Summary
Noções básicas sobre esmalte formação e possíveis alterações requer o estudo da atividade do Ameloblasto. Aqui, descrevemos um método confiável e consistente para microdissecar o esmalte órgãos contendo ameloblastos fase de maturação e de secreção que podem ser utilizados para procedimentos experimentais mais quantitativos e qualitativos.
Abstract
Esmalte defeitos resultantes de condições ambientais e as formas de vida são preocupações de saúde pública por causa de sua alta prevalência. Estes defeitos resultam de actividade alterada das células responsáveis pela síntese de esmalte chamado ameloblastos, que apresentam no órgão do esmalte. Durante a Amelogênese, ameloblastos seguem uma sequência específica e precisa dos acontecimentos de proliferação, diferenciação e morte. Um rato continuamente crescendo incisivos é um modelo experimental adequado para estudar Ameloblasto fases de atividade e diferenciação em condições fisiológicas e patológicas. Aqui, descrevemos um método confiável e consistente para microdissecar o órgão do esmalte de ratos expostos a tóxicos ambientais. O epitélio dental microdissecado conter secreção e maturação-estágio ameloblastos que podem ser utilizados para experiências qualitativas, tais como ensaios de imuno-histoquímica e hibridação in situ , bem como para análises quantitativas como RT-qPCR, RNA-seq e mancha ocidental.
Introduction
Muitos defeitos de esmalte do desenvolvimento podem resultar da exposição a tóxicos ambientais e/ou estilo de vida inadequado1,2,3,4. Caracterização de perturbar eventos e moléculas de Amelogênese usando o procedimento descrito neste momento irá promover o uso de defeitos de esmalte resultante como primeiros marcadores de exposição à várias substâncias tóxicas e pode ajudar a reconstituir a história da saúde de cada paciente durante o período perinatal, quando o esmalte é synthetized1,2. Síntese de esmalte pode ser dividido em quatro fases principal, dependendo do Ameloblasto atividade5. O primeiro passo reagrupa proliferação de célula e pre-Ameloblasto precursor. Durante a segunda etapa, ameloblastos diferenciados secretam proteínas da matriz esmalte (EMPs), principalmente amelogenina, enamelin e ameloblastin, que determinam a espessura do esmalte final. Assim, qualquer interrupção da síntese de EMP leva a defeitos quantitativos do esmalte. Após a deposição da espessura de esmalte cheia, começa a fase de maturação. Durante este estágio, crescimento de apatita do cristalite em largura e espessura permite que o esmalte alcançar a mais elevada relação de mineralização encontrada em um tecido biológico, com até 96% em peso. Defeitos de esmalte desreguladoras eventos que ocorrem durante a liderança da fase maturação qualitativa. Finalmente, ameloblastos entram numa fase de post-maturação, também chamada de pigmentação em roedores e sofrem apoptose durante a erupção do dente fazendo defeitos de esmalte (se houver) irreparáveis e irreversíveis, assim, defeitos fornecem potencial gravação retrospectiva de Ameloblasto salienta. Em roedores, Amelogênese segue uma sequência semelhante de eventos com a particularidade que os incisivos estão crescendo continuamente, o que os torna um modelo adequado para estudar o processo geral de Amelogênese. Assim, qualquer interrupção da Amelogênese resulta em alterações da qualidade do esmalte e/ou quantidade, dependendo da janela de tempo do evento perturbador. Nesse sentido, a exposição a dioxinas, chumbo e sistema endócrino (CDE) como bisfenol A (BPA), genisteína e vinclozolina, têm sido mostrados para gerar esmalte hypomineralizations1,2,3 ,6,7,8. Assimétricos brancos opacos pontos foram identificados sobre os incisivos de ratos expostos a uma dose BPA de baixa dose durante o período fetal e o primeiro mês após o nascimento1. Estes defeitos de esmalte em ratos e aqueles de hipomineralização humana molar incisivo (MIH), possuem características semelhantes de clínicas, estruturais e bioquímicas. MIH é uma patologia de esmalte dental recentemente descrito, para que a etiologia ainda permanece incerto9,10 , apesar de muitos fatores causais tendo sido a hipótese de9,10,11 ,12.
