Summary
Denne protokollen beskriver i detalj hvordan du dikte og microfluidic enhetene for X-ray Diffraksjon datainnsamling ved romtemperatur. I tillegg beskriver hvordan overvåke protein krystallisering av dynamisk lysspredning og hvordan å behandle og analysere fikk Diffraksjon data.
Abstract
Denne protokollen beskriver fabrikere microfluidic enheter med lav X-ray bakgrunn optimalisert for goniometer basert fast målet føljetong krystallografi. Enhetene er mønstret fra epoxy limet bruker myke litografi, og egner seg for i situ X-ray Diffraksjon eksperimenter ved romtemperatur. Eksempel brønnene er collectible på begge sider med polymere polyimid (pi) folie windows at Diffraksjon datainnsamling med lav X-ray bakgrunn. Denne fabrikasjon metoden er lite krevende og rimelig. Etter innkjøp av en master SU-8-wafer, kan alle fabrikasjon fullføres utenfor et renrom i en typisk research laboratoriemiljø. Chip design og fabrikasjon protokollen benytte kapillær valving til microfluidically dele en vandig reaksjon til definerte nanoliter størrelse dråper. Denne mekanismen unngår eksempel tapet fra kanalen døde-volumet og kan enkelt utføres manuelt uten å bruke pumper eller annet utstyr for væske aktivering. Beskriver vi hvordan isolert nanoliter størrelse dråper protein løsning kan bli overvåket i situ av dynamiske lys spredning kontroll protein krystall nucleation og vekst. Etter passende krystaller er dyrket, kan komplett X-ray Diffraksjon datasett samles ved hjelp goniometer basert i situ fast målet føljetong Røntgenkrystallografi ved romtemperatur. Protokollen inneholder egendefinerte skript for å behandle Diffraksjon datasett ved hjelp av en serie programvareverktøy til å løse og forbedre protein krystallstruktur. Dette unngår gjenstandene muligens indusert under cryo-bevaring eller manuell krystall håndtering konvensjonelle krystallografi eksperimenter. Vi presenterer og sammenligne tre proteinstrukturer som ble løst med små krystaller med dimensjoner på ca 10-20 µm vokst i brikken. Bandets og diffracting i situ, håndtering og dermed mekanisk forstyrrelser av skjøre krystaller er minimert. Protokollen detaljer hvordan du dikte en egendefinert X-ray gjennomsiktig microfluidic chip egnet for i situ føljetong krystallografi. Som nesten alle krystall kan brukes for Diffraksjon datainnsamling, er disse microfluidic chips en svært effektiv krystall leveringsmetode.
Introduction
Vite 3D strukturen i et protein er viktig å forstå funksjonaliteten. Nær-atomic oppløsning strukturer er hittil mest oppnås ved Røntgenkrystallografi. Denne teknikken eksponerer protein krystaller X-ray stråling og den resulterende Diffraksjon mønsteret, deretter analyseres for proteinstrukturer og raffinement. I tradisjonell Røntgenkrystallografi registreres et komplett Diffraksjon datasett fra en enkelt, ideelt stor, krystall ved kryogene temperaturer. Slike krystaller, men er stort sett ikke trivielt å vokse, og å identifisere egnet cryo-bevaring forhold kan bli utfordrende i seg selv og kan også føre til avvik fra den opprinnelige protein struktur5.
Siste teknologiske fremskritt i X-ray fri-elektron laser (FEL) og synchrotron beamlines har lov til å løse strukturer fra mindre krystaller som nye mikro-fokus beamlines, økt røntgenbilde stråle glans og forbedret X-ray detektorer ble tilgjengelig6,7. Små krystaller er vanligvis enklere å vokse enn store og defekt gratis krystaller8,9. Imidlertid er små krystaller lider av X-ray stråling skader mye raskere enn store krystaller. Dette er fordi forhold til en stor krystall, en høyere X-ray dose må sendes til en mindre krystall volum til diffract sammenlignbare oppløsning. Derfor er selv kryogene beskyttelse ofte ikke tilstrekkelig til å spille inn et komplett Diffraksjon datasett fra en enkelt microcrystal.
For å overvinne dette hinderet, blitt serielle krystallografi metoden for valg til å samle inn og flette Diffraksjon mønstre fra mange tilfeldig orientert microcrystals å få en komplett dataset. Stråling indusert krystall skadene blir minimale ved å spre den totale X-ray dosen brukes til å løse en proteinstruktur over mange krystaller5,10. I en ' diffract før ødelegge ' FEL eksperimentet, hver krystall brukes bare for én eksponering ved hjelp av femto-andre X-ray pulser. Mikro-fokus beamlines på tredje generasjon synchrotron kilder kan igjen utføre føljetong krystallografi med noen millisekunder kort X-ray eksponeringer11,12,13,14. Uten en krystall oscillation eller rotering under datainnsamlingen, men bare delvis Bragg refleksjoner kan registreres og dermed titusenvis eller mer Diffraksjon mønstre er vanligvis påkrevd for struktur besluttsomhet15. Hittil har er ulike sett med eksempel leveringsmåter utviklet for seriell krystallografi, som nylig gjennomgått14,16,17,18,19. Blant dem, flere faste mål basert eksempel levering strategier ble vellykket kombinert med krystall rotasjon i X-ray eksponeringer slik at betydelig færre Diffraksjon mønstre kan gi like komplett datasett mens også forbruker mindre prøven i forhold til klassisk føljetong krystallografi eksperimenter hvor stillbilder er registrert7,,16,,20,,21,,22,,23 , 24.
Vi presenterer en protokoll for å utvikle microfluidic innretninger med lav X-ray bakgrunn. Enhetene er mønstret fra 5 minutters epoxy limet bruker myke litografi og er egnet for på plass X-ray Diffraksjon eksperimenter ved romtemperatur som nytte integrere eksempel utarbeidelsen direkte i X-ray satt opp, som er tilfellet med tid-løst studier som følger blande-indusert kinetics18,19. Microfluidic kanaler er collectible på begge sider med polymere polyimid (pi) folie, som resulterer i X-ray windows med en kombinert tykkelse på ca 16 µm at for lav X-ray bakgrunn bildebehandling. Alle brukte materialer gir god løsemidler motstand. Denne fabrikasjon metoden er relativt enkel og rimelig. Etter innkjøp av en master SU-8-wafer, kan alle fabrikasjon fullføres utenfor et renrom i en typisk research lab.
I et eksempel beskriver vi sjetonger for goniometer basert fast målet føljetong krystallografi. Først diskuteres i design og fabrikasjon vurderinger ved bruk av kapillær valving til microfluidically dele en vandig reaksjon til et valgt antall nanoliter størrelse dråper. Denne mekanismen unngår eksempel tapet fra kanalen døde volum og deling kan enkelt utføres manuelt uten å bruke pumper eller annet utstyr for væske aktivering. Slike isolerte nanoliter størrelse dråper protein løsning er overvåket i situ med dynamisk lysspredning (DLS) kontroll protein krystall nucleation og vekst. Det har tidligere blitt demonstrert at DLS målinger kan utføres i microfluidic enheter som består av en polydimethylsiloxane (PDMS) struktur limt til et glass lysbilde25,26. Fordi polyimid (pi) laget har en høy overføring for bølgelengder lengre enn 550 nm, tilnærming kan utvides til mål i X-ray gjennomsiktig chips også, når du bruker en passende laser bølgelengde27,28. Basert på DLS resultatene, første nucleation kan observeres, og ytterligere slippverktøy fordampning kan stoppes for å få færre men større protein krystaller.
Når tilstrekkelig krystaller er dyrket, kan komplett X-ray Diffraksjon datasett deretter hentes bruker goniometer basert i situ fast målet føljetong Røntgenkrystallografi ved romtemperatur. Diffraksjon datasett behandles ved hjelp av en rekke verktøy og egendefinerte skript for å løse krystallstruktur protein. Denne teknikken unngår gjenstander ofte indusert under cryo-bevaring konvensjonelle krystallografi forsøk.
Vi sammenligner tre mål proteinstrukturer som ble løst med om 10-20 µm små krystaller vokst chip bedre enn 2 Å oppløsning. Bandets og diffracting i situ, håndtering og dermed mekanisk forstyrrelser av skjøre krystaller er minimert. Denne protokollen kan brukes for protein krystaller som diffract høy oppløsning samt lav oppløsning (1,7 Å 3.0 Å). Som nesten alle krystall kan brukes for Diffraksjon, er lite utvalg bortkastet, gjør dette til en svært effektiv krystall leveringsmetode.
