Summary
Этот протокол описывает подробно в изготовлении и эксплуатации microfluidic приборы для сбора данных рентгеновской дифракции при комнатной температуре. Кроме того он описывает, как контролировать кристаллизации белка путем динамического рассеяния света, и как обрабатывать и анализировать полученные данные дифракции.
Abstract
Этот протокол описывает изготовления microfluidic приборы с низкой рентгеновского фона, оптимизирован для угломер на основе фиксированной цели серийный кристаллографии. Устройства узором из эпоксидного клея с помощью мягкой литографии и подходят для в situ эксперименты рентгеновской дифракции при комнатной температуре. Образец скважины находятся бочки с обеих сторон полимерные полиимида фольги windows, которые позволяют сбора данных дифракции с низкой рентгеновского фона. Этот метод изготовления неприхотливые и недорогой. После поиска Су-8 мастер пластин, все изготовления может быть завершена за пределами чистых помещений в типичной исследовательской лабораторной среде. Чип дизайн и изготовление протокол использовать, капиллярной запорной арматуры для microfluidically разделить водный реакции на определенные nanoliter размера капли. Этот механизм загрузки позволяет избежать потери образца от мертвых громкость канала и легко может быть выполнена вручную без использования насосов и другого оборудования для жидкости срабатывания. Мы описываем, как изолированные nanoliter размера капель раствора белка может контроль на местах , динамический свет рассеяния для управления белка кристалл зарождения и роста. После того, как подходящие кристаллы выращивают, полный рентгеновской дифракции наборы данных могут быть собраны с помощью гониометра основанные на месте фиксированной целевой серийный рентгеноструктурного анализа при комнатной температуре. Протокол обеспечивает пользовательские сценарии для обработки дифракции наборы данных с помощью набора программных средств для решения и уточнения Кристаллическая структура белка. Этот подход позволяет избежать артефактов, индуцированного возможно во время крио сохранение или ручной кристалл, обработка в обычных кристаллографии экспериментов. Мы представляем и сравнить три белковых структур, которые были решены с помощью мелких кристаллов с размерами примерно 10-20 мкм, выращенных в чипе. Кристаллизации и Дифрагирующая в situ, обработка и следовательно механические нарушения хрупкие кристаллы сводится к минимуму. Протокол описывает изготовить пользовательских подходит для в situ серийный кристаллографии рентгеновского чип прозрачный microfluidic. Как почти каждый кристалл может использоваться для сбора данных дифракции, эти чипы microfluidic являются очень эффективный кристалл метод доставки.
Introduction
Зная 3D структура белка имеет важное значение для понимания его функциональность. До настоящего времени вблизи атомных резолюции структуры наиболее часто получаются рентгеноструктурного анализа. Этот метод предоставляет белковых кристаллов для рентгеновского излучения и результате дифракционные текстуры затем анализируются для определения структуры и изысканности. В традиционных рентгеноструктурного анализа полный дифракции dataset записывается из одного, в идеале большие, кристалла при криогенных температурах. Такие кристаллы, однако, главным образом не являются тривиальными расти, и для выявления подходящих крио сохранение условий может стать сложной задачей само по себе и иногда также может вызвать отклонения от в родном протеине структуры5.
Последние технологические достижения в рентгеновский лазер на свободных электронах (ГСМ) и Синхротронное излучение позволили решить структур от мелких кристаллов, как новый микро упором излучение, увеличение рентгеновского пучка блеск, и стал более детекторы рентгеновского излучения доступно6,7. Как правило легче расти чем большим и дефект бесплатно кристаллов8,9, маленькие кристаллы. Однако небольшие кристаллы страдают от рентгеновского излучения ущерб гораздо быстрее, чем крупные кристаллы. Это потому, что по сравнению с большой кристалл, более высокие дозы рентгеновского должны проецироваться в меньший объем кристалл к излучению сопоставимых резолюции. Таким образом даже криогенных защиты недостаточно часто для записи набора данных полный дифракции от одного микрокристаллита.
Чтобы преодолеть этот барьер, серийный кристаллографии стал методом выбора для сбора и объединения дифракционные текстуры из многих произвольно ориентированный микрокристаллов для получения полного набора данных. Индуцированная кристалл повреждения сводится к минимуму путем распространения общей дозы рентгеновского излучения используется для решения структуры белков через большое количество кристаллов5,10. В ' преломлять перед уничтожать ' FEL эксперимент, каждый кристалл используется только для одной экспозиции, используя импульсы рентгеновского Фемто второй. В свою очередь излучение микро фокус на третьего поколения источников синхротронного можно выполнить последовательный кристаллографии с несколько миллисекунд короткие рентгеновского облучения11,12,13,14. Без колебаний кристалл или вращение во время сбора данных, однако, лишь частично Брэгг размышления могут быть записаны и следовательно десятки тысяч или больше дифракционные текстуры обычно требуются для определения структуры15. На сегодняшний день, разнообразный набор методов доставки образца был разработан для последовательного кристаллографии, как недавно рассмотрели14,16,,1718,19. Среди тех несколько фиксированной цели на основе поставки образца, которую стратегии успешно сочетались с кристалл вращение во время рентгеновского облучения, таким образом, что значительно меньше дифракционные текстуры может обеспечить не менее полные наборы данных также потребляя меньше Пример по сравнению классической серийный кристаллографии эксперименты, где неподвижных изображений, записанных7,16,20,21,,2223 , 24.
Мы представляем протокол для изготовления microfluidic приборы с низкой рентгеновского фона. Узорные от 5-мин эпоксидный клей с помощью мягкой литографии и подходят для in situ дифракции рентгеновских лучей экспериментов при комнатной температуре, что выгоды от интеграции подготовки пробы непосредственно в рентгеновской установки, как в случае с устройства время решен исследования, которые следуют смешивания индуцированной кинетики18,19. Microfluidic каналы находятся бочки с обеих сторон полимерные полиимида фольгой, привело рентгеновского windows с комбинированной толщиной около 16 мкм, которые позволяют для низких рентгенография фон. Все используемые материалы обеспечивают хорошую растворителей сопротивления. Этот метод изготовления является сравнительно простым и недорогим. После поиска Су-8 мастер пластин, все изготовления может быть завершена за пределами чистых помещений в лабораторных условиях типичной исследований.
В пример приложения мы описываем чипы для угломер на основе фиксированной цели серийный кристаллографии. Во-первых дизайн и изготовление вопросы использования капиллярного запорной арматуры для microfluidically разделить водный реакции в выбранное количество капель nanoliter размера, обсуждаются. Этот механизм загрузки позволяет избежать потери образца от мертвых громкость канала и расщепление может легко выполняться вручную без использования насосов и другого оборудования для жидкости срабатывания. Такие изолированные nanoliter размера капель раствора белка являются мониторинг на местах с использованием динамического рассеяния света (DLS) для управления белка кристалл зарождения и роста. Ранее было продемонстрировано, что DLS измерения могут быть выполнены в microfluidic приборы, состоящий из полидиметилсилоксан (PDMS) структуры, приклеенная к25,стекла в слайд26. Потому что слой полиимида высоких передач для длин волн более 550 Нм, подход может быть расширен для измерения рентгеновского прозрачный фишки также, при использовании соответствующей лазера длина волны27,28. Основываясь на результатах DLS, первоначальный нуклеации может наблюдаться, и дальнейшее испарение капли могут быть остановлены получить меньше, но больше белковых кристаллов.
После того, как достаточно кристаллы выращивают, то полный рентгеновской дифракции наборов данных, затем могут быть собраны с помощью гониометра основанные на месте фиксированной целевой серийный рентгеноструктурного анализа при комнатной температуре. Дифракция наборы данных обрабатываются с использованием набор программных инструментов и пользовательских сценариев для решения Кристаллическая структура белка. Этот метод позволяет избежать артефактов, часто индуцированных течение крио сохранение используется в обычных кристаллографии экспериментов.
Мы сравниваем три целевых структур белков, которые были решены с помощью о 10-20 мкм маленькие кристаллы, выращенных в чип лучше, чем 2 Е резолюции. Кристаллизации и Дифрагирующая в situ, обработка и следовательно механические нарушения хрупкие кристаллы сводится к минимуму. Этот протокол может применяться для кристаллов белков, которые преломлять высокого разрешения, а также низким разрешением (1.7 Å 3.0 Å). Как почти каждый кристалл может быть использован для дифракции, маленький образец впустую, что делает этот метод доставки очень эффективный кристалл.
