Summary
Comprendre les émail des altérations de la formation et, éventuellement, il faut l’étude de l’activité de l’Odam. Nous décrivons ici une méthode fiable et cohérente pour micro-disséquer les organes émail contenant des améloblastes de sécrétion et de maturation des stades qui peuvent être utilisés pour les procédures expérimentales quantitatives et qualitatives.
Abstract
Anomalies de l’émail résultant de conditions environnementales et les modes de vie sont des préoccupations de santé publique en raison de leur prévalence élevée. Ces défauts résultent de l’activité altérée des cellules responsables de la synthèse d’émail nommée améloblastes, qui présentent à l’organe de l’émail. Au cours de l’Amélogenèse, améloblastes suivent une séquence spécifique et précise des événements de la prolifération, la différenciation et la mort. Un rat sans cesse croissante des incisives est un modèle expérimental pour étudier les étapes de l’activité et la différenciation Odam dans des conditions physiologiques et pathologiques. Nous décrivons ici une méthode fiable et cohérente pour micro-disséquer organe de l’émail des rats exposés à des substances toxiques environnementaux. L’épithélium dentaire micro-disséqués contiennent des améloblastes de sécrétion et de maturation des stades qui peuvent être utilisés pour des expériences qualitatifs, tels que les dosages de l’immunohistochimie et hybridation in situ , ainsi que pour les analyses quantitatives telles que RT-qPCR, RNA-seq et éponger occidental.
Introduction
Plusieurs anomalies de l’émail du développement peuvent résulter de l’exposition aux substances toxiques environnementaux et/ou de style de vie inapproprié1,2,3,4. Caractérisation de perturber les événements et les molécules d’Amélogenèse en utilisant la procédure décrite actuellement favorisera l’utilisation des anomalies de l’émail qui en résulte comme marqueurs précoces de l’exposition à plusieurs substances toxiques et peut-être aider à reconstituer l’histoire de la santé de chaque patient pendant la période périnatale, quand l’émail est synthétisée1,2. Synthèse de l’émail peut être divisée en quatre grandes étapes selon Odam activité5. La première étape regroupe la prolifération cellulaire et pré-Odam précurseur. Au cours de la deuxième étape, les améloblastes différenciées sécrètent émail protéines de la matrice (PGE), principalement amélogénine, enamelin et ameloblastin, qui détermine l’épaisseur de l’émail final. Ainsi, toute perturbation de la synthèse de l’EMP conduit à des anomalies quantitatives de l’émail. Après la déposition de l’épaisseur de l’émail complet, commence la phase de maturation. Au cours de cette étape, croissance cristallites apatite en largeur et en épaisseur permet à l’émail atteindre le plus haut ratio de minéralisation dans un tissu biologique, avec jusqu'à 96 % en poids. Défauts d’émail des événements perturbateurs qui se produisent au cours de la maturation étape conduit à qualitative. Enfin, améloblastes entrent dans une phase de maturation post, également appelée pigmentation chez les rongeurs et apoptose au cours de l’éruption de dents faisant des anomalies de l’émail (le cas échéant) irréparable et irréversible, donc défauts potentiel enregistrement rétrospective de Odam souligne. Chez les rongeurs, Amélogenèse suit une séquence d’événements avec la particularité que leurs incisives poussent en permanence, ce qui en fait un modèle approprié pour étudier le processus général d’Amélogenèse similaire. Ainsi, toute perturbation d’Amélogenèse provoque des altérations de l’émail de qualité ou quantité, selon la fenêtre de temps de l’événement qui perturbent. En ce sens, l’exposition à la dioxine, du plomb et produits chimiques perturbant le système endocrinien (SPSE) comme le bisphénol A (BPA), génistéine et vinclozoline, ont démontré que générer émail hypomineralizations1,2,3 ,6,7,8. Des taches opaques blanches asymétriques ont été identifiés sur les incisives des rats exposés à une dose BPA de faibles doses pendant la période fœtale et le premier mois après la naissance1. Ces anomalies de l’émail chez les rats et celles des incisives molaire humaine hypomineralization (MIH), partagent des caractéristiques cliniques, structurales et biochimiques semblables. MIH est une pathologie décrite récemment l’émail dentaire, dont l’étiologie demeure encore peu clair9,,10 , malgré les nombreux facteurs de causalité ayant émis l’hypothèse9,10,11 ,,12.