Denne protokollen gir en detaljert guide på hvordan å forberede X-ray gjennomsiktig microfluidic chips i situ protein krystallisering Diffraksjon innsamling og. Prosedyren ble nøye utformet for å dra nytte microfluidic presisjon uten avansert utstyr i laboratoriet. Datainnsamling på synchrotron beamline kan også utføres uten en spesialisert goniometer eller luftfukter å lette reprodusere resultatene av ikke-eksperter. Presentert teknikken kan brukes for seriell millisekund krystallografi datainnsamling på romtemperatur mens stråling skade minimal og uten introdusere stress til krystallene etter vekst av cryo-beskyttelse eller krystall håndtering. Derfor er metoden beskrevet egnet for alle protein krystallisering prosjektet.
Protocol
1. chip Design og Master fabrikasjon
- Maske design
- Skissere ønsket stasjon geometrier bruker et egnet CAD-tegneprogram. For hvert photoresist lag, kan du forberede en personlige maske. Alle design brukt i denne protokollen er diskutert i detalj i delen resultater og er tilgjengelig som AutoCad '. DWG' format i supplerende fil 1.
Merk: For å bygge all-PDMS enheter, kanal høyde / bredde-størrelsesforhold bør ikke overstige 1:10 for å hindre kanal kollaps. Både polyimid (pi) folie og kurert epoxy harpiks er kraftigere og i prinsippet bør tillate også høyere størrelsesforhold. Men overstige vi bevisst ikke 1:10 forhold, slik som første design kan testes som tradisjonelle PDMS enheter. - Oversette CAD-filer til emulsjon filmen photomasks. Bruk en nominell 64 k DPI oppløsning vil tillate nøyaktige funksjoner ned ca 5 µm størrelse.
Merk: Dette kan gjøres gjennom et trykkeri. Imaging tjenester kan foretrekker forskjellige tegning konvensjoner å effektivisere filkonvertering for maske bildebehandling. Vennligst be om foretrukne tegning konvensjoner forhånd å unngå arbeidskrevende feilsøking under konverteringen. Masker med gjennomsiktig funksjoner på svart bakgrunn vil mønster SU8 photoresist funksjoner på kjeks til funksjonelle PDMS microchannels under kopi molding. Igjen for svart funksjoner gjennomsiktig bakgrunn masker å forberede PDMS former passer for X-ray flis fabrikasjon. Vi anbefaler bestiller begge maske polariteter å tillate tidlige prototyper og utforming av godkjenningen å dikte PDMS enheter før oversette design i X-ray chips.
- Skissere ønsket stasjon geometrier bruker et egnet CAD-tegneprogram. For hvert photoresist lag, kan du forberede en personlige maske. Alle design brukt i denne protokollen er diskutert i detalj i delen resultater og er tilgjengelig som AutoCad '. DWG' format i supplerende fil 1.
- SU8 master fabrikasjon
Merk: Dette er den eneste prosessen som må utføres i en renrom. Hvis kritiske renrom utstyret ikke er tilgjengelig, kan Fullfør-trinnet bli outsourcet til MEMS støperi serviceselskaper som leverer klar mønstret SU8 mestere. Prosessen SU8 Ifølge data ark instruksjon. Trinn 1.2.1 til 1.2.4 oppsummere generelle SU8 master fabrikasjon arbeidsflyten, med komplett parametere for tre-lags X-ray chip design oppført i tabell 1. En introduksjon til flerlags SU8 justering har vært publisert tidligere29.- Hell ca 1 mL av SU8 motstå på 3 tommers wafer og spinn pelsen SU8 ned til ønsket tykkelse ved hjelp av riktig rotere fart og tid som angitt i tabell 1 (figur 1, trinn 1). Pre stek photoresist ifølge lag tykkelsen på 65 ° C og 95 ° C i noen minutter hver. Utføre før bake å størkne SU8 å forhindre det stikker til photomask og forbedre motstå vedheft til underlaget (figur 1, trinn 2).
- Vise photoresist for UV-lys som angitt i tabell 1 etterfulgt av en post-exposure-bake på 95 ° C katalytisk fullføre photoreaction som er startet i løpet av eksponering (figur 1, trinn 3).
- Gjenta disse trinnene for hvert påfølgende lag. Deretter justere photomasks for påfølgende laget med hjelp av en maske aligner og Vernier caliper justering merker29master.
- Vask bort alle ueksponerte SU8 motstå ved å utvikle kjeks i propylenglykol metyl Eter acetate (PGMEA), til isopropanol skylling lenger avslører melkeaktig nedbør (figur 1, trinn 4). Tørr kjeks med trykksatt nitrogen.
Merk: Isopropanol er en dårlig løsningsmiddel for SU8 og dens nedbør angir gjenværende uherdet restene.
- PDMS mold fabrikasjon
- Legg et stykke aluminiumsfolie (15 × 15 cm) i en Petriskål (10 cm), og plasser SU8 master på aluminiumsfolie i Petriskål for enkel fjerning av master etter PDMS.
- Bland silikon base med herding agent (10:1), som resulterer i et samlet beløp på 25 g, kraftig med en slikkepott i en krukke eller en mekanisk mikser. En 3 tommers wafer i en Petriskål (10 cm) forbruker ca 25 g PDMS resultere i en 5 mm tykk skive.
- Hell ferdigblandet PDMS på SU8-master (figur 1, trinn 5) til en høyde på 4 mm. Desiccate PDMS i 5 minutter for å fjerne luftbobler til ingen, eller bare noen bobler forblir på overflaten PDMS.
- Kurere PDMS i en ovn ved 70 ° C i 1 time. Så kutte ut det herdet PDMS med en skalpell og forsiktig Skrell PDMS mold fra SU8 master (figur 1, trinn 6). Kuttet helt ned til master å forhindre PDMS sprekker under peeling.
- Valgfritt: Forberede cross-sectional skiver av PDMS formene å bekrefte at alle SU8-lag på malen har ønsket tykkelser (figur 1). Tidlig microfluidic kanal oppsett testing kan utføres i alle PDMS chips.
Merk: En replika-formet PDMS kan festes direkte til en barometer substrate etter punching tilgangsporter (trinn 3.3) i PDMS gjennom O2 plasma aktivisering benytter 20 s, 0.4 mbar O2, 50 M, 13,56 MHz. Som nevnt i delen 1.2., dette krever overfor masken polaritet og dermed wafer disposisjon X-ray flis fabrikasjon.
2. i Situ X-ray flis fabrikasjon
- Fortynne både epoxy harpiks forløpere i en siste etanol konsentrasjon av 40 wt % etanol. Totale masse 0,25 g hver epoxy harpiks prekursor i etanol er tilstrekkelig for en 1 cm2 chip.
Merk: Dette reduserer viskositeten av resulterende 5 min epoxy å forenkle boble-fri blanding og kopi-mold støping og minimere tykkelsen på den endelige kurert epoxy lag. Etanol fordamper gjennom PDMS under herding trinnet. - Degas PDMS mold i et vakuum desiccator i 30 min, slik at det kan absorbere små luftbobler fra epoxy harpiks under molding trinnet.
- Kuttet polyimid (pi) folien omtrent 70 × 70 mm og span den rundt en 75 × 50 mm glass lysbilde med tape for å få en flat og stive overflate med tape på baksiden. Plasma aktivere folien med 50 W, 13,56 MHz, 0.4 mbar O2 plasma for 20 s, deretter ruge komplett folie-lysbildet i en vandig løsning av 1 vol % (3-aminopropyl) trimethoxysilane (leiligheter) eller (3-glycidyloxypropyl) trimethoxysilane (GPTS) i 5 min på 20 ° C.
- Grundig blande både etanol utvannet epoxy forløper løsninger for å sikre optimal herding oppførsel. Hent PDMS-formene av vakuum kammer og plassere dem på en flat overflate. Deretter raskt dispensere en dråpe av blandet harpiks på hver mikrostruktur på mold bruker brønnene (ca 10 µL per 1 cm2 microstructures) (figur 1, trinn 7a).
- Hente polyimid (pi) folie lysbilde sandwich fra vandig silane (leiligheter eller GTPS) løsning. Tørr folien med trykkluft eller nitrogen.
- Plass forberedt polyimid (pi) folie-objektglass sandwich på avsatt epoxy harpiks (figur 1, trinn 7b). Trykk bestemt av objektglass knyttet til polyimid (pi) folie mot PDMS mold. Plass en metallplate på objektglass og deretter innskudd vekter bruke opptil 1,4 N/cm2 trykk 1t, mens epoxy harpiks kurer ved romtemperatur.