Этот протокол обеспечивает подробное руководство о том, как подготовить рентгеновского прозрачный microfluidic фишки в situ белка кристаллизации и дифракции сбора данных. Процедура была тщательно разработана для выгоды от microfluidic точности без необходимости сложного оборудования в лаборатории. Кроме того сбор данных на Синхротронное излучение может осуществляться без необходимости специализированного гониометр или увлажнитель для облегчения воспроизведения результаты не эксперты. Представленный метод может быть применен для последовательного миллисекунды кристаллографии сбора данных при комнатной температуре при сохранении радиационных повреждений минимальной и без введения стресс после роста кристаллов крио защиты или кристалл обработки. Следовательно описан метод подходит для любого проекта кристаллизации белка.
Protocol
1. чип дизайн и изготовление мастер
- Дизайн маска
- Наметить нужного канала геометрии с помощью подходящего рисования программы CAD. Для каждого слоя фоторезиста Подготовьте отдельные маски. Все конструкции, используемые в настоящем протоколе подробно описываются в разделе результаты и доступны как AutoCad '. DWG' формат в дополнительный файл 1.
Примечание: Для строительства все PDMS устройств, пропорции высоты и ширины канала не должна превышать 1:10 для предотвращения краха канала. Полиимидная пленка и вылечить Эпоксидная смола крепкий и в принципе должны также позволить более высокой пропорции. Однако мы намеренно не превышает 1:10, что коэффициент, так что первоначальные проекты могут быть prototyped как традиционные PDMS устройства. - Перевести эмульсии фильм фотошаблонов CAD-файлы. Используйте номинальный 64 k точек на дюйм резолюции, чтобы точные особенности вниз размер около 5 мкм.
Примечание: Это может быть сделано через службу коммерческой. Imaging услуги могут предпочесть различные рисования конвенций по упорядочению файл преобразования для маски изображений. Пожалуйста, задавайте вопросы о предпочтительной рисования конвенций авансом, чтобы избежать трудоемкой неисправностей во время преобразования. Маски с прозрачной функции на черном фоне будет шаблон функции фоторезиста SU8 на вафельные приносить функциональных PDMS микроканалов во время формования реплики. В свою очередь черный функции на прозрачном фоне маски необходимо подготовить PDMS формы для изготовления чипа рентгеновского. Мы рекомендуем заказывать обе полярности маска для раннего прототипирования и дизайна проверки для изготовления PDMS устройств до воплощения дизайн в рентгеновских фишки.
- Наметить нужного канала геометрии с помощью подходящего рисования программы CAD. Для каждого слоя фоторезиста Подготовьте отдельные маски. Все конструкции, используемые в настоящем протоколе подробно описываются в разделе результаты и доступны как AutoCad '. DWG' формат в дополнительный файл 1.
- SU8 мастер изготовление
Примечание: Это единственный процесс, который должен выполняться в чистых помещениях. Если критические cleanroom оборудование не доступен, завершения шага могут быть переданы MEMS литейного сервисных компаний, которые обеспечивают готовым рисунком SU8 мастеров. Процесс SU8 согласно инструкции лист данных. Шаги 1.2.1 для 1.2.4 суммировать общие SU8 мастер изготовления рабочего процесса, с полным параметрами для трехслойной рентгеновского чип дизайн, перечисленных в таблице 1. Введение в многослойных SU8 выравнивания был ранее опубликован29.- Налейте примерно 1 мл SU8 устоять на 3-дюймовый пластин и спин пальто SU8 до нужной толщины, используя соответствующие прясть скорость и время, как указано в таблице 1 (рис. 1, шаг 1). Предварительно испечь фоторезиста согласно толщины слоя на 65 ° C до 95 ° C на несколько минут. Выполнение предварительно испечь закрепить SU8 для предотвращения прилипания к photomask и улучшения противостоять адгезия к основанию (рис. 1, шаг 2).
- Разоблачить фоторезиста УФ-лучи, как указано в таблице 1 , а затем после-мультиэкспозицию-выпекать при температуре 95 ° C каталитически завершить фотореакционного, которая инициируется во время экспозиции (рис. 1, шаг 3).
- Повторите эти шаги для каждого последующего слоя. Затем совместите фотошаблонов последующего слоя с мастером, с помощью маски выравниватель и штангенциркуль выравнивания знаки29.
- Смыть все неэкспонированные SU8 противостоять путем разработки вафельные в пропиленгликоля Метилацетат эфира (PGMEA), до тех пор, пока изопропанол полоскания больше не раскрывает Млечный осадков (рис. 1, шаг 4). Сухие пластины с давлением азота.
Примечание: Изопропиловый спирт является плохой растворитель для SU8 и свое высыпание указывает остаточное неотвержденных остается.
- Изготовление формы PDMS
- Поместите кусок алюминиевой фольги (15 × 15 см) в чашку Петри (10 см) и поместите SU8 мастер на алюминиевой фольги в чашке Петри для легкого удаления мастера после отверждения PDMS.
- Смешайте силиконовой основе с отверждением агент (10:1), что приводит к общей сумме 25 g, энергично шпателем в банку или механической мешалкой. 3-дюймовый вафельные в чашке Петри (10 см) потребляет около 25 г PDMS приведет к плите толщиной 5 мм.
- Залить предварительно смешанные PDMS на SU8-мастер (рис. 1, шаг 5) до высоты 4 мм из. Desiccate PDMS для 5 мин для удаления пузырьков воздуха до без, или только несколько пузырьков остаются на поверхности PDMS.
- Вылечить PDMS в духовке при 70 ° C в течение 1 ч. Затем вырежьте вылечить PDMS с помощью скальпеля и аккуратно чистить PDMS плесень от SU8 мастера (Рисунок 1, шаг 6). Вырежьте все, вплоть до мастер для предотвращения PDMS трещин во время пилинга.
- Дополнительно: Подготовьте поперечного сечения фрагментов PDMS формы для подтверждения, что все SU8-слои на мастер имеют требуемой толщины (рис. 1). Ранние microfluidic канал макет испытаний могут выполняться все PDMS фишек.
Примечание: Реплика формованных PDMS можно тычковой непосредственно на стеклянной подложке после штамповки порты доступа (шаг 3.3) в PDMS через O2 плазменная активация с помощью 20 s, 0,4 мбар O2, 50 Вт, работающих на частоте 13,56 МГц. Как отмечено в разделе 1.2., это требует напротив маска полярности и следовательно вафельные наброски для изготовления чипа рентгеновского.
2. в Situ изготовление чип рентгеновские
- Развести обе эпоксидной смолы прекурсоров в этанол до окончательного этанола концентрации 40 wt %. Общая масса 0,25 г каждого прекурсора эпоксидной смолы в этанол является достаточным для одного чипа 1 см2 .
Примечание: Это уменьшает вязкость результате эпоксидной 5 мин для упрощения пузырей смешивания и Литье реплики плесень и свести к минимуму толщины слоя окончательный вылечить Эпоксидная. Этанол испаряется через PDMS этапе лечения. - Дега PDMS плесень в вакуумного эксикатора для 30 минут, так что он может поглотить небольшие воздушные пузыри из эпоксидной смолы на этапе формования.
- Вырежьте полиимидная пленка около 70 × 70 мм и продолжительность его вокруг 75 × 50 мм стекла слайд с помощью ленты для получения ровной и жесткой поверхности с лентой на задней. Плазменная активация фольги с 50 Вт, работающих на частоте 13,56 МГц, 0,4 мбар O2 плазмы для 20 сек, затем инкубировать полный фольги слайд в водном растворе 1 vol % (3-аминопропил) trimethoxysilane (APTS) или trimethoxysilane (3-glycidyloxypropyl) (оснастка) за 5 мин при 20 ° C.
- Тщательно перемешайте оба этанола разбавленной эпоксидной прекурсоров решения обеспечить оптимальное отверждение. Получать PDMS-формы из вакуумной камеры и разместите их на плоскую поверхность. Затем быстро распределить капли смешанных смолы на каждой микроструктуры на плесень с помощью микропипеткой (около 10 мкл на 1 см2 микроструктур) (рис. 1, шаг 7a).
- Получить сэндвич полиимида фольги слайд из Водная силановая (APTS или GTPS) решения. Сухая пленка с сжатым воздухом или азотом.
