Summary
Questo protocollo descrive dettagliatamente come fabbricare e gestire dispositivi microfluidici per la raccolta di dati di diffrazione di raggi x a temperatura ambiente. Inoltre, viene descritto come monitorare la cristallizzazione della proteina di dispersione della luce dinamica e come elaborare e analizzare dati di diffrazione ottenuti.
Abstract
Questo protocollo descrive la fabbricazione di dispositivi microfluidici con bassa priorità bassa di raggi x ottimizzato per goniometro basati su bersaglio fisso seriale cristallografia. I dispositivi vengono campiti da colla epossidica mediante litografia soft e sono adatti per in situ esperimenti di diffrazione di raggi x a temperatura ambiente. I pozzetti sono con coperchio su entrambi i lati con finestre di lamina polimerica polyimide che consentono la raccolta di dati di diffrazione con bassa priorità bassa dei raggi x. Questo metodo di fabbricazione è poco impegnativo e poco costoso. Dopo l'origine di un wafer master SU-8, tutti di fabbricazione può essere completato di fuori di una camera bianca in un ambiente di laboratorio di ricerca tipico. Il protocollo di progettazione e fabbricazione di chip utilizzano valvole capillare per dividere una reazione acquosa in goccioline nanolitro definite dimensioni microfluidically. Questo meccanismo di caricamento evita la perdita di campione da morti-volume del canale e può facilmente essere eseguito manualmente senza l'utilizzo di pompe o altre apparecchiature per azionamento fluido. Descriviamo come isolato nanolitro dimensioni gocce di soluzione proteica può essere monitorati in situ di luce dinamica scattering controllo proteine cristallo nucleazione e crescita. Dopo cristalli adatti sono sviluppati, diffrazione di raggi x completo set di dati possono essere raccolti tramite goniometro basato in situ fissata destinazione cristallografia a raggi x seriale a temperatura ambiente. Il protocollo fornisce script personalizzati per elaborare diffrazione DataSet utilizzando una suite di strumenti software per risolvere e perfezionare la struttura di cristallo della proteina. Questo approccio evita i manufatti possibilmente indotti durante la crioconservazione o cristallo manuale gestione in esperimenti di cristallografia convenzionale. Presentiamo e confrontare tre strutture di proteine che sono stati risolti utilizzando piccoli cristalli con dimensioni di circa 10-20 µm cresciuti nel chip. Da cristallizzazione e diffracting in situ, maneggevolezza e quindi meccanica è ridotto al minimo le dispersioni di cristalli fragili. Il protocollo dettaglia come fabbricare un chip microfluidico trasparente raggi x custom adatto per in situ seriale cristallografia. Come quasi ogni cristallo può essere utilizzato per la raccolta di dati di diffrazione, questi chip microfluidici sono un metodo di consegna di cristallo molto efficiente.
Introduction
Conoscere la struttura 3D di una proteina è essenziale per capire la sua funzionalità. Strutture di risoluzione vicino-atomica finora sono più comunemente ottenuti dalla cristallografia a raggi x. Questa tecnica espone cristalli della proteina di radiazione a raggi x e i modelli di diffrazione risultanti vengono poi analizzati per raffinatezza e determinazione della struttura. In cristallografia a raggi x tradizionali, un set di dati di diffrazione completa è registrata da un cristallo singolo, idealmente grande, alle temperature criogeniche. Tali cristalli, tuttavia, per lo più non sono banali a crescere, e per identificare condizioni di crioconservazione adatto può diventare impegnativo in sé e a volte anche causare deviazioni dalla struttura della proteina nativa5.
I recenti progressi tecnologici in laser a elettroni liberi a raggi x (FEL) e sincrotrone beamlines hanno permesso di risolvere strutture da cristalli più piccoli, come nuovo beamlines micro-messa a fuoco, brillantezza del fascio di raggi x aumentato e migliorati rivelatori di raggi x è diventato disponibili6,7. In genere, piccoli cristalli sono più facili a crescere più grande e gratuito cristalli8,9il difetto. Tuttavia, piccoli cristalli soffrono di danni di radiazione di raggi x molto più veloci di cristalli di grandi dimensioni. Questo perché rispetto ad un grande cristallo, una dose elevata di raggi x deve essere proiettata in un più piccolo volume di cristallo a diffrangono risoluzione paragonabile. Di conseguenza, anche criogenico protezione spesso non è sufficiente per registrare un set di dati di diffrazione completa da un singolo microcrystal.
Per superare questo ostacolo, cristallografia seriale è diventato il metodo di scelta per raccogliere e unire i pattern di diffrazione da molti microcristalli orientati casualmente per ottenere un set di dati completo. Radiazione sono ridotta a icona di cristallo indotto danni diffondendo la dose totale di raggi x utilizzati per risolvere una struttura proteica sopra un alto numero di cristalli5,10. In un ' diffrangono prima distruggere ' esperimento di FEL, ogni cristallo viene utilizzato solo per un'esposizione usando gli impulsi di raggi x di femto secondi. A sua volta, micro-focus beamlines presso sincrotroni di terza generazione in grado di eseguire seriale cristallografia con qualche millisecondo breve raggi x CVE11,12,13,14. Senza un cristallo oscillazione o rotazione durante la raccolta dati, tuttavia, possono essere registrati solo parziale riflessioni di Bragg e quindi decine di migliaia o più modelli di diffrazione sono in genere necessari per la determinazione di struttura15. Ad oggi, un insieme diversificato di metodi di consegna del campione è stato sviluppato per la cristallografia di seriale, come recentemente rivisto14,16,17,18,19. Tra quelli, diversi bersaglio fisso basato su strategie con successo sono state combinate con rotazione di cristallo durante le esposizioni ai raggi x tale che significativamente meno motivi di diffrazione possono fornire ugualmente completa di set di dati, anche consumando meno di consegna del campione campione rispetto alla classica seriale cristallografia esperimenti cui sono ancora le immagini registrate7,16,20,21,22,23 , 24.
Vi presentiamo un protocollo per fabbricare dispositivi microfluidici con bassa priorità bassa dei raggi x. I dispositivi vengono campiti da colla a resina epossidica 5 min mediante litografia soft e sono adatti per gli esperimenti di diffrazione di raggi x in situ a temperatura ambiente che beneficiano di integrare la preparazione dei campioni direttamente in set-up di raggi x, come nel caso di risolta in tempo gli studi che seguono cinetica indotta da miscelazione18,19. Canali microfluidici sono con coperchio su entrambi i lati con un foglio di poliimmide polimerici, conseguente windows di raggi x con uno spessore combinato di circa 16 µm che consentono il basso imaging a raggi x sfondo. Tutti i materiali utilizzati offrono buona resistenza ai solvente. Questo metodo di fabbricazione è relativamente semplice e poco costoso. Dopo l'origine di un wafer master SU-8, tutti di fabbricazione può essere completato di fuori di una camera bianca in un ambiente di laboratorio di ricerca tipico.
In un esempio di applicazione, descriviamo chip per goniometro basati su bersaglio fisso seriale cristallografia. In primo luogo, le considerazioni di progettazione e fabbricazione per l'utilizzo di valvole capillare a microfluidically dividere una reazione acquosa in un numero selezionato di nanolitro dimensioni goccioline sono discusse. Questo meccanismo di caricamento evita la perdita di campione dal canale morto-volume e spaccare facilmente può essere eseguita manualmente senza l'utilizzo di pompe o altre apparecchiature per azionamento fluido. Tale isolato nanolitro dimensioni gocce di soluzione proteica sono monitorati in situ mediante diffusione dinamica della luce (DLS) di controllo proteine cristallo nucleazione e crescita. Precedentemente è stato dimostrato che misure di liste di distribuzione possono essere eseguite in dispositivi microfluidici che consiste di una struttura di polidimetilsilossano (PDMS) legata a un vetro diapositiva25,26. Perché lo strato di polyimide ha un alta trasmissione per lunghezze d'onda più di 550 nm, l'approccio può essere esteso alle misurazioni in fiches trasparente ai raggi x, quando si utilizza un laser appropriato lunghezza d'onda27,28. Base ai risultati DLS, nucleazione iniziale può essere osservato, e ulteriore evaporazione goccia può essere fermato per ottenere cristalli della proteina di meno ma più grandi.
Dopo sufficiente cristalli vengono coltivati, set di dati completo diffrazione di raggi x può essere raccolto quindi utilizzando goniometro basato in situ fissata destinazione seriale cristallografia a raggi x a temperatura ambiente. I set di dati di diffrazione sono trattati con una suite di strumenti software e script personalizzati per risolvere la struttura di cristallo della proteina. Questa tecnica evita manufatti spesso indotti durante la crio-conservazione usati negli esperimenti di cristallografia convenzionale.
Mettiamo a confronto tre strutture di destinazione di proteine che sono stati risolti utilizzando circa 10-20 µm piccoli cristalli cresciuti nel chip migliore poi 2 risoluzione Å. Da cristallizzazione e diffracting in situ, maneggevolezza e quindi meccanica è ridotto al minimo le dispersioni di cristalli fragili. Questo protocollo può essere applicato per cristalli proteici che diffrangono ad alta risoluzione, nonché a bassa risoluzione (1.7 Å a 3.0 Å). Come quasi ogni cristallo può essere usato per la diffrazione, piccolo campione è sprecato, rendendo questo un metodo di consegna di cristallo molto efficiente.
