Summary
DNA 損傷修復機構研究で定義されたサブ核領域の病変を誘導するシステムが必要です。405 nm レーザー装備レーザー走査共焦点の顕微鏡を使用してローカライズされた二本鎖切断を作成し、これらの病変の修復因子のダイナ ミックスを定量化するための自動化された手順を提供する手法を提案します。
Abstract
DNA 損傷応答 (DDR) は、検出、信号、および DNA 損傷を修復するタンパク質の茄多を使用します。この応答の輪郭を描くがゲノム維持機構の解明を理解する重要です。募集と病変における蛋白質の交換は非常にダイナミックなので、彼らの研究には迅速かつ空間的区切りに DNA 損傷を生成する機能が必要です。ここでは、我々 はローカル 405 nm レーザー ライン装備一般的なレーザ走査共焦点顕微鏡を用いたひと細胞における DNA 損傷を誘導するための手順を説明します。ゲノム維持要因レーザ ストライプは、蛍光抗体法 (IF) またはリアルタイムで評価できますの蓄積は、蛍光レポーターが付いたタンパク質を利用しました。リン酸化ヒストン H2A を使用しています。(Γ-H2A.X) x マーカーとしての複製蛋白質 A (RPA), メソッドは、隣接するクロマチンの普及からローカル募集の要因を識別するための十分な解像度を提供しています。さらにサイト被害を効率的にタンパク質染色体 DNA での動態を監視する ImageJ ベースのスクリプトを提供します。これらの改良は、DDR のダイナミクスの研究を簡単になります。
Introduction
細胞は、DNA 損傷のゲノムの完全性を脅す内因性と外因性の源に常に公開されます。DDR は、シグナル伝達経路を検出、信号、およびゲノムの安定性を維持するために DNA の損傷を修復のアンサンブルです。DNA 二本鎖切断 (Dsb)、DDR が 2 つの相補的なプラットフォームを中心に発生: γ H2A.X ラベル クロマチンと ssDNA 結合複合体 RPA1,2でコーティングされた通常切除一本鎖 DNA 領域。
UV レーザー マイクロ - チミジン アナログ 5-ブロモ-2' デオキシウリジン (BrdU) または bisbenzimide エトキシド trihydrochloride (BBET、ヘキスト 33342) DNA 染料前感作細胞照射単鎖切断 (を含む DNA 損傷の混合物を作成しますSSBs) と Dsb をクロマチンと一本鎖 Dna の両方のプラットフォーム3,4ローカライズされた DDR を引き出します。前の仕事を示した場合2、5と組み合わせて高エネルギー紫外線 A レーザー (335 365 nm) を使用して、DSB でこれらの 2 つの異なるプラットフォームにゲノム維持要因の採用を差別することができます。装備されてこのようなレーザー顕微鏡は、高エネルギー レーザー、405 nm レーザを用いたレーザ走査共焦点顕微鏡よりも学術と製薬の設定でずっとより少なく流行し専用の UV A 送信目的必要と高価ですライン。蛋白質の募集とマイクロ照射サイトで交換の研究はゲノム維持要因の動的挙動を記述するために必要な骨の折れる手動画像解析による排除も。
ここでは、BrdU または BBET の核酸染色と細胞の前感作性マイクロ照射による DNA 損傷でゲノム維持因子の動態のモニタリングを可能に一般的な共焦点顕微鏡の 405 nm レーザー後に続くことを示します。改良された解像度にフィールドとデコンボリューションの大きい深さ z 積み重ねとともにプラットフォーム マーカーとして γ H2A.X または RPA 複雑な亜単位を使用できますローカルに広がるそれらから Dsb に補充される要因を区別する実験者初期病変を囲む大規模なクロマチン ドメイン。核内の異なるコンパートメントによるとこのサブ分類マイクロ照射サイトに募集される未同定蛋白質の潜在的な役割を絞り込むことができます。また、便利なプロトコルを提供し、オープン ソース ・ ソフトウェア (ImageJ 分布) フィジー6,7、8を使用してゲノム維持要因のダイナミクスをすばやく解析するパイプラインを最適化します。現在マイクロ照射方法にこれらの改良は、事実上すべての研究室の設定可能な DDR の研究をレンダリングします。
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Protocol
1. 細胞の前感作性
- マイクロ照射実験前に 24 h 種 FB 8 も培養の 405 nm レーザ光と優れたイメージングの最大透過率を確保するため 170 μ m 厚 coverslip のようなガラス/樹脂底付きスライド 1 x DMEM 含む 10% の井戸あたり U2OS セルが 40,000 セルレーザー走査共焦点顕微鏡を反転します。8 も microslide を使用している場合、すべての後の治療とプロトコルの洗浄手順ウェルあたり 500 μ L のメディアまたはソリューションを使用します。