- Поместите подготовленные полиимида фольги стекло слайд сэндвич на хранение эпоксидной смолы (рис. 1, шаг 7b). Твердо нажмите слайд стекла придает полиимидная пленка против плесени PDMS. Место металлический лист на стекло слайд, а затем депозит весов давление до 1.4 N/cm2 за 1 ч, в то время как эпоксидной смолы лечит при комнатной температуре.
Примечание: В идеале, не смолы остается на фольгу в районах, где структуры в форме имеют максимальную высоту. Они соответствуют кристаллизации скважин, где происходит кристаллизация потом.- Необязательно: Если точное литье малых функций является критической, PDMS плесень могут быть усилены с алюминиевой раме во время формования шаг31.
- Удалите слайд стекла с полиимидная пленка и узорчатыми эпоксидной, пилинг от плесени PDMS (Рисунок 1 шаг 8). Плазмы активировать узорной эпоксидной стороне с 50 Вт, работающих на частоте 13,56 МГц, 0,4 мбар O2 плазмы для 20 s.
- После удаления полиимидные пленки от плазмы палаты Инкубируйте эпоксидно узорные фольги в растворе 1% водного раствора APTS (или оснастка) vol 5 мин при 20 ° C. Аналогичным образом подготовьте второй ООН узорной полиимида фольги с взаимодополняющими 1 vol % оснастка (или APTS) силана активации. После инкубации сухие структурированных и неструктурированных фольги с сжатым воздухом.
- Расположите эпоксидной стороне лицом вверх на плоской поверхности, используя поверхностное натяжение в капле воды под посредником для предотвращения керлинг фольги и обеспечить максимальную плоскостности. Затем поместите второй активированные полиимида фольги на вершине и аккуратно полоска с пальцем от одного угла к противоположности сделать их облигаций и во избежание образования пузырьков.
3. доступ в порты для жидкой поставки
- Подготовка 4 мм толщиной PDMS плит в чашке Петри согласно шаги 1.3.1 для 1.3.3 без использования SU8-мастер. Нарежьте плиты PDMS блоки соответствующего размера для покрытия всех входе портов в чипе, без покрытия отдельных кристаллизации отсеков чипа.
- Плазменная активация оба, чип и PDMS блока в 50 Вт, работающих на частоте 13,56 МГц, 0,4 мбар O2 плазмы для 20 s. Для химического соединения, затем Инкубируйте каждую часть в 1 vol % APTS или оснастка растворе 5 мин при 20 ° C. Сухой каждой части с сжатым воздухом и нажмите PDMS плиты микросхему фольги.
- Для улучшения сцепления, установите фишку на плоской плиты PDMS и накрыть пластиковой пленкой, затем слайд чистого стекла и металлических блок. Наконец депозит весов давление до 1.4 N/cm2 около 1 часа.
- Пробейте отверстия для доступа с 0,75 мм биопсии удара на каждой позиции, где впускных и выпускных отверстий, отмечены в чип дизайн и печать обратно с лентой. Чип теперь доступна для любых труб с наружным диаметром соответствующий диаметр отверстия (как описано в шаге 4.2).
4. Поверхностная обработка
- Подготовить в 1:20 разрежения акций 9 wt % фторопластовые фтор-растворитель для окончательного 0,45 wt % концентрации. Хранения запасов решения и разведения в холодильник в темноте при 4 ° C.
- Загрузить 1:20 фторопластовые разрежения в шприц 1 мл Luer-lock. Прикрепить 27 g × 5/8" иглу в шприц и затем PTFE Шланги для иглы.
- Подсоедините трубку к розетке чип рентгеновского и вставляют фторопластовые рабочего раствора, подготовленную на этапе 4.1, пока не будут заполнены все каналы.
- Установите фишку с плоской стороной вниз на горячей плите 190 ° C за 5 мин до испарится весь растворитель для перевода из фторопласта на тонкой пленки покрытия.
Примечание: При использовании новой геометрии, проверьте, если каналы были забиты с фторопластовой во время этого процесса покрытия. Если это так, далее разбавьте раствор.
5. белка подготовка
- Весят лиофилизированные тауматина и растворить его в буферном растворе, перечисленные в таблице 2 соответствующие тома для получения окончательного белка концентрацию 40 мг мл-1.
- Dialyze глюкозы глюкозоизомеразная против буфера, перечисленные в таблице 2 , согласно протоколу производителя.
- Подготовьте белка thioredoxin, как описано ранее, Шуберт et. al. 30.
- Проверка окончательного белка концентрации фотометрических используя коэффициентами вымирания, обобщены в таблице 2, рассчитаны с помощью программы ProtParam32.
- Подготовить все решения с использованием ультрачистая вода и фильтровать их с 0,2 мкм фильтром.
- Центрифуга для решения белка при 20 ° C 15 мин на 16100 x g и принять супернатант для кристаллизации экспериментов.
6. белка кристаллизации в рентгеновских чип
- Для кристаллизации белков в microfluidic фишки, смесь равных количеств белка решения и осадителя раствора. В таблице 2кратко концентрацию белка, состав буфера и осадителя композиции. Подготовьте общий объем около 20 мкл для заполнения microfluidic чип.
- Сразу же после перемешивания, внедрить решение во впускное отверстие чипа через шприц, сочетании до 27 g × 5/8" иглы и трубки PTFE с наружным диаметром 0,75 мм (подробно на шаге 4.2).
Примечание: Процедура заполнения для последовательной макета требует предварительного грунтования чипа с фтором масло, которое делается простым путем загрузки фторированные нефти из порта розетки перед инъекцией кристаллизации раствора через впускное отверстие. Все загрузки шаги должны контролироваться с помощью микроскопа для контроля давления прикладной шприц и соответствующую скорость потока.» - После того, как заполнены чип, отдельных отсека отдельных кристаллизации путем впрыскивать фторированные нефти в впускное отверстие чипа. Уплотнение чип путем блокирования всех впускных и выпускных отверстий чипа. Это может быть сделано, вставив скрепку.
Примечание: Потому что кристаллизации отсеков заполнены белка/осадителя раствора, фторированные масло заполняет только впускного канала чипа, не затрагивая решения в отсеках кристаллизации. - Чтобы имитировать кинетики кристаллизации диффузии паров, место запечатанном чип на температуре и нормальной атмосфере разрешить капелька в отсеке кристаллизации, чтобы уменьшить испарение воды через полиимидная пленка.
- После кристалл наблюдается формирование через микроскоп или DLS измерений (шаг 7), передавать полная microfluidic чип в соответствующие осадителя решение, чтобы остановить дальнейшее испарение из кристаллизации скважин до дифракции рентгеновских лучей проводится эксперимент.
7. динамического рассеяния света измерения в скважинах кристаллизации в чип
Примечание: DLS измерения проводились с лазерной Выходная мощность 100 МВт, длина волны 660 нм и рассеянный свет был обнаружен в угол рассеяния 142 °. Потому что все исследуемый образец решения были водный преломления воды (n = 1,33) используются во всех расчетах.
- Место microfluidic чип в SBS формат пластины держателя DLS документа, используя адаптер, описанный в шаге 8.1. Вставьте адаптер в устройство.
- Тщательно Отрегулируйте лазерный фокус внутри отсека microfluidic чип с помощью моторизованных x-, y-, z этап. Потому что чип microfluidic очень тонкий, отрегулируйте уровень z, применяя шаги небольшой прирост.
Примечание: Правильная регулировка подтверждается высоким перехвата и гладкой хвост результате автокорреляционной функции измерения DLS. Калибровка файл может быть создан в соответствии с расположением каждого индивидуального кристаллизации в microfluidic чип, позволяя автоматизированных DLS измерений в нескольких отсеков с течением времени. - Выполнение каждого измерения DLS в 293 K 30 s и повторить измерение каждые 5 мин до конца эксперимента кристаллизации.
Примечание: Первоначальный нуклеации может сопровождаться радиуса распространения DLS измерений со временем и формирования успешных кристалла может параллельно следовать построен в Микроскоп DLS пластины читателя.
8. Дифракционные сбора данных
- Адаптеры для излучение Угломеры
- Печать адаптеры для пластины гониометр положение и поворот рентгеновского фишки во время сбора кристаллографических данных.
- Изготовить адаптеры для базового угломер на 3D принтере хобби класса, с помощью настройки параметров по умолчанию, как рекомендовано изготовителем.
Примечание: Адаптеры были разработаны с использованием 3D-CAD-системы и координат файлы адаптеры прилагаются в '. STL'-формат файла в приложении. - Исправьте рентгеновского фишек к адаптеру с помощью двухсторонней ленты.