Merk: Ideelt sett ingen harpiks forblir på folien i områder der strukturer i mold har maksimal høyde. Dette tilsvarer krystallisering brønnene der krystallisering skjer etterpå.- Valgfritt: Hvis nøyaktig molding små funksjoner er kritisk, PDMS mold kan være forsterket med aluminiumsramme under molding trinn31.
- Fjerne av objektglass polyimid (pi) folien og mønstret epoxy ved peeling det fra PDMS mold (figur 1 trinn 8). Plasma aktivere siden mønstret epoxy med 50 W, 13,56 MHz, 0.4 mbar O2 plasma for 20 s.
- Etter fjerning av polyimid (pi) folien fra plasma kammer, ruge epoxy-mønstret folien i en 1 vol % vandig leiligheter (eller GPTS) løsning for 5 min på 20 ° C. Tilsvarende forberede en andre un mønstret polyimid (pi) folie med komplementære 1 vol % GPTS (eller leiligheter) silane aktiveringen. Etter inkubasjon, tørr både strukturert og ustrukturert folie med trykkluft.
- Plasser epoxy siden face opp på flatt underlag, bruker overflatespenning av en dråpe vann under som megler hindre curling av folien og sikre maksimal flathet. Plass den andre aktivert polyimid (pi) folien på toppen og forsiktig strek med fingeren fra ett hjørne til motsatt å gjøre dem bånd og å unngå dannelse av bobler.
3. tilgang porter for væskestrømmen
- Forberede 4 mm tykk PDMS plater i en Petriskål etter trinn 1.3.1 til 1.3.3 uten å bruke SU8-master. Skjær skive i PDMS blokker av passende størrelse å dekke alle innløp porter i chip, uten å dekke individuelle krystallisering seksjonene av chip.
- Plasma aktivere begge, chip og PDMS blokk i 50 M, 13,56 MHz, 0.4 mbar O2 plasma for 20 s. For kjemisk binding, deretter ruge hver del i en 1 vol % leiligheter eller GPTS vannoppløsning i 5 min på 20 ° C. Tørke hver del med trykkluft og trykk PDMS skive til folie chip.
- Forbedre bonding, plassere brikken på en flat PDMS plate og dekke det med en plastfolie, etterfulgt av et rent glass lysbilde og en metall blokk. Til slutt sette vekter for å legge opptil 1,4 N/cm2 press i ca 1 time.
- Hull tilgang med 0,75 mm biopsi punch på hver posisjon der innløp og utløp porter markeres chip-design og forsegle ryggen med tape. Chip er nå tilgjengelig for noen rør med en ytre diameter matchende diameteren på hullet (som beskrevet i trinn 4.2).
4. overflatebehandling
- Forberede en 1:20 fortynning av 9 wt % fluoropolymer aksjer i fluoro-løsningsmiddel til en siste konsentrasjon av 0,45 wt %. Lagre lager løsninger og fortynninger i kjøleskap i mørket på 4 ° C.
- Laste 1:20 fluoropolymer fortynning 1 mL Luer-lock sprøyter til. Knytte en 27G × 5/8-tommers nålen på sprøyten og en PTFE rør til nålen.
- Koble slangen til X-ray brikke stikkontakt og injisere fluoropolymer fungerende løsning utarbeidet i trinn 4.1 til alle kanaler er fylt.
- Plassere brikken med den flate siden ned på en kokeplate 190 ° C i 5 min til å fordampe alle løsemiddelet til å sette inn i fluoropolymer på en tynn film belegging.
Merk: Når du bruker en ny geometri, kontrollere om kanaler var tilstoppet med fluoropolymer underveis belegg. I så fall ytterligere fortynne lager løsningen.
5. protein forberedelse
- Veie lyofilisert thaumatin og oppløse den i en buffer løsning oppført i tabell 2 aktuelle volumet å få en endelig protein konsentrasjon av 40 mg mL-1.
- Dialyze glukose isomerase mot bufferen oppført i tabell 2 i henhold til produsent-protokollen.
- Forberede protein thioredoxin som beskrevet tidligere av Schubert et. al. 30.
- Kontroller de siste protein konsentrasjonene photometrically bruker utryddelse koeffisientene oppsummert i tabell 2, beregnes av programvaren ProtParam32.
- Forberede alle løsninger med ultrapure vann og filtrere dem med filtere 0,2 µm.
- Sentrifuge protein løsningene ved 20 ° C i 15 min 16100 x g, og ta nedbryting for krystallisering eksperimenter.
6. protein krystallisering X-ray chip
- For å utkrystallisere proteiner microfluidic sjetonger, bland like mye protein løsning og precipitant løsning. Protein konsentrasjon, buffer sammensetning og precipitant komposisjon oppsummeres i tabell 2. Forberede et totalt volum på rundt 20 µL å fylle en microfluidic chip.
- Umiddelbart etter blanding, injisere løsningen til innløp porten av chip via en sprøyte, koblet til en 27G × 5/8-tommers nål og PTFE rør med 0,75 mm ytre diameter (detaljert i trinn 4.2).
Merk: Fylle prosedyren for seriell oppsettet krever en tidligere fylling av chip med fluorholdige olje, som gjøres enkleste ved lasting fluorholdige oljen fra uttaket porten før injisere krystallisering løsningen gjennom innløpet port. Alle lasting trinnene bør overvåkes bruker et mikroskop for å kontrollere brukt sprøyte trykket og tilsvarende flyt." - Etter at chip er fylt, skille de personlige krystallisering avdelinger ved å injisere fluorholdige olje til innløp porten på chip. Forsegle brikken blokkerer alle innløp og utløp porter av chip. Dette kan gjøres ved å sette inn en binders.
Merk: Fordi krystallisering seksjonene er fylt av protein/precipitant løsning, fluorholdige olje bare fyller innløp kanalen av chip, uten å påvirke løsningen i krystallisering seksjonene. - For å etterligne damp diffusjon krystallisering kinetikk, plass forseglet chip omgivelsestemperatur og normal atmosfære å tillate slippverktøyet i krystallisering skuffen å krympe av fordampning av vann gjennom polyimid (pi) folien.
- Etter krystall formasjon er observert via et mikroskop eller DLS målinger (trinn 7), overføre komplett microfluidic chip i precipitant løsningen, stoppe videre fordampning fra krystallisering brønnene til X-ray Diffraksjon eksperimentet utføres.
7. dynamisk lys spredning mål i krystallisering brønner i Chip
Merk: DLS målinger ble utført med en laser utgangseffekt på 100 mW, en bølgelengde på 660 nm og spredte lys ble oppdaget i spredning vinkel 142 °. Fordi alle undersøkte utvalg løsninger var vandig brytningsindeks vann (n = 1,33) ble brukt i alle beregninger.
- Sted microfluidic chip i den i SBS format plate innehaveren av DLS apparatet ved hjelp av kortet beskrevet i trinn 8.1. Sett inn kortet i enheten.
- Nøye justere laser fokus inne en kupé av microfluidic chip ved å bruke motoriserte x-, y-, z-scenen. Microfluidic-brikken er svært tynn, justere z-nivået ved å bruke lite inkrement trinnene.
Merk: En riktig justering er bekreftet av en høy skjæringspunkt og en glatt hale av den resulterende autokorrelasjon DLS målingen. Kan opprette en kalibrering fil som samsvarer med plasseringen av hver individuelle krystallisering i microfluidic chip, slik at automatiske DLS mål i flere rom over tid. - Utføre hver DLS måling på 293 K for 30 s og gjenta målingen hver 5 min til slutten av krystallisering eksperimentet.
Merk: Første nucleation kan etterfølges av radius fordelingen av DLS målinger over tid og vellykket krystall-formasjonen kan parallelt etterfølges av innebygd mikroskopet av DLS plate leseren.
8. Diffraksjon datainnsamling
- Adaptere for beamline goniometers
- Skrive ut kortene for plate goniometer plasser og rotere X-ray chips under krystallografisk datainnsamlingen.
- Dikte adaptere for den grunnleggende goniometer på en hobby-klasse 3D skriver bruker standard parameterinnstillinger som anbefalt av produsenten.
Merk: Kortene ble utviklet ved hjelp av en 3D-CAD-System og koordinere filene av kortene er vedlagt i '. STL "-filformat i tillegg. - Fastsette X-ray chips til kortet med dobbeltsidig tape.