Outra patologia de hipomineralização esmalte importantes devido a fatores ambientais é a fluorose dental (DF), que é a consequência da absorção excessiva de flúor (> 0,1 mg/kg/dia)13,14. A principal fonte de flúor é a água potável que é completada ou naturalmente enriquecida com flúor. Flúor é também muitas vezes prescrito para prevenir a cárie dentária, mas a dose profilática é 50% menor do que a um tóxico (≤0.05 mg/kg/dia). MIH e DF, duas patologias frequentes resultantes da exposição a fatores ambientais, podem apresentar características comuns que precisam ser caracterizados devido a potencialização dos efeitos hypomineralizing de flúor combinado com outras substâncias tóxicas como CDE2 ou amoxicilina15.
Microdissecação do órgão do esmalte rato contendo ameloblastos em fases diferentes de diferenciação vai ajudar a entender o mecanismo de ação das moléculas capazes de interromper a atividade Ameloblasto e causar defeitos de esmalte ser diagnosticada após a erupção do dente. Em outras palavras, a caracterização das alterações do esmalte gene expressão e esmalte matriz composição devido a tóxicos ambientais permite a reconstituição da história de exposição a substâncias tóxicas e facilita o monitoramento de segurança ambiental para o público saúde.
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Protocol
Todos os animais utilizados neste estudo foram mantidos de acordo com as orientações para o cuidado e o uso de animais de laboratório do Ministério da agricultura (A-75-06-12).
1. animal exposição a substâncias tóxicas
- Antes de realizar este protocolo, obter aprovação institucional necessária e certifique-se de cumprir todas as orientações de cuidados com animais.
- Aplica o design do protocolo de pesquisa que permite a constituição de diferentes grupos experimentais para testar o impacto do molecule(s) investigado na fase de secreção de Ameloblasto e o estágio de maturação do Ameloblasto. Aqui, quatro grupos de ratos Wistar machos foram constituídos dependendo de sua exposição ao fluoreto (NaF) em combinação ou não com a ABP (figura 1A)2. Todos os animais foram observados e dissecados em dia 65 (figura 1B).
2. dissecação de Hemi-mandíbulas de ratos adultos
- Eutanásia em ratos por asfixia de CO2 , opcionalmente seguida por decapitação na cabeça separada do resto do corpo. Expor os ratos de CO2 por 5 min em uma caixa dedicada16.
- Remova toda a pele dos lábios inferiores usando um bisturi #11 a fim de obter acesso fácil aos incisivos inferiores.
- Com o bisturi mesmo, fazer uma incisão entre os dois incisivos inferiores com uma ligeira pressão e mandíbula será dividida em duas metades.
- Cortar a articulação mandibular temporal com um bisturi para desanexar o maxilar e segurar a hemi-mandíbula com uma pinça fina.
- Corte os tecidos moles circundantes com um bisturi e retire todos os músculos, tendões e ligamentos, com uma espátula até que o osso está completamente limpo.
3. isolamento do incisivo17,18
- Cuidadosamente raspe o osso, colocando a lâmina paralela ao eixo longitudinal principal do incisivo. Começa a crista óssea perto as dicas do incisivo (extremidade proximal) até o final do incisivo perto do loop do colo do útero. O movimento de incisão procede de proximal para distal direção.
- Fazer um primeiro corte distalmente ao lacete cervical com o bisturi para remover o Gônio da hemi-mandíbula e permitir tirar o incisivo facilmente sem danificar a ansa cervical ou fase secretora de ameloblastos (linha vermelha na Figura 2).
- Faça um segundo corte abaixo o segundo molar e inserir o bisturi entre o osso e a superfície medial do incisivo. Quando todo o osso basal é levantado, girar para fora o incisivo e tirar com cuidado para evitar esmalte tecido órgão prejudicar usando uma pinça fina.