-
в situ рентгеноструктурного анализа
- Сбор данных дифракции с помощью пучка размером 10 × 5 мкм (FWHM профиль Гаусса) на 296 K. Использование рентгеновского излучения с энергией 12,8 кэВ и поток 2.2 · 1011 фотоны · s-1 в ослабленных луча и запись дифракционные текстуры с помощью Pilatus 6 M гибрид пиксельный детектор.
Примечание: Microfluidic приборы, содержащие тауматина, глюкозы глюкозоизомеразная или thioredoxin кристаллы используются для в situ рентгеновского кристаллографических экспериментов на излучение EMBL P14 о синхротрон PETRA III. Размер фокуса доступные пучка и потока могут отличаться в других источников рентгеновского излучения. Количество кристаллов подвергается белка, количество дифракционные текстуры, записанные с каждый кристалл, угол диапазона колебаний в экспозиции и выдержка резюмируются в таблице 3. - Процесс набора двух последовательных дифракционной картины индивидуально с помощью программы XDS33. Используйте bash скрипт «xds.sh» нашли в дополнении.
- Создание HKL файлов для каждого набора данных из всех кристаллов и их с помощью программного обеспечения XSCALE33масштаб. Используйте bash скрипт «xscale.sh» в дополнение для создания входного файла для XSCALE.
Примечание: Только наборы данных кристаллов, которые имеют больше чем 90%, что указывает на высокую степень изоморфизма, коэффициенты корреляции должен быть масштабируется. › ‹I/σ (I) консервативной критерий (> 2) должны использоваться для определения высоких резолюция оболочки. Молекулярные замены с помощью программы MOLREP34 CCP4 люкс35 может использоваться для получения фаз для дальнейшего построения с использованием 3D координат белка банк данных (PDB), показано в таблице 3модели. - Уточнить все структуры изотопически с использованием Refmac535,36 и использовать ЛЫСУХА37 для визуального осмотра окончательной модели.
Примечание: Молекулы растворителя должна быть добавлены автоматически во время процесса уточнения и должны быть проверены для подтверждения химически разумной позиции. Все модели должны быть проверены для определения Рамачандран останцы.
- Сбор данных дифракции с помощью пучка размером 10 × 5 мкм (FWHM профиль Гаусса) на 296 K. Использование рентгеновского излучения с энергией 12,8 кэВ и поток 2.2 · 1011 фотоны · s-1 в ослабленных луча и запись дифракционные текстуры с помощью Pilatus 6 M гибрид пиксельный детектор.
9. данных оценки
- Радиационных повреждений
- Анализ распада дифракции власти со временем, с помощью метода, описанного в Оуэн et al38. Для этого Вычислите сумму I/σ(I) (предоставляемые XDS33) из всех индексированных размышления каждого вычисленного дифракции dataset (2 последовательных дифракционной картины), для использования в качестве исходного значения. Используйте bash скрипт «ISigma.sh» из дополнения.
- Нормализовать дифракции мощность каждого набора данных среднее дифракции власти первого набора данных.
- Анализировать изменение значения Rmeas с течением времени, принимая значения Rmeas от Correct.LP файлы, полученные из XDS33 (bash скрипт «Rmeas.sh» из дополнения).
- Кристалл ориентации
- Определите Углы Эйлера для получения информации о распределении кристаллической решетки ориентации по отношению к системе координат лаборатории. Рассчитайте Углы Эйлера от XDS ориентации матрицы дано в выходном файле XPARM39 с помощью программного обеспечения Matlab. Используйте bash скрипт «rotation_matrix.sh» для извлечения матрицу вращения из каждого кристалла из файла XPARM. Выходной файл можно используйте в качестве входных данных в Matlab для вычисления углов Эйлера с использованием Matlab функции rotro2eu.m (дополнительный файл).
Примечание: Подробное описание вычисления опубликовал Zarrine-Афсар et al40. - Преобразуйте полученные Углы Эйлера из радиан в градусы. Группа полученные Углы Эйлера для всех трех вращения плоскостей (xy, xz и zy) в классах 10 ° и участок их с помощью программного обеспечения происхождения9.
- Определите Углы Эйлера для получения информации о распределении кристаллической решетки ориентации по отношению к системе координат лаборатории. Рассчитайте Углы Эйлера от XDS ориентации матрицы дано в выходном файле XPARM39 с помощью программного обеспечения Matlab. Используйте bash скрипт «rotation_matrix.sh» для извлечения матрицу вращения из каждого кристалла из файла XPARM. Выходной файл можно используйте в качестве входных данных в Matlab для вычисления углов Эйлера с использованием Matlab функции rotro2eu.m (дополнительный файл).
Representative Results
Эпоксидной смолы является отличным пломбировочный материал для изготовления чипа рентгеновского. Это дешевый, простой и надежный процесс без использования специализированных инструментов (рис. 1). Уменьшение вязкости эпоксидной путем разбавления с 40 wt % этанола способствовали удаления избытков смолы выше кристаллизации скважины, что приводит к определенным рентгеновского windows. Более высоких разведениях этанола в результате дефекты в вылечить смолы. Анализируя рентгеновского чип сечений, мы определили Общая толщина окна обеих сторон, чтобы быть около 19 µm толщиной, которая очень близка к номинальной толщины используется полиимидная пленка 2 × 7,5 мкм (рис. 2)
Кристаллизации испытания были разделены на несколько nanoliter размера реакции отсеков каждый, с использованием капиллярной клапанного механизма, как описано ранее41. Эта техника «магазин тогда создать» загрузка позволяет избежать потери образца от мертвых громкость канала и может легко выполняться вручную, устраняя необходимость использования насосов и другого оборудования для жидкости срабатывания42. Чип заливают маслом фторированные перед загрузкой водный образца. Поверхностное натяжение на нефть вода интерфейс между грунтование нефти и водной образец результатов в перепаде давления через интерфейс. Это давление Лапласа зависит радиус кривизны и поверхностное натяжение интерфейса. Чтобы свести к минимуму свою энергию, интерфейс должен свести к минимуму его поверхности, что эквивалентно максимизации своей основной радиусы кривизны при постоянном объеме. Интерфейс низкого кривизны в широкий канал имеет более низкое давление Лапласа, то интерфейс высокой кривизны в сегмент узкий канал. Таким образом вилку образца преференциально входит и протекает через широкий обойти канал вместо протекающей через узкие капиллярного клапан ограничения. Наконец пример вилка следуют фторированные нефти для разделения образца скважин на независимые капельки.
Прочная и надежная загрузка была достигнута с скорости потока до 1 мл/ч в как последовательный, так и механизм параллельных хорошо (рис. 3). Также в структуре «последовательный», перетяжек клапан впуска и капиллярной последовательно связаны через обходной канал31. В отличие от этого в «параллельной» макет, два отдельных основных каналов подключить все хорошо отверстия или капиллярной клапаны только43. Обе концепции механизма ранее объединили с разработки управления составом экрана, который является полезным аспектом в кристаллизации белка43,44. Последовательный дизайн имеет только два жидкости портов, один вход и один выход. Она имеет меньше жидкости портов и по этой причине проще строить и эксплуатировать. Параллельный макет имеет 4 жидкости портов, 2 для основной канал, соединяющий скважин и 2 для увязки капиллярного клапаны воздуха или избыток нефти побега. Загрузка отсюда можно перейти от обеих сторон основным каналом. Эта схема в целом имеет низкое сопротивление потока для равное количество скважин из-за его короче объездной. Поэтому лучше подходит для масштабирования вверх устройств с большим числом скважин. Кроме того, образец скважин являются ориентированные ближе вместе, которая предлагает преимущества для автоматической обработки изображений.
Полный пример также загрузки было отмечено для обоих макетов, если либо построен как высотой два или три высота дизайн. В двух высота дизайн хорошо образца и обход каналы являются равной высоты. Три высота дизайн требует маску третий, дополнительный слой SU8 и выравнивание шагом для дальнейшего обеспечения того, чтобы образец колодцев выше, чем предыдущие обойти каналы. Эта высота дифференциальные способствует образец жидкости в скважину через же капиллярные, запорная арматура принцип, который останавливает поток на перетяжек. Здесь высокий потолок хорошо соответствует нижней, что давление Лапласа выдвигаясь мениска и поток вдоль направления обхода только благоприятствует после скважин заполнили полностью, что клапан перетяжек далее блокировать поток и отвлечь его вниз объездной. Однако успешной загрузки не требует строго скважин будет выше, чем обход надлежащих капилляров запорной арматуры, также может быть достигнуто путем регулировки ширины канала соответственно. Тем не менее наш опыт, выше колодцы выполняются значительно более надежной и дефект бесплатные загрузки наблюдалось на до десяти раз выше скорости потока во всех трех высота образцов по сравнению с их эквивалентами двух высота. Этот эффект был более выраженным в параллельный макет.