注: 自分のフラットの形態のための密着が良好と大きな核の U2OS 細胞の発見を容易タンパク質マイクロ照射のサイトで募集が、必要に応じて、その他の付着性のセル型を使用できます。細胞が 80% を理想的にする約必要がありますの数を増やすにマイクロ照射時の confluency 照射実験ごとのセル。非常に高い合流9細胞周期の S および G2 段階で行われる相同組換えなど、特定の修復経路を混乱させることができる細胞周期変化可能性があります。 - 5% CO2、37 ° C で一晩細胞をインキュベートし、(手順 1.3) でセルをあらかじめ感光性 BrdU (手順 1.4) または BBET (ヘキスト 33342)。
注: (ポイ) DNA 病変へのタンパク質のライブ募集を観察するには、transfect または細胞播種後蛍光タンパク質とポイ 24 h の融合を運ぶプラスミッド DNA を変換します。24 h 後-transfection/伝達、事前に敏感し、リアルタイムで DNA 損傷部位でポイの募集を監視する細胞をマイクロ照射します。 - 405 nm レーザーに博覧会によって生成される Dsb の数を増やす、BrdU の 10 μ M をマイクロ照射前に 24 h のメディアに追加します。マイクロ-照射、マイクロ ピペットを使用して前に 405 nm レーザーにセルの最大の露出を確保するためフェノールレッドなし中で 2 回細胞をすすいでください。
- また、10 μ g/ml 37 ° C で細胞培養のインキュベーターで適切な培地で BBET と 15 分のためのセルを扱う治療後、フェノールレッド マイクロ照射前にせず中で 2 回すすいでください。
2. 細胞マイクロ照射
- 適切なレーザー スキャンの顕微鏡を選択します。
注: ここに示した実験は 50 mW 405 nm レーザー線、63 X 1.4 開口石油目的を備えた顕微鏡システムで行った。Dsb を生成する細胞がマイクロ照射 1 × 1,024 x 1,024 ピクセル/フィールド (63 倍の倍率で 0.21 μ m/ピクセル) でスキャン ズームと単方向モードでは 8 μ s/ピクセルで。使用されるレーザーの電力は 25%、BBET と BrdU-前-増感細胞の 80% であった。ユーザーが彼らのシステムを構成するには、提案システムのレーザー パワー後目的は、製造元の指示に従って電源メーターを用いて測定しました。測定値が 2.6 に対応して mW と 7.0 mW の BBET と BrdU-前-増感細胞、それぞれ。 -
顕微鏡と環境制御チャンバーを入れます。
- サンプルはステージ上での定温器細胞に不必要なストレスを避けるために、実験全体で均質な DDR の速度を確保するために置かれる前に、商工会議所を 5% CO2と 37 ° C に設定します。
-
よく分散セルとフィールドを選択、フォーカスを調整し、場合プロトコル後イメージの獲得を促進する彼らの位置を登録します。タンパク質募集マイクロ照射後の反応を監視するため前損傷参照ポイントとして機能する少なくとも 1 つのイメージを取得します。
注: グリッド培養容器は、後続の手順でマイクロ照射細胞のローカリゼーションを促進するまた使用可能性があります。- BBET 標識細胞を用いた場合の実験、不当な DNA 損傷を避けるため、細胞を可視化するための十分な最低レーザーの消費電力 405 nm レーザーを用いた細胞焦点を調整します。
- ランプから放射される紫外線は照らされたサイトで DNA 損傷を誘発する、BBET 染色性細胞にフォーカスを調整する広視野蛍光を使用しないでください。
- BrdU 標識細胞を使用している場合は、サブ核小体などを見ることによって差動干渉の対照 (DIC) または位相コントラスト イメージングを使用してフォーカスを調整します。
- 蛍光標識したランドマークを発現する細胞を使用している場合は、代表的な蛍光強度とフォーカル プレーンを選択します。
注: は、人工ローカライズ可能性があります強力な過剰発現、POI の非常に高いレベルを発現する細胞を避けてください。さらに、匹敵するレベル (安定したクローンの選択ポイ式および採用レベルの変動を最小限に抑える推奨) でポイを表現するセルを選択します。
- BBET 標識細胞を用いた場合の実験、不当な DNA 損傷を避けるため、細胞を可視化するための十分な最低レーザーの消費電力 405 nm レーザーを用いた細胞焦点を調整します。
- システムの退色 (FRAP) _module 後蛍光回復を使用してマイクロ照射ステップの顕微鏡を構成します。
注: セットアップ顕微鏡システムのマイクロ照射実験を検討する最も重要なパラメーター: 405 nm のレーザーは、回数 (すなわちレーザーは同じ座標に行く回の数) の出力電力ピクセル/フィールドの数 (倍率と 1 ピクセル解像度 1,024 × 1,024 X 63 = 0.21 μ m)、およびピクセルあたりの滞在時間。これらすべての要因は細胞が発生するエネルギーの量に影響を与える、従って量と DNA の種類損傷生成された (見なさい議論線量最適化の詳細)。 - 細胞をマイクロ-照射顕微鏡システムの FRAP モジュールを使用する。