Questo protocollo fornisce una guida dettagliata su come preparare chip microfluidici trasparente ai raggi x in situ proteina cristallizzazione e diffrazione di raccolta dei dati. La procedura è stato attentamente progettata di beneficiare di microfluidica precisione senza richiedere sofisticate apparecchiature in laboratorio. Inoltre, raccolta di dati presso la beamline di sincrotrone può essere eseguita senza la necessità di un goniometro specializzato o un umidificatore per facilitare che riproducono i risultati da non esperti. La tecnica presentata può essere applicata per millisecondo seriale cristallografia raccolta di dati a temperatura ambiente mantenendo il danno da radiazione minima e senza introdurre lo stress ai cristalli dopo crescita gestendo cryo-protezione o cristallo. Quindi, il metodo descritto è adatto per qualsiasi progetto di cristallizzazione di proteine.
Protocol
1. progettazione e fabbricazione di Master di chip
- Design maschera
- Delineare le geometrie di canale desiderato utilizzando un idoneo programma di disegno CAD. Per ogni strato di photoresist, preparare una maschera di singola. Tutti i disegni utilizzati in questo protocollo sono discussi in dettaglio nella sezione risultati e sono disponibili come AutoCad '. DWG' formato nel File supplementari 1.
Nota: Per la costruzione di dispositivi di tutti-PDMS, le proporzioni di altezza e la larghezza di canale non deve superare 01:10 per prevenire il collasso del canale. Pellicola di polyimide sia resina catalizzata sono robusti e in linea di principio dovrebbe consentire anche proporzioni superiori. Tuttavia, abbiamo volutamente non ha superato il 01:10 rapporto, di modo che iniziale disegni potrebbe essere prototipato come dispositivi tradizionali di PDMS. - Tradurre i file CAD in emulsione pellicola fotomaschere. Utilizzare una risoluzione nominale 64 k DPI per consentire funzioni di accurate fino a dimensioni di circa 5 µm.
Nota: Questo può essere fatto tramite un servizio commerciale. Servizi di imaging possono preferire diverse convenzioni di disegno per semplificare la conversione di file per l'imaging di maschera. Si prega di informarsi sulle convenzioni disegno preferite in anticipo per evitare la laboriosa opera di mediazione durante la conversione. Maschere con caratteristiche trasparenti su priorità bassa nera saranno modello SU8 photoresist caratteristiche su wafer di rendimento funzionale PDMS microcanali durante lo stampaggio replica. A sua volta, neri caratteristiche maschere sfondo trasparente sono necessari per preparare PDMS stampi adatti per la fabbricazione di chip di raggi x. Si consiglia di ordinare entrambe le polarità maschera per consentire convalida precoce di prototipazione e progettazione fabbricare dispositivi PDMS prima di tradurre il disegno nei circuiti integrati di raggi x.
- Delineare le geometrie di canale desiderato utilizzando un idoneo programma di disegno CAD. Per ogni strato di photoresist, preparare una maschera di singola. Tutti i disegni utilizzati in questo protocollo sono discussi in dettaglio nella sezione risultati e sono disponibili come AutoCad '. DWG' formato nel File supplementari 1.
- SU8 produzione master
Nota: Questo è l'unico processo che deve essere eseguita in una camera bianca. Se critico cleanroom attrezzature non sono disponibile, il passaggio di completamento possa essere esternalizzato a società di servizi di fonderia MEMS che offrono pronta a motivi SU8 maestri. Processo SU8 secondo le istruzioni del foglio dati. Passi 1.2.1 a 1.2.4 riassumono il SU8 fabbricazione principale flusso di lavoro generale, con i parametri completi per la progettazione di chip di raggi x di tre-strato elencati nella tabella 1. Un'introduzione al multistrato SU8 allineamento è stato precedentemente pubblicato29.- Versare circa 1 mL di SU8 resistere sul cappotto di wafer e spin 3 pollici SU8 fino allo spessore desiderato utilizzando la velocità di rotazione appropriato e tempo come specificato nella tabella 1 (Figura 1, passaggio 1). Pre-cuocere il photoresist secondo lo spessore di strato a 65 ° C e 95 ° C per pochi minuti ciascuno. Eseguire il pre-cuocere per solidificare SU8 per evitare che si attacchi a strato di fotoresist e per migliorare l'adesione di resistere al substrato (Figura 1, passaggio 2).
- Esporre il photoresist alla luce UV come specificato nella tabella 1 seguita da una post-esposizione-cuoce a 95 ° C per completare cataliticamente fotoreazione che viene avviato durante l'esposizione (Figura 1, passaggio 3).
- Ripetere questi passaggi per ogni strato successivo. Quindi allineare le maschere fotografiche dello strato successivo con il Maestro utilizzando una maschera allineatore e calibro a corsoio allineamento marchi29.
- Lavare via tutti i SU8 non esposti resistere sviluppando la cialda in propilene glicole metil etere acetato (PGMEA), fino a isopropanolo risciacquo non rivela latteo precipitazione (Figura 1, passaggio 4). Asciugare la cialda con azoto pressurizzato.
Nota: Isopropanolo è un povero solvente per SU8 e relativa precipitazione indica residuali resti non polimerizzati.
- Fabbricazione di stampo PDMS
- Posizionare un pezzo di carta stagnola (15 × 15 cm) in una capsula Petri (10 cm) e inserire il master SU8 lungo l'estruso di alluminio nella piastra di Petri per una facile rimozione del Maestro dopo l'indurimento PDMS.
- Mescolare base in silicone con indurimento agente (10:1), risultante in un totale di 25 g, energicamente con una spatola in un vaso o un miscelatore meccanico. Un wafer da 3 pollici in una capsula Petri (10cm) consuma circa 25 g di PDMS per provocare una spessa lastra di 5 mm.
- Versare PDMS pre-miscelati sul SU8-master (Figura 1, passaggio 5) per un'altezza di 4 mm. disidratare il PDMS per 5 min per rimuovere le bolle d'aria fino a che non, o solo alcune bolle rimangono sulla superficie PDMS.
- Curare il PDMS in un forno a 70 ° C per 1 h. Poi tagliare il PDMS curata con un bisturi e Sbucci delicatamente lo stampo PDMS dal Maestro SU8 (Figura 1, punto 6). Tagliare tutto il senso giù il maestro per prevenire crepe PDMS durante il peeling.
- Optional: Preparare fette trasversali degli stampi PDMS per confermare che tutti gli SU8-strati del Master hanno lo spessore desiderato (Figura 1). Test di layout del canale microfluidico precoce può essere eseguita in tutti i chip di PDMS.
Nota: Un PDMS replica-stampato può essere incollato direttamente su un substrato di vetro dopo la punzonatura porte di accesso (punto 3.3) nel PDMS attraverso l'attivazione in plasma O2 con 20 s, 0,4 mbar O2, 50 W, 13,56 MHz. Come indicato al punto 1.2., ciò richiede fronte maschera polarità e quindi wafer muta per la fabbricazione di chip di raggi x.
2. fabbricazione di Chip in Situ dei raggi x
- Diluire entrambi precursori di resina epossidica in etanolo ad una concentrazione di etanolo finale del 40% in peso. Una massa totale di 0,25 g di ogni precursore di resina epossidica in etanolo è sufficiente per un unico chip di2 di 1 cm.
Nota: Questo riduce la viscosità della resina epossidica 5 min risultante per semplificare la bolla-libero di miscelazione e colata in stampi di replica e per ridurre al minimo lo spessore dello strato finale epossidico. L'etanolo evapora attraverso il PDMS durante la fase di reticolazione. - Degas, la muffa PDMS in un essiccatore sotto vuoto per 30 min, modo che può assorbire piccole bolle d'aria dalla resina epossidica durante la fase di stampaggio.
- Tagliare la pellicola di polyimide per circa 70 × 70 mm e span intorno a 75 × 50 mm vetro diapositiva utilizzando nastro per ottenere una superficie piana e rigida con il nastro adesivo sul retro. Al plasma attivare la stagnola con 50 W, 13,56 MHz, 0,4 mbar O2 plasma per 20 s, quindi incubare la lamina-diapositiva completa in una soluzione acquosa di 1 vol % (3-amminopropil) trimetossisilano (APTS) o (3-glycidyloxypropyl) trimetossisilano (GPTS) per 5 min a 20 ° C.
- Miscelare accuratamente sia soluzioni di precursore etanolo diluito a resina epossidica per garantire un comportamento ottimo polimerizzazione. Recuperare PDMS-stampi da camera a vuoto e posizionarli su una superficie piana. Poi rapidamente erogare una goccia di resina mista su ogni microstruttura sullo stampo utilizzando una micropipetta (circa 10 µ l in ogni 1 cm2 di microstrutture) (Figura 1, passaggio 7a).
- Recuperare il panino di lamina-diapositiva di polyimide dalla soluzione acquosa Silano (APTS o GTPS). Asciugare il foglio con aria compressa o azoto.