-
i situ Røntgenkrystallografi
- Samle Diffraksjon data ved hjelp av en bjelke størrelse 10 × 5 µm (FWHM av Gaussian profil) på 296 K. Bruk røntgenstråler med en av 12,8 keV og en forandring av 2.2 · 1011 fotoner · s-1 i dempes strålen, og posten Diffraksjon mønstre ved hjelp av en Pilatus 6 M hybrid pixel detektor.
Merk: Microfluidic enheter som inneholder thaumatin, glukose isomerase eller thioredoxin krystaller brukes til i situ X-ray krystallografisk eksperimenter på EMBL beamline P14 av PETRA III synchrotron. Tilgjengelige strålen fokus størrelse og fluks avvike på kildene X-ray. Antall synlige protein krystaller, antall Diffraksjon mønstre innspilt fra hver krystall, oscillation vinkel området per eksponering og eksponeringstid oppsummeres i tabell 3. - Prosessen angir to påfølgende Diffraksjon mønster med programmet XDS33. Bruk bash-skript "xds.sh" i tillegg.
- Opprette HKL filer for hvert datasett fra alle krystaller og skalere dem ved hjelp av programvaren XSCALE33. Bruk bash-skript "xscale.sh" i tillegg til å opprette en inndatafil XSCALE.
Merk: Bare datasett krystaller som har korrelasjonskoeffisienter større enn 90%, som indikerer en høy grad av isomorphism, skal skaleres. Konservative kriterium ‹I/σ (I) › (> 2) skal brukes til å bestemme høyeste oppløsning skallet. Molekylær erstatning ved hjelp av programmet MOLREP34 CCP4 suite35 kan brukes til å få faser for ytterligere modell bygning ved hjelp av 3D-koordinatene av Protein databank (PDB) vises i tabell 3. - Forbedre alle strukturer isotopically bruker Refmac535,36 og bruke KVAKK37 for visuell inspeksjon av den siste modellen.
Merk: Løsemiddel molekyler automatisk skal legges til under av raffinement og må kontrolleres for å bekrefte kjemisk rimelig posisjoner. Alle modeller må undersøkes for å identifisere Ramachandran outliers.
- Samle Diffraksjon data ved hjelp av en bjelke størrelse 10 × 5 µm (FWHM av Gaussian profil) på 296 K. Bruk røntgenstråler med en av 12,8 keV og en forandring av 2.2 · 1011 fotoner · s-1 i dempes strålen, og posten Diffraksjon mønstre ved hjelp av en Pilatus 6 M hybrid pixel detektor.
9. data evaluering
- Stråling skader
- Analysere forfallet av Diffraksjon makt over tid med en metode beskrevet av Owen et al38. For dette, kan du beregne den totale summen av I/σ(I) (fra XDS33) av alle indekserte refleksjoner av hver evaluerte Diffraksjon datasett (2 sammenhengende Diffraksjon mønster), bruke som en referanseverdi. Bruk bash-skript "ISigma.sh" fra supplement.
- Normalisere Diffraksjon kraften i hvert datasett å bety Diffraksjon makt første datasettet.
- Analysere endringen av Rmeas verdier over tid ved å ta Rmeas verdiene fra Correct.LP filene fra XDS33 (bash script "Rmeas.sh" fra supplement).
- Crystal orientering
- Bestem vinklene Euler å få informasjon om distribusjon av krystall gitter retningene i forhold til laboratoriet koordinatsystem. Beregne Euler vinkler fra XDS orientering matrise i utdatafilen XPARM39 programmvre Matlab. Bruk bash-skript "rotation_matrix.sh" for å ekstra rotasjon matrise fra hver krystall fra filen XPARM. Bruke utdatafilen som inndata i Matlab for å beregne Euler vinkler bruker Matlab funksjon rotro2eu.m (supplerende fil).
Merk: En detaljert beskrivelse av beregningen er publisert med Zarrine-Afsar et al40. - Konvertere innhentet Euler vinkler fra radianer til grader. Gruppere innhentet Euler vinkler for alle tre rotasjon fly (xy, xz og zy) i klasser på 10° og tegne dem ved hjelp av programvaren Origin9.
- Bestem vinklene Euler å få informasjon om distribusjon av krystall gitter retningene i forhold til laboratoriet koordinatsystem. Beregne Euler vinkler fra XDS orientering matrise i utdatafilen XPARM39 programmvre Matlab. Bruk bash-skript "rotation_matrix.sh" for å ekstra rotasjon matrise fra hver krystall fra filen XPARM. Bruke utdatafilen som inndata i Matlab for å beregne Euler vinkler bruker Matlab funksjon rotro2eu.m (supplerende fil).
Representative Results
Epoxy er en utmerket fyllmasse X-ray flis fabrikasjon. Det er billig, enkel og robust prosessen uten å kreve spesialverktøy (figur 1). Redusere epoxy viskositet ved å fortynne den med 40 wt % etanol tilrettelagt fjerning av overskytende resin over krystallisering brønnen, som resulterer i definerte X-ray windows. Høyere etanol fortynninger resulterte i feil i herdet harpiks. Ved å analysere X-ray chip tverrsnitt, bestemt vi totale vinduet tykkelsen på begge sider til å være ca 19 µm tykk, som er svært nær nominell tykkelsen på brukte polyimid (pi)-folier på 2 × 7.5 µm (figur 2)
Krystallisering forsøk ble isolert i flere nanoliter størrelse reaksjon rom hver, bruker en kapillær ventil mekanisme som beskrevet tidligere41. Denne "store-da-Opprett" lasting teknikken unngår eksempel tapet fra kanalen døde-volumet og kan enkelt utføres manuelt, eliminerer behovet for å bruke pumper eller annet utstyr for væske actuation42. Chip er primet med fluorholdige olje før lasting vandig prøven. Overflatespenningen i olje-vann-grensesnittet mellom grunning olje og vandig prøven resultater i en presset forskjell over grensesnittet. Dette Laplace presset avhenger både kurveradiusen og overflatespenning av grensesnittet. For å redusere energibruk, må grensesnittet redusere overflaten som tilsvarer maksimere sin viktigste radier svingtype på konstant volum. En lav kurvatur i en bred kanal har lavere Laplace trykk så en høy kurvatur-grensesnitt i en smal kanal-segmentet. Derfor prøve pluggen inn fortrinnsvis og renner gjennom bred bypass kanal i stedet for strømmer gjennom smale kapillær ventil restriksjoner. Endelig etterfølges utvalg pluggen av fluorholdige olje å skille eksempel brønnene i uavhengige dråper.
Robust og pålitelig lasting ble oppnådd med strømningshastigheter opp til 1 mL/t i både en seriell og en parallell godt arrangement (Figur 3). I oppsettet for "føljetong" er godt innløp og kapillær ventil constrictions sekvensielt koblet til en bypass kanal31. Derimot i "parallelle" oppsett to separate viktigste kanaler koble alle godt viker eller kapillær ventiler bare43. Begge ordningen konsepter har vært tidligere sammen med formulering kontroll skjermen komposisjon, som er et nyttig aspekt i protein krystallisering43,44. Seriell design har bare to væske porter, en vik og en stikkontakt. Den har færre flytende porter, og derfor er enklere å bygge og drive. Parallell oppsettet har 4 væske porter, 2 for den viktigste kanalen koble brønnene og 2 for å koble opp kapillær ventilene la luften eller overflødig olje rømme. Lasting kan derfor fortsette fra begge hovedkanalen sider. Dette oppsettet har generelt lavere flyt motstand for likt antall brønner på grunn av det kortere omkjøringsvei. Det er derfor bedre egnet for skaleres opp enheter med et høyt antall brønner. Også prøve brønnene er orientert nærmere sammen, som gir fordeler for automatisert imaging.
Komplett utvalg godt lasting ble observert for begge oppsettene, hvis enten bygget som en to-høyde eller en tre høyde design. I en design med to høyde er både prøven godt og omkjøringsvei kanalene like høyde. Tre høyde utformingen krever en tredje maske, et lag med ekstra SU8 og et justering skritt for å sikre at prøven brønnene blir høyere enn forgjengeren omkjøringsvei kanaler. Denne høyde-differensial fremmer inn prøven væske inn i brønnen gjennom den samme kapillær valving prinsippet som stopper strømmen på constrictions. Her tilsvarer høyere godt taket en lavere Laplace press fremmarsj menisk og flyt omkjøringsvei retning bare foretrukket når brønner har fylt helt slik at ventilen constrictions blokkerer videre flyten og viderekoble ned bypass. Men krever vellykket lasting strengt ikke brønnene er høyere enn bypass som passende kapillær valving kan også oppnås ved å justere kanal bredder tilsvarende. Likevel, i vår erfaring, høyere brønnene utført betydelig mer robust og defekt gratis lasting ble observert på opptil ti ganger høyere strømningshastigheter i alle tre høyde design sammenlignet med tilsvarende to høyde. Denne effekten ble mer uttalt i oppsettet parallelt.