注: ほとんどのシステムで複数のセルのマイクロ照射実行できます単一のフィールドに斑点や線/長方形 (通常 1-2 μ m 幅) として。蛍光標識したタンパク質のライブ イメージングを実行するときは、すぐに損傷後、各セルのマイクロ照射にかかる時間を DDR の遅延誘導になりますのでマイクロ照射フィールドごとにセルの数が少ないを制限します。これは、DNA 損傷に非常に急速に補充される蛋白質を監視するときに特に重要です。 -
マイクロ照射、ウェル スライドやプレートに戻す 5% CO2と 37 ° c の定温器の場合のサンプルを処理する前に必要な期間 (セクション 5) 後すぐにライブ イメージングを続行または (セクション 3)。
- 最初のステップとして、数分以内、場合プロトコルのいくつかの時間後照射までセルを修正します。ポイは、に応じて募集速度が異なる場合があります。通常、Dsb と SSBs でクロマチン関連蛋白質は病変に非常に急速にローカライズされます、5 分以内は時々 削除します。SsDNA で組み立てるものなどいくつかの要因は切除機械エンゲージに後時点で募集して時間 (参照してください図 1および参照4) そこに残る。
3. ライブ イメージング蛍光標識したタンパク質
- マイクロ照射細胞タイムラプス イメージングを実行します。病変に非常に急速に補充される、フレームあたり数秒が理想的ですが、獲得後 (例えば、切除要因)、破損している領域にローカライズする蛋白質のため可能性があります蛋白質は、高原が達成されるまで 1-2 分ごとを実行。
注: 漂白可能な限り避けるために、タンパク質損傷のサイトで募集が信号の定量化を妨げることは彩度を到達しないようにイメージ獲得のためのレーザー出力を最小化し、その後分析 (データの分析を参照してください。セクション 4)。63 X 提示システムで行われていたイメージング/1.4 油客観的 8 μ s/ピクセル滞留時間、解像度 1,024 × 1,024、1 X ズームを使用して、2 の平均します。これらのパラメーターが他のシステムや異なる実験用に最適化する必要があることに注意してください。 - マイクロ照射 15 30 セルのカイネティクス測定まで追加のフィールド内のセルを取得します。精度と募集動態の再現性を確保するため生物的複製の少なくとも 3 回実験を繰り返します。
注: 特定の共焦点システムにこのプロトコルを適用するときことができます知られている蛍光標識したゲノム維持因子の募集速度を監視することによって開始する (例えば、53BP1 GFP RPA32 GFP 等)。マイクロ照射条件を最適化するライブ イメージングを使用すると、急速に複数のパラメーターをテストするユーザーができます。
4. 募集動態解析
- フィジー画像解析ソフトウェア11Microirradiation 解析プラグイン10をインストールします。
-
フィジーで取得した画像を開きます。Microirradiation 解析スイートのプルダウンのプラグイン メニューから「損傷アナライザー」を選択します。各マイクロ照射セルの利子 (ROI) (通常 3 x 3 μ m)、および非照射と照射・ ロワの背景領域を定義する画面の指示に従ってください。
- 潜在的なバイアスを最小限に抑えるために同じサイズの使用・ ロワは、信号強度を意味します。取得した画像は、ベースラインとしてマイクロ照射のサイトで募集を監視するために使用が、少なくとも 1 つの予備照射フレームを含めるも。
- 投資収益率のすべてのデータが完全にコマ撮りシリーズ以上収集されると、csv (コンマ区切りファイル) または txt (タブ区切りファイル) として結果を含むプラグインによって作成されるファイルを保存します。このファイルには、各時点の各 ROI (意味強度の背景、意味強度非照射および強度の照射の意味) 平均強度の測定が含まれています。
注: プラグインは自動的にバック グラウンド強度を減算 (私b) 照射された陰影の強度から (私s) と非照射・ ロワ (私n)。また、退色 (照射/非照射) を補正するため両方の値 (下記参照) の比率を計算します。
プラグインはまた最初の時点 (値 1 に設定) とすべての正規化を計算各核 (最初の時点を基準にして比) 他の時間ポイント。プラグインのウェブサイト10で追加情報を見つけることができます。
-
すべてマイクロ照射細胞 (少なくとも 15-30 セル) のプラグインを使用して分析を実行し、時間をかけてマイクロ照射領域の相対的な強化の平均をグラフ化します。各データの平均値の標準誤差をポイントし、プロットを計算します。
- 学生のtを実行することによって 2 つの実験条件の募集動態の違いを確認-各データ ポイントのテスト。
5. 場合プロトコル
-
