Summary
Schmelz Bildung und mögliche Veränderungen zu verstehen, erfordert das Studium der Ameloblast Aktivität. Hier beschreiben wir eine zuverlässige und konsistente Methode, um Mikro-sezieren Emaille Organe mit Sekretion und Reifung-Bühne Fibrillen, die für die weitere quantitative und qualitative experimentelle Vorgehensweise verwendet werden können.
Abstract
Schmelz Mängel aufgrund von Umweltbedingungen und Lebensweisen sind öffentliche Gesundheit Bedenken wegen ihrer hohen Prävalenz. Diese Mängel ergeben sich durch veränderte Aktivität von Zellen verantwortlich für Emaille-Synthese genannt Fibrillen, die in Emaille Orgel präsentieren. Während Amelogenesis folgen Fibrillen eine spezifische und präzise Abfolge von Ereignissen der Proliferation, Differenzierung und Tod. Eine Ratte, die stetig wachsende Schneidezähne ist ein geeignetes experimentelles Modell Ameloblast Aktivität und Differenzierung Stufen unter physiologischen und pathologischen Bedingungen zu studieren. Hier beschreiben wir eine zuverlässige und konsistente Methode, um Mikro-sezieren Emaille-Orgel von Ratten, Umweltgifte ausgesetzt. Die Mikro-seziert dental Epithelien enthalten Sekretion und Reifung-Bühne Fibrillen, die für qualitative Experimente wie Immunohistochemistry Assays und in Situ Hybridisierung, sowie für Quantitative Analysen wie verwendet werden kann RT-qPCR, RNA-Seq und westliche Beflecken.
Introduction
Viele Entwicklungsstörungen Schmelz Mängel können Belastung durch Umweltgifte und/oder unangemessenen Lebensstil1,2,3,4ergeben. Charakterisierung der Störung Ereignisse und Moleküle der Amelogenesis mit dem derzeit beschriebenen Verfahren fördert die Nutzung der daraus resultierenden Schmelz Mängel als frühe Marker der Exposition gegenüber mehreren Schadstoffen und kann dazu beitragen, die Geschichte der Gesundheit wiederherzustellen jeder Patient während der Perinatalperiode Emaille dazu1,2 wird. Emaille-Synthese kann in vier Hauptphasen je nach Ameloblast Aktivität5unterteilt werden. Der erste Schritt enthält Vorläufer Zell- und Pre-Ameloblast Verbreitung. Im zweiten Schritt absondern differenzierte Fibrillen Emaille Matrixproteine (EMPs), vor allem Amelogenin, enamelin und Ameloblastin, die die Dicke der letzte Schmelz zu bestimmen. So führt eine Unterbrechung der EMP-Synthese auf quantitative Defekte des Zahnschmelzes. Nach der Absetzung der Dicke voller Schmelz beginnt die Reifung. Während dieser Phase kann Apatit-Kristallit-Wachstum in der Breite und Dicke den Schmelz, das höchste Mineralisierung Verhältnis gefunden in einem biologischen Gewebe, mit bis zu 96 % nach Gewicht zu erreichen. Störenden Ereignisse, die während der Reifung Bühne führen zu qualitativen auftreten Emaille Mängel. Schließlich Fibrillen in eine Phase der Post-Reifung, auch genannt Pigmentierung bei Nagetieren, eintreten und Apoptose während Zahndurchbruch machen Schmelz Mängel (falls vorhanden) nicht wieder gutzumachenden und unumkehrbar, defekte bieten somit potenzielle Retrospektive Erfassung der Ameloblast betont. Bei Nagetieren folgt Amelogenesis eine ähnliche Abfolge von Ereignissen mit der Besonderheit, die ihre Schneidezähne kontinuierlich wachsen, wodurch sie ein geeignetes Modell, den allgemeinen Prozess der Amelogenesis zu studieren. Somit entsteht eine Unterbrechung des Amelogenesis in Veränderungen der Emaille Qualität und/oder Quantität, je nach dem Zeitfenster des störenden Ereignisses. In diesem Sinne gezeigt Exposition gegenüber Dioxin, Blei und endokrine Störung Chemikalien (EDZ) wie Bisphenol A (BPA), Genistein und Vinclozolin, Emaille Hypomineralizations1,2,3 generieren ,6,7,8. Asymmetrische Weiße undurchsichtige Flecken wurden auf die Schneidezähne von Ratten ausgesetzt, eine niedrig dosierte BPA Dosis während der fetalen und den ersten Monat nach der Geburt1identifiziert. Diese Emaille-Mängel bei Ratten, und die menschlichen Molaren Schneidezahn Hypomineralization (MIH), teilen ähnliche klinische, strukturelle und biochemische Eigenschaften. MIH ist eine kürzlich beschriebenen Zahnschmelz Pathologie, für die bleibt der Ätiologie noch unklar9,10 trotz vielen ursächlichen Faktoren gewesen theoretisiert9,10,11 ,12.