Une autre pathologie de hypominéralisation émail important en raison de facteurs environnementaux est la fluorose dentaire (DF), qui est la conséquence d’une absorption excessive de fluorure (> 0,1 mg/kg/jour)13,14. La principale source de fluor est l’eau potable qui est complétée ou naturellement enrichie en fluor. Le fluorure est également souvent prescrit pour prévenir la carie dentaire, mais la dose prophylactique n’est que 50 % plus bas que le toxique un (≤ 0,05 mg/kg/jour). MIH et DF, deux pathologies fréquentes résultant de l’exposition à des facteurs environnementaux peuvent présenter des caractéristiques communes qui doivent être caractérisés en raison de la potentialisation des effets de hypomineralizing de fluorure combinée avec d’autres substances toxiques telles que le CDE2 ou amoxicilline15.
Micro-dissection de l’organe de l’émail rat contenant les améloblastes à des stades différents de la différenciation vous aidera à comprendre le mécanisme d’action des molécules capables de perturber l’activité Odam et causer des anomalies de l’émail d’être diagnostiqués après l’éruption de la dent. En d’autres termes, la caractérisation des modifications d’émail gene expression et émail composition de la matrice en raison des substances toxiques environnementales permet la reconstitution de l’histoire de l’exposition aux substances toxiques et facilite le contrôle de la sécurité environnementale pour le public santé.
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Protocol
Tous les animaux utilisés dans la présente étude ont été maintenues conformément aux lignes directrices pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire du Ministère Français de l’Agriculture (A-75-06-12).
1. animale exposition aux substances toxiques
- Avant d’effectuer ce protocole, obtenir l’approbation institutionnelle nécessaire et s’assurer de se conformer à toutes les directives de protection des animaux.
- S’appliquent à la conception du protocole de recherche permettant la constitution de différents groupes expérimentaux afin de tester l’impact de la molécules étudiées sur la phase de sécrétion Odam et la phase de maturation Odam. Ici, quatre groupes de rats Wistar mâles ont été constitués selon leur exposition au fluorure (NaF) en combinaison ou non avec BPA (Figure 1 a)2. Tous les animaux ont été observées et disséquées jour 65 (Figure 1 b).
2. dissection de Hemi-mandibules des Rats adultes
- Euthanasier des rats de CO2 asphyxie, éventuellement suivi par décapitation à la tête séparée du reste du corps. Exposer des rats à CO2 pendant 5 min dans une zone dédiée à16.
- Retirez toute la peau de la lèvre inférieure à l’aide d’un scalpel #11 afin d’obtenir un accès facile pour les incisives inférieures.
- Avec le scalpel même, faites une incision entre les deux incisives inférieures avec une légère pression et la mandibule sera divisée en deux moitiés.
- Couper l’articulation mandibulaire temporale avec un scalpel pour détacher la mâchoire et tenir l’hémi-mandibule avec pince fine.
- Couper les tissus mous environnants avec un scalpel et enlever tous les muscles, tendons et ligaments à l’aide d’un racloir jusqu'à ce que l’OS est parfaitement propre.
3. isolement des incisives17,18
- Raser avec soin l’OS en plaçant la lame parallèle à l’axe longitudinal majeur de l’incisive. Commencez à la crête osseuse près les conseils de l’incisive (extrémité proximale) jusqu'à la fin de l’incisive près de la boucle du col utérin. La motion de l’incision part de proximale à la direction distale.
- Faites une première coupe distale à la boucle du col avec le scalpel pour enlever la gonion de l’hémi-mandibule et permettre de décoller de l’incisive facilement sans endommager la boucle col de l’utérus ou le stade sécrétoire des améloblastes (ligne rouge dans la Figure 2).
- Faire une deuxième coupe au-dessous de la deuxième molaire et insérez le scalpel entre l’os et la surface médiale de l’incisive. Lorsque tout l’OS basal est levée, faire pivoter vers l’extérieur l’incisive et enlevez-le soigneusement pour éviter l’émail organe tissu porter atteinte à l’aide de pinces fines.