- Posizionare il panino di lamina vetrino preparato polyimide sulla resina epossidica depositato (Figura 1, passaggio 7b). Premere con fermezza il vetrino attaccato per la pellicola di polyimide contro lo stampo PDMS. Posizionare un foglio di metallo sul vetrino e poi deposito pesi da applicare fino a 1,4 N/cm2 pressione per 1 h, mentre le cure di resina epossidica a temperatura ambiente.
Nota: Idealmente, resina non rimane sulla lamina in aree dove le strutture nello stampo hanno l'altezza massima. Questi corrispondono ai pozzetti cristallizzazione dove la cristallizzazione avviene in seguito.- Opzionale: Se accurato stampaggio di piccole caratteristiche è critico, lo stampo PDMS possa essere rinforzato con un telaio in alluminio durante lo stampaggio punto31.
- Rimuovere la lastra di vetro con la pellicola di polyimide e la resina epossidica con motivi di peeling dallo stampo PDMS (Figura 1 passaggio 8). Al plasma attivare lato modellato a resina epossidica con 50 W, 13,56 MHz, 0,4 mbar O2 plasma per 20 s.
- Dopo la rimozione della pellicola di polyimide da camera plasma, incubare la lamina a resina epossidica-fantasia in una soluzione di % acquosa APTS (o GPTS) vol 1 per 5 min a 20 ° C. Allo stesso modo, preparare un secondo foglio di polyimide ONU-fantasia con i complementari 1 vol % GPTS (o APTS) attivazione di silano. Dopo l'incubazione, asciugare lamina strutturato e non strutturati con aria pressurizzata.
- Posizionare il resina epossidica lato verso l'alto su una superficie piana, usando la tensione superficiale di una goccia d'acqua sotto come un mediatore per prevenire arricciatura del foglio e per garantire la massima planarità. Quindi posizionare il secondo foglio di poliimmide attivato sulla parte superiore e delicatamente la striscia con il dito da un angolo all'opposto per renderli bond e per evitare la formazione di bolle.
3. accesso porte per erogazione di fluidi
- Preparare 4 mm spessore lastre PDMS in una capsula Petri secondo passi 1.3.1 a 1.3.3 senza utilizzare il SU8-master. Tagliare la lastra in PDMS blocchi di dimensioni adeguate a coprire tutte le porte di ingresso nel chip, senza coprire i vani singoli cristallizzazione del chip.
- Al plasma attivare entrambi, il chip e il PDMS blocco in 50 W, 13,56 MHz, 0,4 mbar O2 plasma per 20 s. Per legame chimico, quindi Incubare ogni parte in 1 vol % APTS o GPTS soluzione acquosa per 5 min a 20 ° C. Asciugare ogni parte con aria pressurizzata e premere la lastra di PDMS sul chip lamina.
- Per migliorare il legame, posizionare il chip su una lastra piana di PDMS e coprirlo con un foglio di plastica, seguito da un vetrino pulito e un blocco di metallo. Infine, depositare pesi per applicare pressione di2 N/cm fino a 1,4 per circa 1 h.
- Accesso perforare con un pugno di biopsia di 0,75 mm a ogni posizione dove porte di entrata e di uscita sono contrassegnate nella progettazione di chip e il retro con del nastro adesivo della guarnizione. Il chip è ora accessibile per qualsiasi tubazione con un diametro esterno corrispondente al diametro del foro (come dettagliato al punto 4.2).
4. trattamento di superficie
- Preparare un 01:20 diluizione di 9 stock di fluoropolimero % wt in fluoro-solvente ad una concentrazione finale di 0,45% in peso. Conservare le soluzioni di riserva e diluizioni in un frigorifero al buio a 4 ° C.
- Caricare il 01:20 del fluoropolymer diluizione in una siringa da 1 mL Luer-lock. Allegare un 27 × 5/8" dell'ago della siringa e poi una tubazione di PTFE all'ago.
- Collegare il tubo all'uscita del chip di raggi x e iniettare la soluzione di lavoro del fluoropolymer preparata al punto 4.1, fino a quando tutti i canali sono pieni.
- Posizionare il chip con il lato piatto verso il basso su un piatto caldo di 190 ° C per 5 min per far evaporare il solvente tutti per depositare il fluoropolymer in una sottile pellicola di rivestimento.
Nota: Quando si utilizza una nuova geometria, controllare se i canali erano intasati con fluoropolimero durante questo processo di rivestimento. Se è così, diluire ulteriormente la soluzione di riserva.
5. proteina preparazione
- Pesare la taumatina liofilizzato e scioglierlo in una soluzione tampone, elencata nella tabella 2 per il volume appropriato per ottenere una concentrazione finale di proteine di 40 mg mL-1.
- Dializzare glucosio isomerasi contro il buffer elencato nella tabella 2 secondo il protocollo del produttore.
- Preparare la tioredossina proteina come descritto in precedenza da Schubert et al. 30.
- Verificare le concentrazioni di proteina finale fotometricamente utilizzando i coefficienti di estinzione riassunti nella tabella 2, calcolato dal software ProtParam32.
- Preparare tutte le soluzioni utilizzando acqua ultrapura e filtrare con un filtro da 0,2 µm.
- Centrifugare le soluzioni di proteine a 20 ° C per 15 min a 16100 x g e prendere il surnatante per esperimenti di cristallizzazione.
6. proteina cristallizzazione nel Chip di raggi x
- Per cristallizzare le proteine nel chip microfluidici, mescolare quantità uguali di soluzione proteica e soluzione precipitante. Concentrazione nella proteina, buffer composizione e composizione precipitante sono riassunti nella tabella 2. Preparare un volume totale di circa 20 µ l per riempire un chip microfluidico.
- Immediatamente dopo la miscelazione, iniettare la soluzione alla porta di ingresso del chip tramite una siringa, accoppiato ad un 27 × 5/8" dell'ago e PTFE tubi con diametro esterno di 0,75 mm (dettagliato al punto 4.2).
Nota: La procedura di riempimento per il layout seriale richiede un previo innesco del chip con olio fluorurati, che è più facile fatto caricando l'olio fluorurati dall'orificio di presa prima di iniettare la soluzione di cristallizzazione attraverso la porta di ingresso. Tutte le fasi di caricamento devono essere monitorate utilizzando un microscopio per controllare la pressione applicata siringa e la corrispondente portata." - Dopo il chip è pieno, è possibile separare i compartimenti individuali cristallizzazione iniettando gas fluorurati olio alla porta di ingresso del chip. Sigillare il chip di bloccare tutte le porte di ingresso e di uscita del chip. Questo può essere fatto inserendo una graffetta.
Nota: Perché i compartimenti di cristallizzazione sono pieni di soluzione di proteina/precipitante, l'olio di fluorurati riempie solo il canale di ingresso del chip, senza intaccare la soluzione nei compartimenti cristallizzazione. - Per simulare la cinetica di cristallizzazione di diffusione del vapore, mettere il chip sigillato a temperatura ambiente e atmosfera normale per consentire la goccia nel vano di cristallizzazione a ridursi dall'evaporazione di acqua attraverso la pellicola di polyimide.
- Dopo crystal è osservata la formazione tramite un microscopio o misurazioni DLS (passaggio 7), trasferire il chip microfluidici completa nella soluzione precipitante appropriato, per fermare ulteriore evaporazione dai pozzetti cristallizzazione fino la diffrazione di raggi x esperimento viene eseguito.
7. dynamic Light Scattering misure in pozzi di cristallizzazione in Chip
Nota: Le liste di distribuzione sono state effettuate con una potenza di uscita del laser di 100 mW, una lunghezza d'onda di 660 nm e la luce diffusa è stata rilevata a un angolo di scattering di 142°. Perché tutte le soluzioni campione oggetto dell'inchiesta erano acquose l'indice di rifrazione dell'acqua (n = 1.33) è stato utilizzato in tutti i calcoli.
- Posto il microfluidic chip nel supporto SBS formato piastra dello strumento DLS utilizzando l'adattatore descritto al punto 8.1. Inserire la scheda nel dispositivo.
- Regolare attentamente il fuoco del laser all'interno di un compartimento del chip microfluidici mediante motorizzato x-, y-, z-fase. Poiché il chip microfluidici è molto sottile, regolare il livello z applicando passi piccoli incrementi.
Nota: Una corretta regolazione è confermata da un'intercettazione di alta e una coda liscia della funzione di autocorrelazione risultante della misurazione DLS. Può essere creato un file di calibrazione per corrispondere alla posizione di ogni singolo cristallizzazione bene nel chip microfluidici, consentendo misure automatizzate di liste di distribuzione in diversi scomparti nel corso del tempo. - Eseguire ogni misurazione DLS a 293 K per 30 s e ripetere la misurazione ogni 5 min fino alla fine dell'esperimento cristallizzazione.
Nota: Nucleazione iniziale può essere seguita dalla distribuzione delle misurazioni DLS raggio nel tempo e la formazione di cristalli di successo può essere seguita in parallelo dal microscopio incorporato del lettore della piastra DLS.
8. raccolta di dati di diffrazione
- Adattatori per beamline goniometri
- Stampare le schede per il goniometro piatto per posizionare e ruotare i chip di raggi x durante la raccolta dati cristallografici.