4. microdissecação do órgão do esmalte sob lente Binocular
- Largue a 200 µ l de tampão fosfato salino (PBS 1x) sobre o incisivo usando uma pipeta. Leve o incisivo com uma pinça fina com a superfície labial voltada para cima. Deixar um bisturi marca entre o incolor e as laranja partes do tecido. Esta marca corresponde a mancha branca subjacente que está sendo observado mais tarde (Figura 2).
- Raspe, com uma escavadeira ou ferramenta equivalente, superfície celular das marcas de bisturi para o correspondente da extremidade apical de ameloblastos (incolor) fase de secreção e para a marca de bisturi para a ponta do incisivo para os ameloblastos de palco (laranja) de maturação.
- Remova o tecido de 2mm, correspondente à fase de transição, como anteriormente descrito,19. Não abra o incisivo durante a dissecção de órgão do esmalte para evitar contaminação pela mesênquima.
- Cortar o laço cervical situado imediatamente na parte apical do incisivo (Figura 2) conforme descrito anteriormente20.
- Cobrá-lo em solução de formalina ou lise de 10% para mais investigações (ver Tabela de materiais).
5. coleção de tecidos de órgãos separados esmalte para investigações
- Queda de 200 µ l PBS 1 X tampão sobre o incisivo.
- Com uma lâmina de bisturi #11, cuidadosamente separe as células epiteliais dentais gradualmente no buffer, separadamente para cada estágio com a ajuda da marca bisturi feita anteriormente.
- Para a célula do RNA e extrações de proteína, coloque o tecido em uma solução de Lise que permite a extração de proteínas e RNAs (ver Tabela de materiais).
Nota: Prepare RNAs de alta qualidade, transformando o tecido-escavadeira no tubo e em seguida moer as células até obter uma mistura homogénea. A mistura está pronta para extração de RNA e proteína de acordo com o procedimento do fabricante, o que foi descrito anteriormente,2,8,17. Geralmente, aproximadamente 5-10 µ g total RNAs e 150 µ g proteínas totais foram obtidas para cada preparação. - Para análise histológica, imuno-histoquímica (IHC) e a hibridação in situ (ISH), colocam a camada de células em formol a 10% por 2 h e, em seguida, loja a 4 ° C em PBS 1x. O tecido pode então ser incorporado em cera/parafina ou tecido OCT para seções congeladas.
- Para extrações de EMP, leve o incisivo com pinça fina. Após uma curta exposição ao ar (desidratação ligeira), uma mancha branca será visível em torno da parte média da superfície vestibular do incisivo, que representa o início da mineralização do esmalte. Esta mancha branca corresponde a transição- / cedo maturação-estágio de ameloblastos, então usá-lo como um indicador para a extração de EMPs21.
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Representative Results
Muitos esmalte defeitos, tais como fluorose dentária12,13, pode resultar de condições ambientais devido à absorção excessiva de flúor ou esmalte hipomineralização semelhante a MIH devido à exposição a alguns CDE1, 7,22. Esses defeitos no desenvolvimento do esmalte podem ser reproduzidos experimentalmente em ratos (Figura 1)1,2,7,23,24. A rato hemi-mandíbula contém um incisivo único separado três molares por um intervalo chamado o diastema. O incisivo continuamente crescente contém dois tecidos mineralizados, o esmalte produzido pelos ameloblastos presentes no órgão do esmalte com outras células epiteliais (Figura 2) e a dentina produzida pelos odontoblastos. O roedor incisivo aparenta ser um modelo adequado para estudar a Amelogênese como, contrariando os molares, que contém todos os estágios de diferenciação/proliferação de Ameloblasto ao longo da vida do animal.