Ein weiterer wichtiger Emaille Hypomineralization Pathologie auf Umweltfaktoren zurückzuführen ist Dentalfluorose (DF), die die Folge der übermäßigen Fluorid Absorption ist (> 0,1 mg/kg/Tag)13,14. Die Hauptquelle von Fluorid ist Trinkwasser, der entweder ergänzt oder natürlich mit Fluorid angereichert. Fluorid ist auch häufig verschrieben, um Karies zu verhindern, aber die prophylaktische Dosis beträgt nur 50 % niedriger als die giftigen ein (≤0.05 mg/kg/Tag). MIH und DF, zwei häufige Krankheiten, die infolge der Exposition gegenüber Umweltfaktoren, können Gemeinsamkeiten zu präsentieren, die durch die Potenzierung der Hypomineralizing Wirkung von Fluorid in Kombination mit anderen Schadstoffen wie EDZ2 gekennzeichnet werden müssen oder Amoxicillin15.
Mikro-Dissektion der Ratte Emaille Orgel mit Fibrillen in verschiedenen Differenzierung Phasen hilft um zu verstehen, den Wirkmechanismus von Molekülen Ameloblast Aktivität zu stören und dazu führen, dass Schmelz Mängel nach dem Zahndurchbruch diagnostiziert werden können. Das heißt, die Charakterisierung der Veränderungen der Emaille gen Ausdruck und Zahnschmelz Matrix Zusammensetzung durch Umweltgifte ermöglicht die Wiederherstellung der Geschichte der Exposition gegenüber Toxinen und erleichtert die Überwachung der ökologischen Sicherheit für öffentliche Gesundheit.
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Protocol
Alle Versuchstiere in der vorliegenden Studie wurden in Übereinstimmung mit Richtlinien für die Pflege und Verwendung von Labortieren vom französischen Ministerium für Landwirtschaft (A-75-06-12) beibehalten.
1. Tier Exposition gegenüber Toxinen
- Holen Sie vor der Durchführung dieses Protokolls der notwendigen institutionellen Genehmigung ein und achten Sie darauf, alle Tierpflege-Richtlinien entsprechen.
- Wenden Sie das Design der Forschungs-Protokoll, so dass die Verfassung der verschiedenen Versuchsgruppen um die Auswirkungen der Schutzmechanismus untersucht auf Ameloblast Sekretion Phase und die Ameloblast-Reifung-Phase zu testen. Hier wurden vier Gruppen von männlichen Wistar-Ratten je nach Gefährdung durch Fluorid (NaF) in Kombination oder nicht mit BPA (Abbildung 1A)2konstituiert. Alle Tiere wurden beobachtet und seziert am Tag 65 (Abbildung 1 b).
2. Präparation der Hemi-Mandibeln von erwachsenen Ratten
- Einschläfern Sie Ratten durch CO2 ersticken, optional gefolgt von Enthauptung auf den getrennten Kopf vom Rest des Körpers. Ratten, die CO2 für 5 min in eine eigene Box16aussetzen.
- Entfernen Sie die Haut von den unteren Lippen mit einem Skalpell #11 um einfachen Zugriff auf die unteren Schneidezähne zu bekommen.
- Mit dem gleichen Skalpell einen Einschnitt zwischen den beiden unteren Schneidezähne mit einem leichten Druck machen und der Unterkiefer wird in zwei Hälften aufgeteilt werden.
- Schneiden Sie das zeitliche mandibuläre Gelenk mit einem Skalpell, den Kiefer zu lösen, und halten Sie die Hemi-Unterkiefer mit einer feinen Pinzette.