場合ソリューションを準備します。ソリューション extraction 事前準備 (0.25% を含む冷たい 1 × PBS トリトン X-100)、ソリューションの洗浄 (0.05% を含む 1x PBS トゥイーン 20)、ソリューションをブロック (3 %bsa および 0.05% を含む 1x PBS トゥイーン 20) と (3% + ショ糖 2% パラホルムアルデヒドの固定の解決PBS 1 で x) ポリプロピレンの円錐管に。
メモ: 単一 8 ウェル microslide 前/後 extraction 溶液 50 mL 洗濯ソリューション、ブロッキング溶液 10 mL、5 mL の固定の解決の 10 mL が必要です。- 固定の解決を準備します。
- 化学のフードの下でパラホルムアルデヒドの 15 g と 30 μ L を 1 L の三角フラスコに 10 N NaOH の二重蒸留水 (ddH2O) の 400 mL を混ぜます。
- 完全に、パラホルムアルデヒドの可溶化攪拌しながらコンテナーと磁性攪拌器ホット プレート上 65 ° C で熱を閉じます。
- 25 mL のピペットを使用して、PBS、攪拌、および 0.45 μ m のフィルターを使用してフィルター X 10 の 50 mL を追加します。
- ショ糖の 10 g を追加し、ddH2o. と 500 mL に完了
- 15 mL コニカル管; のソリューションの約数使用するまで-20 ° C で保存します。
- 染色液 1 mg/mL の 1x PBS で 4, 6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI) 縮尺の原液を希釈して核を準備します。
- 固定の解決を準備します。
- マイクロ ピペットを使用して、マルチも顕微鏡のスライドやプレートの井戸からメディアを慎重に取り外し、すぐに 2 回待つことがなくソリューションを変更する場合は洗浄液の 500 μ L で洗ってください。
注: ここで示した場合データは洗浄され、すべてのソリューションを 500 μ l 添加培養 8 ウェルの顕微鏡スライドで育った細胞を使用して得られました。ボリュームは、実験者によって使用される細胞培養容器によって調整する必要があります。さらに、細胞がガラス/樹脂底からデタッチできます簡単に、細心の注意でもしプロトコルを実行します。セル損失を最小限に抑えるためにすべてのソリューションの変更のピペットを使用します。 - 氷上インキュベート ソリューション extraction 前と 15-30 s 前の抽出を実行するための手によって優しく旋回ステップする場合冷たい 500 μ L で 5 分最も細胞質および核質の蛋白質を削除し、クロマチンから信号を最大化/DNA 関連の要因。
- 500 μ L の場合は洗浄液で 2 回洗浄します。
- 場合の固定の解決の 500 μ L に室温で 15 分間インキュベートします。また、固定ステップの既製パラホルムアルデヒド溶液 (3-4%) を使用します。
- 500 μ L の場合は洗浄液で 2 回洗浄します。
- 冷たい場合はプリ/ポスト extraction ソリューションの 500 μ L で 5 分間氷の上を孵化し、透過ステップを実行する手で優しくスライドを渦します。
- 500 μ L の場合は洗浄液で 2 回洗浄します。
- ブロッキング液の場合の少なくとも 30 分間 500 μ L で室温で孵化させなさい。
- マイクロ ピペットを使用してブロッキング液を削除し、ソリューションをブロックで希釈した 250 μ L 一次抗体と 4 ° C で加湿チャンバーで一晩インキュベートします。
注: の共局在の潜在的な人工物を避けるために順番に一次抗体の孵化を実行ことをお勧めです。適切なコントロールを実行すると、同時に、プロセスをスピードアップする一次抗体をインキュベートします。 - 4 回穏やかな攪拌 (上 60 rpm) の場合は洗浄液の 500 μ L で 5 分間洗ってください。
- 加湿チャンバーでブロッキング液で希釈した二次抗体の 250 μ L で 37 ° C で 1 時間インキュベートします。
注: は、蛍光標識した二次抗体の添加によって光からサンプルを保護します。 - 穏やかな攪拌の場合洗浄液 500 μ L にそれぞれ 5 分間で 4 回を洗浄します。
- 1x PBS 1 μ G/ml の核を染色 DAPI を含む 500 μ L で 5 分間室温でインキュベートします。
- 500 μ L の 1x PBS で 2 回洗浄し、細胞イメージングのための PBS ソリューション x 1 の 500 μ L のまま。
- グリッドのスライドまたは登録ステージ位置を使用して、検索よ特徴付けられた DNA 損傷マーカーを用いたマイクロ照射細胞 (例えばγ-H2A.X、RPA32、等)。
- ウェル文化スライドまたはレーザー走査型共焦点顕微鏡の適切な設定を使用してすべての関連するチャンネルのプレートをイメージします。