Чтобы имитировать кинетики кристаллизации диффузии паров, конечное проницаемость Пленки полиимидные использовалась для управления испарения воды с течением времени. Экспериментальный испарения были количественно путем мониторинга изменения объема капли со временем путем приравнивания падение площадь поверхности и хорошо высоты (рис. 4 c). Испарение из скважин кристаллизации в чипе рентгеновского не перейти в линейной моде, как сокращение площади поверхности капли, совпадая с увеличением концентрации вещества приводит к скорости снижения испарения за время45. Первоначальный испарения вслед за приблизительно линейной ставке примерно 0.5 nL h-1 в скважины геометрии серийный макета.
Чтобы лучше понять кинетики кристаллизации, DLS измерения проводились в скважинах кристаллизации microfluidic чипа. Для первоначального DLS измерений PDMS чип, тычковой на слайде стекло было использовано для обеспечения лучше оптические свойства для эксперимента, рассеяние света. Этот чип был же хорошо размеры как чип рентгеновского. PDMS имеет высокий паропроницаемость чем водоплавающих полиимида windows в рентгеновских чип45. Поскольку поток масштабируется линейно с расстоянием, испарения траектории полиимида оконный хорошо может быть сопоставлен с соответствующей PDMS окно соответствующего толщины.
DLS результаты показывают, что распределение радиус изменяется с течением времени (рис. 4A-B), продемонстрировав, что DLS измерения позволяют обнаруживать первоначальный нуклеации, прежде чем первый кристаллических частиц наблюдаются. Эта информация может использоваться для nucleate и расти монокристаллов в колодец, внешне регулируя интенсивность испарения и следовательно Пересыщение уровнях на ранней стадии зарождения46.
Чип рентгеновского было зафиксировано на 3D печатной адаптер для гониометр совместимый плиты SBS на EMBL излучение Синхротронное P14 на Петра III (рис 5A). Кроме того меньше 3D печатной рамы могут использоваться для горе рентгеновского фишек для стандартных излучение Угломеры21. Тауматина кристаллы имеют размер 10-20 мкм (Рисунок 5B) и преломлять разрешением 2.0 до Å (рис. 5 c). Как и ожидалось, рентгеновского фона вклад двух тонких полиимидные пленки windows от рентгеновского чип ограничивается полиимида полимер рассеяния кольца 11 Å (2θ ~ 5°) и 33 Å (2θ ~ 1,7 °) для волны рентгеновского 0,97 Å. Эти два кольца не беспокоить обработки данных. Было собрано всего набора данных с 83 тауматина кристаллов и 10 дифракционные текстуры были записаны от каждого кристалла с 1° вращение во время каждого кадра. Обработка данных и уточнения параметров, а также статистические данные о наборе тауматина перечислены и по сравнению с двумя другими наборами данных глюкозоизомеразная глюкозы и thioredoxin которые были также собраны в situ перечислены в таблице 3 и Таблица 4.
Интенсивность кариеса нормализованных дифракции власти со временем было расследовано путем расщепления тауматина набора данных в пяти суб наборы данных (два дифракционные текстуры были использованы на подмножество поддерживать полные наборы данных). Как показано на рисунке 6B, мощность дифракции начал снижаться после первого набора суб и был ниже 50% в четвертом наборе данных суб. В результате Rmeas значения sub наборов данных растут с течением времени, указанием рентгеновского излучения ущерб во время сбора данных. Мы предполагаем, что свободные радикалы, генерируемые во время рентгеновского облучения быстро деградируют соседние кристаллы в одном отсеке реакции. Например такой вторичный ущерб X-ray был менее выраженными в соответствующий экспериментальный подход, где кристаллы были распространены на значительно большую площадь в полиимида сэндвич21. Чтобы свести к минимуму общий ущерб рентген, только небольшое количество дифракционные текстуры из конкретного кристалла следует собирать при комнатной температуре. Кроме того только один кристалл одного белка должны быть предоставлены в отсек microfluidic чипа. Тем не менее все структуры модели, изысканный, с использованием обработанных наборов данных показывают очень хорошо стереохимия и подходящих статистических данных (Таблица 4). Кроме того все карты плотности окончательный электрона были очень хорошего качества.
В предыдущих подходов кристаллографии рентгеновского прозрачный фишки ориентация и расположение кристаллов пришлось сознательно манипулировать, чтобы получить случайное распределение кристалл ориентации40 или был получен кристалл движений в жидком слое21. Чтобы оценить кристалл ориентации в чипов прозрачный microfluidic рентгеновского, указанных в настоящем Протоколе, был определен блок клеток ориентации всех выставленных кристаллов относительно системы координат лаборатории. Для бипирамидальных тауматина кристаллов незначительное предпочтение было отмечено (рис. 7A), в то время как мы получили широкое распространение для глюкозы глюкозоизомеразная кристаллов (рис. 7B). Мы полагали, что в нанометровом масштабе, большинство материалов демонстрируют значительные неровности. Следовательно кристаллы могут спонтанно nucleate на поверхности в значительно менее предвзято ориентации спонтанно. Такой маленький кристалл ядро может быть заблокирован в ориентации, продолжая расти до соответствующего размера без переориентации относительно нормали поверхности. В самом деле поверхности опосредованной кристалл нуклеации уже давно неудобство для кристаллографов, пытаясь цикла прилагаемый кристалл поверхности без повреждения кристалла в процессе. Здесь мы можем непосредственно использовать такие кристаллы для сбора данных дифракции. Однако существуют конкретные ограничения системы, как thioredoxin показал сильное предпочтение для некоторых ориентаций в xy-, xz - и yz самолеты (рис. 7 c). Показали примеры демонстрируют, что ориентация распределения зависит не только от роста окружающей среды, но и на форму кристалла. Thioredoxin кристаллы имеют удлиненные фигуры, которые имеют тенденцию расти в предпочтительный ориентации, в то время как тетрагональная бипирамидальных тауматина кристаллы или кристаллов глюкозоизомеразная ромбическая глюкозы не показывать это поведение. Однако во всех случаях, даже с предпочтительным направления, доступные спектр кристалл вращений привели к достаточно хороший охват взаимные пространства и следовательно полные наборы данных для всех расследование белков. Таким образом никаких дополнительных мер должны приниматься при выборе кристаллы для Xray экспозиции.