For å etterligne damp diffusjon krystallisering kinetikk, utnyttes endelig permeabilitet av polyimid (pi) folien for å kontrollere fordampning over tid. Eksperimentell fordampning priser kvantifisert ved å overvåke endringen slippverktøy volum over tid ved likhetstegn mellom slipp areal og godt høyde (figur 4C). Fordampning fra krystallisering brønner i X-ray chip fortsetter ikke i et lineært, som et mindre areal av drop samtidig med økende stoff konsentrasjonen resulterer i en redusert Fordampningshastighet tid45. Første fordampning fulgte en ca lineær hastighet på om 0,5 nL h-1 i brønner for den serielle layoutgeometrien.
For bedre å forstå den krystallisering kinetikk, ble DLS målinger utført i krystallisering brønnene av microfluidic chip. Første DLS målinger, var en PDMS chip limt på et glass lysbilde pleide å gi bedre optiske egenskaper for lysspredning eksperimentet. Denne brikken hadde samme godt dimensjoner som X-ray chip. PDMS har en høyere vanndamp permeabilitet enn polyimid (pi) av polyimid (pi) windows i X-ray chip45. Siden flux skalaer lineært med avstand, samsvarer fordampning banen til en polyimid (pi) windowed godt med et tilsvarende PDMS vindu av riktig tykkelse.
DLS resultater viser at radius fordelingen endringer over tid (figur 4A-B) viser at DLS målinger kan oppdage den første nucleation før første krystallinsk partikler er observert. Denne informasjonen kan brukes til å nucleate og vokse enkelt krystaller per brønn ved tilpasning eksternt fordampning og dermed supersaturation nivåer på et tidlig stadium i nucleation46.
X-ray chip ble løst på en 3D trykt adapter for SBS kompatibel plate goniometer på EMBL-beamline av synchrotron P14 på PETRA III (figur 5A). Alternativt kan en mindre 3D trykt ramme brukes til mount X-ray sjetonger til standard beamline goniometers21. Thaumatin krystaller har en størrelse på 10-20 µm (figur 5B) og diffract til en oppløsning på 2,0 Å (figur 5C). Som forventet, røntgen bakgrunn bidrag av to tynne polyimid (pi) folier windows fra X-ray brikken er begrenset til polyimid (pi) polymer spredning ringer på 11 Å (2θ ~ 5°) og 33 Å (2θ ~ 1,7 °) for X-ray bølgelengden til 0,97 Å. Disse to ringer forstyrr ikke databehandling. Totalt dataset med 83 thaumatin krystaller ble samlet inn og 10 Diffraksjon mønstre ble registrert fra hver krystall med en 1° rotasjon i hver ramme. Databehandling og raffinement parametere, samt statistikk for thaumatin datasettet er oppført og sammenlignet med to andre datasett glukose isomerase og thioredoxin som var samlet i situ er oppført i tabell 3 og Tabell 4.
Intensitet forfallet av normalisert Diffraksjon makt over tid ble undersøkt ved å dele opp thaumatin dataset i fem sub datasett (to Diffraksjon mønstre ble brukt per delsett for å opprettholde komplett datasett). Som vist i figur 6B, Diffraksjon makt begynte å redusere etter første sub datasettet og var under 50% i fjerde sub datasettet. Resultatet øke Rmeas verdiene for sub datasett også over tid, som angir X-ray stråling skader under datainnsamling. Vi hypothesize at frie radikaler genereres under røntgen-eksponering raskt brytes ned nærliggende krystaller i samme reaksjon batterirommet. Slike sekundære X-ray skadene var for eksempel mindre uttalt i en relatert eksperimentelle tilnærming, der krystaller er distribuert over et betydelig større område polyimid (pi) sandwich21. For å minimere samlede X-ray skade, skal bare et lite antall Diffraksjon mønstre fra en bestemt krystall samles ved romtemperatur. Også, bare én enkelt protein krystall må utsettes hver avdeling av microfluidic chip. Alle strukturmodeller raffinert bruker behandlet datasett viser meget god stereokjemi og egnet statistikk (Tabell 4). Dessuten, var alle endelige elektron tetthet kart av meget god kvalitet.
I forrige krystallografi tilnærminger X-ray gjennomsiktig sjetonger, retning og ordning av krystallene hadde manipuleres bevisst for å få en tilfeldig fordeling av krystall orientering40 eller ble innhentet av krystall bevegelser innen flytende lag21. For å evaluere krystall retningen i X-ray gjennomsiktig microfluidic chips beskrevet i denne protokollen, identifiserte enheten cellen retningen av alle synlige krystaller med hensyn til laboratoriet koordinatsystem. For bipyramidal thaumatin krystaller, ble en liten preferanse observert (figur 7A), mens vi fikk en bred distribusjon for glukose isomerase krystaller (figur 7B). Vi tenkte at på nanometer scale, de fleste materialer ha betydelige råhet. Derfor kan krystaller spontant nucleate på overflaten i betydelig mindre partisk orientering spontant. Slike en liten krystall kjerne kan være låst i en retning, mens du fortsetter å vokse til passende størrelse uten å snu i forhold til normal av overflaten. Faktisk har overflaten mediert krystall nucleation lenge vært en ulempe for crystallographers prøver å gjenta en vedlagt krystall av overflaten uten å skade krystall i prosessen. Her kan vi direkte bruke slike krystaller for Diffraksjon datainnsamling. Imidlertid finnes systemet bestemte begrensninger, som thioredoxin en sterk preferanse for visse orientering i xy-, xz- og yz-fly (figur 7C). Eksemplene viste viser at retningen fordelingen ikke bare avhengig av vekst miljøet, men også på crystal figuren. Thioredoxin krystallene har langstrakt figurer som pleier å vokse i foretrukket retning, mens tetragonal bipyramidal thaumatin krystaller eller orthorhombic glukose isomerase krystaller ikke viser dette problemet. Men i alle tilfeller, selv med ønsket orientering tilgjengelig rekke krystall rotasjoner resulterte i tilstrekkelig god dekning av gjensidige plass og dermed komplette datasett for alle undersøkt proteiner. Dermed måtte ingen ytterligere tas når krystaller for Xray eksponering.
