA)- (أ) التمثيل التخطيطي لأربع مجموعات تجريبية من ويستار يشكل بالنسبة للدراسة الحالية، والفئات التي تعتمد على الظروف البيئية المختلفة المطبقة على الفئران. من يوم 1 (فيكونداتيون) الحمل حتى الفطام يوم 21 (P21)، 5 ميكروغرام/كغ منهاج عمل بيجين في 0.5 مل زيت الذرة كان شفويا يديرها تزقيمية مدتها يوميا للنساء الحوامل والمرضعات، حين كانت تدار زيت الذرة وحدها للسيطرة على المجموعة. بعد الفطام، وحدد كل السد وموزعة بشكل عشوائي في أحد الفريقين المقابلة. ذكور الفئران كانت المختارة لهذه الدراسة ويتعرض إلى 5 ميكروغرام/كغ/يوم BPA وحدها، 5 ملم NaF وحدها، أو على حد سواء في نفس الجرعة حتى 65 يوما بعد الولادة (P65). وأعطى الفريق مراقبة المذيبات وحدها. (ب) عند الولادة يوم 30 (P30)، أظهرت الفئران المعرضة المزمن لجرعات منخفضة من منهاج عمل بيجين البقع البيضاء معتمة وحدد النمط الظاهري أسنان لم يعد واضحا للفئران الكبار (P65). العصابات الأبيض والبرتقالي متناوبة من الفلور الأسنان نموذجية (مدافع) لوحظت في الفئران تعامل مع NaF. النمط الظاهري أشد تميزت تلون القاطعة هامة حددت في الفئران المعرضة إلى كل من وكلاء. Incisal البرتقالي متجانسة المينا اتسمت مكافحة الفئران. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: التمثيل التخطيطي للإجراء. عزل أميلوبلاستس من مراحل إفراز والنضج من الجهاز المينا تشريح الصغير- هيمي الفئران-الفك السفلي يحتوي على الأضراس الثلاثة والقاطعة متزايد باستمرار مع أنسجة غضاريف اثنين وعاج تنتجها odontoblasts (باللون الأصفر) والمينا التي تنتجها أميلوبلاستس (باللون البرتقالي). عندما القاطعة معزولة ونزعت قليلاً، بقعة بيضاء قرب الجزء قمي من السطح الشفوية يمكن ملاحظتها. أنه يساعد على تحديد المرحلة أميلوبلاست من التمايز، كما أنها تغطي مرحلة انتقالية بين مراحل إفراز والنضج. جهاز المينا بعناية تشريح الصغرى والمنفصلين عن ذويهم في 3 أجزاء تبعاً لمراحل التمايز أميلوبلاست وتستخدم أما للتحليل (نسيجية) النوعي أو الكمي النهج التجريبي (تحليلات مرناً والبروتين من الرايت qPCR و الغربية النشاف، على التوالي).