- Schneiden Sie die umliegenden Weichteile mit einem Skalpell und entfernen Sie alle Muskeln, Sehnen und Bänder mit einem Schaber, bis die Knochen vollständig sauber ist.
3. Isolation der Schneidezahn17,18
- Rasieren Sie vorsichtig den Knochen indem man die Klinge parallel zur großen Längsachse der Schneidezahn ab. Starten Sie am knöchernen Kamm in der Nähe von den Spitzen der Schneidezahn (proximales Ende) bis zum Ende der Schneidezahn in der Nähe der zervikalen Schleife. Die Schnitt-Bewegung geht von der proximalen, distale Richtung.
- Machen Sie einen ersten Schnitt nach distal der zervikalen Schleife mit dem Skalpell zu entfernen die Gonion Hemi-Unterkiefer und Ausziehen der Schneidezahn leicht ohne Beschädigung der zervikalen Schleife oder der sekretorischen Phase der Fibrillen (rote Linie in der Abbildung 2) zu ermöglichen.
- Machen Sie einen zweiten Schnitt unterhalb der zweiten Molaren, und legen Sie das Skalpell zwischen den Knochen und der medialen Fläche der Schneidezahn. Wenn der basalen Knochen aufgehoben wird, der Schneidezahn nach außen zu drehen und zu Emaille vorsichtig ausziehen Organgewebe beeinträchtigen mit einer feinen Pinzette.
4. Mikro-Dissektion der Zahnschmelz-Organ unter binokularen Objektiv
- Tropfen Sie 200 µL der Saline Phosphatpuffer (1 X PBS) auf dem Schneidezahn mit einer Pipette. Die labiale Fläche nach oben nehmen Sie die Schneidezahn mit einer feinen Pinzette mit. Machen Sie ein Skalpell zwischen die farblose und die orangefarbenen Teile des Gewebes zu markieren. Dieses Zeichen entspricht den zugrunde liegenden weißen Fleck ist danach zu beobachten (Abbildung 2).
- Kratzen Sie mit einem Bagger oder gleichwertige Werkzeug der Zelloberfläche von der Skalpell-Marke auf der apikalen Ende entsprechend Sekretion Bühne (farblos) Fibrillen, und von der Skalpell-Marke an der Spitze der Schneidezahn für die Reifung Stufe (Orange) Fibrillen.
- Entsprechend der Übergangsphase, wie zuvor beschrieben192-mm-Gewebe zu entfernen. Öffnen Sie den Schneidezahn nicht während Emaille Orgel Dissektion zur Vermeidung von Kontaminationen durch das Mesenchym.
- Schneiden Sie die zervikale Schleife befindet sich unmittelbar am apikalen Teil der Schneidezahn (Abbildung 2) als zuvor beschriebenen20.
- In 10 % Formalin oder Lyse Lösung für weitere Untersuchungen (siehe Tabelle der Materialien) sammeln.
(5) Sammlung von getrennten Emaille Organ Gewebe für weitere Untersuchungen
- Fallen Sie 200 µL PBS 1 X Puffer auf die Schneidezähne.
- Trennen Sie mit einer Skalpellklinge #11 sorgfältig dental Epithelzellen allmählich im Puffer, separat für jede Stufe mit Hilfe der zuvor Skalpell-Marke.
- Legen Sie für Zelle RNA und Protein-Extraktionen das Gewebe in eine Lyse Lösung, die Gewinnung von Proteinen und RNAs ermöglicht (siehe Tabelle der Materialien).
Hinweis: Bereiten Sie hochwertige RNAs durch Drehen des Gewebe-Baggers in der Röhre, und dann schleifen die Zellen bis eine homogene Mischung zu erhalten. Die Mischung ist bereit für RNA und Protein Extraktion des Verfahrens des Herstellers, die zuvor beschriebenen2,8,17Jahre alt war. In der Regel über 5-10 µg Gesamt RNAs und 150 µg Gesamt Proteine wurden für jede Zubereitung erhalten. - Für histologische Analysen setzen Immunhistochemie (IHC) und in Situ Hybridisierung (ISH), die Zellschicht in 10 % Formalin für 2 h, dann bei 4 ° C mit 1 X PBS-Puffer-Speicher. Das Gewebe kann dann in Wachs/Paraffin oder Gewebe OCT für Gefrierschnitte eingebettet werden.