Órgão do esmalte microdissecado de incisivos de ratos pode ser separado de acordo com o estágio de diferenciação Ameloblasto com a ajuda de uma mancha branca que aparece após uma ligeira desidratação, e isto pode ser usado como um indicador da fase de transição entre a secreção - e estágios de maturação19,21,25. A qualidade do esmalte microdissecado tecidos podem ser verificados pelo corante tricromo de Masson é coloração (Figura 3A). Observação microscópica mostrou células epiteliais típico de esmalte e Ameloblasto paliçada. A ausência de contaminação mesenquimal foi atestada pela ausência de verde de colágeno coloração (Figura 3A) e expressão (Figura 3B). Estes tecidos dissecados-micro podem ser utilizados para qualitative analyses como IHC (Figura 3) e ISH e análises quantitativas como RT-qPCR (Figura 3B), RNA-seq e mancha ocidental. Por exemplo, o receptor de andrógeno era especificamente localizado nos ameloblastos maturação-palco usando um anticorpo específico dirigido contra esta proteína (ver Tabela de materiais) (Figura 3)8. Os estágios de diferenciação principal Ameloblasto caracterizam-se por gene específico expressão padrões26 pode ser identificada no órgão do esmalte microdissecado. Por exemplo, secreção-palco ameloblastos expressam enamelin2 e estágio de maturação ameloblastos expressam calicreína 4 (KLK4) (Figura 3B). Eles contêm altos níveis de ferritina, o que confere a capacidade de armazenar grandes quantidades de ferro, que é responsável pela cor laranja do esmalte27.
Interrupção de fluoreto de Amelogênese facilmente pode ser seguida pela observação de lisados celulares para extrações de RNA: controlar lysates do estágio de maturação era laranja, Considerando que os tratados com flúor foram luz amarelo a incolor (Figura 4A). Análise dos níveis de RNA extraído do órgão do esmalte microdissecado maturação-palco mostrou KLK4 para baixo-regulamento sobre tratamento de flúor (Figura 4B), que também foi evidenciado por uma análise de transcriptomic em grande escala recentemente relatados2. Proteínas específicas expressaram quer por secreção ou maturação-estágio ameloblastos também podem ser localizados usando esmalte microdissecado órgão28. Por exemplo, o receptor de andrógeno era especificamente localizado usando esmalte microdissecado órgão8,28.
Figura 1: esmalte defeitos observados em ratos expostos ao flúor (NaF), em combinação ou não com bisfenol A (BPA). (A) representação esquemática dos quatro grupos experimentais de ratos Wistar constituídos para o presente estudo, grupos que dependia as diferentes condições ambientais aplicadas aos ratos. Gestacional dia 1 (fecundação) até o desmame dia 21 (P21), 5 µ g/kg BPA em 0,5 mL de óleo de milho foi administrada por via oral por gavagem diariamente para fêmeas gestantes e lactantes, Considerando que o óleo de milho sozinho foi administrado ao grupo controle. Após o desmame, cada barragem foi identificada e distribuída aleatoriamente em um dos dois grupos correspondentes. Ratos machos foram selecionados para este estudo e expostos a 5 µ g/kg/dia BPA sozinho, 5mm NaF sozinho, ou ambos com a mesma dose até 65 dias após o nascimento (P65). Grupo de controle foi dado solvente sozinho. (B) no pós-Natal dia 30 (P30), ratos cronicamente expostos ao BPA de baixa dose exibiram manchas brancas opacas e um fenótipo dental evidente já não foi identificado por ratos adultos (P65). Bandas alternadas de brancas e laranja de fluorose dentária típica (DF) foram observadas em ratos tratados com NaF. Um fenótipo mais grave, caracterizado por uma descoloração importante incisivo foi identificado em ratos expostos a ambos os agentes. Esmalte incisal laranja homogêneo tipificou ratos controle. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: representação esquemática do procedimento. Isolamento de ameloblastos de secreção e maturação-estágios do órgão do esmalte microdissecado. A rato hemi-mandíbula contém três molares e um incisivo continuamente crescente com dois tecidos mineralizados, a dentina produzida pelos odontoblastos (em amarelo) e o esmalte produzido pelos ameloblastos (em laranja). Quando o incisivo é isolado e ligeiramente desidratado, uma mancha branca perto da parte apical da superfície labial é observável. Ajuda a identificar o Ameloblasto estágio de diferenciação, que abrange a fase de transição entre a secreção e maturação-estágios. O órgão do esmalte é cuidadosamente microdissecado, separada em 3 partes, dependendo os estágios de diferenciação do Ameloblasto e usado para análise qualitativa (histológica) ou abordagens experimentais quantitativas (análise do mRNA e proteína por RT-qPCR e Ocidental, mancha, respectivamente).