الشكل 3: مراقبة الجودة من تشريح الصغرى إفراز-والنضج-مراحل الجهاز المينا. يتم فصل الجهاز المينا الفئران في 3 أجزاء تتضمن حلقة عنق الرحم، ومرحلة إفراز أميلوبلاستس، وأميلوبلاستس مرحلة النضج. (A) "تريتشرومي ماسون" لتلطيخ أجزاء تشريح الصغرى أظهرت الخلايا الظهارية مختلفة، وعدم وجود الخلايا الوسيطة. مقياس بار، 100 ميكرومتر-(ب) تحليل التعبير الجيني بتجارب RT-qPCR للكشف المستخرج من إفراز ومرحلة النضوج المينا الجهاز. ولوحظ نمط نموذجي من اناميلين والتعبير KLK4، فضلا عن عدم وجود الكولاجين 1 المتوقع في الخلايا الوسيطة. فلوري (ج) تلطيخ المستخدمة (انظر الجدول للمواد) على وجه التحديد جسم الموجهة ضد مستقبلات الاندروجين أعرب فقط بواسطة أميلوبلاستس مرحلة النضج. مقياس بار، 20 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: الحصول على نتائج الممثل مع الجهاز الفئران الصغيرة تشريح المينا. (أ) عندما كانت حراكه الخلايا في المخزن مؤقت تحلل لاستخراج الحمض النووي الريبي (انظر الجدول للمواد)، مرحلة نضوج الأنسجة التي تحتوي على أميلوبلاستس المصطبغة ظهر اللون البرتقالي في ظروف معاملة السيطرة ومنهاج عمل بيجين. الجزء إفراز-المرحلة أصفر بغض النظر عن الظروف. في معاملة NaF، كانت جميع ليساتيس الضوء الأصفر إلى عديم اللون. (ب) مثال RT-قبكر البيانات التي يحصل عليها باستعدادات الجيش الملكي النيبالي من أجهزة المينا الجرذان المقدمة إلى مختلف الظروف البيئية. NaF أسفل-وينظم KLK4 مرحلة النضج، ومنهاج عمل بيجين زيادة التعبير اناميلين في إفراز-المرحلة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
أميلوبلاست تغيير النشاط و/أو انتشار أميلوبلاست تعطلت، والتمايز، ونضج العمليات تؤدي إلى عيوب المينا لا رجعة فيه، وفي المقابل، وصف العيوب المينا قد تساعد في تطوير فهم لتغيير النشاط أميلوبلاست أثناء أميلوجينيسيس. وهكذا، الدراسات المتعلقة بالجهاز المينا معزولة عاملاً محدداً توضيح الأحداث المرضية التي أدت إلى المينا العيوب أيا كان مصدرها، البيئية أو الوراثية.
أصلاً قد وصف هذا الأسلوب هيلير et al. 17 وروبنسون et al. 18، ويستخدم لإظهار آثار محددة في كل مرحلة من التمايز هيئة المينا. ثم أنه قد تم تكييف للشراكة الأورو-متوسطية الاستخراج19،،من2425. ونحن حاليا استخدام هذا الإجراء لفصل الأجزاء الرئيسية للجهاز المينا وجمع العينات البيولوجية في ظروف بيئية مختلفة لتحليل الكشف والبروتينات (ربما داخل وخارج الخلايا البروتينات) استخدام الكمية والنوعية تقنيات.
الدقة في الدقيقة-التشريح يتطلب تدريب كبيرة قبل تطبيقه، للسماح بجمع الجهاز المينا يتم الحفاظ عليها وتجنب التلوث الوسيطة وأي تدمير الأنسجة. وعلاوة على ذلك، من الصعب جداً أن تنجح مع الفئران أو الجرذان الصغيرة. والواقع أن الجزء الأصعب من هذا الإجراء الحفاظ على مورفولوجيا الأنسجة، وعلم الأنسجة، والتوجه في المدينة والعش، بدلاً من الأساليب الكلاسيكية يؤديها عادة على القواطع لهذين النهجين.