4. micro-Dissection de l’organe de l’émail sous lentille binoculaire
- Déposer 200 µL de tampon Phosphate salin (PBS 1 X) sur l’incisive à l’aide d’une pipette. Prendre l’incisive avec pince fine avec la face labiale vers le haut. Faire un scalpel marque entre l’incolore et les parties orange du tissu. Cette note correspond à la tache blanche sous-jacente qui est observable par la suite (Figure 2).
- Gratter, avec une pelle ou un outil équivalent, la surface de la cellule de la marque de scalpel à l’extrémité apicale correspondant à sécrétion améloblastes de scène (incolore) et de la marque de bistouri Swann-Morton à la pointe de l’incisive pour les améloblastes de phase (orange) de maturation.
- Enlever le tissu de 2 mm, correspondant à la phase de transition, comme précédemment décrit19. Ne pas ouvrir l’incisive au cours de la dissection orgue émail pour éviter la contamination par le mésenchyme.
- Couper la boucle col de l’utérus située immédiatement à la partie apicale de l’incisive (Figure 2) tel que décrit précédemment20.
- Ramasser en solution à 10 % de formol ou lyse pour complément d’enquête (voir Table des matières).
5. collection de tissus organes séparés émail pour d’autres recherches
- Déposer 200 µL de tampon PBS 1 X sur l’incisive.
- Avec une lame de bistouri #11, soigneusement détacher les cellules épithéliales dentaires progressivement dans la mémoire tampon, séparément pour chaque étape avec l’aide de la marque de bistouri faite précédemment.
- Pour cellule RNA et extractions de protéine, mettre le tissu dans une solution de lyse qui permet l’extraction de protéines et ARN (voir Table des matières).
NOTE : Préparez RNAs de haute qualité en tournant la tissu-pelle dans le tube et ensuite ponçage les cellules jusqu'à l’obtention d’un mélange homogène. Le mélange est prêt pour des extractions ARN et des protéines selon la procédure par le fabricant, qui a été précédemment décrit2,8,17. Habituellement, environ 5-10 µg au total RNAs et 150 µg de protéines totales ont été obtenus pour chaque préparation. - Pour les analyses histologiques, immunohistochimie et hybridation in situ (ISH), mettent la couche de cellules dans 10 % de formol pendant 2 h, puis conserver à 4 ° C dans du PBS 1 X. Les tissus peuvent ensuite être incorporés dans cire/paraffine ou tissu OCT pour coupes congelées.
- Pour les extractions EMP, prendre l’incisive avec pince fine. Après une courte exposition à l’air (déshydratation légère), une tache blanche sera visible autour de la partie médiane de la face labiale de l’incisive, qui représente l’initiation de la minéralisation de l’émail. Cette tache blanche correspond à la transition- / tôt-la phase de maturation des améloblastes, donc l’utiliser comme indicateur pour l’extraction de PGE21.
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Representative Results
Plusieurs émail défauts, tels que la fluorose dentaire12,13, peut résulter de conditions environnementales en raison de l’absorption excessive de fluorure ou d’un émail hypominéralisation semblable au MIH dus à l’exposition à des perturbateurs endocriniens1, 7,,22. Ces anomalies de l’émail du développement peuvent être reproduits expérimentalement sur des rats (Figure 1)1,2,7,23,24. Le rat hémi-mandibule contient une seule incisive séparée de trois molaires par un espace appelé le diastème. L’incisive continuellement croissante contient deux tissus minéralisés, la dentine produite par les odontoblastes et l’émail produites par les améloblastes présents dans l’organe de l’émail avec d’autres cellules épithéliales (Figure 2). Les incisives de rongeurs semble être un modèle approprié pour étudier l’Amélogenèse car, contrairement aux molaires, il contient toutes les étapes de prolifération/différenciation Odam tout au long de la vie de l’animal.