注: 示されたシステムのイメージングは 63 X で行われました/1.4 油客観的 8 μ s/ピクセル滞留時間、解像度 1,024 × 1,024、1 X ズームを使用して、2 の平均します。これらのパラメーターが他のシステムや異なる実験用に最適化する必要があることに注意してください。
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Representative Results
次のマイクロ照射細胞はゲノム維持蛋白質1,12の性質によっては時間の特定の期間の回復が許可されます。Dsb は RPA と他のゲノム維持要因9によってコーティングされて急速に ssDNA の限られた領域を作成する、細胞周期の S および G2 段階の最も広く、核酸分解酵素によって処理されます。この ssDNA 領域は募集と他の DDR 要因13の交換を規制する DDR の中に広く変更されるクロマチンに囲まれています。場合によってマイクロ照射領域にタンパク質募集を監視できます (図 1 a)。通常、クロマチン関連要因 (例えばγ-H2A.X、53BP1など) は以前 (1-5 分) で検出時間 ssDNA 結合蛋白質よりポイント DSB 端のヌクレアーゼを介した切除 RPA ssDNA プラットフォームを生成する必要があるため(≥10 分)。画像解析と文書を容易にする我々 はフィジー スクリプト (、アウトライン表示)10自動的にチャネルを使用して DNA 色素関連付けられている (例えばDAPI)、細胞核の概要を考案したマイクロ照射を区別しやすくストライプと uninformative DNA 染色最終的なイメージから核の定義 (図 1 b) を維持しながらうちを残すことによって個々 のセル。
Γ H2A.X と RPA 複雑な亜単位は、それぞれクロマチンに ssDNA 関連要因のためマーカーとして機能します。RPA ssDNA は γ H2A.X 抗体 (図 1) で飾られた大きな蛍光クロマチン ストライプに囲まれた点状の巣として表示されます。これらのマーカーとの共局在は、ゲノム維持要因 DNA 病変の位置を正確に定義する使用ことができます。例えば、γ H2A.X 信号13とともに共同 53BP1、DSB 修復経路選択を制御するクロマチン関連タンパク質をローカライズします。逆に、PRP19、RPA32 配布14,15,16,17 に密接に一致する点状の巣として ATR 活性化と DNA 修復を促進する RPA ssDNA の機能を採用、E3 ユビキチンリ ガーゼ(図 1)。ノートでは、いくつかの要因初期病変に隣接するクロマチンにまた募集されるが、γ H2A.X と 53BP1 のような Dsb を囲む大規模なドメインに流さないように。この場合において、これらの要因点状焦点としてが一本鎖 Dna 結合蛋白質と完全に共同ローカライズはしないします。
ライブセル イメージング、細胞の蛍光マーカーが付いたポイを表現することができるマイクロ照射し、リアルタイムでイメージング高度を取得する詳細な募集動態 (図 2 a-C)。蛍光ラベルは互いからスペクトル分離できること、複数の異なった蛋白質を同時に観察できます。我々 は時系列情報 (ムービー メーカー、見る映画オンライン補足資料として図 2の) を含む映画ファイルを生成する、タンパク質を定量化するユーザーを許可する 2 つのフィジー スクリプトを作成した時系列の解析を容易にするには、マイクロ照射サイト (損傷アナライザー)10で募集。通常タンパク質の挙動を記述するために必要な時間のかかる手動画像キュレーションではなく損傷解析スクリプト ガイド マイクロ照射しながら自動的にサイトで信号濃縮を監視する合理化された手順をユーザー細胞運動の補正、画像ドリフト、バック グラウンド信号、および漂白すべての時に実験のポイント。生成されたデータが簡単にスプレッドシート アプリケーションにコンパイルし、必要な (図 2 D) としてプロットします。
図 1:クロマチンとマイクロ照射誘起病変で RPA ssDNA プラットフォームに因子のゲノム維持局在。(A) 事前に感作細胞におけるレーザー マイクロは切除によって遠藤- とエキソ-核酸 ssDNA を生成する DNA 二重鎖の切断の生産に 。SsDNA 林小班は、複製タンパク質 A に対する抗体または他の ssDNA ローカライズの要因を使用して点状の巣として視覚化できます。対照的に、タンパク質や大規模なクロマチン ドメインに広がって変更マイクロ照射サイト ターゲットにリン酸化ヒストン異型 H2A 抗体で観測されたパターンと同様でより大きいストライプとして表示されます。X (Γ-H2A.X)。BBET (B) 細胞が前感作または BrdU マイクロ照射、あらかじめ抽出した、固定、および示された蛋白質のステンド グラス。12 ビット画像 1 X ズームで採集し、アウトライン フィジー スクリプトを使用して処理されます。