واحدة من المزايا الرئيسية لاستخدام الجهاز المينا تشريح الصغير مقارنة مع هيمي كله ديمينيراليزيد-الفك السفلي هو صيانة المينا الكشف والبروتينات بفضل عدم وجود أي مجموعة بعد انتهاء العلاج. يمكن استخدام الجهاز المينا تشريح الصغرى مباشرة لجميع تقنيات البيولوجيا الجزيئية والكيمياء الحيوية دون تحديد أو استزراع الخلايا. وميزة هذا الإجراء هو القياسات المباشرة لمستويات البروتين والحمض النووي الريبي التي تعكس تلك الكميات في أميلوبلاستس محددة في فيفو في الظروف الفسيولوجية أو المرضية. وبالإضافة إلى ذلك، بعض سميات التصرف في مرحلة التمايز واحد على وجه التحديد، كما الحال مع فلوريد، الذي يعمل على أميلوبلاستس مرحلة النضج وليس على إفراز-المرحلة منها23،24. يسمح مايكرو--التشريح لمناطق مختلفة من الجهاز المينا دراسة إليه العمل من بعض سميات أو جينات محددة قد تكون آثارها غير قابل للكشف على الجهاز كله المينا أو الخلايا المعزولة. في الواقع، أميلوبلاستس، خاصة متباينة منها، هي صعوبة في جمع والثقافة في المختبر، الذي يشهد على ذلك عدم وجود دراسات تناولت هذا الموضوع. هي الخلايا الظهارية الأسنان فقط التي يمكن أن تكون معزولة قبل أميلوبلاستس، والخلايا الجذعية من20حلقة عنق الرحم. وبالإضافة إلى ذلك، خطوط الخلايا أميلوبلاستيك المبلغ عنها، أساسا الفئران هات 729والماوس LS830وجيش تحرير الكونغو31والبشرية 1 ص32، كثيرا ما تفقد خصائص التمايز في فيفو أميلوبلاستس: وهم يعربون عن المصفوفة خارج الخلية البروتينات (EMPs) مثل أميلوبلاستين وبالمثل إلى مرحلة إفراز أميلوبلاستس، وأيضا KLK4 أو SLC26A4/بيندرين، مثل مرحلة النضج أميلوبلاستس8، بل أكثر أو أقل غير قادر على التعبير عن أميلوجينين وطاغية مصفوفة لإنتاج المينا. عزل الخلايا الجذعية الظهارية الأسنان وأميلوبلاستس الجنينية قد تشكل خياراً للدراسة في المراحل الأولى من التمايز أميلوبلاست، ولكن الدراسات المتعلقة بعملية تمعدن المينا المحطة الطرفية لا يمكن تنفيذها بطريقة مختلفة من في فيفو نماذج. هذا الجزء الأخير من أميلوجينيسيس هو العامل المحدد لنوعية المينا. في حين أن العوامل الرئيسية التي تشارك في وضع الأسنان، مثل Bmp، Msx، وصندوق الأجيال القادمة، الدرجة، Shh، و Wnt وصفاً جيدا33،34، محكم المتورطين في نوعية المينا هي لا تزال غير مفهومة. وصف العوامل الرئيسية في نوعية المينا ضروري لفك تسوس الأسنان واكتشاف العلاج العلاجية أو الوقائية الابتكارية تسوس الأسنان، التي تشكل مشكلة صحية عامة رئيسية ك 92% من 20 إلى 64 سنة الكبار القديمة في العالم لديك، أو كان واحد على الأقل التسوس35،،من3637.
وقد تشكل القوارض المعرضين سميات البيئية قادرة على تعطيل أميلوجينيسيس وتغيير نوعية المينا نموذجا جيدا للدراسات المتعلقة بالعوامل البيئية. يمكن أيضا استخدام إجراءات مماثلة للدراسات الفنية المتعلقة بجينات المصالح المعنية مباشرة أو غير مباشرة في أميلوجينيسيس. الجهاز المينا تشريح الجزئي الذي مادة مناسبة لوصف آليات العمل سميات وما الهدف الجينات في فيفو تفادي أي تحيز التجريبية. عندما سيتميز العيوب المينا الإنمائية، يمكن استخدام هذا نهج كنموذج تنبؤي من الآثار المرضية المحتملة للملوثات رواية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب قد لا يوجد تضارب في الكشف عن.
