Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Mikroflödessystem marker för In Situ Crystal röntgendiffraktion och In Situ dynamiska ljusspridning för seriell Crystallography

Published: April 24, 2018 doi: 10.3791/57133
Automatic Translation
*1,2, *3,4,5, 3, 6, 6, 3,4, 3,4,5, 1,2,4, 1,7
1Center for Free Electron Laser Science, DESY, 2Department of Physics, University of Hamburg, 3Institute for Biochemistry and Molecular Biology, Laboratory for Structural Biology of Infection and Inflammation, University of Hamburg, 4The Hamburg Center for Ultrafast Imaging, University of Hamburg, 5Integrated Biology Infrastructure Life-Science Facility at the European XFEL (XBI), 6European Molecular Biology Laboratory, EMBL c/o DESY, 7Department of Cellular and Molecular Biophysics, Max Planck Institute of Biochemistry
* These authors contributed equally

Summary

Det här protokollet beskriver i detalj hur att fabricera och driva mikroflödessystem enheter för röntgendiffraktion datainsamling vid rumstemperatur. Dessutom, det beskriver hur du övervakar protein kristallisering av dynamiska ljusspridning och hur att bearbeta och analysera erhålls diffraktion data.

Abstract

Det här protokollet beskriver fabricera mikroflödessystem enheter med låg röntgen bakgrund optimerad för goniometer baserade fasta mål seriell kristallografi. Enheterna är mönstrade från epoxi lim med mjuk litografi och lämpar sig för i situ röntgendiffraktion experiment vid rumstemperatur. Prov brunnarna är lock på båda sidor med polymera polyimid folie windows som tillåter diffraktion datainsamling med låg röntgen bakgrund. Denna tillverkning metod är kravlös och billig. Efter inköp av en SU-8 master wafer, kan alla fabrication slutföras utanför ett renrum i en typisk forskning laboratoriemiljö. Chip konstruktion och tillverkning protokollet utnyttja kapillär ventilsystem till microfluidically split en vattenlösning reaktion i definierade nliter storlek små droppar. Denna lastning mekanism undviker prov förlust från kanal döda-volym och kan enkelt utföras manuellt utan att använda pumpar eller annan utrustning för flytande aktivering. Vi beskriver hur isolerade nliter storlek droppar av protein lösning kan vara övervakade i situ av dynamiskt ljus spridning till kontroll protein crystal kärnbildning och tillväxt. Efter lämplig kristaller odlas, kan komplett röntgendiffraktion datamängder sugas upp med goniometer baserat i situ fast målet seriell röntgenkristallografi i rumstemperatur. Protokollet ger anpassade skript för att bearbeta diffraktion datamängder med en svit av verktyg för att lösa och förfina protein kristallstrukturen. Detta tillvägagångssätt undviker föremålen möjligen inducerad under cryo-bevarande eller manuell crystal hantering i konventionella kristallografi experiment. Vi presenterar och jämför tre proteinstrukturer som löstes med små kristaller med dimensioner på ca 10-20 µm odlas i chip. Utkristalliseras och diffracting i situ, hantering och därmed mekaniska störningar av sköra kristaller minimeras. Protokollet visar hur att fabricera en anpassad röntgen transparent mikroflödessystem chip passar i situ seriell kristallografi. Som nästan varje kristall kan användas för diffraktion datainsamling, är dessa mikroflödessystem marker en mycket effektiv crystal leveransmetod.

Introduction

Att veta 3D-strukturen för ett protein som är viktigt att förstå dess funktionalitet. Nära-atomär upplösning strukturer erhålls hittills oftast av röntgenkristallografi. Denna teknik exponerar proteinkristaller till röntgenstrålning och de resulterande diffraktionsmönster analyseras sedan för strukturbestämning och förfining. I traditionella röntgenkristallografi registreras en komplett diffraktion datamängd från en enda, idealiskt stor, kristall vid kryogena temperaturer. Sådana kristaller, dock mestadels inte är trivialt att växa, och att identifiera lämplig cryo-bevarande villkor kan bli utmanande i sig och kan ibland också orsaka avvikelser från de infödda protein struktur5.

Senaste tekniska framsteg inom röntgen gratis-elektron laser (FEL) och synkrotron linjer har gjort för att lösa strukturer från mindre kristaller, som nya micro-fokus linjer, ökad X-ray balk briljans och förbättrad röntgen detektorer blev tillgänglig6,7. Små kristaller är oftast lättare att odla än stora och defekt gratis kristaller8,9. Små kristaller lider dock röntgen strålning skada mycket snabbare än stora kristaller. Detta beror på att jämfört med en stor kristall, en högre röntgen dos måste vara projicerad på en mindre crystal volym till gravering till jämförbar upplösning. Därför räcker det ofta inte med ens kryogen skydd för att spela in en komplett diffraktion datauppsättning från en enda microcrystal.

För att övervinna detta hinder, blivit seriell kristallografi vald analysmetod att samla in och slå samman diffraktionsmönster från många slumpmässigt orienterade microcrystals att erhålla en komplett datamängd. Strålning framkallad kristall skador minimeras genom att sprida den totala Röntga dosen används för att lösa en proteinstruktur över ett stort antal kristaller5,10. I en ' gravering innan förstöra ' FEL experiment, varje kristall används endast för en exponering med hjälp av femto-andra röntgen pulser. Micro-fokus linjer på tredje generationen synkrotron källor kan i sin tur utföra seriell kristallografi med några millisekund kort röntgen exponeringar11,12,13,14. Utan en crystal svängning eller rotation under datainsamling, dock endast partiell Bragg reflektioner kan registreras och därmed tiotusentals eller mer diffraktionsmönster krävs normalt för struktur bestämning15. Hittills har har en rad olika prov leveransmetoder utvecklats för seriell kristallografi, som nyligen granskade14,16,17,18,19. Bland dem, flera fast-mål baserat prov leverans strategier var framgångsrikt kombineras med crystal rotation under röntgen exponeringar sådan att betydligt färre diffraktionsmönster kan ge lika komplett datamängder och förbrukar dessutom mindre prov som jämfört till klassiskt seriell crystallography experiment där stillbilder är inspelad7,16,20,21,22,23 , 24.

Vi presenterar ett protokoll för att fabricera mikroflödessystem enheter med låg röntgen bakgrund. Enheterna är mönstrade från 5-min epoxy lim med mjuk litografi och lämpar sig för in situ - röntgendiffraktion experiment vid rumstemperatur som gynnas av att integrera provberedningen direkt i röntgen set-up, som fallet med tid-löst studier som följer blandning-inducerad kinetik18,19. Mikroflödessystem kanaler är lock på båda sidor med polymera polyimid folie, vilket resulterar i X-ray windows med en sammanlagd tjocklek på ca 16 µm som möjliggör låg röntgenfotografering bakgrund. Alla begagnade material ger god beständighet mot lösningsmedel. Denna tillverkning metod är comparably enkel och billig. Efter inköp av en SU-8 master wafer, kan alla fabrication slutföras utanför ett renrum i en typisk forskning lab miljö.

I ansökan exempelvis beskriver vi marker för goniometer baserade fasta mål seriell kristallografi. Först diskuteras av konstruktion och tillverkning överväganden för att använda kapillär ventilsystem till microfluidically split en vattenlösning reaktion i ett antal utvalda nliter storlek droppar. Denna lastning mekanism undviker prov förlust från kanal döda-volym och uppdelning kan enkelt utföras manuellt utan att använda pumpar eller annan utrustning för flytande aktivering. Sådana isolerade nliter storlek droppar av protein lösning är övervakade i situ med dynamisk ljusspridning (DLS) till kontroll protein crystal kärnbildning och tillväxt. Det har tidigare påvisats att DLS mätningar kan utföras i ultrakalla enheter bestående av en Polydimetylsiloxan (PDMS) struktur bundna till ett glas bild25,26. Eftersom polyimid lagret har en hög överföring för våglängder längre än 550 nm, metoden kan förlängas till mätningar i röntgen transparent chips också, när du använder en lämplig laser våglängd27,28. Baserat på DLS resultaten, inledande kärnbildning kan observeras, och ytterligare droplet avdunstning kan stoppas för att få färre men större proteinkristaller.

Efter tillräckligt kristaller odlas, kan komplett röntgendiffraktion datamängder sedan samlas med goniometer baserat i situ fast målet seriell röntgenkristallografi i rumstemperatur. Diffraktion datamängder bearbetas med en svit av programvaruverktyg och anpassade skript för att lösa protein kristallstrukturen. Denna teknik undviker artefakter ofta induceras under cryo-bevarande används i konventionella kristallografi experiment.