Figur 1 : Av microfluidic X-ray flis fabrikasjon. (1) SU-8 er utlevert på silisium substrat og spinn belagt for å få ønsket lagtykkelse. (2) Photoresist er eksponert for UV-stråling gjennom en maske. (3) ueksponerte photoresist er så utviklet bort av fortløpende vask med PGMEA og isopropanol, resulterer i (4) en SU-8 master for ytterligere avstøpning trinn. (5) PDMS er strømmet ut, og (6) etter herding PDMS mold, skrelles fra master SU-8. (7a) Epoxy limet er utlevert på PDMS mold og (7b) en aktivert polyimid (pi) folie er kjemisk festet til epoxy harpiks. (8) etter herding skrelles polyimid (pi) folien med mønstret tynn epoxy filmen fra PDMS mold. (9) i et siste skritt, er enheten collectible med en andre polyimid (pi) folie til en lukket lav X-ray bakgrunn microfluidic chip. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Bilde (venstre) og mikroskopi bilder av tverrsnitt av siste sjetonger. Et representativt kanal segment (midten) og en krystallisering godt (høyre) fra to separate chips vises. Pilene angir målt avstand. Alle dimensjoner er i µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Skjemaer over krystallisering godt design med [A] parallell eller [B] føljetong layout, som vist fra toppen og fra siden med dimensjoner i µm. Typisk kanal høyder var: 50 µm bypass, 50-60 µm krystallisering godt, 5-10 µm kapillær ventil, svarer godt mengder ca 2,5 nL (parallell oppsett) og 8 nL (seriell oppsett). Representant også laste atferd er vist med mat fargestoffer. Chip ble primet med 12 wt % 1 T, 1 H, 2H, 2H-perfluoro-1-octanol i FC-43, før mat fargestoff ble injisert i lagring brønner. Hvite pilene angir retningen på flyten. Oversikt over bilder lastet enheter viser alle brønnene lastet feil gratis, illustrerer robust utvalg lasting. Parallell oppsettet illustreres som tre høyde design, med krystallisering brønner høyere enn bypass, mens oppsettet føljetong er avbildet som en to-høyde design med brønner og omkjøringsvei har samme høyde. Typisk strømningshastigheter var rundt 150 µL/t under lasting, men feil gratis lasting ble observert i flowrates på opptil 1 mL/t i tre høyde-design. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : I situ dynamisk lys spredning av en krystallisering vel over tid. [A] mikroskopiske bilde rekke krystallisering godt. Lagrede slippverktøyet kontinuerlig krymper som vanndamp fordamper over tid. Første thaumatin microcrystals kan observeres etter 4 h. [B] tilsvarende etter radius distribusjon av thaumatin partikler målt ved DLS under samme krystallisering prosessen fotografert i [A]. Dannelsen av en andre radius brøk, som angir første nucleation hendelser kan sees etter ca 1-2 h. [C] representant volum reduksjon av to referanse slippverktøy volumer på grunn av fordamping vanntap over tid. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5 : i situ Diffraksjon datainnsamling. [A] personlige microfluidic chips er montert av en 3D trykt adapter (blå) på en plate goniometer. [B] Thaumatin krystaller i microfluidic chip under røntgen-eksponering som fotografert av innebygde mikroskopet på beamline P14. [C] Diffraksjon av thaumatin krystaller ble registrert til en oppløsning på 2,0 Å, med negligibly lav bakgrunn. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6 : Data evaluering av Diffraksjon data fra thaumatin krystaller i microfluidic chip, innspilt i romtemperatur-. [A] electron tettheten av raffinerte thaumatin modellen med rammen bare 1-2 datasett (blå konturene på 1,5 σ). [B] intensitet forfallet av thaumatin krystaller som en funksjon av X-ray dose. [C] utviklingen av Rmeas verdien over X-ray dose. Boksen tomter i [B] og [C] med kvartiler (øvre verdier 75% median verdier 50%, lavere verdier 25% og betyr) og følehorn med 95% konfidensintervall representerer forfallet av Diffraksjon intensitet og Rmeas av alle synlige krystaller (n = 83). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7 : Fordeling av enheten cellen orientering i microfluidic chip folien med hensyn til laboratoriet koordinatsystemet. [A] bipyramidal thaumatin krystaller viste en bred distribusjon av retninger som dekker nesten 180° i xy-(blå), xz-fly (grønn) og yz-(red) flyet. [B] glukose isomerase viser også en omfattende distribusjon, mens [C] thioredoxin viste en sterk preferanse for bestemte retninger. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| SU8-lag | Spin strøk | Før bake | Utsette | Etter bake |
| [65 / 95 ° C] | [65 / 95 ° C] | |||
| 1-laget : brønner | 1000 RPM | 0 / 10 min | 200 mJ/cm2 | 1 / 4 min |
| 15 µm SU8-3010 | ||||
| 2nd lag: omkjøringsvei | 2000 RPM | 0 / 16 min | 220 mJ / cm2 | 1 / 5 min |
| 35 µm SU8-3025 | ||||
| 3rd lag: ventiler | 3000 RPM | 0 / 3 min | 150 mJ / cm2 | 1 / 2 min |
| 5 µm SU8-3005 |
Tabell 1: SU8 prosessen eksempel på tre-lags parallelle X-ray flis tegning. Dette lag bestilling vil tillate avstøpning en PDMS mold X-ray flis fabrikasjon. For å direkte mold en PDMS under prototyping, reverse laget rekkefølge under master fabrikasjon starter fra 3rd til slutt med1-laget i stedet.
| Protein | Protein konsentrasjon | Protein buffer | precipitant | Plass gruppen PDB oppføring | Utryddelse koeffisienten [M-1 cm-1] |
| Thaumatin (Thaumatococcus daniellii) | 40 mg mL-1 | 50 mM Bis-Tris, pH 6,5 | 1.1 M natrium tartrate, 50 mM Tris, pH 6.8 | I4222, 1LR2 | 29420 |
| Glukose isomerase (Streptomyces rubiginosus) | 25 mg mL-1 | 10 mM HEPES, 1 mM MgCl2, pH 7.0 | 100 mM Bis-Tris, 2,7 M ammonium sulfate, pH 5.7 | I222, 4ZB2 | 46410 |
| Thioredoxin (Wuchereria bancrofti) | 34 mg mL-1 | 20 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA, 150 mM NaCl, pH 8.0 | 27.5% PEG1500, 100 mM SPG buffer, pH 6.3 | P41212, 4FYU | 24075 |
Tabell 2: Krystallisering forhold og space grupper av protein krystaller forberedt, inkludert utryddelse koeffisient og pdb koden.
| Protein | Antall synlige krystaller | Antall Diffraksjon mønster per krystall | Svingning området per eksponering [°] | Eksponeringstid [ms] | PDB-oppføring for MR |
| Thaumatin (Thaumatococcus daniellii) | 103 | 10 | 1 | 40 | 1LR2 |
| Glukose isomerase (Streptomyces rubiginosus) | 69 | 100 | 0,1 | 80 | 4ZB2 |
| Thioredoxin (Wuchereria bancrofti) | 68 | 10 | 1 | 40 | 4FYU |
Tabell 3: X-ray Diffraksjon data samling parameter.
| Data samling statistikken | thaumatin (Ramme 1-20) |
glukose isomerase (ramme 1-100) | thioredoxin (Ramme 1-10) |
| Beamline | P14 | ||
| Bølgelengde [Å] | 0.96863 | ||
| Plassen gruppen | P41212 | I222 | P42212 |
| Enheten cellen parametere: en = b, c [Å] | 58.62, 151.48 | 93.91, 99.60, 103.04 | 58.45, 151.59 |
| Antall krystaller | 101 | 41 | 34 |
| Totalt oscillation [°] | 10 | 10 | 10 |
| Oppløsning [Å] | 30.1.1989 (1.95-1.89) |
30.1.1975 (1.80-1.75) |
30.3.2000 (3,20-3,00) |
| Temperatur [K] | 296 | 296 | 296 |
| R p.i.m.b | 7.5 (25,5) | 8.8 (28,0) | 9.1 (33.2) |
| Målt refleksjoner | 1553200 | 690000 | 1111196 |
| Unik refleksjoner | 21850 | 48942 | 44449 |
| Gjennomsnittlig I/σ(I) | 6.07 (1,78) | 5.85 (1.66) | 4.08 (1,47) |
| MN(I) halv-sett korrelasjon CC(1/2) | 96.2 (72.2) | 95,8 (68,2) | 97,9 (75.3) |
| Fullstendigheten [%] | 99.8 (100.0) | 100.0 (99,9) | 99,9 (100.0) |
| Redundans | 71.1 | 14.1 | 25 |
| Raffinement statistikk | |||
| Oppløsning utvalg [Å] | 1/30/1989 | 1/30/1975 | 3/30/2000 |
| R / Rgratis [%] | 18.8/23.9 | 18.1/20.5 | 18.9/23.1 |
| Protein atomer | 1550 | 3045 | 1129 |
| Vannmolekyler | 51 | 111 | 164 |
| Ligand molekyler | 20 | 0 | 0 |
| RMS avvik | |||
| Bond-lengde [Å] | 0,02 | 0.026 | 0,01 |
| Bond vinkel [°] | 2,04 | 2.22 | 1.43 |
| B faktor [Å2] | |||
| Protein | 22,6 | 20 | 50 |
| Vann | 25,1 | 27,1 | 29,7 |
| Ligand | 20.4 | ||
| Ramachandran tomten analyse | |||
| Mest favoriserte områdene [%] | 97.67 | 95.32 | 96.13 |
| Tillatte områder [%] | 2.44 | 4,16 | 3.64 |
| Sjenerøst tillatt områder [%] | 0.49 | 0.52 | 0,23 |
| a: verdier i parentes er for høyeste oppløsning skall. | |||
b: ( ), hvor (hkl) er gjennomsnittlig intensiteten av refleksjoner hkl, Σhkl er summen over alle refleksjoner og Σi er summen over jeg målinger av refleksjon hkl. |
|||
Tabell 4: Data innsamlingstall av datasett fra thaumatin, glukose isomerase og thioredoxin.