Acknowledgments
تم تمويل هذا العمل من جامعة باريس-ديدرو والمعهد الوطني الفرنسي للصحة والبحوث الطبية (INSERM)، والمعهد الفرنسي لبحوث طب (المحزونات).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bisphenol A | Sigma Aldrich, Saint Louis MO | 239658 | |
| formalin 10% | Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO | HT5012 | |
| Tri-Reagent | Euromedex, France | TR118 | |
| RLT buffer | Qiagen, Les Ulis, France | 74126 | RNeasy Protect Mini Kit |
| Androgen receptor antibody | Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) | sc-816 | rabbit polyclonal antibody |
| PBS 10x | EUOMEDEX | ET330.A | |
| Sodium fluoride (NaF) | Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO | S-1504 | |
| paraplast regular | Leica microsystems, Nanterre cedex, France | 39601006 | called was/parafin in the text |
| tissue OCT | VWR, Fontenay-sous-Bois, France | 411243 | |
| Extra Fine Bonn Scissors - Straight/8.5 cm | PHYMEP , Paris, France | 14084-08 | |
| Handle for Scalpel Blades - 12.5 cm | PHYMEP, Paris, France | 10035-12 | |
| Curved Scalpel Blade | PHYMEP , Paris, France | 10035-20 | |
| Dissecting Knife - Fine/Straight Tip | PHYMEP , Paris, France | 10055-12 | |
| Circle Knife | PHYMEP, Paris, France | 10059-15 | |
| scalpel blades n°11 Swann-Morton | VWR, Fontenay-sous-Bois, France | 233-0024 | |
| binocular lens | Leica biosystems, Nanterre cedex, France | MZFLIII |
References
- Jedeon, K., et al. Enamel defects reflect perinatal exposure to bisphenol A. Am J Pathol. 183, 108-118 (2013).
- Jedeon, K., et al. Chronic Exposure to Bisphenol a Exacerbates Dental Fluorosis in Growing Rats. J Bone Miner Res. 31, 1955-1966 (2016).
- Alaluusua, S., et al. Developmental dental aberrations after the dioxin accident in Seveso. Environ Health Perspect. 112, 1313-1318 (2004).
- Chapple, I. L., et al. Interaction of lifestyle, behaviour or systemic diseases with dental caries and periodontal diseases: consensus report of group 2 of the joint EFP/ORCA workshop on the boundaries between caries and periodontal diseases. J Clin Periodontol. 44, S39-S51 (2017).
- Nanci, A. Enamel: Composition, Formation, and Structure. Ten Cate's Oral Histology Development, Structure, and Function. , 8th ed, Elsevier mosby. 122-164 (2012).
- Leite, G. A., Sawan, R. M., Teofilo, J. M., Porto, I. M., Sousa, F. B., Gerlach, R. F. Exposure to lead exacerbates dental fluorosis. Arch Oral Biol. 56, 695-702 (2011).
- Jedeon, K., et al. Enamel hypomineralization due to endocrine disruptors. Connect Tiss Res. 55, 1-5 (2014).
- Jedeon, K., et al. Androgen receptor involvement in rat amelogenesis: an additional way for endocrine disrupting chemicals to affect enamel synthesis. Endocrinology. 157, 4287-4296 (2016).
- Weerheijm, K. L., Jalevik, B., Alaluusua, S. Molar-incisor hypomineralisation. Caries Res. 35, 390-391 (2001).
- Jälevik, B. Prevalence and Diagnosis of Molar-Incisor- Hypomineralisation (MIH): A systematic review. Eur Arch Paediatr Dent. 11, 59-64 (2010).
- Alaluusua, S. Aetiology of Molar-Incisor Hypomineralisation: A systematic review. Eur Arch Paediatr Dent. 11, 53-58 (2010).
- Jedeon, K., Berdal, A., Babajko, S. The tooth, target organ of Bisphenol A, could be used as a biomarker of exposure to this agent. Bisphenol A: Sources, Risks of Environmental Exposure and Human Health Effects. Gibert, Y. , Nova Science Publishers. 205-225 (2015).
- Fejerskov, O., Larsen, M. J., Richards, A., Baelum, V.
- Robinson, C., Connell, S., Kirkham, J., Brookes, S. J., Shore, R. C., Smith, A. M. The effect of fluoride on the developing tooth. Caries Res. 38, 268-276 (2004).
- Sahlberg, C., Pavlic, A., Ess, A., Lukinmaa, P. L., Salmela, E., Alaluusua, S. Combined effect of amoxicillin and sodium fluoride on the structure of developing mouse enamel in vitro. Arch Oral Biol. 58, 1155-1164 (2013).
- Pritchett-Corning, K. R. Euthanasia of neonatal rats with carbon dioxide. J Am Assoc Lab Anim Sci. 48, 23-27 (2009).