Figura 3: controle de qualidade de microdissecado secreção e maturação-estágios do órgão do esmalte. Órgão do esmalte de rato é separada em 3 partes, contendo o loop do colo do útero, a secreção-palco ameloblastos e ameloblastos do estágio de maturação. (A) corante tricromo de Masson, coloração de peças microdissecado mostrou as diferentes células epiteliais e a ausência de células mesenquimais. Escala da barra, 100 µm. (B) análise de expressão do Gene por RT-qPCR experimentos de RNAs extraídos da fase de maturação e secreção órgão do esmalte. Foi observado um padrão típico de enamelin e KLK4 expressão, bem como a ausência de colágeno 1 esperado em células mesenquimais. Fluorescente (C) coloração usado um anticorpo (ver Tabela de materiais) dirigido especificamente contra o receptor de andrógeno, expressado somente pelo estágio de maturação ameloblastos. Escala da barra, 20 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: resultados representativos obtidos com o órgão do esmalte dissecado micro rato. (A) quando as células foram resuspended em um tampão de Lise para extração do RNA (ver Tabela de materiais), tecido de maturação-palco contendo pigmentos ameloblastos apareceu laranja em condições de controle e BPA-Tratado. A porção de secreção-estágio é amarela, não importa as condições. No tratamento do NaF, todos os lisados foram luz amarelo a incolor. (B) exemplo de RT-qPCR dados obtidos com os preparativos de RNA de órgãos de esmalte de ratos submetidos a diversas condições ambientais. NaF para baixo-regulado KLK4 na fase de maturação, e BPA aumentou a expressão enamelin na fase de secreção. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Atividade Ameloblasto alterado e/ou interrompidos Ameloblasto proliferação, diferenciação e liderança de processos de maturação a defeitos de esmalte irreversível e, por sua vez, a caracterização de defeitos de esmalte pode ajudar a desenvolver a compreensão de que a alteração Ameloblasto atividade durante a Amelogênese. Assim, os estudos sobre o órgão do esmalte isoladas são determinantes para elucidar os eventos patológicos levando a esmalte defeitos seja qual for a sua origem, ambiental ou genética.
Esta técnica foi descrita originalmente por Hiller et al 17 e Robinson et al 18e é usado para demonstrar efeitos específicos em cada fase da diferenciação de órgão do esmalte. Ele então foi adaptado para EMP extrações19,24,25. Atualmente utilizamos este procedimento para separar as partes principais do órgão do esmalte e coletar as amostras biológicas em diferentes condições ambientais para analisar o RNAs e proteínas (possivelmente intra e extra cellular proteínas) usando quantitativa e qualitativa técnicas.
A precisão da micro-dissecção requer formação substancial antes de sua aplicação, para permitir que a coleção do órgão do esmalte preservada e para evitar contaminação mesenquimal e qualquer destruição de tecido. Além disso, é muito difícil ter sucesso com ratos ou ratos pequenos. Com efeito, a parte mais complicada do processo é preservar a morfologia do tecido, histologia e orientação em IHC e ISH, ao contrário de técnicas clássicas comumente realizada em incisivos para essas duas abordagens.