Supplementry-fil 1: chip_geometry.dwg. CAD-fil av chip geometrier brukes. Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplementry-fil 2: goniometer_adapter.stl. STL-filen angir X-ray chip goniometer kortet. Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplementry-fil 3: xds.sh. Bash script for å lage inndatafiler behandle kiler av Diffraksjon data av XDS. Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplementry-fil 4: xscale.sh. Bash-skript for å flette Diffraksjon data fra delsett og lage en HKL-fil. Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplementry-fil 5: ISigma.sh. Bash script for å pakke ut ISigma verdiene fra alle personlige delsett. Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplementry-fil 6: Rmeas.sh. Bash script for å pakke ut Rmeas verdier fra alle personlige delsett. Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplementry-fil 7: rotation_matrix.sh. Bash script for å forberede inndatafilen for Matlab beregne Euler vinkler fra rotasjon matrise. Klikk her for å laste ned denne filen.
Discussion
Vi dikte microfluidic enheter for i situ X-ray Diffraksjon av mønstre epoxy harpiks som fyller materiale og polyimid (pi) folie som vinduet materiale. Vår prosedyre optimalisert trinnene av fabrikasjon prosessen over tidligere X-ray chip design16,21. Vi redusert vinduet tykkelsen og dermed bakgrunnen spredning mens Lettelsene også fabrikasjon som færre prosesstrinn er nødvendig. i situ krystallisering bruker beskrevet protokollen har betydelige fordeler. Den lar Diffraksjon datainnsamling ved romtemperatur og utelukker dermed behovet av cryo beskyttelse, som i noen tilfeller inneholder risikoen ved å innføre gjenstander i protein strukturen. Videre er krystallene ikke underlagt fysisk stress, fordi overføring av krystaller fra sine opprinnelige omgivelser kan unngås. Gjennom denne prosedyren krystallene opprettholde deres høyeste kvalitet og lider ikke av noen behandling.
I vår erfaring dreier De viktigste trinnene i protokollen kontrollere krystallisering prosessen. Parameterne for å få X-ray egnet krystaller med aktuelle dimensjoner må identifiseres empirisk og kan ikke bli tatt direkte fra damp diffusjon eksperimenter. Bruke identiske konsentrasjoner av protein og precipitant resulterte ikke alltid i krystaller i forskjellige sjetonger eller tider i forskjellige brønner i samme chip. Dette angir at alle faktorer som påvirker krystall nucleation og vekst bør vurderes nøye, som mor brennevin sammensetning eller krystallisering kinetics (gjennom fordamping banen). Som større krystaller diffract høyere oppløsning, dyrkes ideelt passe store krystaller. Crystal nucleation og vekst kan følges med DLS mål. Justere laser fokus i ~ 50 µm tynn krystallisering deler av chip kan være utfordrende og krever nøye manuell justering. Ved brønner dypere enn 100 µm var laser automatisk justering mulig og pålitelig, slik at flere brønner kan overvåkes gjennom automatisert oppkjøpet ordninger.
Polyimid (pi) basert X-ray chips produserer bare en lav bakgrunn og vi viser hensiktsmessigheten av disse enhetene for rutine X-ray Diffraksjon datainnsamling ved å løse strukturer for tre modell proteiner. Den beste oppløsningen innhentet i chip skilte seg, sammenlignet med tidligere oppnådd oppløsninger, fra betydelig større protein krystaller og konvensjonelle X-ray datainnsamling. Dette kan skyldes flere faktorer og krystallisering tilstand optimalisering kan videre forbedre Diffraksjon. Det var mulig å samle inn i situ Diffraksjon data opptil 1,8 Å oppløsning bruk krystallen med størrelse mindre enn 30 µm. Den detaljerte analysen av thaumatin Diffraksjon data gitt innsikt om stråling skader. For å begrense forlenge stråling skade, må bare en enkelt krystall utsettes hver avdeling i microfluidic enheten, som spredningen av radikaler og i nærliggende krystaller kan oppstå. For å forbedre hastigheten på datainnsamling, bør dette automatisert i fremtiden.
På grunn av krystall morfologi, i noen tilfeller kan en foretrukket retning oppstå. Dette var for eksempel tilfellet med datasettet thioredoxin der krystallene hadde en sterkt foretrukket retning i forhold til vinduene chip. Selv her, kan vi samle inn komplett Diffraksjon dataset. Hvis krystaller forevise en ønsket retning chip og spesielt hvis tilsvarende plass gruppen har også en lav symmetri, deretter fullstendigheten av datasettet bør følges under samlingen slik at tilstrekkelig Diffraksjon mønstre cane være samlet.
Tid-løst studier med disse brikkene er direkte mulig når bruker lys indusert reaksjoner med en pumpe-sonden tilnærming. Polyimid (pi) folie lystransmisjon for pumpe laser må bli belyst og eventuelt fjerne optisk polyimid (pi) eller COC kan brukes. Gjeldende microfluidic geometrier tillater ikke substrat blande eksperimenter etter krystallene er vokst. Men forventer vi beskrevet X-ray flis fabrikasjon protokollen også være egnet for slike blande design for både tid-løst X-ray Diffraksjon samt spredning tilnærminger19.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av PIER frø fondet PIF-2015-46, BMBF gir 05K16GUA og 05K12GU3, og "The Hamburg sentrum for superrask Imaging-struktur, dynamikk og kontroll av saken i Atomic skalaen" excellence klyngen av Deutscher Forschungsgemeinschaft (DFG). Arbeidet med forfatterne tilknyttet Center for fri-elektron Laservitenskap ble finansiert av Helmholtz foreningen gjennom programmet orientert midler. Synchrotron MX dataene ble samlet inn på beamline P14 drives av EMBL Hamburg på PETRA III lagring ring (DESY, Hamburg, Tyskland).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SU-8 3000 Series | MicroChem Corp. | SU-8 3000 | Photoresist |
| PGMEA | Sigma-Aldrich | 484431 | Developer |
| Isopropyl alcohol | Solvent | ||
| Ethanol | Solvent | ||
| Epoxy glue | UHU | Plus Schnellfest 5 min | Epoxy glue |
| PDMS | Dow Corning | Sylgard 184 | Silicone |
| Kapton foil | Dupont/ American Durafilm | HN grade, gauge 30 (7.5 μm) | polyimide foil |
| APTS | Sigma-Aldrich | 440140 | Chemical |
| GPTS | Sigma-Aldrich | 440167 | Chemical |
| Cytop CTX-109AE | Asahi Glass Co. Ltd | Cytop CTX-109AE | Cytop fluoropolymer coating |
| CT-Solv 100E | Asahi Glass Co. Ltd | CT-Solv 100E | Cytop fluoro-solvent |
| HFE-7500 | 3M | Novec 7500 | Fluorinated oil |
| AutoCAD | AutoDesk Inc. | AutoCAD | CAD Software |
| Biopsy Punch | Harris | Uni-core 0.75 mm | |
| Photo mask | JD Photo Data | ||
| 3 inch wafer | University Wafer | Silicon wafer | |
| Mask aligner | SÜSS MicroTec | MJB4 | Mask aligner |
| PDMS mixer | Thinky | ARE-250 | |
| Plasma machine | Diener electronic | Zepto | |
| Thaumatin | Sigma Aldrich | T7638 | Protein |
| Glucose Isomerase | Hamton Research | HR7-102 | Protein |
| Bis-Tris | Sigma Aldrich | B9754 | Chemical |
| Sodium Tartrate | Merck | 106664 | Chemical |
| Tris-HCl | Sigma Aldrich | 10812846001 | Chemical |
| HEPES | Carl Roth | 6763.2 | Chemical |
| Magnesium Chloride | Sigma Aldrich | 208337 | Chemical |
| Ammonium Sulfate | Sigma Aldrich | A4418 | Chemical |
| EDTA | Sigma Aldrich | E6758 | Chemical |
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich | 1064060250 | Chemical |
| PEG1500 | Molecular Dimensions | MD2-100-6 | Chemical |
| SPG buffer | Jena Bioscience | CSS-389 | Chemical |
| SpectroLight600 | XtalConcepts | DLS Instrument | |
| Nanodrop | Thermo Scientific | Spectrophotometer | |
| Zentrifuge | Eppendorf | ||
| Ultimaker2 | Ultimaker | 3D printer | |
| Form2 | Formlabs | 3D printer | |
| Amicon Filter | Sartorius Stedim | 0.2 µm filter | |
| Tubing | Adtech Polymer Engineering Ltd | Bioblock/05 | PTFE tubing 0.3 mm Inner Diameter x 0.76 mm Outer Diameter |
| Syringes | BD | 309628 | 1ml Luer-Lock Tip |
| Needle | Terumo Agani Needle | AN*2716R1 | 27Gx5/8" |
References
- Rasmussen, B. F., Stock, A. M., Ringe, D., Petsko, G. A. Crystalline ribonuclease A loses function below the dynamical transition at 220 K. Nature. 357 (6377), 423-424 (1992).