一本鎖 Dna とクロマチン関連要因 (最大強度 Z 投影表示) の解像度 (C) Z - BBET または BrdU 前感作細胞のスタッキングが可能します。(D) 使用、クロマチンに ssDNA 関連ゲノム維持要因としてすることができますこのメソッド、53BP1 と PRP19 分類それぞれ。スケール バー = 10 μ m;D の画像、すべて同じ規模です。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: DNA 損傷のサイトに RPA 複雑な募集ライブ イメージングします。(A) 安定または一過性トランスフェクション transfected セルのマイクロ照射蛍光レポーターが付いた候補タンパク質をコードするプラスミドの DNA 傷害リアルタイムに蛋白質の募集モニタリングを可能にします。(B) 細胞は pDEST47 RPA32 GFP プラスミドを導入させたし、後 24 h を分離します。蛋白質の表現は、法によって確認されました。PDEST SFB EGFP 発現する (C) 細胞または pDEST47 RPA32 GFP プラスミド BrdU で事前に感作されたマイクロ照射し、分照射後 1 回 1 X ズームで 12 ビットでイメージします。タイミングは、分照射後です。00時 00分時間のポイント画像は、マイクロ照射前に撮影されました。動画ファイルは、ムービー メーカー フィジー スクリプトを使用して作成された、キー フレームが表示されます。スケール バー = 10 μ m. (D) RPA32 募集-マイクロ照射のストライプに GFP が定量的損傷アナライザー フィジー スクリプトを使用して監視します。出力データは、Microsoft Excel を使用してプロットしました。黒い線予備照射信号に対してマイクロ照射地点 RPA32 GFP の平均濃縮倍であり誤差が 15 の独立してマイクロ照射細胞の平均の標準誤差を表します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
映画 1: マイクロ照射 SFB GFP 発現細胞タイムラプス。PDEST SFB GFP プラスミドをトランスフェクトした一過性細胞であった BrdU, マイクロ照射と 29 分の毎分 1 回イメージの刷 24 hこの映画をダウンロードするここをクリックしてください。
映画 2: マイクロ照射 RPA32 GFP 発現細胞タイムラプス。PDEST47 RPA32 GFP プラスミドをトランスフェクトした一過性細胞であった BrdU, マイクロ照射と 29 分の毎分 1 回イメージの刷 24 hこの映画をダウンロードするここをクリックしてください。
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Discussion
上記の方法を使用すると、照射済み BBET または BrdU で感作細胞 - 405 nm レーザー マイクロは付着性細胞の核内で DNA 性病 Dsb のローカライズされた世代をことができます。これらの Dsb で DDR の速度は、真核細胞9,18,19の他のメソッドで生成されたものに似ています。マイクロ照射サイトで DSB 切除は ssDNA 世代 RPA32 を対象とした抗体または RPA32 GFP 融合を使用して続くことができるに します。その一方で、クロマチン関連要因は、参照として γ H2A.X を使用に配置できます。クロマチン関連要因は γ H2A.X と同じくらい初期の DSB から広がる可能性がありますいない、一本鎖 Dna 結合蛋白質の巣とは異なることができる点状の巣として表示されます。
Dsb が生成され、タンパク質募集と被害サイトからのクリアランスは、固定セルに IF を監視できます。これらの実験を実行すると、POI に対して適切な場合抗体のみが必要です。特定のエピトープを持つフレームに興味のある遺伝子を運ぶプラスミッドを設計することができる場合互換性のある抗体が利用できない場合 (例えば: フラグ、タグ) や蛍光タンパク質。付着性のセルにこれらのプラスミドの一時的または安定したトランスフェクション/伝達は、特定の要因は DNA を損傷する積極登用かどうかを決定する使用できます。蛋白質の過剰発現は誤ローカリゼーションにつながることができ、人工的にマイクロ照射のストライプに採用を後押しするかもしれない。内因性のタンパク質の代表は、結果を得るに CRISPR Cas9 技術今使用できます日常的に適切なエピトープ20,21興味の任意の遺伝子にタグを付ける。
マイクロ照射分析フィジー プラグインで説明する Python スクリプトでは、可視化、プレゼンテーション、文書、および DDR 蛋白質動力学の解析を促進します。この分析パッケージはオープン ソースありマイクロ照射実験と画像の取得を実行するために使用する顕微鏡プラットフォームに関係なく機能。必要なは、バイオ フォーマット互換性ファイル22として顕微鏡プラットフォームで撮影した画像を保存することです。背景、以来漂流、および修正を漂白は自動的に行われる、指定されたスクリプトと DNA 損傷部位でのタンパク質レベルの解析は簡単で、非常に高速で実行される一般的な手動信号の定量化と比較して顕微鏡画像集録ソフトウェア。