Vi jämför tre protein målstrukturer som löstes med ungefär 10-20 µm små kristaller odlas i chip till bättre då 2 Å upplösning. Utkristalliseras och diffracting i situ, hantering och därmed mekaniska störningar av sköra kristaller minimeras. Detta protokoll kan tillämpas för proteinkristaller som gravering på hög upplösning samt låg upplösning (1,7 Å till 3.0 Å). Som nästan varje kristall kan användas för diffraktion, lilla provet går till spillo, vilket gör detta till en mycket effektiv crystal leveransmetod.

Detta protokoll ger en detaljerad guide om hur du förbereder röntgen transparent mikroflödessystem chip i situ protein kristallisation och diffraktion datainsamling. Förfarandet var noggrant utformade för att gynna från mikroflödessystem precision utan avancerad utrustning i labbet. Också, datainsamling på den synkrotron beamline kan utföras utan en specialiserad goniometer eller luftfuktare att lindra reproducera resultaten av icke-experter. Presenterade tekniken kan tillämpas för seriell millisekund kristallografi datainsamling vid rumstemperatur samtidigt som den strålning skadan minimal och utan att införa stress till kristallerna efter tillväxten av cryo-skydd eller crystal hantering. Därför är den beskrivna metoden lämplig för alla protein kristallisering projekt.

Protocol

1. chip Design och Master Fabrication

  1. Maskdesign
    1. Redogöra för önskad kanal geometrier med hjälp av en lämplig CAD ritprogram. För varje fotoresist lager, förbereda en enskild mask. Alla konstruktioner som används i detta protokoll diskuteras i detalj i resultatavsnittet och finns som AutoCad '. DWG' format i kompletterande fil 1.
      Obs: För att bygga all-PDMS enheter, bildförhållande kanal höjd och bredd bör inte överstiga 1:10 för att förhindra kanal kollaps. Både polyimid folie och härdande epoxiharts är robustare och i princip bör också tillåta högre bildförhållanden. Men vi avsiktligt inte överstiga 1:10 förhållandet, så som inledande mönster kunde vara prototyped som traditionella PDMS-enheter.
    2. Översätta CAD-filer till emulsion film fotomasker. Använd en nominell 64 k DPI-upplösning så att korrekta funktioner ner till ca 5 µm storlek.
      Obs: Detta kan göras genom en kommersiell tjänst. Imaging services kan föredra olika ritning konventioner att effektivisera filkonvertering för mask avbildning. Fråga gärna om de föredragna ritning konventionerna upfront att undvika mödosam felsökning under konverteringen. Masker med transparenta funktioner på svart bakgrund kommer mönster SU8 fotoresist funktionerna på rånet att ge funktionella PDMS mikrokanaler under replika gjutning. I sin tur behövs svart funktioner på transparent bakgrund masker för att förbereda PDMS formar lämplig för röntgen chip fabrication. Vi rekommenderas att beställa både mask polariteter att möjliggöra tidiga prototyper och design validering att fabricera PDMS enheter innan översätta designen till röntgen marker.
  2. SU8 master fabrication
    Obs: Detta är den enda process som behöver utföras i renrum. Om kritiska renrum utrustning inte är tillgänglig, kan det komplett steget outsourcas till MEMS gjuteri serviceföretag som levererar redo mönstrade SU8 mästare. Processen SU8 enligt instruktionen data sheet. Steg 1.2.1 till 1.2.4 sammanfatta det allmänna SU8 master fabrication arbetsflödet, med komplett parametrar för tre skikt röntgen chip design som anges i tabell 1. En introduktion till multi-layer SU8 anpassningen har varit publicerade tidigare29.
    1. Häll ca 1 mL SU8 motstå på 3 tums wafer och spin pälsen SU8 ner till önskad tjocklek med hjälp av lämpliga centrifugeringshastighet och tid som anges i tabell 1 (figur 1, steg 1). Förgrädda fotoresist enligt lagrartjockleken vid 65 ° C och 95 ° C ett par minuter varje. Utföra den före baka för att stelna SU8 att förhindra att den fastnar i photomasken och förbättra motstå vidhäftning till underlaget (figur 1, steg 2).
    2. Exponera fotoresist för UV-ljus som anges i tabell 1 följt av en post-exponering-baka vid 95 ° C att katalytiskt slutföra de är som initieras under exponeringen (figur 1, steg 3).
    3. Upprepa dessa steg för varje efterföljande skikt. Sedan justera fotomasker av efterföljande lager med befälhavaren använder en mask aligner och skjutmått alignment marks29.
    4. Tvätta bort alla oexponerade SU8 motstå genom att utveckla rånet i propylenglykol metyl eter acetat (PGMEA), tills isopropanol sköljning längre avslöjar mjölkaktig nederbörd (figur 1, steg 4). Torka rånet med trycksatt kväve.
      Obs: Isopropanol är en dålig lösningsmedel för SU8 och dess nederbörd indikerar återstående ohärdat resterna.
  3. PDMS mögel tillverkning
    1. Placera en bit aluminiumfolie (15 × 15 cm) i en petriskål (10 cm) och placera SU8 befälhavaren på aluminiumfolie i petriskål för enkel borttagning av befälhavaren efter PDMS härdning.
    2. Blanda silikon bas med härdning agent (10:1), vilket resulterar i ett totalt belopp av 25 g, kraftigt med en spatel i en burk eller en mekanisk mixer. En 3 tums wafer i en petriskål (10 cm) förbrukar ca 25 g av PDMS att resultera i en 5 mm tjock platta.
    3. Häll pre-blandad PDMS på den SU8-master (figur 1, steg 5) till en höjd av 4 mm. Desiccate PDMS för 5 min för att avlägsna luftbubblor tills ingen, eller endast några bubblor kvar på PDMS ytan.
    4. Bota PDMS i en ugn vid 70 ° C i 1 h. Sedan skära ut den härdade PDMS med en skalpell och dra försiktigt PDMS mögel från SU8 master (figur 1, steg 6). Skär ända ner till befälhavaren att förhindra PDMS sprickor under peeling.
    5. Tillval: Förbereda tvärsnittsdata skivor av PDMS formarna att bekräfta att alla SU8-lager på master har de önskade tjocklekar (figur 1). Tidiga mikroflödessystem kanal layout test kan utföras i alla PDMS marker.
      Obs: En replika-gjuten PDMS kan limmas direkt på en glass substrate efter stansning tillgång portar (steg 3.3) in PDMS genom O2 plasma aktivering med 20 s, 0.4 mbar O2, 50 W, 13,56 MHz. Som nämnts i avsnitt 1.2., detta kräver mittemot mask polaritet och därmed wafer disposition för röntgen chip fabrication.