Organe de l’émail micro-disséqué d’incisive de rat peut être séparé selon le stade de différenciation Odam avec l’aide d’une tache blanche qui s’affiche après une légère déshydratation, et cela peut être utilisé comme un indicateur de la phase de transition entre la sécrétion - et stades de mûrissement19,21,25. La qualité de l’émail micro-disséqué les tissus peuvent être vérifiées par Trichrome de Masson de coloration (Figure 3 a). Observation microscopique a montré des cellules épithéliales émail typique et une palissade Odam. L’absence de contamination mésenchymateuse a été attestée par l’absence de vert de collagène coloration (Figure 3 a) et expression (Figure 3 b). Ces tissus micro-disséqué peuvent être utilisés pour qualitative analyses comme IHC (Figure 3) et ISH et analyses quantitatives comme la RT-qPCR (Figure 3 b), RNA-seq et éponger occidental. Par exemple, le récepteur des androgènes était spécifiquement localisé dans les phase de maturation améloblastes utilisant un anticorps spécifique dirigé contre cette protéine (voir la Table des matières) (Figure 3)8. Les étapes de différenciation principal Odam sont caractérisent par gène spécifique expression patterns26 qui peuvent être identifiés sur l’organe de l’émail micro-disséqué. Par exemple, sécrétion-stade améloblastes expriment enamelin2 et maturation-stade améloblastes expriment kallikréine 4 (KLK4) (Figure 3 b). Ils contiennent des niveaux élevés de ferritine qui confèrent la possibilité de stocker des quantités élevées de fer, qui est responsable de la couleur orange de l’émail des27.
Perturbation de fluorure d’Amélogenèse peut facilement être suivie par observation des lysats de cellules pour les extractions de RNA : contrôler les lysats phase de maturation étaient orange, alors que ceux traités à fluorure est lumière jaune à incolore (Figure 4 a). Analyse des niveaux d’ARN extrait de phase de maturation micro-disséqué organe de l’émail a montré KLK4 vers le bas-règlement sur le traitement de fluorure (Figure 4 b), qui a été également mis en évidence par une analyse transcriptomique à grande échelle a récemment signalé2. Protéines spécifiques exprimé soit par sécrétion ou maturation allures améloblastes peuvent également être localisées à l’aide de micro-disséqué émail orgue28. Par exemple, le récepteur des androgènes était spécifiquement localisé à l’aide de micro-disséqué émail orgue8,28.
Figure 1 : émail de défauts observés sur des rats exposés au fluorure (NaF), en combinaison ou non avec le bisphénol A (BPA). (A) Représentation schématique des quatre groupes de rats Wistar constituées pour la présente étude, les groupes qui dépendait des conditions environnementales différentes appliquées aux rats expérimentaux. Du jour de gestation 1 (fecondation) jusqu’au sevrage jour 21 (P21), 5 µg/kg BPA dans 0,5 mL d’huile de maïs a été administré par voie orale par gavage tous les jours aux femmes enceintes et allaitantes, tandis que l’huile de maïs seul a été administré au groupe témoin. Après le sevrage, chaque barrage a été identifié et distribuée au hasard dans l’un des deux groupes correspondants. Des rats mâles ont été choisis pour cette étude et exposés à 5 µg/kg/jour seul, BPA 5 mM NaF seul, ou les deux à la même dose jusqu'à 65 jours après la naissance (P65). Groupe témoin reçut le solvant seul. (B) à 30 (P30) jours après la naissance, des rats exposés de façon chronique à faibles doses BPA présentaient des taches opaques blanches et un phénotype dentaire n’est plu évident a été identifié chez le rat adulte (P65). Alternance de bandes blancs et orange de la fluorose dentaire typique (DF) ont été observés chez les rats traités avec NaF. Un phénotype plus sévère caractérisé par une décoloration importante incisive a été identifié chez des rats exposés aux deux agents. Émail incisal orange homogène caractérisée des rats témoins. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : représentation schématique de la procédure. Isolement des améloblastes de sécrétion - et -stades de mûrissement de l’organe de l’émail micro-disséqué. Le rat hémi-mandibule contient trois molaires et une incisive continuellement croissante avec deux tissus minéralisés, la dentine produite par les odontoblastes (en jaune) et l’émail produites par les améloblastes (en orange). Lorsque l’incisive est isolé et un peu déshydraté, une tache blanche près de la partie apicale de la face labiale est observable. Il aide à identifier les Odam stade de différenciation, puisqu’il couvre la phase de transition entre la sécrétion - et -stades de mûrissement. L’organe de l’émail est soigneusement disséqué de micro séparé en 3 parties selon les stades de différenciation Odam et utilisés pour l’analyse qualitative (histologique) ou quantitatives approches expérimentales (analyses de l’ARNm et de protéines par RT-qPCR et Western Blot, respectivement).