- EMP-Extraktionen dauern Sie die Schneidezahn mit einer feinen Pinzette. Nach einer kurzen Exposition gegenüber Luft (leichte Dehydrierung) ist ein weißer Fleck um den mittleren Teil der labiale Fläche der Schneidezahn sichtbar die Einleitung der Emaille-Mineralisierung darstellt. Dieser weiße Fleck entspricht Übergang- / frühen Reife-Phase der Fibrillen, also verwenden Sie es als ein Indikator für die Extraktion von EMPs21.
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Representative Results
Viele Mängel, Emaille, wie z. B. Dentalfluorose12,13, kann vor Umwelteinflüssen durch übermäßige Fluorid Absorption oder Emaille Hypomineralization ähnlich MIH aufgrund der Exposition gegenüber einigen EDZ-1, 7,22. Diese Entwicklungsstörungen Schmelz Mängel können experimentell auf Ratten (Abbildung 1)1,2,7,23,24reproduziert werden. Die Ratte Hemi-Unterkiefer enthält ein einzelnes Schneidezahn getrennt von drei Backenzähne durch einen Spalt der Diastema genannt. Die stetig wachsende Schneidezähne enthält zwei mineralisierten Gewebe, das Dentin von Odontoblasts produziert und den Zahnschmelz, produziert von Fibrillen im Zahnschmelz Orgel mit anderen Epithelzellen (Abbildung 2). Das Nagetier Schneidezahn erscheint ein geeignetes Modell der Amelogenesis zu studieren, da im Gegensatz zu den Molaren, sie alle Ameloblast Verbreitung/Differenzierung Stufen des Tieres lebenslang enthält.
Mikro-seziert Emaille-Orgel von Ratte Schneidezahn nach Ameloblast Differenzierung Bühne mit Hilfe der ein weißer Fleck, der nach einer leichten Dehydratation scheint getrennt werden kann, und dies als Indikator für die Übergangsphase zwischen Sekretion verwendet werden und Reife-Phase19,21,25. Die Qualität des Zahnschmelzes Mikro seziert, die Gewebe von Trichrome Masson geprüft werden können ist (Abbildung 3A) Färbung. Mikroskopische Beobachtung zeigte typische Emaille Epithelzellen und Ameloblast Palisade. Das Fehlen von mesenchymalen Kontamination war durch das Fehlen von Kollagen grün Färbung (Abbildung 3A) und Ausdruck (Abb. 3 b) bezeugt. Diese Mikro-seziert Gewebe können für Qualitative analyses wie IHC (Abbildung 3) und ISH und quantitativen Analysen wie RT-qPCR (Abb. 3 b), RNA-Seq und Western blotting verwendet werden. Zum Beispiel der Androgen-Rezeptor wurde speziell in der Reifung-Bühne-Fibrillen mit einem spezifischen Antikörper gegen dieses Protein lokalisiert (siehe Tabelle der Materialien) (Abbildung 3)8. Die wichtigsten Ameloblast Differenzierung Stufen zeichnen sich durch spezifische gen Ausdruck Muster26 , die auf Mikro-seziert Emaille Orgel identifiziert werden können. Z. B. Sekretion-Bühne Fibrillen express enamelin2 und Reifung-Bühne Fibrillen express Kallikrein 4 (KLK4) (Abb. 3 b). Sie enthalten hohe Konzentrationen an Ferritin, die verleihen die Fähigkeit, hohe Mengen an Eisen, zu speichern, die für die orange Farbe des Zahnschmelzes27verantwortlich ist.
Fluorid-Unterbrechung der Amelogenesis kann leicht verfolgt werden, durch Beobachtung der Zelle Lysates für RNA-Extraktion: Steuern Reifung-Bühne Lysates waren Orange, während Fluorid behandelt Licht waren gelb, farblos (Abb. 4A). Analyse der RNA-Ebenen aus Mikro-seziert Reifung-Bühne Emaille Orgel zeigte KLK4 Down-Regulation auf Fluorid Behandlung (Abbildung 4 b), was auch durch eine groß angelegte transkriptomischen Analyse belegt wurde extrahiert berichtete kürzlich2. Spezifische Proteine ausgedrückt entweder durch Sekretion oder Reifung-Bühne, die Fibrillen mit Mikro-seziert Emaille Orgel28auch lokalisiert werden können. Beispielsweise wurde speziell der Androgenrezeptor lokalisiert mit Mikro-seziert Emaille Orgel8,28.