プロトコルに従って、ユーザーする必要があります慎重にスキャンを構成、それぞれレーザー - 損傷の適切な量を達成して通常 DDR 反応速度論に従ってください Dsb を誘導するために共焦点顕微鏡システム。確かに、数量とマイクロ照射による DNA 損傷のタイプは、レーザーの波長および線量に関する前感作の方法に依存します。Dsb は、ここで説明した条件によって生成される、にもかかわらず、405 nm レーザー マイクロ照射の光増感酸素化細胞も cyclopyrimidine ダイマー (チミン) SSBs を含む他の DNA 損傷の混合物を生成する心に留めておくと酸化拠点、顕微鏡システム、設定23,24,25の間で異なります。したがって、発生した損害と誘発される応答の包括的な画像を取得する実行する必要マイクロ照射サイトで病変を注意深く監視します。重要なは、Dsb への応答を研究する各顕微鏡システムを標準的な DNA 損傷タンパク質とマイクロ照射のサイトで翻訳後修飾の速度を監視することにより最適化してください。Γ H2A.X と RPA の複雑な亜単位 (RPA70、RPA32 または RPA14) を使用できますたとえば、Dsb で彼らは検出するは非常に簡単、便利にそして急速に蓄積します。親指のルールとして γ H2A.X 信号は、初期 (5 分) でストライプとして視覚化する必要があります、後期 (3-4 h まで) 時間後損傷を指すは、RPA は点状の巣として蓄積を始めるべきであるに対し約 10-15 分後-微小照射。パン核 γ H2A.X 信号を観察すると、細胞によって受け取ったエネルギーの量は非生理的し、急速な細胞死になります。
特定の DNA 修復経路の研究に 405 nm のレーザーを使用する場合に考慮しなければならないいくつかの制限があります。たとえば、BBET 405 nm 組み合わせ容易に SSBs と Dsb の組み合わせから生成される、6-4 光合成 (6-4 PPs) は生成しません、したがって、ヌクレオチド除去修復タンパク質の募集の速度はそれらと異なっています。UV-C マイクロ照射を用いて観察.動態と Dsb に応答に関与する様々 な蛋白質の募集の範囲も23使用されているメソッドの損傷 DNA によると異なる場合があります。これらの変化のため、ユーザーがそのランドマークで認識される可能性のある病変のタイプを最大化するために、システムを適応させることをお勧めします。このようなシステムはより少なく広く利用できるが、他の種類を使用して UV-A を含む (337-355 nm) レーザーやフェムト秒近赤外 (800 nm) 別作試薬と共に (例えば: トリ メチル ソラーレン) の詳細を生成することできますDNA によって特定の DNA 損傷修復研究24,26経路です。
新しい条件がテストされているたびに、用量、波長、および前の増感剤の組み合わせをテストするのには、目的の病変を効率的に生成することを確保するために確立された DNA 修復タンパク質の蛍光標識を使用すると便利です。たとえば、化における PARP1 と XRCC1 SSB と基礎切除修理のためマーカーとして機能することができます、XPA はヌクレオチド除去修復の良い指標、53BP1 は Dsb と非相同末端結合 (23,25 を参照機能を募集 ,,2728)。DNA のレベルを定量化する DNA 損傷の特定の種類に関連付けられている変更を使用もことができますを認識する抗体は付加体や休憩します。それはこうして Dsb (γ H2A.X、53BP1) 場合、SSBs (ポリ ADP リボース抗体を使用)、6-4 PPs cyclopyrimidine ダイマー酸化基地を監視し、目的病変23,の最高レベルを達成するためのパラメーターを決定することが可能27,29. を注意深く観察、ユーザーはマイクロ照射を使用して興味の彼らの修復経路を研究することができるはず。
完全にローカライズされた偏向を生成する 405 nm レーザー ラインを装備広まったレーザー走査型共焦点顕微鏡の使用は併用サブ分類ゲノム維持要因、および合理化されたデータ プラットフォーム固有 DNA 損傷マーカーマイクロ照射解析フィジー プラグインの助けを借りて処理、描画経験の両方にアクセスの可能なより DDR 要因ダイナミクスの研究とゲノム メンテナンス フィールドの初心者捜査します。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