- Fabbricare gli adattatori per il goniometro base su una stampante 3D di modellismo utilizzando le impostazioni predefinite dei parametri come consigliato dal produttore.
Nota: Le schede sono state progettate usando un sistema 3D-CAD e i file delle coordinate degli adattatori vengono collegati '. STL'-formato di file nel supplemento. - Difficoltà i chip di raggi x all'adattatore mediante nastro biadesivo.
-
in situ cristallografia a raggi x
- Raccogliere i dati di diffrazione utilizzando una dimensione di larghezza di 10 × 5 µm (FWHM di profilo gaussiano) a 296 K. uso raggi x con un'energia di 12,8 keV e un flusso di 2,2 · 1011 fotoni · s-1 nel fascio attenuato e record di diffrazione usando un detector Pilatus 6 M ibrido.
Nota: Dispositivi microfluidici contenente taumatina, cristalli di glucosio isomerasi o tioredossina sono utilizzati per in situ raggi x cristallografici esperimenti presso la beamline EMBL P14 del sincrotrone PETRA III. Flusso e dimensioni di messa a fuoco del fascio disponibile possono variare alle altre sorgenti di raggi x. Il numero di cristalli di proteine esposte, il numero di modelli di diffrazione registrata da ogni cristallo, la gamma di angolo di oscillazione per l'esposizione e il tempo di esposizione è riassunti nella tabella 3. - Processo di imposta di due consecutivi di diffrazione singolarmente utilizzando il programma XDS33. Utilizzare lo script bash "xds.sh" presente nel supplemento.
- Creare file HKL per ogni set di dati da tutti i cristalli e scalarle utilizzando il software XSCALE33. Utilizzare lo script bash "xscale.sh" nel supplemento per creare un file di input per XSCALE.
Nota: Solo i set di dati di cristalli che sono superiori al 90%, che indica un alto grado di isomorfismo, i coefficienti di correlazione deve essere ridimensionato. Il criterio conservativo ‹I/σ (I) › (> 2) deve essere utilizzato per determinare la shell di risoluzione più alta. Sostituzione molecolare utilizzando il programma MOLREP34 dal CCP4 suite35 può essere utilizzato per ottenere le fasi per modello ulteriore edificio utilizzando le coordinate 3D di Protein Data Bank (PDB) mostrato nella tabella 3. - Affinare tutte le strutture utilizzando isotopicamente Refmac535,36 e utilizzare COOT37 per l'ispezione visiva del modello finale.
Nota: Delle molecole del solvente devono essere aggiunto automaticamente durante il processo di affinamento e devono essere controllati per confermare posizioni chimicamente ragionevole. Tutti i modelli devono essere ispezionati per l'identificazione degli outlier Ramachandran.
- Raccogliere i dati di diffrazione utilizzando una dimensione di larghezza di 10 × 5 µm (FWHM di profilo gaussiano) a 296 K. uso raggi x con un'energia di 12,8 keV e un flusso di 2,2 · 1011 fotoni · s-1 nel fascio attenuato e record di diffrazione usando un detector Pilatus 6 M ibrido.
9. valutazione dei dati
- Danno da radiazione
- Analizzare il decadimento del potere di diffrazione nel tempo utilizzando un metodo descritto da Owen et al.38. Per questo, è necessario calcolare la somma totale di I/σ(I) (fornito da XDS33) di indicizzate tutte le riflessioni di ogni set di dati di diffrazione valutati (modello di diffrazione consecutivi 2), da utilizzare come valore di riferimento. Utilizzare lo script bash "ISigma.sh" dal supplemento.
- Normalizzare la potenza di diffrazione di ogni set di dati alla potenza media diffrazione del primo set di dati.
- Analizzare la variazione dei valori di Rmeas nel tempo prendendo i valori Rmeas dal Correct.LP file ottenuti da XDS33 (script bash "Rmeas.sh" dal supplemento).
- Orientamento dei cristalli
- Determinare gli angoli di Eulero per ottenere informazioni sulla distribuzione degli orientamenti grata di cristallo nel rispetto al sistema di coordinate di laboratorio. Calcolare gli angoli di Eulero della matrice di orientamento XDS nel file di output XPARM39 utilizzando il software Matlab. Utilizzare lo script bash "rotation_matrix.sh" per estrarre la matrice di rotazione da ogni cristallo dal file XPARM. Utilizzare il file di output come input in Matlab per calcolare gli angoli di Eulero usando il rotro2eu.m di funzione Matlab (file supplementari).
Nota: Una descrizione dettagliata del calcolo è stata pubblicata da Zarrine-Afsar et al.40. - Convertire gli angoli di Eulero ottenuti da radianti in gradi. Gli angoli di Eulero ottenuti per tutti i piani di rotazione tre (xy, xz e zy) nelle classi di 10° di gruppo e tracciarle utilizzando il software Origin9.
- Determinare gli angoli di Eulero per ottenere informazioni sulla distribuzione degli orientamenti grata di cristallo nel rispetto al sistema di coordinate di laboratorio. Calcolare gli angoli di Eulero della matrice di orientamento XDS nel file di output XPARM39 utilizzando il software Matlab. Utilizzare lo script bash "rotation_matrix.sh" per estrarre la matrice di rotazione da ogni cristallo dal file XPARM. Utilizzare il file di output come input in Matlab per calcolare gli angoli di Eulero usando il rotro2eu.m di funzione Matlab (file supplementari).
Representative Results
Resina epossidica è un materiale di riempimento eccellente per la fabbricazione di chip di raggi x. È economico, semplice e robusta al processo senza la necessità di strumenti specializzati (Figura 1). Ridurre la viscosità della resina epossidica diluendo con etanolo al 40 wt % ha facilitato la rimozione della resina in eccesso sopra il pozzo di cristallizzazione, con conseguente definito windows di raggi x. Diluizioni di etanolo superiori ha provocato difetti in resina polimerizzata. Analizzando le sezioni trasversali di chip di raggi x, abbiamo determinato lo spessore totale finestra di entrambi i lati per essere circa 19 µm di spessore, che è molto vicino lo spessore nominale delle pellicole usate polyimide di 2 × 7,5 µm (Figura 2)
Prove di cristallizzazione sono state isolate in diversi dimensioni nanolitro reazione scomparti ciascuno, utilizzando un meccanismo valvola capillare come descritto in precedenza41. Questa tecnica di caricamento 'store-allora-creare' evita la perdita di campione da morti-volume del canale e può facilmente essere eseguita manualmente, eliminando la necessità di utilizzare pompe o altre apparecchiature per azionamento fluido42. Il chip è innescato con olio fluorurati prima di caricare il campione acquoso. La tensione superficiale all'interfaccia acqua-olio fra olio di rabbocco e risultati campione acquoso in una differenza di pressione attraverso l'interfaccia. Questa pressione di Laplace dipende sia il raggio di curvatura e la tensione superficiale dell'interfaccia. Per ridurre al minimo la sua energia, l'interfaccia deve ridurre al minimo la superficie, che equivale a massimizzare i suoi raggi principali di curvatura a volume costante. Un'interfaccia di curvatura bassa in un canale largo ha una bassa pressione di Laplace allora un'interfaccia ad alta curvatura in un segmento di canale stretto. Pertanto, la spina di campione preferenzialmente entra e attraversa tutto il bypass canale invece che scorre attraverso le restrizioni di valvola capillare stretto. Infine, la spina di campione è seguita da olio fluorurati per separare pozzetti in goccioline indipendente.
Robusto e affidabile il caricamento è stato realizzato con portate fino a 1 mL/h in entrambi, un seriale e una disposizione ben parallela (Figura 3). Nel layout 'seriale', ben costrizioni valvola aspirazione e capillare in sequenza sono collegati attraverso un canale di bypass31. Al contrario, nel layout 'parallelo', due canali principali separati collegano tutte le insenature ben o capillare valvole solo43. Entrambi i concetti di disposizione sono stati precedentemente combinati con formulazione e controllo alla composizione dello schermo, che è un aspetto utile nella proteina cristallizzazione43,44. Il design seriale ha solo due porte fluide, un ingresso e un'uscita. Ha meno liquidi porte e per questo motivo, è più semplice da costruire e operare. Il layout parallelo ha 4 porte fluide, 2 per il canale principale di collegamento pozzi e 2 per il collegamento delle valvole capillare di lasciare aria o fuga di olio in eccesso. Caricamento può quindi procedere da entrambi i lati del canale principale. Questo layout è nel complesso più basso resistenza di flusso per un numero uguale di pozzi a causa della sua esclusione più brevi. Quindi è meglio adatto per dispositivi up-regolata con un elevato numero di pozzi. Inoltre, i pozzetti sono orientata più vicino insieme, che offre vantaggi per automatizzato di imaging.