2. in Situ röntgen Chip Fabrication

  1. Späd båda epoxi harts prekursorer i etanol en slutliga etanol koncentrationen av 40 wt %. En slutsumma samlas av 0,25 g av varje epoxy harts föregångare i etanol räcker för en 1 cm2 marker.
    Obs: Detta minskar viskositeten hos den resulterande 5 min epoxin att förenkla bubbla-fri blandning och replika-mögel gjutning och för att minimera tjockleken på det slutliga härdad epoxi lagret. Etanolen avdunstar genom PDMS under härdning steg.
  2. Degas PDMS mögel i vakuum exsickator för 30 min, så att det kan absorbera små luftbubblor från epoxiharts under gjutning steg.
  3. Skär polyimid folien ca 70 × 70 mm och span runt en 75 × 50 mm glas bild använder tejp för att erhålla en plan och styv yta med tejp på baksidan. Plasma aktivera folien med 50 W, 13,56 MHz, 0.4 mbar O2 plasma för 20 s, sedan Inkubera komplett folie-bilden i en vattenlösning av 1 vol % (3-aminopropyl) trimethoxysilane (APTS) eller (3-glycidyloxypropyl) trimethoxysilane (GPTS) för 5 min vid 20 ° C.
  4. Grundligt blanda både etanol utspätt epoxi föregångare lösningar för att säkerställa optimal härdning beteende. Hämta PDMS-formar från vakuumkammare och placera dem på en platt yta. Sedan snabbt expediera en droppe av blandade harts på varje mikrostrukturen på mögel med hjälp av en mikropipett (cirka 10 µL per 1 cm2 av mikrostrukturer) (figur 1, steg 7a).
  5. Hämta polyimid folie-slide smörgås från aqueous silan (APTS eller GTPS) lösningen. Torka folien med trycksatt luft eller kväve.
  6. Placera den beredda polyimid folie-glas-Skjut smörgåsen på den deponerade epoxiharts (figur 1, steg 7b). Tryck fast glas bilden bifogas polyimid folien mot PDMS mögel. Placera en plåt på glasskiva och sedan insättning vikter upp till 1,4 N/cm2 tryck för 1 h, medan epoxi harts härdar vid rumstemperatur.
    Obs: Helst ingen kåda finns kvar på folien i de områden där strukturerna i mögel har maximal höjd. Dessa motsvarar kristallisering brunnarna där kristallisation sker är efteråt.
    1. Valfritt: Om korrekt gjutning av små funktioner är kritisk, PDMS mögel kan förstärkas med en aluminiumram under listerna steg31.
  7. Ta bort glasskiva med polyimid folien och mönstrade epoxin genom att dra det från PDMS mögel (figur 1 steg 8). Plasma aktivera mönstrade epoxi sidan med 50 W, 13,56 MHz, 0.4 mbar O2 plasma för 20 s.
  8. Efter avlägsnande av polyimid folien från plasma kammaren, inkubera epoxi-mönstrad folien i en 1 vol % vattenlösning APTS (eller GPTS) lösning för 5 min vid 20 ° C. På samma sätt förbereda en andra un-mönstrade polyimid folie med kompletterande 1 vol % GPTS (eller APTS) silan aktiveringen. Efter inkubering, torka både strukturerade och ostrukturerade folie med tryckluft.
  9. Placera den epoxi sida uppåt på en plan yta, med en droppe vatten under ytspänning som medlare att förhindra curling av folien och se till maximal planhet. Placera sedan andra aktiverade polyimid folien på toppen och försiktigt strimma med fingret från ett hörn till motsatsen, att göra dem bond och för att undvika bildandet av bubblor.

3. tillgång portar för flytande leverans

  1. Förbered 4 mm tjock PDMS plattor i en petriskål enligt steg 1.3.1 till 1.3.3 utan att använda den SU8-master. Skär plattan i PDMS block av lämplig storlek att täcka alla insugningskanalerna i kretsen, utan att täcka de enskilda kristallisering fack av chip.
  2. Plasma aktivera båda, chip och PDMS blockera 50 W, 13,56 MHz, 0.4 mbar O2 plasma för 20 s. För kemisk bindning, sedan ruva varje del i en 1 vol % APTS eller GPTS vattenlösning för 5 min vid 20 ° C. Torka varje del med tryckluft och tryck på PDMS plattan på folie chip.
  3. Att förbättra bindning, placera chipet på en platt PDMS-platta och täck den med ett plast-omkullkastar, följt av en ren glasskiva och en metall block. Slutligen, deponera vikter för att applicera upp till 1,4 N/cm2 tryck för ca 1 h.
  4. Tillgång hål med en 0,75 mm biopsi punch på varje position där in- och utsugningskanaler markeras i chip design och försegla ryggen med tejp. Chipet är nu tillgänglig för alla slangar med en ytterdiameter på diametern på hålet (som beskrivits i steg 4.2).

4. ytbehandling

  1. Förbereda en 1:20 utspädning av 9 wt % fluorpolymer lager i fluoro-lösningsmedel till en slutlig koncentration av 0,45 wt %. Lagra stamlösningar och spädningar i ett kylskåp i mörker vid 4 ° C.
  2. Ladda 1:20 fluorpolymer utspädning i en 1 mL Luer-lock-spruta. Bifoga en 27G × 5/8 ”nål till sprutan och sedan en PTFE-slangen på nålen.
  3. Anslut slangen till röntgen chip utlopp och injicera fluorpolymer arbetslösning bereddes i steg 4.1 tills alla kanaler är fyllda.
  4. Placera chipet med den platta sidan nedåt på en 190 ° C värmeplatta för 5 min att avdunsta alla lösningsmedel för att sätta in fluorpolymer på en tunn film beläggning.
    Obs: När du använder en ny geometri, kontrollera om kanaler var igensatt med fluorpolymer under denna beläggningsprocessen. I så fall ytterligare späd stamlösningen.

5. protein förberedelse

  1. Väga frystorkade taumatin och lös upp det i en buffertlösning som anges i tabell 2 till lämplig volym att erhålla en slutlig proteinkoncentration 40 mg mL-1.
  2. Dialyze glukos isomerase mot bufferten visas i tabell 2 enligt tillverkaren protokollet.
  3. Förbereda den protein thioredoxin som tidigare beskrivits av Schubert et. al. 30.
  4. Kontrollera de slutliga protein koncentrationer fotometriskt använder de utplåningkoefficienter sammanfattas i tabell 2, beräknas av programvaran ProtParam32.
  5. Förbereda alla lösningar med hjälp av ultrarent vatten och filtrera dem med ett 0,2 µm filter.
  6. Centrifugera protein lösningar vid 20 ° C under 15 minuter vid 16100 x g och ta supernatanten för kristallisering experiment.

6. protein kristallisering i röntgen Chip

  1. För att kristallisera proteiner i ultrakalla marker, blanda lika mängder protein lösning och fällningsmedel lösning. Proteinkoncentration, buffert sammansättning och fällningsmedel sammansättning sammanfattas i tabell 2. Förbereda en total volym på cirka 20 µL att fylla en mikroflödessystem chip.
  2. Omedelbart efter blandning, injicera lösningen i inlopp porten av chip via en spruta, kopplad till en 27G × 5/8 ”nål och PTFE slangar med 0,75 mm yttre diameter (detaljerad i steg 4.2).
    Obs: Fyllning förfarandet för seriell layouten kräver ett föregående grundning av chip med fluorerade olja, vilket görs enklast genom att läsa fluorerade oljan från outlet hamnen innan du injicerar kristallisering lösningen genom inloppsport. Alla åtgärder för lastning bör övervakas med Mikroskop för att styra tillämpad spruta trycket och den motsvarande flödet ”.
  3. Efter chip är fylld, separata enskilda kristallisering facken genom att injicera fluorerade olja till inloppsport av chip. Försegla chip genom att blockera alla in- och utsugningskanaler av chip. Detta kan göras genom att infoga ett gem.
    Obs: Eftersom kristallisering facken fylls av protein/fällningsmedel lösning, fluorerade oljan bara fyller öppningen kanaliserar av chip, utan att påverka lösningen i delar av kristallisering.
  4. För att efterlikna vapor diffusion kristallisering kinetik, placera den förseglade marker i rumstemperatur och normal atmosfär att tillåta droplet-programmet i kristallisering facket att krympa genom avdunstning av vatten genom polyimid folien.
  5. Efter crystal bildandet konstateras via Mikroskop eller DLS mätningar (steg 7), överför den kompletta mikroflödessystem chipet till lämpliga fällningsmedel lösningen, att stoppa ytterligare avdunstning från kristallisering brunnarna tills röntgendiffraktion experimentet utförs.

7. dynamisk ljus spridning mätningar i kristallisering brunnar i Chip

Obs: DLS mätningar utfördes med en laser uteffekt 100 mW, en våglängd på 660 nm och det spridda ljuset upptäcktes i en scattering vinkel på 142°. Eftersom alla undersökta prov lösningar var aqueous brytningsindex för vatten (n = 1,33) användes i alla beräkningar.

  1. Plats mikroflödessystem chip i den i SBS format plattan innehavaren av DLS instrumentet med hjälp av kortet som beskrivs i steg 8,1. Sätt in kortet i enheten.
  2. Noggrant justera laser fokus inuti ett fack av mikroflödessystem chip med hjälp av motoriserad x-, y-, z-scenen. Eftersom mikroflödessystem chip är mycket tunn, justera z-nivån genom tillämpning små steg steg.
    Obs: En rätt justering bekräftas av en hög intercept och en smidig svans av resulterande autokorrelation funktion DLS mätningen. En kalibrering-fil kan skapas för att matcha positionen för varje enskild kristallisering väl i mikroflödessystem chip, möjliggör automatiserad DLS mätningar i flera fack över tid.
  3. Utför varje DLS mätning på 293 K för 30 s och upprepa mätningen var 5 minut fram till slutet av kristallisering experimentet.
    Obs: Initial kärnbildning kan följas av RADIUS-fördelningen av DLS mätningar över tid och framgångsrika crystal bildandet kan parallellt följas av mikroskopet inbyggda DLS plattan läsaren.