Uma das principais vantagens de usar o órgão do esmalte microdissecado em comparação com a desmineralizada toda hemi-mandíbula é a manutenção do esmalte RNAs e proteínas graças à falta de qualquer pós-coleção tratamento. O órgão do esmalte microdissecado diretamente pode ser usado para todas as técnicas de biologia molecular e bioquímica sem seleção ou cultivo de células. A vantagem deste procedimento é as medições directas dos níveis de RNA e proteína que reflete suas quantidades em ameloblastos específicas na vivo em condições fisiológicas ou patológicas. Além disso, algumas tóxicas para atuam no palco de uma diferenciação especificamente, como é o caso do flúor, que atua na fase de maturação ameloblastos e não na secreção-palco os23,24. A microdissecação das diferentes regiões do órgão do esmalte permite o estudo do mecanismo de ação de algumas substâncias tóxicas ou genes específicos, cujos efeitos podem ser detectados sobre o órgão do esmalte inteiro ou em células isoladas. Com efeito, ameloblastos, especialmente diferenciado aqueles, são difíceis de coletar e cultura in vitro, que é atestada pela falta de estudos relatados sobre o assunto. As células epiteliais só dentais que podem ser isoladas são pre-ameloblastos e células-tronco do laço cervical20. Além disso, as linhas de célula ameloblastic relatados, principalmente rato HAT-729, rato LS830, ALC31e humano AM-132, muitas vezes perdem as características de diferenciação dos ameloblastos no vivo : eles expressam proteínas de matriz extracelular (EMPs) como ameloblastin semelhante a secreção-palco ameloblastos e também KLK4 ou SLC26A4/pendrin, tais como o estágio de maturação ameloblastos8, mas são mais ou menos incapazes de expressar amelogenina e a mineralização da matriz para produzir o esmalte. O isolamento de células-tronco epiteliais dentais e ameloblastos embrionários pode constituir uma opção para estudar os primeiros estágios de diferenciação do Ameloblasto, mas os estudos sobre o processo de mineralização do esmalte terminal não podem ser efectuados de modo diferente do que com modelos na vivo . Esta última parte da Amelogênese é determinante para a qualidade do esmalte. Considerando que os principais fatores envolvidos no desenvolvimento de dente, como Bmp, Msx, Fgf, entalhe, Shh, Wnt são bem descritos33,34, firmemente envolvidos na qualidade do esmalte são ainda mal compreendidos. A caracterização dos fatores-chave na qualidade do esmalte é necessária decifrar a cárie dentária e descobrir o tratamento inovador de curativo ou preventivo para a cárie dentária, que constituem um problema de saúde pública como 92% de 20 a 64 anos velhos adultos no mundo têm ou tiveram pelo menos uma cárie35,36,37.
Roedores expostos a tóxicos ambientais capazes de perturbar Amelogênese e alterar a qualidade do esmalte podem constituir um bom modelo para estudos sobre fatores ambientais. Procedimentos semelhantes também podem ser utilizados para estudos funcionais sobre os genes de interesse, directa ou indirectamente envolvido na Amelogênese. O órgão do esmalte microdissecado é um material adequado para caracterizar os mecanismos de ação dos tóxicos e seu alvo genes na vivo evitando qualquer viés experimental. Quando defeitos de esmalte do desenvolvimento serão caracterizados, tal abordagem poderia ser utilizada como um modelo preditivo de potenciais impactos patológica dos poluentes romance.
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Disclosures
Os autores têm sem conflitos de interesse a divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pela Universidade Paris-Diderot, o Instituto Nacional francês de saúde e pesquisa médica (INSERM) e o Instituto Francês de pesquisa odontológica (IFRO).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bisphenol A | Sigma Aldrich, Saint Louis MO | 239658 | |
| formalin 10% | Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO | HT5012 | |
| Tri-Reagent | Euromedex, France | TR118 | |
| RLT buffer | Qiagen, Les Ulis, France | 74126 | RNeasy Protect Mini Kit |
| Androgen receptor antibody | Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) | sc-816 | rabbit polyclonal antibody |
| PBS 10x | EUOMEDEX | ET330.A | |
| Sodium fluoride (NaF) | Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO | S-1504 | |
| paraplast regular | Leica microsystems, Nanterre cedex, France | 39601006 | called was/parafin in the text |
| tissue OCT | VWR, Fontenay-sous-Bois, France | 411243 | |
| Extra Fine Bonn Scissors - Straight/8.5 cm | PHYMEP , Paris, France | 14084-08 | |
| Handle for Scalpel Blades - 12.5 cm | PHYMEP, Paris, France | 10035-12 | |
| Curved Scalpel Blade | PHYMEP , Paris, France | 10035-20 | |
| Dissecting Knife - Fine/Straight Tip | PHYMEP , Paris, France | 10055-12 | |
| Circle Knife | PHYMEP, Paris, France | 10059-15 | |
| scalpel blades n°11 Swann-Morton | VWR, Fontenay-sous-Bois, France | 233-0024 | |
| binocular lens | Leica biosystems, Nanterre cedex, France | MZFLIII |
References
- Jedeon, K., et al. Enamel defects reflect perinatal exposure to bisphenol A. Am J Pathol. 183, 108-118 (2013).