Abbildung 1: Email an Ratten ausgesetzt, Fluorid (NaF) in Kombination oder nicht mit Bisphenol A (BPA) beobachteten Defekte. (A) schematische Darstellung der vier experimentelle Gruppen von Wistar Ratten für die vorliegende Studie bildeten Gruppen, die abhängig von den verschiedenen Umweltbedingungen auf die Ratten angewendet. Von Tag 1 (Fecondation) bis Entwöhnung Tag 21 (P21) war 5 µg/kg BPA in 0,5 mL Maisöl oral durch Magensonde täglich, Schwangere und stillende Frauen verabreicht während Maisöl allein zur Kontrollgruppe verabreicht wurde. Nach dem absetzen, war jeder Damm identifiziert und in die entsprechenden zwei Gruppen nach dem Zufallsprinzip verteilt. Männliche Ratten wurden für diese Studie ausgewählt und 5 µg/kg/Tag BPA allein 5 mM NaF allein, ausgesetzt oder beide bei der gleichen Dosis bis 65 Tage nach der Geburt (P65). Kontrollgruppe erhielt Lösungsmittel allein. (B) bei postnatalen Tag 30 (P30), Ratten chronisch ausgesetzt niedrig dosiertem BPA ausgestellt Weiße undurchsichtige Flecken und ein nicht mehr offensichtlicher dental Phänotyp wurde für Erwachsenen Ratten (P65) identifiziert. Bei Ratten mit NaF behandelt wurden abwechselnd weißen und orangefarbenen Bands der typischen Dentalfluorose (DF) beobachtet. Ein schwerer Phänotyp zeichnet sich durch eine wichtige Schneidezahn Verfärbung wurde bei Ratten ausgesetzt beide Agenten identifiziert. Homogene orange Inzisal Emaille versinnbildlicht Kontrolle Ratten. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Schematische Darstellung des Verfahrens. Isolierung von Fibrillen von Sekret und Reifung-Etappen von Mikro-seziert Emaille Orgel. Die Ratte Hemi-Unterkiefer enthält drei Molaren und eine stetig wachsende Schneidezahn mit zwei mineralisierten Gewebe, das Dentin, produziert von Odontoblasts (in gelb) und den Zahnschmelz von Fibrillen (in Orange) produziert. Wenn der Schneidezahn ist isoliert und leicht dehydriert, ist ein weißer Fleck in der Nähe der apikalen Teil der labiale Oberfläche zu beobachten. Es hilft, um Ameloblast Stadium der Differenzierung, zu erkennen, wie es der Übergangsphase zwischen der Sekretion und Reifung-Phase umfasst. Die Emaille-Orgel ist sorgfältig Mikro seziert, in 3 Teilen je nach der Ameloblast Differenzierung Stufen getrennt und verwendet für qualitative (histologischen) Untersuchung oder quantitative experimentelle Ansätze (mRNA und Protein Analysen von RT-qPCR und Western Blot, beziehungsweise).