Ben carico completo del campione è stato osservato per entrambi i layout, se sia costruita come un due-altezza o un disegno di tre-altezza. In un disegno di due-altezza, sia pozzetto del campione e i canali di bypass sono di uguale altezza. La progettazione di tre-altezza richiede una terza maschera, un ulteriore livello di SU8 e un passo di allineamento per garantire ulteriormente che i pozzetti dei campioni diventano più alti rispetto alla precedente bypass canali. Questo altezza-differenziale promuove la stipula di fluido campione il pozzo attraverso il capillare stesso principio che arresta il flusso alle costrizioni di valvole. Qui, il soffitto ben superiore corrisponde a una minore pressione di Laplace dell'avanzamento del menisco e di flusso lungo la direzione di bypass è favorita solo dopo wells hanno riempito completamente tale che le costrizioni di valvola bloccano ulteriormente il flusso e deviarlo verso il basso il bypass. Tuttavia, caricamento riuscito non richiede rigorosamente i pozzetti per essere superiore il bypass come valvole capillare appropriato può essere ottenuta anche regolando di conseguenza larghezze di canale. Ciò nonostante, nella nostra esperienza, i pozzi superiori eseguito significativamente più robusto e caricamento gratuito di difetto è stata osservata a volte fino a dieci portate superiori in tutti i tre-altezza disegni rispetto ai loro equivalenti di due-altezza. Questo effetto era più pronunciato in layout parallelo.
Per simulare la cinetica di cristallizzazione di diffusione del vapore, la permeabilità finita della pellicola di polyimide è stata sfruttata per controllare l'evaporazione dell'acqua nel corso del tempo. Tassi di evaporazione sperimentale sono stati quantificati monitorando la variazione del volume di goccia nel tempo equiparando goccia superficie e altezza ben (Figura 4). L'evaporazione dai pozzi di cristallizzazione del chip di raggi x non procede in modo lineare, come una contrazione superficie della goccia in concomitanza con la crescente risultati di concentrazione del soluto in una velocità di evaporazione ridotta per tempo45. L'evaporazione iniziale seguita un tasso approssimativamente lineare di circa 0,5 nL h-1 in pozzetti della geometria del layout seriale.
Per meglio comprendere la cinetica di cristallizzazione, liste di distribuzione sono state effettuate nei pozzetti cristallizzazione del chip microfluidici. Per misure di liste di distribuzione iniziale, un chip PDMS incollato su un vetrino è stato utilizzato per fornire migliori proprietà ottiche per l'esperimento di diffrazione della luce. Questo chip aveva le stesse dimensioni bene come il chip x-ray. PDMS ha una maggiore permeabilità al vapore acqueo di polyimide delle finestre polyimide nei raggi x chip45. Poiché il flusso scalabilità lineare con la distanza, la traiettoria di evaporazione di un polyimide con finestra ben può essere abbinata una corrispondente finestra PDMS di opportuno spessore.
DLS risultati mostrano che la distribuzione di raggio cambia nel tempo (fig. 4A-B), dimostrando che le misurazioni di liste di distribuzione consentono di rilevare la nucleazione iniziale prima prime particelle cristalline sono osservate. Questa informazione può essere utilizzata per nucleazione e crescere cristalli singoli per pozzetto regolando esternamente il tasso di evaporazione e quindi la soprasaturazione livelli in una fase precoce della nucleazione46.
Il chip x-ray è stato fissato su una scheda stampata 3D per il goniometro di piastra compatibile SBS presso la beamline EMBL del sincrotrone P14 a PETRA III (Figura 5A). Alternativamente, un telaio stampato 3D più piccolo può essere usato per chip di montaggio dei raggi x a standard beamline goniometri21. Taumatina cristalli hanno una dimensione di 10-20 µm (figura 5B) e diffrangono fino ad una risoluzione di 2.0 Å (Figura 5). Come previsto, il contributo di sfondo di raggi x delle due finestre di pellicole di polyimide sottile dal chip x-ray è limitato agli anelli di scattering di polyimide polimero a 11 Å (2 θ ~ 5°) e 33 Å (2 θ ~ 1,7 °) per la lunghezza d'onda dei raggi x di 0,97 Å. Questi due anelli non disturbare l'elaborazione dati. È stato raccolto un totale dataset con 83 taumatina cristalli e 10 modelli di diffrazione sono stati registrati da ogni cristallo con una rotazione di 1° durante ogni fotogramma. Elaborazione dati e parametri di raffinatezza, nonché le statistiche del dataset taumatina sono elencate e confrontate con due altri DataSet dell'isomerasi del glucosio e thioredoxin che erano anche raccolti in situ sono elencati in tabella 3 e Tabella 4.
Il decadimento di intensità della potenza normalizzata diffrazione nel corso del tempo è stato studiato scindendo il dataset taumatina nei cinque sub DataSet (due modelli di diffrazione sono stati utilizzati al sottoinsieme di mantenere completa di set di dati). Come mostrato in Figura 6B, il potere di diffrazione ha cominciato a diminuire dopo il primo set di dati di sub ed era inferiore al 50% nel quarto sub dataset. Di conseguenza, i valori di Rmeas dei DataSet sub sono anche aumentando nel tempo, che indica il danno da radiazione a raggi x durante la raccolta dei dati. Supponiamo che i radicali liberi generati durante l'esposizione ai raggi x rapidamente degradare cristalli vicini nello stesso contenitore di reazione. Ad esempio, tali danni secondari di raggi x è stato che meno pronunciato in un approccio sperimentale correlato, dove i cristalli sono stati distribuiti su una superficie significativamente maggiore in un panino di polyimide21. Per minimizzare il danno complessivo di raggi x, solo un piccolo numero di modelli di diffrazione da un cristallo particolare deve essere raccolti a temperatura ambiente. Inoltre, solo un singolo cristallo di singola proteina deve essere esposto per vano del chip microfluidici. Tuttavia, tutti i modelli di struttura raffinati utilizzando i set di dati elaborati mostrano stereochimica molto buono e adatto alle statistiche (tabella 4). Inoltre, tutte le mappe di densità dell'elettrone finale erano di qualità molto buona.
In precedenti approcci di cristallografia sui chip trasparente ai raggi x, l'orientamento e la disposizione dei cristalli ha dovuto essere deliberatamente manipolato per ottenere una distribuzione casuale di cristallo orientamenti40 o è stata ottenuta dai movimenti di cristallo all'interno del liquido livello21. Per valutare l'orientamento di cristallo nei raggi x trasparente microfluidic chip descritto in questo protocollo, è stato determinato l'orientamento della cella unità di tutti i cristalli esposti per quanto riguarda il sistema di coordinate di laboratorio. Per i cristalli bipiramidali taumatina, una leggera preferenza è stata osservata (figura 7A), mentre abbiamo ottenuto un'ampia distribuzione di cristalli di glucosio isomerasi (figura 7B). Abbiamo ragionato che su scala nanometrica, maggior parte dei materiali presentano rugosità significativa. Quindi, cristalli spontaneamente potrebbero nucleano sulla superficie in significativamente meno prevenuti orientamenti spontaneamente. Tale nucleo di un piccolo cristallo può essere bloccato in un orientamento, pur continuando a crescere fino a dimensioni appropriate senza riorientamento rispetto alla normale della superficie. Infatti, nucleazione superficie mediato del cristallo è da sempre un fastidio per cristallografi cercando a ciclo continuo un cristallo allegato alla superficie senza danneggiare il cristallo nel processo. Qui, possiamo utilizzare direttamente tali cristalli per la raccolta di dati di diffrazione. Esistono tuttavia limitazioni specifiche del sistema, come la tioredossina ha rivelato una forte preferenza per determinati orientamenti in xy, xz e yz-aerei (Figura 7). Gli esempi hanno mostrati dimostrano che la distribuzione di orientamento non dipende soltanto l'ambiente di crescita ma anche la forma di cristallo. I cristalli di thioredoxin hanno allungato forme che tendono a crescere in orientamento preferito, mentre i cristalli di taumatina tetragonale bipiramidali o i cristalli di isomerasi del glucosio ortorombico non mostrano questo comportamento. Tuttavia, in tutti i casi, anche con comodo orientamenti che della gamma accessibile di rotazioni di cristallo ha provocata sufficientemente buona copertura di spazio reciproco e quindi completo set di dati per tutti studiato proteine. Così, ulteriori misure non ha dovuto essere presa quando seleziona i cristalli per l'esposizione dei raggi x.