8. diffraktion datainsamling

  1. Adaptrar för beamline Vinkelmätare
    1. Skriva ut korten för de platta goniometer för att placera och rotera röntgen marker under kristallografiska datainsamling.
    2. Fabricera adaptrarna för den bas goniometer på en hobby-grade 3D-skrivare som använder parametern standardinställningarna som rekommenderas av tillverkaren.
      Obs: Adaptrarna utformades med hjälp av en 3D-CAD-System och samordna filerna av korten bifogas i '. STL'-filformat i supplementet.
    3. Fixa röntgen marker till adaptern med dubbelhäftande tejp.
  2. i situ röntgenkristallografi
    1. Samla in diffraktion data med hjälp av en balk med storleken 10 × 5 µm (FWHM av Gaussprofil) på 296 K. används röntgen med en energi av 12,8 keV och en flux 2.2 · 1011 fotoner · s-1 i försvagat beam och rekord diffraktionsmönster med Pilatus 6 M hybrid pixel detektor.
      Obs: Mikroflödessystem enheter innehållande taumatin, glukos isomerase eller thioredoxin kristaller används för i situ röntgen kristallografiska experiment på de EMBL beamline P14 av den PETRA III synchrotron. Tillgängliga beam fokus storlek och flux kan skilja sig vid andra röntgenkällor. Antalet exponerade proteinkristaller, antalet diffraktionsmönster som spelats in från varje kristall, intervallet svängning vinkel per exponering och exponeringstiden sammanfattas i tabell 3.
    2. Processen uppsättningar av två på varandra följande diffraktionsmönster individuellt med programmet XDS33. Använda skriptet bash ”xds.sh” hittade i supplementet.
    3. Skapa HST filer för varje datamängd från alla kristaller och skala dem med hjälp av programvaran XSCALE33. Använda skriptet bash ”xscale.sh” i tillägg till skapa en indatafil för XSCALE.
      Obs: Endast datamängder av kristaller som har korrelationskoefficienterna större än 90%, vilket indikerar en hög grad av isomorfi, ska skalas. Den konservativa kriterium ‹I/σ (I) › (> 2) bör användas för att fastställa högsta upplösning skalet. Molekylär ersättning med hjälp av programmet MOLREP34 från de CCP4 Svit35 kan användas för att erhålla faserna för ytterligare modellbygge med hjälp av 3D-koordinater i Protein Data Bank (PDB) som visas i tabell 3.
    4. Förfina alla strukturer isotopically använder Refmac535,36 och använda SOTHÖNA37 för visuell inspektion av den slutgiltiga modellen.
      Obs: Lösningsmedel molekyler automatiskt bör läggas under processen förfining och behöver kontrolleras för att bekräfta kemiskt rimliga positioner. Alla modeller måste inspekteras för att identifiera Ramachandran extremvärden.

9. resultatutvärdering

  1. Strålskador
    1. Analysera förfalla av diffraktion makt över tid med hjälp av en metod som beskrivs av Owen et al38. Beräkna den totala summan av I/σ(I) (tillhandahålls av XDS33) av alla indexerade reflektioner av varje utvärderade diffraktion datamängd (2 på varandra följande diffraktionsmönster), att använda som ett referensvärde för detta. Använda skriptet bash ”ISigma.sh” från tillägget.
    2. Normalisera diffraktion kraften i varje datamängd till genomsnittlig diffraktion kraften i den första datamängden.
    3. Analysera förändringen av Rmeas värden över tiden genom att ta Rmeas värdena från Correct.LP filer från XDS33 (bash script ”Rmeas.sh” från tillägget).
  2. Crystal orientering
    1. Bestämma de Euler vinklarna för att få information om fördelningen av de crystal galler riktlinjerna med avseende på koordinatsystemet som laboratorium. Beräkna de Euler vinklarna från matrisen XDS orientering i utdatafilen XPARM39 med programvaran Matlab. Använda det bash-scriptet ”rotation_matrix.sh” för att extrahera rotation matrix från varje kristall från filen XPARM. Använda utdatafilen som indata i Matlab för att beräkna de Euler vinklar med hjälp av Matlab funktion rotro2eu.m (kompletterande fil).
      Obs: En detaljerad beskrivning av beräkningen har publicerats av Zarrine-Afsar et al40.
    2. Konvertera de erhållna Euler vinklarna från radianer till grader. Gruppera de erhållna Euler vinklarna för alla tre rotation flygplan (xy, xz och zy) i klasser med 10° och rita dem med hjälp av programvaran Origin9.

Representative Results

Epoxy är en utmärkt fyllnadsmaterial för röntgen chip fabrication. Det är billigt, enkelt och robust process utan att kräva specialiserade verktyg (figur 1). Att minska epoxi viskositet genom att späda ut det med 40 wt % etanol underlättat avlägsnande av överskott harts ovan kristallisering brunnen, vilket resulterar i definierade X-ray windows. Högre etanol utspädningar resulterade i defekter i härdad harts. Genom att analysera röntgen chip tvärsnitt, bestämde vi totala fönster tjockleken på båda sidor vara ungefär 19 µm tjock, som ligger mycket nära nominella tjockleken på de begagnade polyimid folier av 2 × 7,5 µm (figur 2)

Kristallisering prövningar isolerades i flera nliter storlek reaktion fack vardera, med hjälp av en kapillär ventilmekanism som tidigare beskrivits41. Denna 'store-då-skapa' lastning teknik undviker prov förlust från kanal döda-volym och kan enkelt utföras manuellt, vilket eliminerar behovet av att använda pumpar eller annan utrustning för flytande aktivering42. Chipet är laddad med fluorerade olja innan du fyller vattenhaltiga provet. Ytspänning i olja-vatten gränssnittet mellan priming olja och vattenhaltiga provresultat i en tryckskillnad över gränssnittet. Detta Laplace tryck beror på både krökningsradien och ytspänningen i gränssnittet. För att minimera sin energi, måste gränssnittet minimera sin yta, vilket motsvarar maximera dess huvudsakliga krökningsradien vid konstant volym. En låg krökning gränssnitt i en bred kanal har lägre Laplace tryck då en hög krökning gränssnitt i en smal kanal-segmentet. Därför prov kontakten träder företrädesvis och flyter genom brett bypass kanal istället för flyter genom de smala kapillära ventil begränsningarna. Slutligen är provet kontakten följt av fluorerade olja till separata prov brunnarna i oberoende droppar.

Robust och pålitlig lastning uppnåddes med flöden på upp till 1 mL/h i både en följetong och en parallell väl arrangemang (figur 3). I 'följetong' layout ansluts väl inlopp och kapillär ventil sammandragningar sekventiellt via en bypass kanal31. Däremot i 'parallella' layout, två separata huvudsakliga kanaler ansluter alla väl vikar eller kapillär ventiler endast43. Båda arrangemang begrepp har tidigare kombinerats med formulering kontroll till skärmen sammansättning, som är en användbar aspekt i protein kristallisering43,44. Seriell utformningen har endast två vätska hamnar, ett inlopp och ett utlopp. Det har färre flytande portar, och därför är enklare att bygga och driva. Parallella layouten har 4 vätska hamnar, 2 för den viktigaste kanalen ansluta brunnarna och 2 för att länka upp kapillär ventilerna att låta luft eller överflödig olja fly. Lastning kan därmed fortsätta från båda huvudkanal sidor. Denna layout har generellt lägre flödesmotstånd för ett lika stort antal brunnar på grund av dess kortare bypass. Det är därför bättre lämpad för upp-skalas enheter med ett stort antal brunnar. Även prov brunnarna är orienterade närmare tillsammans, som erbjuder fördelar för automatiserad imaging.

Komplett urval väl lastning observerades för både layouter, om antingen byggt som en två-höjd eller en tre-höjd design. I en två-höjd design är både provet väl och bypass kanaler av lika höjd. Tre-höjd design kräver en tredje mask, extra SU8 och en justering steg för att ytterligare säkerställa att provet brunnarna blir högre än föregående bypass kanaler. Denna höjd-differential främjar ingå brunnen genom samma kapillären ventilsystem principen som stoppar flödet vid förträngningar av provet vätska. Här, motsvarar högre väl taket en lägre Laplace pressa av framryckande menisken och flöde längs bypass riktning endast gynnas när wells har fyllt helt så att de ventilen sammandragningar blockera ytterligare flödet och avleda den ner bypass. Framgångsrika lastning kräver dock, inte strikt brunnarna vara högre än bypass som lämpliga kapillär ventilsystem kan också uppnås genom att justera kanalbredder med detta. Trots vår erfarenhet högre brunnarna utförs betydligt mer robust och defekt fri lastning observerades på upp till tio gånger högre flöden i alla tre-höjd mönster jämfört med deras motsvarigheter i två-höjd. Denna effekt var mer uttalad i parallella layouten.