- Tilton, R. F. J. R., Dewan, J. C., Petsko, G. A. Effects of temperature on protein structure and dynamics: X-ray crystallographic studies of the protein ribonuclease-A at nine different temperatures from 98 to 320 K. Biochemistry. 31 (9), 2469-2481 (1992).
- Fraser, J. S., Clarkson, M. W., Degnan, S. C., Erion, R., Kern, D., Alber, T. Hidden alternative structures of proline isomerase essential for catalysis. Nature. 462 (7273), 669-673 (2009).
- Juers, D. H., Matthews, B. W. The role of solvent transport in cryo-annealing of macromolecular crystals. Acta Crystallogr. D. 60 (Pt 3), 412-421 (2004).
- Huang, C. Y., et al. In meso in situ serial X-ray crystallography of soluble and membrane proteins. Acta Crystallogr. D. 71 (Pt 6), 1238-1256 (2015).
- Gati, C., et al. Atomic structure of granulin determined from native nanocrystalline granulovirus using an X-ray free-electron laser. P. Natl. Acad. Sci. USA. 114 (9), 2247-2252 (2017).
- Gati, C., et al. Serial crystallography on in vivo grown microcrystals using synchrotron radiation. IUCrJ. 1 (Pt 2), 87-94 (2014).
- von Dreele, R. B. Multipattern Rietveld refinement of protein powder data. J. Appl. Crystallogr. 40 (1), 133-143 (2007).
- Cherezov, V. Lipidic cubic phase technologies for membrane protein structural studies. Curr. Opin. Struct. Biol. 21 (4), 559-566 (2011).
- Gati, C. Data processing and analysis in serial crystallography at advanced X-ray sources. , Dissertation, Hamburg (2015).
- Stellato, F., et al. Room-temperature macromolecular serial crystallography using synchrotron radiation. IUCrJ. 1 (Pt 4), 204-212 (2014).
- Botha, S., et al. Room-temperature serial crystallography at synchrotron X-ray sources using slowly flowing free-standing high-viscosity microstreams. Acta Crystallogr. D. 71 (Pt 2), 387-397 (2015).
- Nogly, P., et al. Lipidic cubic phase serial millisecond crystallography using synchrotron radiation. IUCrJ. 2 (Pt 2), 168-176 (2015).
- Martin-Garcia, J. M., Conrad, C. E., Coe, J., Roy-Chowdhury, S., Fromme, P. Review: Serial femtosecond crystallography: A revolution in structural biology. Arch. Biochem. Biophys. 602, 32-47 (2016).
- White, T. A., et al. CrystFEL: A software suite for snapshot serial crystallography. J Appl Crystallogr. 45 (2), 335-341 (2012).
- Perry, S. L., et al. A microfluidic approach for protein structure determination at room temperature via on-chip anomalous diffraction. Lab Chip. 13 (16), 3183-3187 (2013).
- Schlichting, I. Serial femtosecond crystallography: the first five years. IUCrJ. 2 (Pt 2), 246-255 (2015).
- Sui, S., Perry, S. L. Microfluidics: From crystallization to serial time-resolved crystallography. Struct. Dynam.-US. 4 (3), (2017).
- Ghazal, A., Lafleur, J. P., Mortensen, K., Kutter, J. P., Arleth, L., Jensen, G. V. Recent advances in X-ray compatible microfluidics for applications in soft materials and life sciences. Lab Chip. 16 (22), 4263-4295 (2016).
- Heymann, M., et al. Room-temperature serial crystallography using a kinetically optimized microfluidic device for protein crystallization and on-chip X-ray diffraction. IUCrJ. 1 (Pt 5), 349-360 (2014).
- Schubert, R., et al. A multicrystal diffraction data-collection approach for studying structural dynamics with millisecond temporal resolution. IUCrJ. 3 (Pt 6), 393-401 (2016).
- Weierstall, U., et al. Lipidic cubic phase injector facilitates membrane protein serial femtosecond crystallography. Nat. Commun. 5, 3309 (2014).
- Conrad, C. E., et al. A novel inert crystal delivery medium for serial femtosecond crystallography. IUCrJ. 2 (Pt 4), 421-430 (2015).
- Cohen, A. E., et al. Goniometer-based femtosecond crystallography with X-ray free electron lasers. P. Natl. Acad. Sci. USA. 111 (48), 17122-17127 (2014).
- Erskine, D., YU, P. Y., Freilich, S. C. High-Pressure Visible Spectroscopy of Polyimide Film. J. Polym. Sci. Pol. Lett. 26 (11), 465-468 (1988).
- Tsai, C. -L., Yen, H. -J., Chen, W. -C., Liou, G. -S. Novel solution-processable optically isotropic colorless polyimidothioethers-TiO2 hybrids with tunable refractive index. J. Mater. Chem. 22 (33), 17236-17244 (2012).
- Destremaut, F., Salmon, J. -B., Qi, L., Chapel, J. -P. Microfluidics with on-line dynamic light scattering for size measurements. Lab Chip. 9 (22), 3289-3296 (2009).
- Chastek, T. Q., Iida, K., Amis, E. J., Fasolka, M. J., Beers, K. L. A microfluidic platform for integrated synthesis and dynamic light scattering measurement of block copolymer micelles. Lab Chip. 8 (6), 950-957 (2008).
- Heymann, M., Fraden, S., Kim, D. Multi-Height Precision Alignment With Selectively Developed Alignment Marks. J. Microelectromech. S. 23 (2), 424-427 (2014).
- Schubert, R., et al. Reliably distinguishing protein nanocrystals from amorphous precipitate by means of depolarized dynamic light scattering. J Appl Crystallogr. 48 (5), 1476-1484 (2015).
- Aghvami, S. A., et al. Rapid prototyping of cyclic olefin copolymer (COC) microfluidic devices. Sensor Actuat. B-Chem. 247, 940-949 (2017).
- Walker, J. M. The Proteomics Protocols Handbook. , Humana Press Inc. Totowa, NJ. (2005).
- Kabsch, W. XDS. Acta Crystallogr D. 66 (Pt 2), 125-132 (2010).
- Vagin, A., Teplyakov, A. Molecular replacement with MOLREP. Acta Crystallogr. D. 66 (Pt 1), 22-25 (2010).
- Winn, M. D., et al. Overview of the CCP4 suite and current developments. Acta Crystallogr. D. 67, 235-242 (2011).
- Murshudov, G. N., et al. REFMAC5 for the refinement of macromolecular crystal structures. Acta Crystallogr. D. 67 (Pt 4), 355-367 (2011).
- Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K.
- Owen, R. L., et al. Exploiting fast detectors to enter a new dimension in room-temperature crystallography. Acta Crystallogr. D. 70 (Pt 5), 1248-1256 (2014).
- Kabsch, W. Automatic-Indexing of Rotation Diffraction Patterns. J. Appl. Crystallogr. 21, 67-71 (1988).
- Zarrine-Afsar, A., et al.
- Boukellal, H., Selimović, S., Jia, Y., Cristobal, G., Fraden, S. Simple, robust storage of drops and fluids in a microfluidic device. Lab Chip. 9 (2), 331-338 (2009).
- Aghvami, S. A., et al. Rapid prototyping of cyclic olefin copolymer (COC) microfluidic devices. Sens. Actuator B Chem. 247, 940-949 (2017).
- Shemesh, J., et al. Stationary nanoliter droplet array with a substrate of choice for single adherent/nonadherent cell incubation and analysis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 111 (31), 11293-11298 (2014).
- Sun, M., Bithi, S. S., Vanapalli, S. A. Microfluidic static droplet arrays with tuneable gradients in material composition. Lab Chip. 11 (23), 3949-3952 (2011).
- Shim, J. -U., et al. Control and measurement of the phase behavior of aqueous solutions using microfluidics. J. Am. Chem. Soc. 129 (28), 8825-8835 (2007).
- Schubert, R., Meyer, A., Baitan, D., Dierks, K., Perbandt, M., Betzel, C. Real-Time Observation of Protein Dense Liquid Cluster Evolution during Nucleation in Protein Crystallization. Cryst. Growth Des. 17 (6), 3579 (2017).