Figura 1 : Schema di microfluidica fabbricazione di chip di raggi x. (1) SU-8 viene erogato su un substrato di silicio e spin rivestito per ottenere lo spessore desiderato. (2) Photoresist è esposto ai raggi UV attraverso una maschera. (3) non esposti photoresist è quindi sviluppato via lavando consecutivamente con PGMEA e isopropanolo, conseguente (4) un master SU-8 per la colata di ulteriori passi. (5) PDMS è versato sulla, e (6) dopo indurimento dello stampo PDMS, è sbucciata dal Maestro SU-8. colla epossidica (7a) viene erogata sullo stampo PDMS e (7b) una pellicola di polyimide attivato è chimicamente legato alla resina epossidica. (8) dopo l'indurimento, la pellicola di polyimide con il film di fantasia sottile a resina epossidica è sbucciata dallo stampo PDMS. (9) in una fase finale, il dispositivo è con coperchio con un secondo foglio di polyimide per produrre un chip della microfluidica recintato di sfondo di raggi x basso. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Fotografia (a sinistra) e microscopia immagini di sezioni trasversali dei chip finale. Un segmento di canale rappresentativo (al centro) e un pozzo di cristallizzazione (a destra) da due chip separati sono mostrati. Le frecce indicano le distanze misurate. Tutte le dimensioni sono espresse in µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : Schemi di cristallizzazione ben progetta con [A] parallelo o seriale layout di [B], come hanno visto dall'alto e dal lato, con le misure indicate in µm. Altezze di canale tipici erano: bypassare il 50 µm, 50-60 µm cristallizzazione ben, 5-10 µm valvola capillare, corrispondenti a ben volumi di circa 2,5 nL (layout parallelo) e 8 nL (seriale layout). Rappresentante anche il comportamento di caricamento viene mostrato con coloranti alimentari. Il chip è stato innescato con 12 wt % 1H, 1 H, 2H, 2h-perfluoro-1-ottanolo in FC-43, prima di colorante alimentare è stato iniettato nei pozzetti di deposito. Frecce bianche indicano la direzione del flusso. Foto panoramica di show di dispositivi caricati tutti i pozzetti caricati difetto di caricamento del campione robusto libero, illustrando. Il layout parallelo è illustrato come un disegno di tre-altezza, con pozzi di cristallizzazione superiore il bypass, mentre il layout seriale è raffigurato come un disegno di due-altezza con pozzi e bypass aventi uguale altezza. Portate tipiche sono stati circa 150 µ l/h durante il caricamento, ma caricamento gratuito di difetto è stata osservata per portate fino a 1 mL/h in un disegno tre di altezza. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 : In situ Dynamic Light Scattering di una cristallizzazione bene nel tempo. [A] serie di immagini microscopica della cristallizzazione ben. La gocciolina stored continua si restringe come vapore acqueo evapora nel tempo. Prima taumatina microcristalli possono essere osservato dopo la distribuzione di 4 h. [B] corrispondente raggio idrodinamico delle particelle taumatina misurata da liste di distribuzione durante il processo di cristallizzazione stessa fotografato in [A]. La formazione di una frazione di secondo raggio, che indica gli eventi di nucleazione iniziale possono essere visto dopo volume rappresentativo di circa 1-2 h. [C] diminuire di due volumi di gocciolina di riferimento a causa della perdita di acqua per evaporazione nel tempo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5 : in situ raccolta di dati di diffrazione. [A] chip microfluidici individuali sono montati da una scheda stampata 3D (blu) su un goniometro di piastra. [B] taumatina cristalli nel microfluidic chip durante l'esposizione ai raggi x come imaged dal microscopio in linea alle beamline P14. [C] diffrazione dei cristalli taumatina è stato registrato a una risoluzione di 2.0 Å, con un background minimo trascurabile. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6 : Valutazione di dati di dati di diffrazione da taumatina cristalli nel chip microfluidici, registrata a temperatura ambiente-. [A] densità elettronica del modello raffinato taumatina utilizzando il telaio 1-2 set di dati solo (blu contorni a 1.5 σ). [B] decadimento di intensità di taumatina cristalli in funzione della dose di raggi x. [C] l'evoluzione del valore Rmeas sopra la dose di raggi x. La casella di terreni a [B] e [C] con quartili (valori superiori 75%, valori mediani 50%, valori 25% inferiore e medio) e baffi con 95% gli intervalli di confidenza rappresentano il decadimento dell'intensità di diffrazione e Rmeas di tutti i cristalli esposti (n = 83). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7 : Distribuzione di orientamenti di cella di unità nell'estruso chip microfluidici per quanto riguarda il sistema di coordinate di laboratorio. [A] cristalli bipiramidali taumatina ha mostrato un'ampia distribuzione di orientamenti che copre quasi 180° in xy-(blu), piano XZ (verde) e il yz-(red) aereo. [B] isomerasi del glucosio Mostra anche una distribuzione ad ampio raggio, mentre [C] thioredoxin ha mostrato una forte preferenza per determinati orientamenti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| SU8-strato | Cappotto di spin | Pre-cuocere | Esporre | Post-cuocere |
| [65 / 95 ° C] | [65 / 95 ° C] | |||
| 1 strato dist : Wells | 1000 GIRI/MIN | 0 / 10 min | 200 mJ/cm2 | 1 / 4 min |
| 15 µm SU8-3010 | ||||
| 2nd strato: Bypass | 2000 GIRI/MIN | 0 / 16 min | 220 mJ / cm2 | 1 / 5 min |
| 35 µm SU8-3025 | ||||
| 3rd strato: valvole | 3000 GIRI/MIN | 0 / 3 min | 150 mJ / cm2 | 1 / 2 min |
| 5 µm SU8-3005 |
Tabella 1: esempio di processo SU8 per la progettazione dei chip di tre-strato parallelo raggi x. Questo strato ordine permetterà per casting uno stampo PDMS per fabbricazione di chip di raggi x. Per modellare direttamente un PDMS durante la prototipazione, invertire lo strato ordine durante la fabbricazione master a dai 3rd dall'inizio alla fine con 1 strato dist invece.
| Proteina | Concentrazione nella proteina | Buffer della proteina | precipitante | Gruppo dello spazio, voce PDB | Coefficiente di estinzione [M-1 cm-1] |
| Taumatina (Thaumatococcus daniellii) | 40 mg mL-1 | 50 mM Bis-Tris, pH 6.5 | 1.1 tartrato di sodio e M, 50 mM Tris, pH 6.8 | I4222, 1LR2 | 29420 |
| Isomerasi del glucosio (Streptomyces rubiginosus) | 25 mg mL-1 | 10 mM HEPES, 1 mM MgCl2, pH 7.0 | 100 mM Bis-Tris, solfato di ammonio di 2,7 M, pH 5,7 | I222, 4ZB2 | 46410 |
| Thioredoxin (Wuchereria bancrofti) | 34 mg mL-1 | 20 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA, 150 mM NaCl, pH 8.0 | 27,5% PEG1500, 100 mM SPG tampone, pH 6.3 | P41212, 4FYU | 24075 |
Tabella 2: Condizioni di cristallizzazione e gruppi dello spazio di cristalli di proteine preparati, tra cui il codice di coefficiente e pdb di estinzione.
| Proteina | Numero di esposti cristalli | Numero di modello di diffrazione a cristallo | Gamma di oscillazione per esposizione [°] | Tempo di esposizione [ms] | Voce PDB per MR |
| Taumatina (Thaumatococcus daniellii) | 103 | 10 | 1 | 40 | 1LR2 |
| Isomerasi del glucosio (Streptomyces rubiginosus) | 69 | 100 | 0.1 | 80 | 4ZB2 |
| Thioredoxin (Wuchereria bancrofti) | 68 | 10 | 1 | 40 | 4FYU |
Tabella 3: diffrazione di raggi x parametro di raccolta dati.
| Dati raccolta statisticheun | taumatina (Fotogramma 1-20) |
isomerasi del glucosio (telaio 1-100) | tioredossina (Telaio 1-10) |
| Beamline | P14 | ||
| Lunghezza d'onda [Å] | 0.96863 | ||
| Gruppo spaziale | P41212 | I222 | P42212 |
| Parametri di cella centrale: un = b, c [Å] | 58.62, 151.48 | 93.91, 99.60, 103,04 | 58.45, 151.59 |
| Numero di cristalli | 101 | 41 | 34 |
| Totale di oscillazione [°] | 10 | 10 | 10 |
| Risoluzione [Å] | 30.1.1989 (1.95 – 1,89) |
30.1.1975 (1,80 – 1,75) |
30.3.2000 (3.20 – 3.00) |
| Temperatura [K] | 296 | 296 | 296 |
| R p.i.mb | 7.5 (25,5) | 8.8 (28,0) | 9.1 (33,2) |
| Riflessioni misurati | 1553200 | 690000 | 1111196 |
| Riflessi unici | 21850 | 48942 | 44449 |
| Medio I/σ(I) | 6,07 (1,78) | 5,85 (1.66) | 4,08 (1,47) |
| MN(I) set di metà correlazione CC(1/2) | 96,2 (72,2) | 95,8 (68,2) | 97,9 (75,3) |
| Completezza [%] | 99.8 (100.0) | 100.0 (99.9) | 99.9 (100.0) |
| Ridondanza | 71,1 | 14.1 | 25 |
| Statistiche di raffinatezza | |||
| Gamma di risoluzioni [Å] | 30/01/1989 | 30/01/1975 | 30/03/2000 |
| R / Rgratis [%] | 18.8/23.9 | 18.1/20.5 | 18.9/23.1 |
| Atomi della proteina | 1550 | 3045 | 1129 |
| Molecole di acqua | 51 | 111 | 164 |
| Molecole leganti | 20 | 0 | 0 |
| Deviazione di RMS | |||
| Lunghezza di legame [Å] | 0,02 | 0,026 | 0,01 |
| Angolo di legame [°] | 2.04 | 2.22 | 1.43 |
| Fattore B [Å2] | |||
| Proteina | 22,6 | 20 | 50 |
| Acqua | 25,1 | 27.1 | 29,7 |
| Ligando | 20,4 | ||
| Analisi del diagramma di Ramachandran | |||
| Regioni più favorite [%] | 97,67 | 95,32 | 96,13 |
| Regioni ammessi [%] | 2,44 | 4,16 | 3.64 |
| Generosamente ammessi regioni [%] | 0,49 | 0,52 | 0.23 |
| r: i valori tra parentesi sono per la shell di risoluzione più alta. | |||
b: ( ), dove ho (hkl) è l'intensità media dell'hkl riflessioni, Σhkl è la somma sopra tutte le riflessioni e Σi è la somma oltre i misure di riflessione hkl. |
|||
Tabella 4: Statistiche di raccolta dei dati del set di dati da taumatina, isomerasi del glucosio e thioredoxin.