- Jedeon, K., et al. Chronic Exposure to Bisphenol a Exacerbates Dental Fluorosis in Growing Rats. J Bone Miner Res. 31, 1955-1966 (2016).
- Alaluusua, S., et al. Developmental dental aberrations after the dioxin accident in Seveso. Environ Health Perspect. 112, 1313-1318 (2004).
- Chapple, I. L., et al. Interaction of lifestyle, behaviour or systemic diseases with dental caries and periodontal diseases: consensus report of group 2 of the joint EFP/ORCA workshop on the boundaries between caries and periodontal diseases. J Clin Periodontol. 44, S39-S51 (2017).
- Nanci, A. Enamel: Composition, Formation, and Structure. Ten Cate's Oral Histology Development, Structure, and Function. , 8th ed, Elsevier mosby. 122-164 (2012).
- Leite, G. A., Sawan, R. M., Teofilo, J. M., Porto, I. M., Sousa, F. B., Gerlach, R. F. Exposure to lead exacerbates dental fluorosis. Arch Oral Biol. 56, 695-702 (2011).
- Jedeon, K., et al. Enamel hypomineralization due to endocrine disruptors. Connect Tiss Res. 55, 1-5 (2014).
- Jedeon, K., et al. Androgen receptor involvement in rat amelogenesis: an additional way for endocrine disrupting chemicals to affect enamel synthesis. Endocrinology. 157, 4287-4296 (2016).
- Weerheijm, K. L., Jalevik, B., Alaluusua, S. Molar-incisor hypomineralisation. Caries Res. 35, 390-391 (2001).
- Jälevik, B. Prevalence and Diagnosis of Molar-Incisor- Hypomineralisation (MIH): A systematic review. Eur Arch Paediatr Dent. 11, 59-64 (2010).
- Alaluusua, S. Aetiology of Molar-Incisor Hypomineralisation: A systematic review. Eur Arch Paediatr Dent. 11, 53-58 (2010).
- Jedeon, K., Berdal, A., Babajko, S. The tooth, target organ of Bisphenol A, could be used as a biomarker of exposure to this agent. Bisphenol A: Sources, Risks of Environmental Exposure and Human Health Effects. Gibert, Y. , Nova Science Publishers. 205-225 (2015).
- Fejerskov, O., Larsen, M. J., Richards, A., Baelum, V.
- Robinson, C., Connell, S., Kirkham, J., Brookes, S. J., Shore, R. C., Smith, A. M. The effect of fluoride on the developing tooth. Caries Res. 38, 268-276 (2004).
- Sahlberg, C., Pavlic, A., Ess, A., Lukinmaa, P. L., Salmela, E., Alaluusua, S. Combined effect of amoxicillin and sodium fluoride on the structure of developing mouse enamel in vitro. Arch Oral Biol. 58, 1155-1164 (2013).
- Pritchett-Corning, K. R. Euthanasia of neonatal rats with carbon dioxide. J Am Assoc Lab Anim Sci. 48, 23-27 (2009).
- Hiller, C. R., Robinson, C., Weatherell, J. A. Variations in the composition of developing rat incisor enamel. Calcif Tissue Res. 18, 1-12 (1975).