Abbildung 3: Qualitätskontrolle von Mikro-seziert Sekretion - und Reifung-Stadien der Schmelz Orgel. Ratte-Emaille-Orgel ist in 3 Teile mit der zervikalen Schleife, die Sekretion-Bühne Fibrillen und Reifung Bühne Fibrillen getrennt. (A) Trichrome Masson Färbung des Mikro-seziert Teile zeigte die verschiedenen epithelialen Zellen und das Fehlen von mesenchymalen Zellen. Skala bar, 100 µm. (B) gen Expressionsanalyse von RT-qPCR Experimente von RNAs, die Sekretion und Reifung-Bühne Emaille Organ entnommen. Ein typisches Muster von enamelin und KLK4 Ausdruck wurde beobachtet, sowie das Fehlen von Kollagen 1 in mesenchymale Zellen erwartet. (C) fluoreszierende Färbung verwendet (siehe Tabelle der Materialien) ein Antikörper spezifisch gegen den Androgen-Rezeptor nur geäußerten Reifung-Bühne Fibrillen gerichtet. Skala bar 20 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4: repräsentative Ergebnisse mit Mikro-seziert Ratte Emaille Orgel. (A) wenn Zellen in einem Lyse-Puffer für die RNA-Extraktion Nukleinsäuretablette waren (siehe Tabelle der Materialien), Reifung-Bühne Gewebe mit pigmentierten Fibrillen erschien Orange unter Kontrolle und BPA-behandelten Bedingungen. Die Sekretion-Gruppenphase Teil ist unabhängig von den Bedingungen gelb. In NaF Behandlung waren alle Lysates Licht gelb, farblos. (B) Beispiel für RT-qPCR Daten mit RNA Zubereitungen aus Emaille Organe von Ratten an verschiedenen Umweltbedingungen eingereicht. NaF Down-reguliert KLK4 in der Reifung-Bühne und BPA erhöht enamelin Ausdruck in der Sekretion-Bühne. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Veränderte Ameloblast Aktivität und/oder gestörten Ameloblast Proliferation, Differenzierung und Reifung Prozesse führen zu irreversiblen Schmelz Mängel und im Gegenzug, die Charakterisierung der Schmelz Mängel kann helfen entwickeln Verständnis für die geänderten Ameloblast Aktivität während Amelogenesis. So sind die Studien an isolierten Emaille Orgel Determinante, die pathologische Ereignisse führt zu defekten unabhängig ihrer Herkunft, Umwelt- oder genetische Schmelz aufzuklären.
Diese Technik wurde ursprünglich von Hiller Et Al. beschrieben 17 und Robinson Et al. 18, und wird verwendet, um spezifische Wirkungen auf jeder Stufe des Zahnschmelzes Orgel Differenzierung zu demonstrieren. Es wurde dann für EMP Extraktionen19,24,25angepasst. Wir verwenden derzeit dieses Verfahren die Hauptteile der Emaille-Orgel zu trennen und sammeln der biologischen Proben unter verschiedenen Umweltbedingungen RNAs und Proteine (möglicherweise Intra- und extra - zellulare Proteine) mit quantitativen und qualitativen Analyse Techniken.
Die Präzision der Mikro-Dissektion erfordert umfangreiche Ausbildung vor ihrer Anwendung, um die Auflistung der erhaltenen Emaille-Orgel zu ermöglichen und mesenchymale Kontamination und Zerstörung des Gewebes zu vermeiden. Darüber hinaus ist es ziemlich schwierig mit Mäuse oder kleine Ratten erfolgreich zu sein. In der Tat ist der schwierigste Teil des Verfahrens zur Erhaltung der Gewebe Morphologie, Histologie und Orientierung im IHC und ISH, im Gegensatz zu klassischen Techniken häufig auf Schneidezähne für diese beiden Ansätze durchgeführt.
Eines der wichtigsten Vorteile der Verwendung der Mikro-seziert Emaille-Orgel im Vergleich zu den entmineralisiertem ganze Hemi-Unterkiefer ist die Erhaltung des Zahnschmelzes RNAs und Proteine durch das Fehlen von jeder Behandlung Post-Sammlung. Die Mikro-seziert Emaille-Orgel kann direkt für alle Techniken der Molekularbiologie und Biochemie ohne Auswahl oder Kultivierung von Zellen verwendet werden. Der Vorteil dieses Verfahrens ist die direkte Messungen der RNA und Protein Ebenen, die ihre Mengen in bestimmten Fibrillen in Vivo in physiologische oder pathologische Bedingungen widerspiegelt. Darüber hinaus wirken einige Giftstoffe auf der Bühne eine Differenzierung speziell, wie der Fall mit Fluorid, ist die Reifung-Bühne Fibrillen und nicht auf Sekretion-Stufe zu23,24wirkt. Die Mikro-Dissektion der verschiedenen Regionen der Schmelz Orgel ermöglicht das Studium der Wirkmechanismus von einige