1 complementare-File: chip_geometry.dwg. File CAD delle geometrie chip utilizzato. Per favore clicca qui per scaricare questo file.
Complementare-File 2: goniometer_adapter.stl. STL-file specificando l'adattatore del goniometro chip dei raggi x. Per favore clicca qui per scaricare questo file.
3 complementare-File: xds.sh. Bash script per la creazione di file di input per elaborare zeppe di dati di diffrazione di XDS. Per favore clicca qui per scaricare questo file.
4 complementare-File: xscale.sh. Bash script per unire i dati di diffrazione da sottoinsiemi e creare un file HKL. Per favore clicca qui per scaricare questo file.
Complementare-File 5: ISigma.sh. Bash script per estrarre i valori di ISigma da tutti i singoli sottogruppi. Per favore clicca qui per scaricare questo file.
Complementare-File 6: Rmeas.sh. Bash script per estrarre i valori Rmeas da tutti i singoli sottogruppi. Per favore clicca qui per scaricare questo file.
7 complementare-File: rotation_matrix.sh. Bash script per preparare il file di input per Matlab calcolare gli angoli di Eulero dalla matrice di rotazione. Per favore clicca qui per scaricare questo file.
Discussion
Noi fabbricare dispositivi microfluidici per in situ diffrazione dei raggi x di patterning resina epossidica come pellicola di polyimide e materiale come materiale della finestra di riempimento. La nostra procedura ottimizzato vari passaggi del processo di fabbricazione sul precedente raggi x chip disegni16,21. Abbiamo ridotto lo spessore della finestra e quindi lo sfondo dispersione mentre anche fabbricazione di interpolazione come meno passaggi di processo sono necessari. cristallizzazione in situ utilizzando il protocollo descritto ha notevoli benefici. Esso consente la raccolta dei dati di diffrazione a temperatura ambiente ed esclude pertanto la necessità della protezione di cryo, che in alcuni casi contiene il rischio di introdurre artefatti nella struttura della proteina. Inoltre, i cristalli non sono soggette a stress fisico, perché il trasferimento dei cristalli dal loro ambiente nativo può essere evitato. Attraverso questa procedura, i cristalli di mantengono la loro qualità più alta e non soffrono di alcun trattamento.
Nella nostra esperienza, le fasi più critiche all'interno del protocollo ruotano intorno a controllare il processo di cristallizzazione. I parametri per ottenere cristalli adatti ai raggi x con dimensioni appropriate devono essere identificati empiricamente e non possono essere preso direttamente da esperimenti di diffusione del vapore. Utilizzando identiche concentrazioni di proteina e precipitante non ha sempre provocato in cristalli in diversi chip, o a volte in diversi pozzi all'interno del chip stesso. Ciò indica che tutti i fattori che influenzano la crescita e la nucleazione del cristallo dovrebbero essere considerati con attenzione, come la cinetica di composizione o cristallizzazione dei liquori di madre (attraverso la traiettoria di evaporazione). Come più grandi cristalli diffrangono a risoluzione più alta, opportunamente grandi cristalli idealmente sono coltivate. Il processo di nucleazione del cristallo e crescita può essere seguito con misurazioni di liste di distribuzione. Regolare il fuoco del laser all'interno del µm ~ 50 scomparti sottile cristallizzazione del chip possono essere impegnativi e possono richiedere attento allineamento manuale. Utilizzando pozzi più profondi rispetto a 100 µm, auto-allineamento laser era fattibile e affidabile, tale che pozzi multipli possono essere monitorati attraverso sistemi di acquisizione automatica.
I chip di raggi x di polyimide basato producono solo un basso fondo e dimostriamo l'idoneità di questi dispositivi per la raccolta dei dati di diffrazione di raggi x di routine risolvendo strutture per tre proteine modello. La migliore risoluzione ottenuta nel chip ha differito, confrontato con risoluzioni precedentemente raggiunti, dalla raccolta di dati di raggi x convenzionale e significativamente più grandi cristalli della proteina. Questo potrebbe essere dovuto a diversi fattori e ulteriore ottimizzazione di condizione di cristallizzazione può migliorare ulteriormente la diffrazione. È stato possibile raccogliere dati di diffrazione in situ fino a 1,8 risoluzione Å applicando cristallo con dimensioni inferiori a 30 µm. L'analisi dettagliata dei dati di diffrazione taumatina fornito le comprensioni circa danno da radiazione. Per limitare il danno da radiazione di estendere, solo un singolo cristallo deve essere esposto per vano nel dispositivo microfluidico, come la diffusione dei radicali e in cristalli vicini può verificarsi. Per migliorare la velocità di raccolta dei dati, questo deve essere automatizzato in futuro.
A causa della morfologia del cristallo, in alcuni casi può verificarsi un orientamento preferito. Questo era per esempio il caso con il dataset di thioredoxin, dove i cristalli hanno avuto un orientamento decisamente da preferire rispetto le finestre di chip. Anche qui, abbiamo potuto raccogliere un set di dati di diffrazione completa. Se cristalli presentano un orientamento preferito nel chip e in particolare se il corrispondente gruppo di spazio ha anche una simmetria bassa, quindi la completezza del dataset deve essere monitorata durante la raccolta tale da essere sufficiente canna di reticoli di diffrazione raccolti.
Studi di tempo-risolta utilizzando questi chip sono direttamente possibili quando usando la luce indotto reazioni con un approccio di pompa-sonda. La trasmissione della luce pellicola di polyimide per il laser di pompa deve essere chiarita e in alternativa, otticamente chiaro polyimide o COC potrebbero essere utilizzati. Le geometrie di microfluidica corrente non consentono per miscelazione esperimenti dopo i cristalli sono cresciuti del substrato. Tuttavia, ci aspettiamo che il protocollo di fabbricazione dei chip di raggi x descritto anche essere adatto per tali disegni per entrambi diffrazione di raggi x risolta in tempo di miscelazione, nonché approcci19di scattering.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dal fondo di seme PIER PIF-2015-46, BMBF concede a 05K16GUA, 05K12GU3 e il cluster di eccellenza 'Il centro di Amburgo per Imaging ultraveloce – struttura, dinamica e controllo della materia su scala atomica' della Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG). Il lavoro degli autori affiliato con il centro per Free Electron Laser Science è stato finanziato dall'Associazione Helmholtz attraverso fondi del programma orientato. Il sincrotrone MX sono stati raccolti presso beamline P14 operati da EMBL Hamburg presso l'anello PETRA III (DESY, Amburgo, Germania).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SU-8 3000 Series | MicroChem Corp. | SU-8 3000 | Photoresist |
| PGMEA | Sigma-Aldrich | 484431 | Developer |
| Isopropyl alcohol | Solvent | ||
| Ethanol | Solvent | ||
| Epoxy glue | UHU | Plus Schnellfest 5 min | Epoxy glue |
| PDMS | Dow Corning | Sylgard 184 | Silicone |
| Kapton foil | Dupont/ American Durafilm | HN grade, gauge 30 (7.5 μm) | polyimide foil |
| APTS | Sigma-Aldrich | 440140 | Chemical |
| GPTS | Sigma-Aldrich | 440167 | Chemical |
| Cytop CTX-109AE | Asahi Glass Co. Ltd | Cytop CTX-109AE | Cytop fluoropolymer coating |
| CT-Solv 100E | Asahi Glass Co. Ltd | CT-Solv 100E | Cytop fluoro-solvent |
| HFE-7500 | 3M | Novec 7500 | Fluorinated oil |
| AutoCAD | AutoDesk Inc. | AutoCAD | CAD Software |
| Biopsy Punch | Harris | Uni-core 0.75 mm | |
| Photo mask | JD Photo Data | ||
| 3 inch wafer | University Wafer | Silicon wafer | |
| Mask aligner | SÜSS MicroTec | MJB4 | Mask aligner |
| PDMS mixer | Thinky | ARE-250 | |
| Plasma machine | Diener electronic | Zepto | |
| Thaumatin | Sigma Aldrich | T7638 | Protein |
| Glucose Isomerase | Hamton Research | HR7-102 | Protein |
| Bis-Tris | Sigma Aldrich | B9754 | Chemical |
| Sodium Tartrate | Merck | 106664 | Chemical |
| Tris-HCl | Sigma Aldrich | 10812846001 | Chemical |
| HEPES | Carl Roth | 6763.2 | Chemical |
| Magnesium Chloride | Sigma Aldrich | 208337 | Chemical |
| Ammonium Sulfate | Sigma Aldrich | A4418 | Chemical |
| EDTA | Sigma Aldrich | E6758 | Chemical |
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich | 1064060250 | Chemical |
| PEG1500 | Molecular Dimensions | MD2-100-6 | Chemical |
| SPG buffer | Jena Bioscience | CSS-389 | Chemical |
| SpectroLight600 | XtalConcepts | DLS Instrument | |
| Nanodrop | Thermo Scientific | Spectrophotometer | |
| Zentrifuge | Eppendorf | ||
| Ultimaker2 | Ultimaker | 3D printer | |
| Form2 | Formlabs | 3D printer | |
| Amicon Filter | Sartorius Stedim | 0.2 µm filter | |
| Tubing | Adtech Polymer Engineering Ltd | Bioblock/05 | PTFE tubing 0.3 mm Inner Diameter x 0.76 mm Outer Diameter |
| Syringes | BD | 309628 | 1ml Luer-Lock Tip |
| Needle | Terumo Agani Needle | AN*2716R1 | 27Gx5/8" |
References
- Rasmussen, B. F., Stock, A. M., Ringe, D., Petsko, G. A. Crystalline ribonuclease A loses function below the dynamical transition at 220 K. Nature. 357 (6377), 423-424 (1992).