- Hiller, C. R., Robinson, C., Weatherell, J. A. Variations in the composition of developing rat incisor enamel. Calcif Tissue Res. 18, 1-12 (1975).
- Robinson, C., Kirkham, J., Nutman, C. A. Relationship between enamel formation and eruption rate in rat mandibular incisors. Cell Tissue Res. 254, 655-658 (1988).
- Smith, C. E., Nanci, A. A method for sampling the stages of amelogenesis on mandibular rat incisors using the molars as a reference for dissection. Anat Rec. 225, 257-266 (1989).
- Chavez, M. G., et al. Isolation and culture of dental epithelial stem cells from the adult mouse incisor. J Vis Exp. (87), (2014).
- Brookes, S. J., Kingswell, N. J., Barron, M. J., Dixon, M. J., Kirkham, J. Is the 32-kDa fragment the functional enamelin unit in all species? Eur J Oral Sci. 119, 345-350 (2011).
- Babajko, S., Jedeon, K., Houari, S., Loiodice, S., Berdal, A. Disruption of Steroid Axis, a New Paradigm for Molar Incisor Hypomineralization (MIH). Front Physiol. 8, 343 (2017).
- Houari, S., et al. Asporin and the mineralization process in fluoride-treated rats. J Bone Min Res. 29, 1446-1455 (2014).
- Denbesten, P., Li, W. Chronic fluoride toxicity: dental fluorosis. Monographs in oral science. 22, 81-96 (2011).
- Kirkham, J., Robinson, C., Phull, J. K., Shore, R. C., Moxham, B. J., Berkovitz, B. K. The effect of rate of eruption on periodontal ligament glycosylaminoglycan content and enamel formation in the rat incisor. Cell Tissue Res. 274, 413-419 (1993).
- Lacruz, R. S., et al. Identification of novel candidate genes involved in mineralization of dental enamel by genome-wide transcript profiling. J Cell Physiol. 227, 2264-2275 (2012).
- Wen, X., Paine, M. L. Iron deposition and ferritin heavy chain (Fth) localization in rodent teeth. BMC research notes. 6, 1 (2013).
- Houari, S., Loiodice, S., Jedeon, K., Berdal, A., Babajko, S. Expression of Steroid Receptors in Ameloblasts during Amelogenesis in Rat Incisors. Front Physiol. 7, 503 (2016).
- Kawano, S., et al. Establishment of dental epithelial cell line (HAT-7) and the cell differentiation dependent on Notch signaling pathway. Connect Tissue Res. 43, 409-412 (2002).
- Zhou, Y. L., Snead, M. L. Identification of CCAAT/enhancer-binding protein alpha as a transactivator of the mouse amelogenin gene. J Biol Chem. 275, 12273-12280 (2000).
- Nakata, A., et al. Establishment and characterization of a spontaneously immortalized mouse ameloblast-lineage cell line. Biochem Biophys Res Commun. 308, 834-839 (2003).
- Harada, H., et al. Establishment of ameloblastoma cell line, AM-1. Journal of oral pathology & medicine: official publication of the International Association of Oral Pathologists and the American Academy of Oral Pathology. 27, 207-212 (1998).
- Jussila, M., Thesleff, I. Signaling networks regulating tooth organogenesis and regeneration, and the specification of dental mesenchymal and epithelial cell lineages. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4, a008425 (2012).
- Tucker, A., Sharpe, P. The cutting-edge of mammalian development; how the embryo makes teeth. Nat Rev Genet. 5, 499-508 (2004).
- Vos, T., et al. Years lived with disability (YLDs) for 1160 sequelae of 289 diseases and injuries 1990-2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010. Lancet. 380, 2163-2196 (2012).
- Marcenes, W., et al. Global burden of oral conditions in 1990-2010: a systematic analysis. J Dent Res. 92, 592-597 (2013).
- National Institute of Dental and Craniofacial Research. Dental Caries (Tooth Decay) in Adults (Age 20 to 64). , Available from: https://www.nidcr.nih.gov/DataStatistics/FindDataByTopic/DentalCaries/DentalCariesAdults20to64.htm (2017).