Рисунок 1 : Схема microfluidic изготовление чип рентгеновского. (1) Су-8 распределяется на кремниевой подложке и спин покрытием для получения желаемой толщины. (2) фоторезиста подвергается воздействию УФ излучения через маску. (3) неэкспонированные фоторезиста затем разработан прочь последовательно стирки с PGMEA и изопропаноле, что приводит к (4) Су-8 мастер для дальнейшего литья шаги. (5) PDMS вылил на, и (6) после отверждения PDMS плесень, очищенные от мастер Су-8. Эпоксидный клей (7a) распределяется на плесень PDMS и (7b) активированные полиимидная пленка является химически связан с эпоксидной смолой. (8) после отверждения, полиимидные фольги с узорными эпоксидная фильм очищенные от плесени PDMS. (9) в качестве заключительного шага устройство является бочки полиимида фольгой второй приносить закрытых низким рентгеновского фона microfluidic чип. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : Фотография (слева) и микроскопии изображений сечений окончательного чипов. Показаны сегмент представитель канала (в середине) и хорошо кристаллизации (справа) от двух отдельных чипов. Стрелки указывают измеренные расстояния. Все размеры указаны в мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 : Схемы кристаллизации хорошо конструкций с [] параллельный или последовательный макет [B], как показано сверху и сбоку, с размерами, указанных в мкм. Типичный канал высот были: 50 мкм обойти, 50-60 мкм кристаллизации хорошо, 5-10 мкм капиллярного клапан, соответствует также объемы около 2,5 nL (параллельный макет) и 8 nL (серийный макета). Представитель также поведение загрузки отображается с помощью пищевых красителей. Чип был загрунтованных с 12 wt % 1H, 1 H, 2 Ч, 2H-перфтор-1-октанол в FC-43, прежде чем пищевой краситель вводили скважин хранения. Белые стрелки показывают направление потока. Обзор изображений загруженных устройств шоу загружены все скважины дефект бесплатно, иллюстрирующие надежные пример загрузки. Параллельный макет иллюстрируется как трех высота дизайн, с кристаллизации колодцев выше чем шунтирование, в то время как последовательный макет изображается как двух высота дизайн с скважин и обойти, имеющие одинаковую высоту. Типичный поток ставки были приблизительно 150 мкл/ч во время загрузки, но дефект бесплатные загрузки было отмечено за подачу до 1 мл/ч в три высоты дизайн. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4 : В situ Динамическое рассеяние света кристаллизации также со временем. [A] микроскопических изображений серии хорошо кристаллизации. Хранимая капелька непрерывной сжимается как паров воды испаряется с течением времени. Первый тауматина микрокристаллов может наблюдаться после 4 ч. [B] корреспондент гидродинамических радиус распределение частиц тауматина, измеряется DLS в ходе того же процесса кристаллизации, сфотографировали в [A]. Формирование второй радиус дроби, о том, что первоначальный нуклеации события можно увидеть после примерно 1-2 ч. [C] Представитель объем уменьшаться из двух томов капелька ссылки из-за потери в результате испарения воды с течением времени. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5 : в местах сбора данных дифракции. [A] отдельные microfluidic фишки установлены 3D печатной адаптером (синий) на гониометре пластины. [B] тауматина кристаллов в microfluidic чип во время рентгеновского облучения, как образы в линии Микроскоп на излучение P14. [C] дифракция кристаллов тауматина был записан с разрешением 2,0 Å, с фоном ничтожно низкой. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 6 : Данные оценки дифракционного данных из тауматина кристаллов в microfluidic чип, записанная при комнатной температуре. [A] Электронная плотность изысканный тауматина модели с помощью кадр 1-2 набора данных только (синий контуров на 1.5 σ). [B] интенсивности распада тауматина кристаллов в зависимости от дозы рентгеновского. [C] Эволюция Rmeas значения над дозы рентгеновского. Поле участков в [B] и [C] с квартили (верхние значения 75%, медианные значения 50%, ниже значения 25% и среднее) и усы с 95% доверительными интервалами представляют распада дифракции света и Rmeas всех выставленных кристаллов (n = 83). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 7 : Распределение блок клеток ориентации в фольге чип microfluidic относительно системы координат лабораторных. [A] тауматина кристаллы бипирамидальных показал широкое распределение направлений, охватывающих почти 180° в xy-(синий), плоскости xz (зеленый) и yz-(red) плоскости. [B] глюкозы глюкозоизомеразная также показывает широкое распространение, в то время как [C] thioredoxin показал сильное предпочтение для некоторых ориентаций. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| SU8-слой | Спиновые пальто | Предварительно испечь | Разоблачение | После выпечки |
| [65 / 95 ° C] | [65 / 95 ° C] | |||
| 1-й слой: скважин | 1000 ОБ/МИН | 0 / 10 мин | 200 МДж/см2 | 1 / 4 мин |
| 15 мкм SU8-3010 | ||||
| 2-й слой: обход | 2000 ОБ/МИН | 0 / 16 мин | 220 МДж / см2 | 1 / 5 мин |
| 35 мкм SU8-3025 | ||||
| 3-й слой: Клапаны | 3000 ОБ/МИН | 0 / 3 мин | 150 МДж / см2 | 1 / 2 мин |
| 5 мкм SU8-3005 |
Таблица 1: пример SU8 процесса для трехслойной параллельных рентгеновского чип дизайн. Этот слой порядок позволит для литья плесень PDMS для изготовления чипа рентгеновского. Напрямую плесень PDMS во время создания прототипов, обратный заказа во время мастер изготовления начать от 3rd закончить с 1 слойst вместо этого слоя.
| Белка | Концентрация белка | Белка буфер | осадителя | Пространственная группа, запись PDB | Коэффициент вымирания [M-1 см-1] |
| Тауматина (Thaumatococcus обращения) | 40 мг мл-1 | 50 мм бис-трис, рН 6,5 | 1,1 Тартрат натрия М, 50 мм трис, pH 6.8 | I4222, 1LR2 | 29420 |
| Глюкоза глюкозоизомеразная (Streptomyces rubiginosus) | 25 мг мл-1 | 10 мм HEPES, 1 мм2MgCl рН 7,0 | 100 мм бис-трис, сульфат аммония 2,7 М, рН 5,7 | I222, 4ZB2 | 46410 |
| Thioredoxin (Wuchereria bancrofti) | 34 мг мл-1 | 20 мм трис-HCl, 5 мм ЭДТА, 150 мм NaCl, рН 8,0 | 27,5% PEG1500, SPG буфера 100 мм, pH 6,3 | P41212, 4FYU | 24075 |
Таблица 2: Условия кристаллизации и пространства группы кристаллов белков подготовлен, включая исчезновение коэффициент и pdb код.
| Белка | Количество выставленных кристаллов | Количество дифракционной картины в кристалл | Диапазон колебаний за воздействия [°] | Время экспозиции [мс] | Запись PDB для MR |
| Тауматина (Thaumatococcus обращения) | 103 | 10 | 1 | 40 | 1LR2 |
| Глюкоза глюкозоизомеразная (Streptomyces rubiginosus) | 69 | 100 | 0.1 | 80 | 4ZB2 |
| Thioredoxin (Wuchereria bancrofti) | 68 | 10 | 1 | 40 | 4FYU |
Таблица 3: параметр сбора данных рентгеновской дифракции.
| Данные сбора статистики | тауматина (Кадр 1-20) |
Глюкоза глюкозоизомеразная (кадр 1-100) | thioredoxin (Кадр 1-10) |
| Излучение | P14 | ||
| Длина волны [Е] | 0.96863 | ||
| Пространственная группа | P41212 | I222 | P42212 |
| Блок Параметры ячейки: = b, c [Е] | 58.62, 151.48 | 93.91, 99.60, 103.04 | 58.45, 151.59 |
| Количество кристаллов | 101 | 41 | 34 |
| Общая колебаний [°] | 10 | 10 | 10 |
| Резолюция [Е] | 30.1.1989 (1,95 – 1,89) |
30.1.1975 (1,80 – 1,75) |
30.3.2000 (3.20-3,00) |
| Температура [K] | 296 | 296 | 296 |
| R p.i.m.b | 7.5 (25,5) | 8.8 (28,0) | 9.1 (33,2) |
| Измеренные размышления | 1553200 | 690000 | 1111196 |
| Уникальный размышления | 21850 | 48942 | 44449 |
| Средняя I/σ(I) | 6.07 (1.78) | 5,85 (1.66) | 4.08 (1,47) |
| MN(I) половину набор корреляции CC(1/2) | 96.2 (72,2) | 95,8 (68,2) | 97,9 (75,3) |
| Полнота [%] | 99,8 (100,0) | 100,0 (99,9) | 99,9 (100,0) |
| Избыточность | 71.1 | 14.1 | 25 |
| Совершенствование статистики | |||
| Резолюция диапазон [Е] | 1/30/1989 | 1/30/1975 | 3/30/2000 |
| R / Rбесплатно [%] | 18.8/23.9 | 18.1/20.5 | 18.9/23.1 |
| Атомы белка | 1550 | 3045 | 1129 |
| Молекулы воды | 51 | 111 | 164 |
| Молекулы лиганда | 20 | 0 | 0 |
| Отклонение | |||
| Бонд длина [Е] | 0.02 | 0,026 | 0.01 |
| Бонд угол [°] | 2.04 | 2.22 | 1.43 |
| B фактор [Е2] | |||
| Белка | 22,6 | 20 | 50 |
| Воды | 25.1 | 27.1 | 29,7 |
| Лиганд | 20.4 | ||
| Анализ участка Рамачандран | |||
| Режим наибольшего благоприятствования регионы [%] | 97.67 | 95.32 | 96.13 |
| Разрешенные регионы [%] | 2.44 | 4.16 | 3.64 |
| Щедро позволила регионов [%] | 0,49 | 0,52 | 0,23 |
| a: значения в скобках являются высокая резолюции оболочки. | |||
b: ( ), где я (hkl) является средняя интенсивность отражения hkl, Σhkl — это сумма за все размышления и Σi сумма я измерения отражения hkl. |
|||
Таблица 4: Данные сбора статистики наборов данных от тауматина, глюкозоизомеразная глюкозы и thioredoxin.