- Tilton, R. F. J. R., Dewan, J. C., Petsko, G. A. Effects of temperature on protein structure and dynamics: X-ray crystallographic studies of the protein ribonuclease-A at nine different temperatures from 98 to 320 K. Biochemistry. 31 (9), 2469-2481 (1992).
- Fraser, J. S., Clarkson, M. W., Degnan, S. C., Erion, R., Kern, D., Alber, T. Hidden alternative structures of proline isomerase essential for catalysis. Nature. 462 (7273), 669-673 (2009).
- Juers, D. H., Matthews, B. W. The role of solvent transport in cryo-annealing of macromolecular crystals. Acta Crystallogr. D. 60 (Pt 3), 412-421 (2004).
- Huang, C. Y., et al. In meso in situ serial X-ray crystallography of soluble and membrane proteins. Acta Crystallogr. D. 71 (Pt 6), 1238-1256 (2015).
- Gati, C., et al. Atomic structure of granulin determined from native nanocrystalline granulovirus using an X-ray free-electron laser. P. Natl. Acad. Sci. USA. 114 (9), 2247-2252 (2017).
- Gati, C., et al. Serial crystallography on in vivo grown microcrystals using synchrotron radiation. IUCrJ. 1 (Pt 2), 87-94 (2014).
- von Dreele, R. B. Multipattern Rietveld refinement of protein powder data. J. Appl. Crystallogr. 40 (1), 133-143 (2007).
- Cherezov, V. Lipidic cubic phase technologies for membrane protein structural studies. Curr. Opin. Struct. Biol. 21 (4), 559-566 (2011).
- Gati, C. Data processing and analysis in serial crystallography at advanced X-ray sources. , Dissertation, Hamburg (2015).
- Stellato, F., et al. Room-temperature macromolecular serial crystallography using synchrotron radiation. IUCrJ. 1 (Pt 4), 204-212 (2014).
- Botha, S., et al. Room-temperature serial crystallography at synchrotron X-ray sources using slowly flowing free-standing high-viscosity microstreams. Acta Crystallogr. D. 71 (Pt 2), 387-397 (2015).
- Nogly, P., et al. Lipidic cubic phase serial millisecond crystallography using synchrotron radiation. IUCrJ. 2 (Pt 2), 168-176 (2015).
- Martin-Garcia, J. M., Conrad, C. E., Coe, J., Roy-Chowdhury, S., Fromme, P. Review: Serial femtosecond crystallography: A revolution in structural biology. Arch. Biochem. Biophys. 602, 32-47 (2016).
- White, T. A., et al. CrystFEL: A software suite for snapshot serial crystallography. J Appl Crystallogr. 45 (2), 335-341 (2012).
- Perry, S. L., et al. A microfluidic approach for protein structure determination at room temperature via on-chip anomalous diffraction. Lab Chip. 13 (16), 3183-3187 (2013).
- Schlichting, I. Serial femtosecond crystallography: the first five years. IUCrJ. 2 (Pt 2), 246-255 (2015).
- Sui, S., Perry, S. L. Microfluidics: From crystallization to serial time-resolved crystallography. Struct. Dynam.-US. 4 (3), (2017).
- Ghazal, A., Lafleur, J. P., Mortensen, K., Kutter, J. P., Arleth, L., Jensen, G. V. Recent advances in X-ray compatible microfluidics for applications in soft materials and life sciences. Lab Chip. 16 (22), 4263-4295 (2016).
- Heymann, M., et al. Room-temperature serial crystallography using a kinetically optimized microfluidic device for protein crystallization and on-chip X-ray diffraction. IUCrJ. 1 (Pt 5), 349-360 (2014).
- Schubert, R., et al. A multicrystal diffraction data-collection approach for studying structural dynamics with millisecond temporal resolution. IUCrJ. 3 (Pt 6), 393-401 (2016).
- Weierstall, U., et al. Lipidic cubic phase injector facilitates membrane protein serial femtosecond crystallography. Nat. Commun. 5, 3309 (2014).
- Conrad, C. E., et al. A novel inert crystal delivery medium for serial femtosecond crystallography. IUCrJ. 2 (Pt 4), 421-430 (2015).
- Cohen, A. E., et al. Goniometer-based femtosecond crystallography with X-ray free electron lasers. P. Natl. Acad. Sci. USA. 111 (48), 17122-17127 (2014).
- Erskine, D., YU, P. Y., Freilich, S. C. High-Pressure Visible Spectroscopy of Polyimide Film. J. Polym. Sci. Pol. Lett. 26 (11), 465-468 (1988).
- Tsai, C. -L., Yen, H. -J., Chen, W. -C., Liou, G. -S. Novel solution-processable optically isotropic colorless polyimidothioethers-TiO2 hybrids with tunable refractive index. J. Mater. Chem. 22 (33), 17236-17244 (2012).
- Destremaut, F., Salmon, J. -B., Qi, L., Chapel, J. -P. Microfluidics with on-line dynamic light scattering for size measurements. Lab Chip. 9 (22), 3289-3296 (2009).
- Chastek, T. Q., Iida, K., Amis, E. J., Fasolka, M. J., Beers, K. L. A microfluidic platform for integrated synthesis and dynamic light scattering measurement of block copolymer micelles. Lab Chip. 8 (6), 950-957 (2008).
- Heymann, M., Fraden, S., Kim, D. Multi-Height Precision Alignment With Selectively Developed Alignment Marks. J. Microelectromech. S. 23 (2), 424-427 (2014).
- Schubert, R., et al. Reliably distinguishing protein nanocrystals from amorphous precipitate by means of depolarized dynamic light scattering. J Appl Crystallogr. 48 (5), 1476-1484 (2015).
- Aghvami, S. A., et al. Rapid prototyping of cyclic olefin copolymer (COC) microfluidic devices. Sensor Actuat. B-Chem. 247, 940-949 (2017).
- Walker, J. M. The Proteomics Protocols Handbook. , Humana Press Inc. Totowa, NJ. (2005).
- Kabsch, W. XDS. Acta Crystallogr D. 66 (Pt 2), 125-132 (2010).
- Vagin, A., Teplyakov, A. Molecular replacement with MOLREP. Acta Crystallogr. D. 66 (Pt 1), 22-25 (2010).
- Winn, M. D., et al. Overview of the CCP4 suite and current developments. Acta Crystallogr. D. 67, 235-242 (2011).
- Murshudov, G. N., et al. REFMAC5 for the refinement of macromolecular crystal structures. Acta Crystallogr. D. 67 (Pt 4), 355-367 (2011).
- Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K.
- Owen, R. L., et al. Exploiting fast detectors to enter a new dimension in room-temperature crystallography. Acta Crystallogr. D. 70 (Pt 5), 1248-1256 (2014).
- Kabsch, W. Automatic-Indexing of Rotation Diffraction Patterns. J. Appl. Crystallogr. 21, 67-71 (1988).
- Zarrine-Afsar, A., et al.
- Boukellal, H., Selimović, S., Jia, Y., Cristobal, G., Fraden, S. Simple, robust storage of drops and fluids in a microfluidic device. Lab Chip. 9 (2), 331-338 (2009).
- Aghvami, S. A., et al. Rapid prototyping of cyclic olefin copolymer (COC) microfluidic devices. Sens. Actuator B Chem. 247, 940-949 (2017).
- Shemesh, J., et al. Stationary nanoliter droplet array with a substrate of choice for single adherent/nonadherent cell incubation and analysis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 111 (31), 11293-11298 (2014).
- Sun, M., Bithi, S. S., Vanapalli, S. A. Microfluidic static droplet arrays with tuneable gradients in material composition. Lab Chip. 11 (23), 3949-3952 (2011).
- Shim, J. -U., et al. Control and measurement of the phase behavior of aqueous solutions using microfluidics. J. Am. Chem. Soc. 129 (28), 8825-8835 (2007).
- Schubert, R., Meyer, A., Baitan, D., Dierks, K., Perbandt, M., Betzel, C. Real-Time Observation of Protein Dense Liquid Cluster Evolution during Nucleation in Protein Crystallization. Cryst. Growth Des. 17 (6), 3579 (2017).