För att efterlikna vapor diffusion kristallisering kinetik, var ändliga genomträngligheten av polyimid folien utnyttjas för att styra vattenavdunstning över tid. Experimentell avdunstningen kvantifierades genom att övervaka byte av droplet volym över tid genom att likställa droppe yta och bra höjd (figur 4 c). Avdunstningen från kristallisering brunnar i röntgen chip fortsätter inte linjärt, som en krympande yta av nedgången sammanfaller med ökande Lösningens koncentration resulterar i en minskad Avdunstningshastighet över tid45. Inledande avdunstning följt en ungefärligt linjära andelen om 0,5 nL h-1 i brunnar av seriell layout geometri.

För att bättre förstå kristallisering kinetik, utfördes DLS mätningar i kristallisering brunnarna av mikroflödessystem chip. För inledande DLS mätningar användes en PDMS-chip som limmas på en glasskiva att tillhandahålla bättre optiska egenskaper för ljusspridning experimentet. Detta chip hade samma väl mått som X-ray chip. PDMS har en högre genomsläpplighet för vattenånga än polyimid av polyimid Fönstren i de Röntga chip45. Eftersom flux skalas linjärt med avstånd, kan avdunstning banan för en polyimid windowed väl matchas med motsvarande PDMS fönster av lämplig tjocklek.

DLS resultaten visar att radien fördelningen förändras över tid (figur 4A-B), visar att DLS mätningarna tillåter för att upptäcka den inledande kärnbildning innan första kristallina partiklar observeras. Denna information kan användas att kärnbildas och odla enkristaller per brunn av externt justera avdunstningen och därmed övermättnaden nivåer i ett tidigt skede kärnbildning46.

X-ray chipet var fast på en 3D tryckta adapter för den SBS kompatibel platta goniometer på den EMBL beamline av synkrotron P14 på PETRA III (figur 5A). Alternativt, en mindre 3D tryckta ram användas till mount röntgen chips till standard beamline Vinkelmätare21. Taumatin kristaller har en storlek på 10-20 µm (figur 5B) och gravering upp till en upplösning av 2.0 Å (figur 5 c). Som förväntat, röntgen bakgrund bidrag två tunna polyimid omkullkastar Fönstren från röntgen chip är begränsad till polyimid polymer scattering ringar 11 Å (2θ ~ 5°) och 33 Å (2θ ~ 1,7 °) för röntgen våglängden 0,97 Å. Dessa två ringar stör inte data bearbetning. En totala datamängd med 83 taumatin kristaller samlades och 10 diffraktionsmönster spelades från varje kristall med en 1° rotation under varje bildruta. Databehandling och förfining parametrar, samt statistik för taumatin datamängden är listade och jämfört med två andra datamängder av glukos isomerase och thioredoxin som var också insamlade i situ listas i tabell 3 och Tabell 4.

Intensitet förfalla av normaliserade diffraktion makten över tid undersöktes genom att dela upp taumatin datamängden i fem sub datamängder (två diffraktionsmönster användes per delmängd för att upprätthålla fullständig datamängder). Som visas i figur 6B, diffraktion makt började minska efter första sub datamängden och var under 50% i fjärde sub datamängden. Som ett resultat, ökar Rmeas värden för de sub-datamängderna också över tid, som visar röntgen strålning skada under datainsamlingen. Vi hypotes att fria radikaler genereras under X-ray exponering snabbt försämra angränsande kristaller i samma reaktion utrymme. Exempelvis var sådan sekundär röntgen skada mindre uttalad i ett närliggande experimentella tillvägagångssätt, där kristaller har delats ut över ett betydligt större område i en polyimid smörgås21. För att minimera övergripande röntgen skada, bör endast ett litet antal diffraktionsmönster från en viss kristall samlas vid rumstemperatur. Också, bör endast ett enda protein crystal utsättas per kupé mikroflödessystem chip. Alla strukturmodeller förfinas med den bearbetade datauppsättningar visar ändå, mycket bra stereokemi och lämplig statistik (tabell 4). Dessutom var alla slutliga elektronen täthet kartor av mycket god kvalitet.

I tidigare kristallografi metoder på röntgen transparent chips, orientering och arrangemang av kristallerna hade att manipulera medvetet för att få en slumpmässig fördelning av crystal riktlinjer40 eller erhölls av crystal rörelser inom de vätskelagrar21. Utvärdera med crystal orientering i röntgen transparent mikroflödessystem marker beskrivs i detta protokoll, bestämdes enhet cell orientering alla exponerade kristaller med avseende på koordinatsystemet som laboratoriet. För bipyramidal taumatin kristaller observerades en svag preferens (figur 7A), medan vi fick en bred distribution för glukos isomerase kristaller (figur 7B). Vi resonerade att på nanometerskalan, de flesta material uppvisar betydande strävhet. Därför kunde kristaller spontant kärnbildas på ytan i betydligt mindre partisk riktlinjer spontant. Sådan en liten kristall kärna kan låsas in i en orientering, medan man fortsätter att växa till lämplig storlek utan att omorientera i förhållande till normalt av ytan. I själva verket har ytan medierad kristallkärnbildning länge varit en plåga för kristallografer försöker slinga en bifogad crystal yta utan att skada kristallen i processen. Här kan vi direkt utnyttja sådana kristaller för diffraktion datainsamling. Men finns systemet specifika begränsningar thioredoxin visade en stark förkärlek för vissa riktlinjer i xy-, xz- och yz-plan (figur 7 c). Exemplen visade visar att orientering fördelningen inte endast beror på tillväxt miljön men också på formen crystal. Thioredoxin kristallerna har avlånga former som tenderar att växa i önskad riktning, medan tetragonala bipyramidal taumatin kristallerna eller Ortorombiska glukos isomerase kristallerna inte visar detta beteende. Dock i alla fall, även med rekommenderad riktlinjer tillgängliga utbudet av crystal rotationer resulterade i tillräckligt god täckning av ömsesidiga utrymme och därmed komplett datauppsättningar för alla undersökta proteiner. Således hade inga ytterligare åtgärder vidtas när du väljer kristaller för Xray exponering.