- Robinson, C., Kirkham, J., Nutman, C. A. Relationship between enamel formation and eruption rate in rat mandibular incisors. Cell Tissue Res. 254, 655-658 (1988).
- Smith, C. E., Nanci, A. A method for sampling the stages of amelogenesis on mandibular rat incisors using the molars as a reference for dissection. Anat Rec. 225, 257-266 (1989).
- Chavez, M. G., et al. Isolation and culture of dental epithelial stem cells from the adult mouse incisor. J Vis Exp. (87), (2014).
- Brookes, S. J., Kingswell, N. J., Barron, M. J., Dixon, M. J., Kirkham, J. Is the 32-kDa fragment the functional enamelin unit in all species? Eur J Oral Sci. 119, 345-350 (2011).
- Babajko, S., Jedeon, K., Houari, S., Loiodice, S., Berdal, A. Disruption of Steroid Axis, a New Paradigm for Molar Incisor Hypomineralization (MIH). Front Physiol. 8, 343 (2017).
- Houari, S., et al. Asporin and the mineralization process in fluoride-treated rats. J Bone Min Res. 29, 1446-1455 (2014).
- Denbesten, P., Li, W. Chronic fluoride toxicity: dental fluorosis. Monographs in oral science. 22, 81-96 (2011).
- Kirkham, J., Robinson, C., Phull, J. K., Shore, R. C., Moxham, B. J., Berkovitz, B. K. The effect of rate of eruption on periodontal ligament glycosylaminoglycan content and enamel formation in the rat incisor. Cell Tissue Res. 274, 413-419 (1993).
- Lacruz, R. S., et al. Identification of novel candidate genes involved in mineralization of dental enamel by genome-wide transcript profiling. J Cell Physiol. 227, 2264-2275 (2012).
- Wen, X., Paine, M. L. Iron deposition and ferritin heavy chain (Fth) localization in rodent teeth. BMC research notes. 6, 1 (2013).
- Houari, S., Loiodice, S., Jedeon, K., Berdal, A., Babajko, S. Expression of Steroid Receptors in Ameloblasts during Amelogenesis in Rat Incisors. Front Physiol. 7, 503 (2016).
- Kawano, S., et al. Establishment of dental epithelial cell line (HAT-7) and the cell differentiation dependent on Notch signaling pathway. Connect Tissue Res. 43, 409-412 (2002).
- Zhou, Y. L., Snead, M. L. Identification of CCAAT/enhancer-binding protein alpha as a transactivator of the mouse amelogenin gene. J Biol Chem. 275, 12273-12280 (2000).
- Nakata, A., et al. Establishment and characterization of a spontaneously immortalized mouse ameloblast-lineage cell line. Biochem Biophys Res Commun. 308, 834-839 (2003).
- Harada, H., et al. Establishment of ameloblastoma cell line, AM-1. Journal of oral pathology & medicine: official publication of the International Association of Oral Pathologists and the American Academy of Oral Pathology. 27, 207-212 (1998).
- Jussila, M., Thesleff, I. Signaling networks regulating tooth organogenesis and regeneration, and the specification of dental mesenchymal and epithelial cell lineages. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4, a008425 (2012).
- Tucker, A., Sharpe, P. The cutting-edge of mammalian development; how the embryo makes teeth. Nat Rev Genet. 5, 499-508 (2004).
- Vos, T., et al. Years lived with disability (YLDs) for 1160 sequelae of 289 diseases and injuries 1990-2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010. Lancet. 380, 2163-2196 (2012).
- Marcenes, W., et al. Global burden of oral conditions in 1990-2010: a systematic analysis. J Dent Res. 92, 592-597 (2013).
- National Institute of Dental and Craniofacial Research. Dental Caries (Tooth Decay) in Adults (Age 20 to 64). , Available from: https://www.nidcr.nih.gov/DataStatistics/FindDataByTopic/DentalCaries/DentalCariesAdults20to64.htm (2017).