Giftstoffe oder spezifischer Gene, deren Auswirkungen auf die ganze Schmelz-Orgel oder isolierte Zellen nachweisbar können. In der Tat differenziert Fibrillen, besonders sind, sind schwer zu sammeln und Kultur in-vitro-, die durch den Mangel an Studien zu diesem Thema berichtet bezeugt ist. Die nur dentalen Epithelzellen, die isoliert werden können sind Pre-Fibrillen und Stammzellen aus der zervikalen Schleife20. Darüber hinaus berichtet Ameloblastic-Zell-Linien, vor allem Ratte HAT 729, Maus LS830, ALC31und menschlichen AM-132, oft verlieren die Differenzierungsmerkmale von in Vivo Fibrillen: sie drücken extrazelluläre Matrixproteine (EMPs) wie Ameloblastin ähnlich wie Sekretion-Bühne Fibrillen, und auch KLK4 oder SLC26A4/Pendrin, z. B. Reifung-Bühne Fibrillen8, sind aber mehr oder weniger nicht ausdrückliche Amelogenin und mineralisieren die Matrix, Emaille zu produzieren. Die Isolation der zahnärztlichen epithelialen Stammzellen und embryonalen Fibrillen kann eine Option, um den ersten Stadien der Ameloblast Differenzierung studieren dar, sondern die Studien über das terminal Emaille Mineralisierung Verfahren nicht durchgeführt werden anders als mit in Vivo Modellen. Dieser letzte Teil der Amelogenesis ist bestimmend für Emaille-Qualität. Während der Zahnentwicklung, wie Bmp, Msx, Fgf, Kerbe, Schlüsselfaktoren beteiligt Shh, Wnt sind gut beschrieben33,34, Beteiligten eng Schmelz Qualität sind immer noch schlecht verstanden. Die Charakterisierung der Schlüsselfaktoren in Emaille-Qualität ist notwendig, um Karies zu entziffern und entdecken innovative heilende oder vorbeugende Behandlung für Karies, die öffentlichen Gesundheitswesens stellen ein Problem dar als 92 % der 20 bis 64 Jahre alten Erwachsenen in der Welt haben Sie oder hatten Sie mindestens eine Karies35,36,37.
Nagetiere ausgesetzt Umweltgifte Amelogenesis stören und Emaille Qualität verändern können, können ein gutes Modell für Studien über Umweltfaktoren darstellen. Ähnliche Verfahren könnte auch für funktionelle Studien auf die Gene von Interesse, die direkt oder indirekt mit Amelogenesis verwendet werden. Die Mikro-seziert Emaille-Orgel ist ein geeignetes Material zur Charakterisierung der Mechanismen der Wirkung von Schadstoffen und deren Ziel Gene in Vivo experimentelle Verzerrungen zu vermeiden. Bei Entwicklungsstörungen Schmelz Mängel geprägt sein werden, könnte ein solcher Ansatz als ein Vorhersagemodell des pathologischen Auswirkungen neuartiger Schadstoffe verwendet werden.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenlegen.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der Universität Paris-Diderot, der französische National Institute of Health und medizinische Forschung (INSERM) und das französische Institut für zahnärztliche Forschung (IFRO) finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bisphenol A | Sigma Aldrich, Saint Louis MO | 239658 | |
| formalin 10% | Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO | HT5012 | |
| Tri-Reagent | Euromedex, France | TR118 | |
| RLT buffer | Qiagen, Les Ulis, France | 74126 | RNeasy Protect Mini Kit |
| Androgen receptor antibody | Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) | sc-816 | rabbit polyclonal antibody |
| PBS 10x | EUOMEDEX | ET330.A | |
| Sodium fluoride (NaF) | Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO | S-1504 | |
| paraplast regular | Leica microsystems, Nanterre cedex, France | 39601006 | called was/parafin in the text |
| tissue OCT | VWR, Fontenay-sous-Bois, France | 411243 | |
| Extra Fine Bonn Scissors - Straight/8.5 cm | PHYMEP , Paris, France | 14084-08 | |
| Handle for Scalpel Blades - 12.5 cm | PHYMEP, Paris, France | 10035-12 | |
| Curved Scalpel Blade | PHYMEP , Paris, France | 10035-20 | |
| Dissecting Knife - Fine/Straight Tip | PHYMEP , Paris, France | 10055-12 | |
| Circle Knife | PHYMEP, Paris, France | 10059-15 | |
| scalpel blades n°11 Swann-Morton | VWR, Fontenay-sous-Bois, France | 233-0024 | |
| binocular lens | Leica biosystems, Nanterre cedex, France | MZFLIII |
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