Figure 1
Figur 1 : Systemet av mikrofabricerade röntgen chip fabrication. (1) SU-8 dispenserats på en kisel substrat och spin belagda för att erhålla önskad lagrartjockleken. (2) fotoresist utsätts för UV-strålning genom en mask. (3) oexponerad fotoresist utvecklas sedan bort av konsekutivt tvättning med PGMEA och isopropanol, resulterar i (4) en SU-8 master för ytterligare gjutning steg. (5) PDMS hälls på, och (6) efter härdning PDMS mögel, är skalade från SU-8 master. (7a) epoxi lim dispenserats på PDMS mögel och (7b) en aktiverad polyimid folien är kemiskt bundna till epoxiharts. (8) efter härdning, är polyimid folien med mönstrad tunn epoxi filmen skalade från PDMS mögel. (9) i ett sista steg är enheten lock med en andra polyimid folie att ge en sluten låg röntgen bakgrund mikroflödessystem chip. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2 : Fotografi (vänster) och mikroskopi bilder av tvärsnitt av de slutliga markerna. Ett representativt kanal segment (mitten) och en kristallisering brunn (höger) från två separata chips visas. Pilarna visar uppmätt avstånd. Alla mått är i µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3 : Scheman av kristallisering mönster väl med [A] parallell- eller [B] serial layout, sett uppifrån och från sidan, med dimensioner anges i µm. Typisk kanal höjder var: 50 µm kringgå, 50-60 µm kristallisering väl, 5-10 µm kapillär ventil, motsvarar väl volymer ca 2,5 nL (parallella layout) och 8 nL (seriell layout). Representant väl lastning beteende visas med mat färgämnen. Chipet var grundmålade med 12 wt % 1H, 1 H, 2H, 2H-perfluoro-1-oktanol i FC-43, innan livsmedelsfärgämne injicerades i lagring brunnar. Vita pilar visar flödesriktningen. Översiktsbilder av laddade enheter visar alla brunnar laddad defekt gratis, som illustrerar robust urval lastning. Parallella layouten illustreras som en tre-höjd design, med kristallisering brunnar högre än bypass, medan layouten seriell avbildas som en två-höjd design med wells och kringgå att ha samma höjd. Typiska flöden var omkring 150 µL/h under lastning, men defekt fri lastning observerades för flöden upp till 1 mL/h i en tre höjd-design. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4 : In situ dynamisk ljus spridning av en kristallisering väl med tiden. [A] mikroskopisk bild serie av kristalliseringen väl. Den lagrade droplet kontinuerlig krymper när vattenånga avdunstar med tiden. Första taumatin microcrystals kan observeras efter 4 h. [B] motsvarande hydrodynamiska radien fördelning av taumatin partiklarna mätt med DLS under samma kristallisation fotograferad i [A]. Bildandet av en andra RADIUS-fraktionen, som anger inledande kärnbildning händelser kan ses efter ungefär 1-2 h. [C] representativa volym minskning av två referens droplet volymer på grund av avdunstning vattenförlust över tid. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5 : i situ diffraktion datainsamling. [A] individuella mikroflödessystem chip monteras av en 3D tryckta adapter (blå) på en tallrik goniometer. [B] taumatin kristaller i mikroflödessystem chip under X-ray exponering som avbildas av mikroskopet i linje på beamline P14. [C] diffraktion taumatin kristaller spelades till en upplösning av 2.0 Å, med negligibly låg bakgrund. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6 : Data utvärdering av diffraktion data från taumatin kristaller i mikroflödessystem chip, inspelad på rumstemperaturen-. [A] elektrontätheten av raffinerade taumatin modell med RAM 1-2 dataset endast (blå konturer på 1,5 σ). [B] intensitet förfalla av taumatin kristaller som en funktion av röntgen dos. [C] evolution av Rmeas värde över röntgen dos. Rutan tomter i [B] och [C] med kvartiler (övre värden 75%, medianvärden 50%, lägre värden 25% och medelvärdet) och morrhår med 95% konfidensintervall representerar förfalla av diffraktion intensitet och Rmeas av alla exponerade kristaller (n = 83). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 7
Figur 7 : Distribution av enhet cell riktlinjer i mikroflödessystem chip folien med avseende på koordinatsystemet som laboratorium. [A] bipyramidal taumatin kristallerna visade en bred fördelning av riktlinjer som omfattar nästan 180° i xy-(blå), xz-planet (grön) och yz-(red) plan. [B] glukos isomerase visar också en omfattande distribution, medan [C] thioredoxin visade en stark preferens för vissa riktlinjer. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

SU8-lager Spin Rock Före härdning Exponera Efter baka
[65 / 95 ° C] [65 / 95 ° C]
1st lager: brunnar 1000 RPM 0 / 10 min 200 mJ/cm2 1 / 4 min
15 µm SU8-3010
2nd lager: Bypass 2000 RPM 0 / 16 min 220 mJ / cm2 1 / 5 min
35 µm SU8-3025
3rd lager: ventiler 3000 RPM 0 / 3 min 150 mJ / cm2 1 / 2 min
5 µm SU8-3005

Tabell 1: SU8 process exempel för tre lager parallella röntgen chip design. Detta lager beställer möjliggör gjutning en PDMS mögel för röntgen chip fabrication. För att direkt mögel en PDMS under prototyping, omvänd lagret beställning under master fabrication starta från 3rd att avsluta med 1st lagret istället.

Protein Proteinkoncentration Protein-buffert fällningsmedel Utrymmegruppen, PDB inträde Extinktionskoefficient [M-1 cm-1]
Taumatin (Thaumatococcus daniellii) 40 mg mL-1 50 mM Bis-Tris, pH 6,5 1.1 M natrium tartrat, 50 mM Tris, pH 6,8 I4222, 1LR2 29420
Glukos isomerase (Streptomyces rubiginosus) 25 mg mL-1 10 mM HEPES, 1 mM MgCl2, pH 7,0 100 mM Bis-Tris, 2.7 M ammoniumsulfat, pH 5,7 I222, 4ZB2 46410
Thioredoxin (Wuchereria bancrofti) 34 mg mL-1 20 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA, 150 mM NaCl, pH 8,0 27,5% PEG1500, 100 mM SPG buffert, pH 6,3 P41212, 4FYU 24075

Tabell 2: Kristallisering villkor och Utrymmegrupper av proteinkristaller beredd, inklusive utrotning koefficient och pdb koden.

Protein Antal exponerade kristaller Antal diffraktionsmönster per crystal Svängningen räckvidd per exponering [°] Exponeringstiden [ms] PDB post för herr
Taumatin (Thaumatococcus daniellii) 103 10 1 40 1LR2
Glukos isomerase (Streptomyces rubiginosus) 69 100 0,1 80 4ZB2
Thioredoxin (Wuchereria bancrofti) 68 10 1 40 4FYU

Tabell 3: röntgendiffraktion data collection-parametern.

Data insamling statistiken taumatin
(Frame 1-20)		 glukos isomerase (Frame 1-100) thioredoxin
(Frame 1-10)
Beamline P14
Våglängd [Å] 0.96863
Utrymmegruppen P41212 I222 P42212
Enhet cell parametrar: en = b, c [Å] 58.62, 151.48 93.91, 99.60, 103.04 58,45, 151.59
Antal kristaller 101 41 34
Totala svängning [°] 10 10 10
Upplösningen [Å] 30.1.1989
(1,95 – 1,89)		 30.1.1975
(1,80 – 1,75)		 30.3.2000 Bull.
(3.20 – 3,00)
Temperatur [K] 296 296 296
R p.i.m.b 7.5 (25,5) 8,8 (28,0) 9,1 (33,2)
Uppmätta reflektioner 1553200 690000 1111196
Unika reflektioner 21850 48942 44449
Genomsnittlig I/σ(I) 6,07 (1,78) 5,85 (1,66) 4.08 (1,47)
Mn(I) halv-set korrelation CC(1/2) 96,2 (72,2) 95,8 (68,2) 97,9 (75,3)
Fullständighet [%] 99,8 (100,0) 100,0 (99,9) 99,9 (100,0)
Redundans 71,1 14.1 25
Förfining statistik
Upplösning utbud [Å] 1/30/1989 1/30/1975 3/30/2000
R / Rgratis [%] 18.8/23.9 18.1/20.5 18.9/23.1
Protein atomer 1550 3045 1129
Vattenmolekyler 51 111 164
Ligand molekyler 20 0 0
RMS-avvikelse
Bond-längd [Å] 0,02 0,026 0,01
Bond vinkel [°] 2,04 2.22 1,43
B faktor [Å2]
Protein 22,6 20 50
Vatten 25,1 27,1 29,7
Ligand 20,4
Ramachandran plot analys
Mest gynnade regioner [%] 97.67 95.32 96.13
Tillåtna regioner [%] 2,44 4.16 3,64
Generöst tillåtna regioner [%] 0,49 0,52 0,23
a: värden inom parentes är för högsta upplösning skalet.
b: (Equation), där jag (HST) är genomsnittliga intensiteten i de reflektioner hkl, Σhkl är summan över alla reflektioner och Σi är summan över jag mätningar av reflektion hkl.

Tabell 4: Data collection statistik av datamängder från taumatin, glukos isomerase och thioredoxin.

Ljusgenomsläppningskoefficient-fil 1: chip_geometry.dwg. CAD-filer av chip geometrier används. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.

Ljusgenomsläppningskoefficient-fil 2: goniometer_adapter.stl. STL-filen specificerar Röntga chip goniometer adaptern. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.

Ljusgenomsläppningskoefficient-fil 3: xds.sh. Bash skript för att skapa indata-filer för att bearbeta kilar av diffraktion uppgifter XDS. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.

Ljusgenomsläppningskoefficient-fil 4: xscale.sh. Bash-skript för att koppla diffraktion data från grupper och skapa en HST fil. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.

Ljusgenomsläppningskoefficient-fil 5: ISigma.sh. Bash-skript för att extrahera ISigma värden från alla enskilda grupper. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.

Ljusgenomsläppningskoefficient-fil 6: Rmeas.sh. Bash-skript för att extrahera Rmeas värden från alla enskilda grupper. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.