この作品は、自然科学および工学研究審議会のカナダ [朝発見グラント 5026]、次世代がん研究会 [朝 21531] から科学者奨学金のサポートされていました。ジャン ・ フランソワ ・ Lucier にありがとう統計分析にフィジー Python スクリプトやアドバイスの優秀な品質管理を提供します。もし固定ソリューション レシピありがとう博士ステファニー A. Yazinski。レーザー パワー測定のヘルプありがとうポール リュドヴィク化のパターン。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Olympus FLUOVIEW FV3000 resonant laser scanning confocal microscope | Olympus | ||
| FluoView FV3000 software (version 2.1) | Olympus | ||
| 405 nm laser | Coherent | Radiation source | |
| Microscope incubator AIO-UNO-OLYUS-1 | Okolab | OKO-UNO-1 | |
| 60X /1.4 Objective | Olympus | Oil immersion objective | |
| 8-well culture slides on coverglass (X-well) | Sarstedt | 94.6190.802 | |
| U2OS osteosarcoma human cell line | ATCC | HTB-96 | Stable cell lines |
| 4’,6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) | ThermoFisher | D1306 | Caution toxic |
| 5-bromo-2′-deoxyuridine (BrdU) | Sigma-Aldrich | 59-14-3 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 30525-89-4 | Caution toxic |
| Bisbenzimide H 33342 (Hoechst 33342) | ThermoFisher | 62249 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | ThermoFisher | BP1600-100 | |
| Trypsin EDTA 0.1% | ThermoFisher | 15400-054 | |
| Triton X-100 | BioShop | TRX777.100 | |
| Tween-20 | ThermoFisher | BP337-500 | |
| Sucrose | BioShop | SUC507 | |
| JetPRIME transfection reagent | Polyplus | 114-07 | |
| ProLong Diamond Antifade mountant with DAPI | ThermoFisher | P36962 | |
| DMEM 1X, + phenol red | Wisent | 319-005-CL | |
| DMEM 1X, - phenol red | Wisent | 319-051-CL | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Wisent | 080-150 | |
| Mouse anti-RPA32 antibody | Abcam | ab2175 | 1:500 for IF |
| Rabbit anti-γ-H2A.X antibody | Cell Signaling | 9718S | 1:500 for IF |
| Rabbit Anti-53BP1 antibody | Cell Signaling | 4937S | 1:500 for IF |
| Rabbit Anti-PRP19 antibody | Abcam | ab27692 | 1:500 for IF |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 647 | Cell Signaling | 4414S | 1:250 for IF |
| Goat anti-mouse IgG Alexa Fluor 488 | Cell Signaling | 4408S | 1:250 for IF |
| Fiji image analysis open-source software | https://fiji.sc | ||
| 1918-K Power meter with a 918D-SL-0D3 sensor | Newport |
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