Figure 3 : contrôle de la qualité du micro-disséqué la sécrétion - et -stades de mûrissement de l’organe de l’émail. Organe de l’émail rat est séparée en 3 parties contenant la boucle du col utérin, les améloblastes sécrétion-scène et améloblastes stade de maturation. De Masson Trichrome (A) la coloration des pièces micro-disséqué ont montré les différentes cellules épithéliales et l’absence de cellules mésenchymateuses. Balance bar, 100 µm. (B) analyse l’expression génique par des expériences de la RT-qPCR d’ARN extrait de sécrétion et de maturation des stades organe de l’émail. Un modèle typique d’enamelin et de l’expression KLK4 a été observé, ainsi que l’absence du collagène 1 prèvu pour cellules mésenchymateuses. Fluorescentes (C) coloration utilisé un anticorps (voir Table des matières) spécifiquement dirigés contre le récepteur des androgènes n'exprimé que par les améloblastes phase de maturation. Balance bar, 20 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : résultats représentatifs obtient avec l’organe de l’émail micro-disséqué rat. (A) lorsque les cellules ont été resuspendues dans un tampon de lyse pour l’extraction de l’ARN (voir Table des matières), tissu de maturation-scène contenant des améloblastes pigmentée est apparu orange dans des conditions de contrôle et BPA-imprégnées d’insecticide. La portion de sécrétion-stade est jaune, quelles que soient les conditions. Dans le traitement de la NaF, tous les lysats furent lumière jaune à incolore. (B) exemple de RT-qPCR données obtenues avec les préparations d’ARN à partir d’organes de l’émail de rats soumis à diverses conditions environnementales. NaF diminuées KLK4 dans la phase de maturation, et BPA a augmenté l’expression enamelin dans la phase de sécrétion. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Odam altérée activité et/ou perturbé Odam prolifération, différenciation et maturation processus responsable d’anomalies de l’émail irréversible et, par conséquent, la caractérisation des anomalies de l’émail peut aider à développer la compréhension de l’altération Odam activité pendant Amélogenèse. Ainsi, les études sur l’organe de l’émail isolés sont déterminants pour élucider les événements pathologiques conduisant à l’émail défauts quels que soient leur origine, environnemental ou génétique.
Cette technique a initialement été décrite par Hiller et al. 17 et Robinson et al. 18et est utilisé pour démontrer les effets spécifiques sur chaque étape de la différenciation des organes émail. Il a ensuite été adapté pour EMP extractions19,24,25. Nous utilisons actuellement cette procédure pour séparer les parties principales de l’organe de l’émail et de recueillir les échantillons biologiques dans des conditions environnementales différentes pour analyser des ARN et des protéines (éventuellement intra - et extra-cellulaires) à l’aide de quantitatifs et qualitatifs techniques.
La précision de la dissection, micro-nécessite une formation substantielle avant son application, afin de permettre la collecte de l’organe de l’émail préservé et à éviter des contaminations mésenchymateuses et toute destruction de tissu. En outre, il est assez difficile à réussir avec la souris ou de rats petits. En effet, la partie la plus délicate de la procédure est de préserver la morphologie tissulaire, l’histologie et l’orientation IHC et ISH, par opposition aux techniques classiques fréquemment exécutées sur incisives pour ces deux approches.