1 Supplementry-файл: chip_geometry.dwg. CAD-файл используется геометрий чип. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
2 Supplementry-файл: goniometer_adapter.stl. STL-файл, указав адаптер гониометр чип рентгеновского. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
3 Supplementry-файл: xds.sh. Баш скрипт для создания входных файлов для обработки клинья дифракции данных по XDS. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
4 Supplementry-файл: xscale.sh. Баш скрипт для слияния данных дифракции из подмножества и создать файл HKL. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Supplementry файл 5: ISigma.sh. Баш скрипт для извлечения значения ISigma из всех отдельных подмножеств. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Supplementry файл 6: Rmeas.sh. Баш скрипт для извлечения значений Rmeas из всех отдельных подмножеств. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
7 Supplementry-файл: rotation_matrix.sh. Баш скрипт для подготовки входного файла для Matlab для вычисления углов Эйлера от матрицы поворота. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Discussion
Мы производим microfluidic приборы для в situ рентгеновской дифракции, кучность эпоксидной смолы в качестве наполнителя материал и полиимидные пленки в качестве окна материал. Наша процедура оптимизирован различные этапы процесса изготовления над предыдущей рентгеновского чип конструкции16,21. Мы сократили толщина окна и тем самым фон рассеяния, а также ослабление изготовление меньшее количество процесса требуются шаги. в situ кристаллизации с использованием описанных протокола имеет значительные преимущества. Это позволяет дифракции сбора данных при комнатной температуре и тем самым исключает необходимость защиты крио, которая в некоторых случаях содержит риск введения артефакты в структуре белка. Кроме того кристаллы не распространяются, физический стресс, потому что можно избежать передачи кристаллы от их родной среде. Через эту процедуру кристаллы поддерживать их высокое качество и не страдают от любого лечения.
По нашему опыту наиболее важные шаги в рамках протокола вращаются вокруг контроля процесса кристаллизации. Параметры для получения рентгеновского подходит кристаллы с надлежащие размеры необходимо определить эмпирически и не могут быть взяты непосредственно из экспериментов диффузии паров. Использование идентичных концентрации белков и осадителя не всегда приводит к кристаллов различных фишек, или время от времени в различных скважин в пределах той же микросхеме. Это означает, что все факторы, влияющие на кристалл зарождения и роста следует тщательно изучить, как мать ликер композиции или кристаллизации кинетика (через испарение траектории). Как более крупные кристаллы излучению для более высоким разрешением, достаточно крупные кристаллы выращивают идеально. Процесс кристалл зарождения и роста может следовать с DLS измерения. Настройка лазерный фокус внутри ~ 50 мкм тонкий кристаллизации отсеков чипа может быть сложным и может потребовать тщательной ручной выравнивание. С помощью скважин глубиной более 100 мкм, лазерный авто выравнивание было осуществимо и надежной, таким образом, что несколько скважин может контролироваться путем автоматического приобретения схем.
На основе полиимидных рентгеновского чипов производят только низких фоновых и мы продемонстрировать пригодность этих устройств для процедуры сбора данных рентгеновской дифракции, решая структур для трех моделей белков. Самое лучшее разрешение, полученные в чип отличались, по сравнению с ранее достигнутых резолюций, от обычного сбора данных рентгеновского и значительно более крупные кристаллы белка. Это может быть вызвано несколькими факторами и кристаллизации условие оптимизации может далее совершенствовать дифракции. Это было невозможно собрать в situ дифракции данных до 1.8 резолюции Å, применяя кристалл с размеры меньше, чем 30 мкм. Детальный анализ данных дифракции тауматина представила идеи о радиационных повреждений. Ограничить расширение радиационного повреждения, только один монокристаллов должны быть предоставлены в отсек в microfluidic устройство, как может произойти распространение радикалов и в соседние кристаллы. Чтобы улучшить скорость сбора данных, это должны быть автоматизированы в будущем.
Благодаря Кристалл морфологии в некоторых случаях может возникнуть предпочтительным ориентации. Это было, например в случае с thioredoxin dataset, где кристаллы были сильно предпочтительным ориентации по отношению к чип windows. Даже здесь мы могли бы собрать набор полный дифракции. Если кристаллы демонстрируют предпочтительного ориентации в чип и в частности если соответствующего пространства группа также имеет низкий симметрии, то полноты набора данных должны быть проверены во время сбора таким образом, чтобы быть достаточно тростника модели дифракции сбор.
Время решен исследования с использованием этих чипов непосредственно возможны, когда с помощью света индуцированной реакции с подходом насоса зонд. Светопропускание полиимида фольги для лазерной насоса необходимо быть выяснены и в качестве альтернативы, оптически ясно водоплавающих или могут быть использованы COC. Текущей геометрии microfluidic не позволяют для смешивания эксперименты, после того, как кристаллы выращивают субстрата. Однако мы ожидаем описанных рентгеновского чип изготовление протокол также пригодны для такого перемешивания образцов для обоих время решена рентгеновской дифракции, а также рассеяние подходы19.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Пирс семенной фонд PIF-2015-46, BMBF предоставляет 05K16GUA и 05K12GU3 и «Центр Гамбурга для сверхбыстрой Imaging – структуры, динамики и контроль вопрос на шкале атомного» передового опыта группы Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG). Работа авторов, связанных с центром на свободных электронах Лазерная наука финансируется Гельмгольца через программы ориентированные фонды. Синхротрона MX данные были собраны на излучение, эксплуатируемых P14 EMBL Гамбург на Петра III хранения кольцо (DESY, Гамбург, Германия).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SU-8 3000 Series | MicroChem Corp. | SU-8 3000 | Photoresist |
| PGMEA | Sigma-Aldrich | 484431 | Developer |
| Isopropyl alcohol | Solvent | ||
| Ethanol | Solvent | ||
| Epoxy glue | UHU | Plus Schnellfest 5 min | Epoxy glue |
| PDMS | Dow Corning | Sylgard 184 | Silicone |
| Kapton foil | Dupont/ American Durafilm | HN grade, gauge 30 (7.5 μm) | polyimide foil |
| APTS | Sigma-Aldrich | 440140 | Chemical |
| GPTS | Sigma-Aldrich | 440167 | Chemical |
| Cytop CTX-109AE | Asahi Glass Co. Ltd | Cytop CTX-109AE | Cytop fluoropolymer coating |
| CT-Solv 100E | Asahi Glass Co. Ltd | CT-Solv 100E | Cytop fluoro-solvent |
| HFE-7500 | 3M | Novec 7500 | Fluorinated oil |
| AutoCAD | AutoDesk Inc. | AutoCAD | CAD Software |
| Biopsy Punch | Harris | Uni-core 0.75 mm | |
| Photo mask | JD Photo Data | ||
| 3 inch wafer | University Wafer | Silicon wafer | |
| Mask aligner | SÜSS MicroTec | MJB4 | Mask aligner |
| PDMS mixer | Thinky | ARE-250 | |
| Plasma machine | Diener electronic | Zepto | |
| Thaumatin | Sigma Aldrich | T7638 | Protein |
| Glucose Isomerase | Hamton Research | HR7-102 | Protein |
| Bis-Tris | Sigma Aldrich | B9754 | Chemical |
| Sodium Tartrate | Merck | 106664 | Chemical |
| Tris-HCl | Sigma Aldrich | 10812846001 | Chemical |
| HEPES | Carl Roth | 6763.2 | Chemical |
| Magnesium Chloride | Sigma Aldrich | 208337 | Chemical |
| Ammonium Sulfate | Sigma Aldrich | A4418 | Chemical |
| EDTA | Sigma Aldrich | E6758 | Chemical |
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich | 1064060250 | Chemical |
| PEG1500 | Molecular Dimensions | MD2-100-6 | Chemical |
| SPG buffer | Jena Bioscience | CSS-389 | Chemical |
| SpectroLight600 | XtalConcepts | DLS Instrument | |
| Nanodrop | Thermo Scientific | Spectrophotometer | |
| Zentrifuge | Eppendorf | ||
| Ultimaker2 | Ultimaker | 3D printer | |
| Form2 | Formlabs | 3D printer | |
| Amicon Filter | Sartorius Stedim | 0.2 µm filter | |
| Tubing | Adtech Polymer Engineering Ltd | Bioblock/05 | PTFE tubing 0.3 mm Inner Diameter x 0.76 mm Outer Diameter |
| Syringes | BD | 309628 | 1ml Luer-Lock Tip |
| Needle | Terumo Agani Needle | AN*2716R1 | 27Gx5/8" |
References
- Rasmussen, B. F., Stock, A. M., Ringe, D., Petsko, G. A. Crystalline ribonuclease A loses function below the dynamical transition at 220 K. Nature. 357 (6377), 423-424 (1992).