Ljusgenomsläppningskoefficient-fil 7: rotation_matrix.sh. Bash-skript för att förbereda indatafilen för Matlab att beräkna Euler vinklar från rotation matrix. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.

Discussion

Vi fabricera mikroflödessystem enheter för i situ röntgendiffraktion av mönstring epoxiharts som fyllning material och polyimid folie som fönster material. Vår procedur optimerad olika stegen i tillverkningsprocessen via tidigare röntgen chip Design16,21. Vi minskade tjockleken fönster och därmed bakgrunden spridning medan också lättnader fabrication som färre processteg krävs. i situ kristallisering använda protokollet beskrivs har betydande fördelar. Det tillåter diffraktion datainsamling vid rumstemperatur och utesluter därmed behovet av cryo skydd, som i vissa fall innehåller risken att införa artefakter i proteinstruktur. Kristallerna omfattas dessutom inte av fysisk stress, eftersom överföringen av kristallerna från sin ursprungliga miljö kan undvikas. Genom detta förfarande, kristallerna upprätthålla deras högsta kvalitet och lider inte av någon behandling.

Vår erfarenhet kretsa de mest kritiska steg inom protokollet kring styra kristallisation. Parametrar för att få Röntga lämplig kristaller med lämpliga dimensioner måste identifieras empiriskt och kan inte tas direkt från vapor diffusion experiment. Med identiska koncentrationer av protein och fällningsmedel resulterade inte alltid i kristaller i olika marker, eller ibland i olika brunnar inom samma chip. Detta indikerar att alla faktorer som påverkar crystal kärnbildning och tillväxt bör övervägas noga, såsom mor sprit sammansättning eller kristallisering kinetik (genom avdunstning banan). Som större kristaller gravering till högre upplösning, odlas idealiskt lämpligt stora kristaller. Processen för crystal kärnbildning och tillväxt kan följas med DLS mätningar. Justera laser fokus inuti den ~ 50 µm tunn kristallisering fack av chip kan vara utmanande och kan kräva noggrann manuell justering. Genom att använda brunnar djupare än 100 µm, var laser auto-justering genomförbart och pålitlig, sådan att flera brunnar skulle kunna övervakas genom automatiserade förvärv system.

Polyimid baserat röntgen marker producerar endast en låg bakgrund och vi visar lämpligheten av dessa enheter för rutin X-ray diffraction datainsamling genom att lösa strukturer för tre modell proteiner. Bästa upplösning erhålls i chip skilde sig, jämfört med tidigare uppnådda resolutioner, från betydligt större proteinkristaller och konventionell röntgen datainsamling. Detta kan bero på flera faktorer och ytterligare kristallisering skick optimering kan ytterligare förbättra diffraktion. Det var möjligt att samla in i situ diffraktion data upp till 1,8 Å upplösning tillämpa kristallen med mått mindre än 30 µm. Detaljerad analys av taumatin diffraktion data också insikter om strålskador. För att begränsa utöka av strålskador, bör endast en enda kristall utsättas per fack i ultrakalla enheten, eftersom spridningen av radikaler och i angränsande kristaller kan uppstå. För att förbättra hastigheten på datainsamling, bör det här automatiseras i framtiden.

På grund av crystal morfologi, i vissa fall kan en rekommenderad orientering uppstå. Detta var till exempel fallet med thioredoxin datamängden, där kristallerna hade en starkt rekommenderad orientering i förhållande till chip Fönstren. Även här kan vi samla in en komplett diffraktion datamängd. Om kristaller uppvisar en rekommenderad orientering i chip och särskilt om motsvarande utrymmegruppen har också en låg symmetri, då fullständighet datamängden bör övervakas under samlingen så att tillräcklig diffraktion mönster sockerrör vara samlas in.

Tid-löst studier med hjälp av dessa marker är direkt möjligt när med ljus inducerad reaktioner med en pump-probe-metoden. Polyimid folie ljustransmission för pump lasern behöver belysas och alternativt optiskt klara polyimid eller COC kunde användas. De nuvarande mikroflödessystem geometrierna tillåter inte för substrat blandas experiment efter kristaller odlas. Vi förväntar oss dock beskrivs röntgen chip fabrication protokollet också vara lämplig för sådan blandning design för både tid-löst röntgendiffraktion samt spridning metoder19.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av PIER utsäde fonden PIF-2015-46, BMBF beviljar 05K16GUA och 05K12GU3, och 'Hamburg centrum för ultrasnabb Imaging – struktur, dynamik och kontroll av ärendet på den atomära skalan' excellence klustret av Deutsche Forschungsgemeinschafts (DFG). Arbetet av författare knutet till centret för Free-elektron Laser vetenskap finansierades av Helmholtz Association genom orienterade programmedel. Synkrotron MX data samlades på beamline P14 drivs av EMBL Hamburg på PETRA III förvaring ring (DESY, Hamburg, Tyskland).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SU-8 3000 Series MicroChem Corp. SU-8 3000 Photoresist
PGMEA Sigma-Aldrich 484431 Developer
Isopropyl alcohol Solvent
Ethanol Solvent
Epoxy glue UHU Plus Schnellfest 5 min Epoxy glue
PDMS Dow Corning Sylgard 184 Silicone
Kapton foil Dupont/ American Durafilm HN grade, gauge 30 (7.5 μm) polyimide foil
APTS Sigma-Aldrich 440140 Chemical
GPTS Sigma-Aldrich 440167 Chemical
Cytop CTX-109AE Asahi Glass Co. Ltd Cytop CTX-109AE Cytop fluoropolymer coating
CT-Solv 100E Asahi Glass Co. Ltd CT-Solv 100E Cytop fluoro-solvent
HFE-7500 3M Novec 7500 Fluorinated oil
AutoCAD AutoDesk Inc. AutoCAD CAD Software
Biopsy Punch Harris Uni-core 0.75 mm
Photo mask JD Photo Data
3 inch wafer University Wafer Silicon wafer
Mask aligner SÜSS MicroTec MJB4 Mask aligner
PDMS mixer Thinky ARE-250
Plasma machine Diener electronic Zepto
Thaumatin Sigma Aldrich T7638 Protein
Glucose Isomerase Hamton Research HR7-102 Protein
Bis-Tris Sigma Aldrich B9754 Chemical
Sodium Tartrate Merck 106664 Chemical
Tris-HCl Sigma Aldrich 10812846001 Chemical
HEPES Carl Roth 6763.2 Chemical
Magnesium Chloride Sigma Aldrich 208337 Chemical
Ammonium Sulfate Sigma Aldrich A4418 Chemical
EDTA Sigma Aldrich E6758 Chemical
Sodium Chloride Sigma Aldrich 1064060250 Chemical
PEG1500 Molecular Dimensions MD2-100-6 Chemical
SPG buffer Jena Bioscience CSS-389 Chemical
SpectroLight600 XtalConcepts DLS Instrument
Nanodrop Thermo Scientific Spectrophotometer
Zentrifuge Eppendorf
Ultimaker2 Ultimaker 3D printer
Form2 Formlabs 3D printer
Amicon Filter Sartorius Stedim 0.2 µm filter
Tubing Adtech Polymer Engineering Ltd Bioblock/05 PTFE tubing 0.3 mm Inner Diameter x 0.76 mm Outer Diameter
Syringes  BD 309628 1ml Luer-Lock Tip
Needle  Terumo Agani Needle AN*2716R1 27Gx5/8"