L’un des principaux avantages de l’utilisation de l’organe de l’émail micro-disséqué par rapport à l’ensemble déminéralisée hemi-mandibulaire est le maintien de l’émail ARN et protéines grâce à l’absence de n’importe quelle collection de post traitement. L’organe de l’émail micro-disséqué directement utilisable pour toutes les techniques de biologie moléculaire et la biochimie sans sélection ni de culture de cellules embryonnaires. L’avantage de cette procédure est les mesures directes des niveaux d’ARN et de protéine qui reflète leurs quantités dans les améloblastes spécifiques in vivo dans des conditions physiologiques ou pathologiques. En outre, certaines substances toxiques agissent sur scène une différenciation plus précisément, comme cela se fait avec du fluorure, qui agit sur la phase de maturation améloblastes et pas sur la sécrétion-stade ceux23,24. La micro-dissection des différentes régions de l’organe de l’émail permet l’étude du mécanisme d’action de certaines substances toxiques ou des gènes spécifiques, dont les effets peuvent être indétectables sur l’organe de l’émail entier ou sur des cellules isolées. En effet, améloblastes, différenciées en particulier ceux, sont difficiles à collecter et la culture in vitro, qui est attestée par l’absence d’études sur le sujet. Les cellules épithéliales seulement dentaires qui peuvent être isolés sont pré-améloblastes et les cellules souches de la boucle du col utérin20. En outre, les lignées de cellules Odontome signalés, principalement rat HAT-729, souris LS830, ALC31et humaine AM-132, perdent souvent les caractéristiques de différenciation des améloblastes de in vivo : elles expriment protéines de la matrice extracellulaire (PGE) comme ameloblastin de la même façon à sécrétion-stade améloblastes et aussi KLK4 ou SLC26A4/pendrin, comme la phase de maturation améloblastes8, mais sont plus ou moins incapables de l’amélogénine express et de minéraliser la matrice pour produire l’émail. Isoler des cellules souches épithéliales dentaires et améloblastes embryonnaire peut constituer une option à étudier les premiers stades de différenciation Odam, mais les études sur le processus de minéralisation émail terminal ne peuvent être effectués différemment qu’avec modèles in vivo . Cette dernière partie d’Amélogenèse est déterminant pour la qualité de l’émail. Considérant que les principaux facteurs impliqués dans le développement dentaire, tels que Bmp, Msx, Fgf, Notch, Shh, Wnt sont bien décrit33,34, ceux étroitement impliqués dans la qualité de l’émail sont encore mal compris. La caractérisation des facteurs clés de la qualité de l’émail est nécessaire pour déchiffrer la carie dentaire et de découvrir un traitement curatif ou préventif novateur pour la carie dentaire, qui constituent un problème majeur de santé publique que 92 % de 20 à 64 ans vieux adultes dans le monde avez ou avez eu au moins une carie35,36,37.
Les rongeurs exposés à des toxiques environnementaux capables de perturber l’Amélogenèse et altérer la qualité de l’émail peuvent constituer un bon modèle pour les études sur les facteurs environnementaux. Des procédures similaires pourraient également être utilisés pour des études fonctionnelles sur les gènes d’intérêt directement ou indirectement impliqué dans Amélogenèse. L’organe de l’émail micro-disséqué est un matériel propre à caractériser les mécanismes d’action des substances toxiques et leur cible gènes in vivo en évitant tout biais expérimental. Lorsque les anomalies de l’émail du développement se caractérisera, une telle approche pourrait servir un modèle de prédiction des effets pathologiques potentiels de nouveaux polluants.
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Disclosures
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêt à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été financé par l’Université Paris-Diderot, l’Institut National Français de la santé et la recherche médicale (INSERM) et l’Institut Français pour la recherche odontologique (IFRO).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bisphenol A | Sigma Aldrich, Saint Louis MO | 239658 | |
| formalin 10% | Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO | HT5012 | |
| Tri-Reagent | Euromedex, France | TR118 | |
| RLT buffer | Qiagen, Les Ulis, France | 74126 | RNeasy Protect Mini Kit |
| Androgen receptor antibody | Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) | sc-816 | rabbit polyclonal antibody |
| PBS 10x | EUOMEDEX | ET330.A | |
| Sodium fluoride (NaF) | Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO | S-1504 | |
| paraplast regular | Leica microsystems, Nanterre cedex, France | 39601006 | called was/parafin in the text |
| tissue OCT | VWR, Fontenay-sous-Bois, France | 411243 | |
| Extra Fine Bonn Scissors - Straight/8.5 cm | PHYMEP , Paris, France | 14084-08 | |
| Handle for Scalpel Blades - 12.5 cm | PHYMEP, Paris, France | 10035-12 | |
| Curved Scalpel Blade | PHYMEP , Paris, France | 10035-20 | |
| Dissecting Knife - Fine/Straight Tip | PHYMEP , Paris, France | 10055-12 | |
| Circle Knife | PHYMEP, Paris, France | 10059-15 | |
| scalpel blades n°11 Swann-Morton | VWR, Fontenay-sous-Bois, France | 233-0024 | |
| binocular lens | Leica biosystems, Nanterre cedex, France | MZFLIII |
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