- Tilton, R. F. J. R., Dewan, J. C., Petsko, G. A. Effects of temperature on protein structure and dynamics: X-ray crystallographic studies of the protein ribonuclease-A at nine different temperatures from 98 to 320 K. Biochemistry. 31 (9), 2469-2481 (1992).
- Fraser, J. S., Clarkson, M. W., Degnan, S. C., Erion, R., Kern, D., Alber, T. Hidden alternative structures of proline isomerase essential for catalysis. Nature. 462 (7273), 669-673 (2009).
- Juers, D. H., Matthews, B. W. The role of solvent transport in cryo-annealing of macromolecular crystals. Acta Crystallogr. D. 60 (Pt 3), 412-421 (2004).
- Huang, C. Y., et al. In meso in situ serial X-ray crystallography of soluble and membrane proteins. Acta Crystallogr. D. 71 (Pt 6), 1238-1256 (2015).
- Gati, C., et al. Atomic structure of granulin determined from native nanocrystalline granulovirus using an X-ray free-electron laser. P. Natl. Acad. Sci. USA. 114 (9), 2247-2252 (2017).
- Gati, C., et al. Serial crystallography on in vivo grown microcrystals using synchrotron radiation. IUCrJ. 1 (Pt 2), 87-94 (2014).
- von Dreele, R. B. Multipattern Rietveld refinement of protein powder data. J. Appl. Crystallogr. 40 (1), 133-143 (2007).
- Cherezov, V. Lipidic cubic phase technologies for membrane protein structural studies. Curr. Opin. Struct. Biol. 21 (4), 559-566 (2011).
- Gati, C. Data processing and analysis in serial crystallography at advanced X-ray sources. , Dissertation, Hamburg (2015).
- Stellato, F., et al. Room-temperature macromolecular serial crystallography using synchrotron radiation. IUCrJ. 1 (Pt 4), 204-212 (2014).
- Botha, S., et al. Room-temperature serial crystallography at synchrotron X-ray sources using slowly flowing free-standing high-viscosity microstreams. Acta Crystallogr. D. 71 (Pt 2), 387-397 (2015).
- Nogly, P., et al. Lipidic cubic phase serial millisecond crystallography using synchrotron radiation. IUCrJ. 2 (Pt 2), 168-176 (2015).
- Martin-Garcia, J. M., Conrad, C. E., Coe, J., Roy-Chowdhury, S., Fromme, P. Review: Serial femtosecond crystallography: A revolution in structural biology. Arch. Biochem. Biophys. 602, 32-47 (2016).
- White, T. A., et al. CrystFEL: A software suite for snapshot serial crystallography. J Appl Crystallogr. 45 (2), 335-341 (2012).
- Perry, S. L., et al. A microfluidic approach for protein structure determination at room temperature via on-chip anomalous diffraction. Lab Chip. 13 (16), 3183-3187 (2013).
- Schlichting, I. Serial femtosecond crystallography: the first five years. IUCrJ. 2 (Pt 2), 246-255 (2015).
- Sui, S., Perry, S. L. Microfluidics: From crystallization to serial time-resolved crystallography. Struct. Dynam.-US. 4 (3), (2017).
- Ghazal, A., Lafleur, J. P., Mortensen, K., Kutter, J. P., Arleth, L., Jensen, G. V. Recent advances in X-ray compatible microfluidics for applications in soft materials and life sciences. Lab Chip. 16 (22), 4263-4295 (2016).
- Heymann, M., et al. Room-temperature serial crystallography using a kinetically optimized microfluidic device for protein crystallization and on-chip X-ray diffraction. IUCrJ. 1 (Pt 5), 349-360 (2014).
- Schubert, R., et al. A multicrystal diffraction data-collection approach for studying structural dynamics with millisecond temporal resolution. IUCrJ. 3 (Pt 6), 393-401 (2016).
- Weierstall, U., et al. Lipidic cubic phase injector facilitates membrane protein serial femtosecond crystallography. Nat. Commun. 5, 3309 (2014).
- Conrad, C. E., et al. A novel inert crystal delivery medium for serial femtosecond crystallography. IUCrJ. 2 (Pt 4), 421-430 (2015).
- Cohen, A. E., et al. Goniometer-based femtosecond crystallography with X-ray free electron lasers. P. Natl. Acad. Sci. USA. 111 (48), 17122-17127 (2014).
- Erskine, D., YU, P. Y., Freilich, S. C. High-Pressure Visible Spectroscopy of Polyimide Film. J. Polym. Sci. Pol. Lett. 26 (11), 465-468 (1988).
- Tsai, C. -L., Yen, H. -J., Chen, W. -C., Liou, G. -S. Novel solution-processable optically isotropic colorless polyimidothioethers-TiO2 hybrids with tunable refractive index. J. Mater. Chem. 22 (33), 17236-17244 (2012).
- Destremaut, F., Salmon, J. -B., Qi, L., Chapel, J. -P. Microfluidics with on-line dynamic light scattering for size measurements. Lab Chip. 9 (22), 3289-3296 (2009).
- Chastek, T. Q., Iida, K., Amis, E. J., Fasolka, M. J., Beers, K. L. A microfluidic platform for integrated synthesis and dynamic light scattering measurement of block copolymer micelles. Lab Chip. 8 (6), 950-957 (2008).
- Heymann, M., Fraden, S., Kim, D. Multi-Height Precision Alignment With Selectively Developed Alignment Marks. J. Microelectromech. S. 23 (2), 424-427 (2014).
- Schubert, R., et al. Reliably distinguishing protein nanocrystals from amorphous precipitate by means of depolarized dynamic light scattering. J Appl Crystallogr. 48 (5), 1476-1484 (2015).
- Aghvami, S. A., et al. Rapid prototyping of cyclic olefin copolymer (COC) microfluidic devices. Sensor Actuat. B-Chem. 247, 940-949 (2017).
- Walker, J. M. The Proteomics Protocols Handbook. , Humana Press Inc. Totowa, NJ. (2005).
- Kabsch, W. XDS. Acta Crystallogr D. 66 (Pt 2), 125-132 (2010).
- Vagin, A., Teplyakov, A. Molecular replacement with MOLREP. Acta Crystallogr. D. 66 (Pt 1), 22-25 (2010).
- Winn, M. D., et al. Overview of the CCP4 suite and current developments. Acta Crystallogr. D. 67, 235-242 (2011).
- Murshudov, G. N., et al. REFMAC5 for the refinement of macromolecular crystal structures. Acta Crystallogr. D. 67 (Pt 4), 355-367 (2011).
- Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K.
- Owen, R. L., et al. Exploiting fast detectors to enter a new dimension in room-temperature crystallography. Acta Crystallogr. D. 70 (Pt 5), 1248-1256 (2014).
- Kabsch, W. Automatic-Indexing of Rotation Diffraction Patterns. J. Appl. Crystallogr. 21, 67-71 (1988).
- Zarrine-Afsar, A., et al.
- Boukellal, H., Selimović, S., Jia, Y., Cristobal, G., Fraden, S. Simple, robust storage of drops and fluids in a microfluidic device. Lab Chip. 9 (2), 331-338 (2009).
- Aghvami, S. A., et al. Rapid prototyping of cyclic olefin copolymer (COC) microfluidic devices. Sens. Actuator B Chem. 247, 940-949 (2017).
- Shemesh, J., et al. Stationary nanoliter droplet array with a substrate of choice for single adherent/nonadherent cell incubation and analysis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 111 (31), 11293-11298 (2014).
- Sun, M., Bithi, S. S., Vanapalli, S. A. Microfluidic static droplet arrays with tuneable gradients in material composition. Lab Chip. 11 (23), 3949-3952 (2011).
- Shim, J. -U., et al. Control and measurement of the phase behavior of aqueous solutions using microfluidics. J. Am. Chem. Soc. 129 (28), 8825-8835 (2007).
- Schubert, R., Meyer, A., Baitan, D., Dierks, K., Perbandt, M., Betzel, C. Real-Time Observation of Protein Dense Liquid Cluster Evolution during Nucleation in Protein Crystallization. Cryst. Growth Des. 17 (6), 3579 (2017).