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rasmussen, B. F., Stock, A. M., Ringe, D., Petsko, G. A. Crystalline ribonuclease A loses function below the dynamical transition at 220 K. Nature. 357 (6377), 423-424 (1992).
  2. Tilton, R. F. J. R., Dewan, J. C., Petsko, G. A. Effects of temperature on protein structure and dynamics: X-ray crystallographic studies of the protein ribonuclease-A at nine different temperatures from 98 to 320 K. Biochemistry. 31 (9), 2469-2481 (1992).
  3. Fraser, J. S., Clarkson, M. W., Degnan, S. C., Erion, R., Kern, D., Alber, T. Hidden alternative structures of proline isomerase essential for catalysis. Nature. 462 (7273), 669-673 (2009).
  4. Juers, D. H., Matthews, B. W. The role of solvent transport in cryo-annealing of macromolecular crystals. Acta Crystallogr. D. 60 (Pt 3), 412-421 (2004).
  5. Huang, C. Y., et al. In meso in situ serial X-ray crystallography of soluble and membrane proteins. Acta Crystallogr. D. 71 (Pt 6), 1238-1256 (2015).
  6. Gati, C., et al. Atomic structure of granulin determined from native nanocrystalline granulovirus using an X-ray free-electron laser. P. Natl. Acad. Sci. USA. 114 (9), 2247-2252 (2017).
  7. Gati, C., et al. Serial crystallography on in vivo grown microcrystals using synchrotron radiation. IUCrJ. 1 (Pt 2), 87-94 (2014).
  8. von Dreele, R. B. Multipattern Rietveld refinement of protein powder data. J. Appl. Crystallogr. 40 (1), 133-143 (2007).
  9. Cherezov, V. Lipidic cubic phase technologies for membrane protein structural studies. Curr. Opin. Struct. Biol. 21 (4), 559-566 (2011).
  10. Gati, C. Data processing and analysis in serial crystallography at advanced X-ray sources. , Dissertation, Hamburg (2015).
  11. Stellato, F., et al. Room-temperature macromolecular serial crystallography using synchrotron radiation. IUCrJ. 1 (Pt 4), 204-212 (2014).
  12. Botha, S., et al. Room-temperature serial crystallography at synchrotron X-ray sources using slowly flowing free-standing high-viscosity microstreams. Acta Crystallogr. D. 71 (Pt 2), 387-397 (2015).
  13. Nogly, P., et al. Lipidic cubic phase serial millisecond crystallography using synchrotron radiation. IUCrJ. 2 (Pt 2), 168-176 (2015).
  14. Martin-Garcia, J. M., Conrad, C. E., Coe, J., Roy-Chowdhury, S., Fromme, P. Review: Serial femtosecond crystallography: A revolution in structural biology. Arch. Biochem. Biophys. 602, 32-47 (2016).
  15. White, T. A., et al. CrystFEL: A software suite for snapshot serial crystallography. J Appl Crystallogr. 45 (2), 335-341 (2012).
  16. Perry, S. L., et al. A microfluidic approach for protein structure determination at room temperature via on-chip anomalous diffraction. Lab Chip. 13 (16), 3183-3187 (2013).
  17. Schlichting, I. Serial femtosecond crystallography: the first five years. IUCrJ. 2 (Pt 2), 246-255 (2015).
  18. Sui, S., Perry, S. L. Microfluidics: From crystallization to serial time-resolved crystallography. Struct. Dynam.-US. 4 (3), (2017).
  19. Ghazal, A., Lafleur, J. P., Mortensen, K., Kutter, J. P., Arleth, L., Jensen, G. V. Recent advances in X-ray compatible microfluidics for applications in soft materials and life sciences. Lab Chip. 16 (22), 4263-4295 (2016).
  20. Heymann, M., et al. Room-temperature serial crystallography using a kinetically optimized microfluidic device for protein crystallization and on-chip X-ray diffraction. IUCrJ. 1 (Pt 5), 349-360 (2014).
  21. Schubert, R., et al. A multicrystal diffraction data-collection approach for studying structural dynamics with millisecond temporal resolution. IUCrJ. 3 (Pt 6), 393-401 (2016).
  22. Weierstall, U., et al. Lipidic cubic phase injector facilitates membrane protein serial femtosecond crystallography. Nat. Commun. 5, 3309 (2014).
  23. Conrad, C. E., et al. A novel inert crystal delivery medium for serial femtosecond crystallography. IUCrJ. 2 (Pt 4), 421-430 (2015).
  24. Cohen, A. E., et al. Goniometer-based femtosecond crystallography with X-ray free electron lasers. P. Natl. Acad. Sci. USA. 111 (48), 17122-17127 (2014).
  25. Erskine, D., YU, P. Y., Freilich, S. C. High-Pressure Visible Spectroscopy of Polyimide Film. J. Polym. Sci. Pol. Lett. 26 (11), 465-468 (1988).
  26. Tsai, C. -L., Yen, H. -J., Chen, W. -C., Liou, G. -S. Novel solution-processable optically isotropic colorless polyimidothioethers-TiO2 hybrids with tunable refractive index. J. Mater. Chem. 22 (33), 17236-17244 (2012).
  27. Destremaut, F., Salmon, J. -B., Qi, L., Chapel, J. -P. Microfluidics with on-line dynamic light scattering for size measurements. Lab Chip. 9 (22), 3289-3296 (2009).
  28. Chastek, T. Q., Iida, K., Amis, E. J., Fasolka, M. J., Beers, K. L. A microfluidic platform for integrated synthesis and dynamic light scattering measurement of block copolymer micelles. Lab Chip. 8 (6), 950-957 (2008).
  29. Heymann, M., Fraden, S., Kim, D. Multi-Height Precision Alignment With Selectively Developed Alignment Marks. J. Microelectromech. S. 23 (2), 424-427 (2014).
  30. Schubert, R., et al. Reliably distinguishing protein nanocrystals from amorphous precipitate by means of depolarized dynamic light scattering. J Appl Crystallogr. 48 (5), 1476-1484 (2015).
  31. Aghvami, S. A., et al. Rapid prototyping of cyclic olefin copolymer (COC) microfluidic devices. Sensor Actuat. B-Chem. 247, 940-949 (2017).
  32. Walker, J. M. The Proteomics Protocols Handbook. , Humana Press Inc. Totowa, NJ. (2005).
  33. Kabsch, W. XDS. Acta Crystallogr D. 66 (Pt 2), 125-132 (2010).
  34. Vagin, A., Teplyakov, A. Molecular replacement with MOLREP. Acta Crystallogr. D. 66 (Pt 1), 22-25 (2010).
  35. Winn, M. D., et al. Overview of the CCP4 suite and current developments. Acta Crystallogr. D. 67, 235-242 (2011).
  36. Murshudov, G. N., et al. REFMAC5 for the refinement of macromolecular crystal structures. Acta Crystallogr. D. 67 (Pt 4), 355-367 (2011).
  37. Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallogr. D. 66 (Pt 4), 486-501 (2010).
  38. Owen, R. L., et al. Exploiting fast detectors to enter a new dimension in room-temperature crystallography. Acta Crystallogr. D. 70 (Pt 5), 1248-1256 (2014).
  39. Kabsch, W. Automatic-Indexing of Rotation Diffraction Patterns. J. Appl. Crystallogr. 21, 67-71 (1988).
  40. Zarrine-Afsar, A., et al. Crystallography on a chip. Acta Crystallogr. D. 68 (Pt 3), 321-323 (2012).
  41. Boukellal, H., Selimović, S., Jia, Y., Cristobal, G., Fraden, S. Simple, robust storage of drops and fluids in a microfluidic device. Lab Chip. 9 (2), 331-338 (2009).
  42. Aghvami, S. A., et al. Rapid prototyping of cyclic olefin copolymer (COC) microfluidic devices. Sens. Actuator B Chem. 247, 940-949 (2017).
  43. Shemesh, J., et al. Stationary nanoliter droplet array with a substrate of choice for single adherent/nonadherent cell incubation and analysis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 111 (31), 11293-11298 (2014).
  44. Sun, M., Bithi, S. S., Vanapalli, S. A. Microfluidic static droplet arrays with tuneable gradients in material composition. Lab Chip. 11 (23), 3949-3952 (2011).
  45. Shim, J. -U., et al. Control and measurement of the phase behavior of aqueous solutions using microfluidics. J. Am. Chem. Soc. 129 (28), 8825-8835 (2007).
  46. Schubert, R., Meyer, A., Baitan, D., Dierks, K., Perbandt, M., Betzel, C. Real-Time Observation of Protein Dense Liquid Cluster Evolution during Nucleation in Protein Crystallization. Cryst. Growth Des. 17 (6), 3579 (2017).

Tags

Kemi fråga 134 i situ röntgendiffraktion fast mål seriell millisekund kristallografi mikrofluidik protein kristallisering i situ dynamisk ljus spridning
Mikroflödessystem marker för <em>In Situ</em> Crystal röntgendiffraktion och <em>In Situ</em> dynamiska ljusspridning för seriell Crystallography
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gicquel, Y., Schubert, R., Kapis,… More

Gicquel, Y., Schubert, R., Kapis, S., Bourenkov, G., Schneider, T., Perbandt, M., Betzel, C., Chapman, H. N., Heymann, M. Microfluidic Chips for In Situ Crystal X-ray Diffraction and In Situ Dynamic Light Scattering for Serial Crystallography. J. Vis. Exp. (134), e57133, doi:10.3791/57133 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter