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Genetics

Investigação de recrutamento de proteína para lesões de DNA usando 405 Nm Laser Microirradiação

Published: March 20, 2018 doi: 10.3791/57410
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1, 1, 1
1Department of Biology, Université de Sherbrooke
* These authors contributed equally

Summary

Estudar a cinética de reparação de danos de DNA requer um sistema para induzir lesões em regiões definidas do sub nucleares. Nós descrevemos um método para criar quebras de dupla-hélice localizadas usando um microscópio confocal de varredura a laser equipado com laser 405 nm e fornecer procedimentos automatizados para quantificar a dinâmica dos fatores de reparação para essas lesões.

Abstract

A resposta de danos de DNA (DDR) usa uma infinidade de proteínas para detectar, sinalizar e reparar lesões do ADN. Delinear essa resposta é fundamental para entender os mecanismos de manutenção do genoma. Desde o recrutamento e a troca de proteínas em lesões são altamente dinâmicos, seu estudo requer a capacidade de gerar danos ao DNA de uma forma rápida e espacialmente delimitado. Aqui, descrevemos procedimentos para induzir localmente o dano de DNA em células humanas, usando comumente disponível-varredura a laser confocal microscópio equipado com uma linha de laser 405 nm. Acumulação de manutenção do genoma fatores em listras do laser podem ser avaliadas por imunofluorescência (IF) ou em tempo real usando proteínas com repórteres fluorescentes. Usando fosforilada histona H2A. X (γ-H2A.X) e replicação proteína A (RPA) como marcadores, o método fornece resolução suficiente para discriminar os fatores recrutados localmente daqueles que se espalham na cromatina adjacente. Nós fornecemos mais scripts baseados em ImageJ para monitorar eficientemente a cinética de relocalization de proteína no DNA danificar sites. Estes refinamentos simplificam muito o estudo da dinâmica da DDR.

Introduction

As células estão constantemente expostas a fontes endógenas e exógenas de dano do ADN que ameaçam sua integridade genômica. O DDR é um conjunto de caminhos que detectam, sinalizar e reparar lesões do ADN para sustentar a estabilidade do genoma de sinalização. Em quebras de dupla-hélice do DNA (DSBs), a DDR ocorre principalmente em duas plataformas complementares: cromatina γ-H2A.X-rotulado e uma região de DNA (ssDNA) single-stranded ressecada normalmente revestidos com a vinculação ssDNA complexo RPA1,2.

UV-laser microirradiação de células pré-sensibilizadas com a timidina análogo 5-bromo-2' desoxiuridina (BrdU) ou a tintura de DNA bisbenzimide Etóxido trihydrochloride (BBET, Hoechst 33342) cria uma mistura de lesões do ADN incluindo (single-stranded quebras SSBs) e DSBs que eliciam uma DDR localizada sobre a cromatina e o ssDNA plataformas3,4. Trabalhos anteriores mostraram que pode ser discriminado recrutamento dos fatores de manutenção do genoma para essas duas plataformas distintas no DSB usando laser de UV-A de alta energia (335-365 nm) combinado com IF2,5. Microscópios equipados com tais lasers são caros como eles exigem um laser de alta energia e dedicados UV-A transmissão objetivos tornando-os muito menos prevalente em contextos acadêmicos e farmacêuticos que microscópios confocal de varredura a laser com laser de 405 nm linhas. O estudo de recrutamento de proteína e troca em locais irradiados micro também é impedido pela análise de imagem manual laborioso necessária para descrever o comportamento dinâmico dos fatores de manutenção do genoma.

Aqui, nós mostramos que o pre-sensibilização das células com mancha de ácido nucleico BrdU ou BBET seguido usando microirradiação laser 405 nm em um microscópio confocal comum permite o monitoramento da dinâmica de fator de manutenção do genoma em lesões do ADN. Usar o γ-H2A.X ou subunidades complexas RPA como marcadores de plataforma juntamente com z-empilhamento para maior profundidade de campo e deconvolução para melhor resolução permite discriminar os fatores que são recrutados localmente para DSBs daqueles que se espalhou para o experimentador domínios de cromatina grande ao redor da lesão inicial. Esta sub classificação de acordo com distintos compartimentos intra nucleares ajuda a refinar as funções potenciais de proteínas descaracterizadas recrutadas para sites micro irradiados. Além disso, fornecemos protocolos convenientes e otimizado de gasodutos para analisar rapidamente a dinâmica dos fatores de manutenção do genoma usando o software open-source Fiji (uma distribuição ImageJ)6,7,8. Estes refinamentos para métodos atuais de microirradiação processam o estudo da DDR possível em praticamente qualquer configuração de laboratório.

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Protocol

1. pré-sensibilização das células

  1. 24 h antes do experimento de microirradiação, 40.000 células de U2OS por bem em 1 x DMEM contendo 10% FBS na cultura 8 poços desliza com fundos de 170 µm de espessura da lamela, como vidro/polímero para garantir máxima transmitância de 405 nm laser de luz e excelente imagem da semente com uma varredura a laser confocal microscópio invertido. Se usar um microslide 8 poços, use 500 µ l de soluções de mídia ou por alvéolo para todos os tratamentos subsequentes e as etapas de lavagem do protocolo.
    Nota: Devido a sua morfologia plana, boa aderência e grandes núcleos, células de U2OS facilitam a detecção de recrutamento de proteína em locais irradiados micro, mas outros tipos de células aderentes podem ser usados quando necessário. Células, idealmente, devem ser de cerca 80% irradiados de confluência no momento da microirradiação para aumentar o número de células por experiência. Confluência de muito alta pode resultar em alterações de ciclo celular que podem perturbar a vias de reparação específica como a recombinação homóloga, que ocorre durante as fases S e G2 do ciclo celular9.
  2. Incubar as células durante a noite a 37 ° C, com 5% de CO2e em seguida pre-sensibilizar as células com (etapa 1.3) BrdU ou (etapa 1.4) BBET (Hoechst 33342).
    Nota: Para observar ao recrutamento de uma proteína de interesse (POI) para lesões do ADN, transfect ou transduce Plasmídeo carregando uma fusão entre uma proteína fluorescente e POI 24 h após a semeadura da célula. 24 h pós-transfection/transdução, pre-sensibilizar e microirradiar as células para monitorar o recrutamento do POI em locais de dano de DNA em tempo real.
  3. Para aumentar o número de DSBs gerados pela exposição ao laser 405 nm, adicione 10 µ m de BrdU aos meios de comunicação para 24 h antes da microirradiação. Antes da microirradiação, utilizando uma micropipeta, enxágue as células duas vezes com meio sem vermelho de fenol para garantir a máxima exposição das células ao laser 405 nm.
  4. Alternativamente, tratar células por 15 min com BBET a 10 µ g/mL em meio adequado em uma incubadora de cultura de células a 37 ° C. Após o tratamento, lave duas vezes com meio sem vermelho de fenol antes da microirradiação.

2. microirradiação de células

  1. Selecione um apropriado microscópio confocal de varredura a laser.
    Nota: As experiências aqui apresentadas foram realizadas em um sistema de microscópio equipado com uma 50 mW 405 nm laser de linha e um objectivo de óleo 63 X 1.4 abertura numérica. Para gerar DSBs, células foram irradiados micro em 1 X zoom de varredura com 1.024 x 1.024 pixels/campo (0,21 µm/pixel na ampliação de X 63) e no modo unidirecional em 8 µs/pixel. A potência do laser usada foi de 25% e 80% para as células de BBET - e BrdU-pré-sensibilizadas, respectivamente. Para ajudar os usuários a configurar o seu sistema, o post-objetivo de potência do laser no sistema apresentado foi medido usando um medidor de energia de acordo com as instruções do fabricante. As medidas correspondem a 2,6 mW e 7,0 mW para BBET - e BrdU-pré-sensibilizadas células, respectivamente.
  2. Ligue a câmara ambiental e o microscópio.
    1. Defina a câmara para 37 ° C com 5% CO2 antes de amostras são colocadas na incubadora no palco para evitar estresse desnecessário para as células e para garantir a homogeneidade cinética DDR em experimentos.
  3. Selecione o campo (s) com células bem-distribuído, ajustar o foco e registrar sua posição para facilitar a aquisição de imagens após o protocolo do IF. Adquira pelo menos uma imagem que servirá como um ponto de referência de pré-dano para monitorar a cinética de recrutamento de proteínas após a irradiação de micro.
    Nota: Vasos Gridded cultura também podem ser usados para facilitar a localização das células micro irradiados em etapas subsequentes.
    1. Para experiências de se usando células BBET-etiquetadas, ajuste o foco sobre células usando o 405 nm laser ao mais baixo do laser o poder suficiente para visualizar as células, a fim de evitar injustificado dano do ADN.
      1. Evite usar widefield fluorescência para ajustar o foco sobre células manchadas de BBET como a luz UV emitida pela lâmpada irá induzir dano de DNA em locais iluminados.
    2. Se usando células BrdU-etiquetadas, ajuste o foco usando o contraste de interferência diferencial (DIC) ou imagens de contraste de fase olhando para sub nucleares características tais como nucléolos.
    3. Se usando células expressando fluorescente-etiquetadas POIs, selecione um plano focal com intensidade de fluorescência representativa.
      Nota: Evite as células que expressam níveis muito elevados do POI como forte superexpressão pode resultar em localização diferente. Além disso, selecione as células que expressam o POI em níveis comparáveis (seleção de clones estáveis é altamente recomendável para minimizar as variações nos níveis de expressão e o recrutamento de POI).
  4. Configure o microscópio para a etapa de microirradiação usando a recuperação de fluorescência após Module fotobranqueamento (FRAP) do sistema.
    Nota: Os parâmetros mais importantes a considerar ao criar o sistema de microscópio para microirradiação experimentos são: a potência de saída do laser 405 nm, número de iterações (i.e., número de vezes que o laser irá percorrer as mesmas coordenadas), número de pixels/campo (63 X ampliação e resolução de 1.024 x 1.024, 1 pixel = 0,21 µm) e o tempo de permanência por pixel. Todos esses fatores impactarão a quantidade de energia que as células de experiência e, portanto, o tipo e quantidade de DNA danificam gerado (ver discussão para mais informações de otimização de dose).
  5. Usando o módulo FRAP do sistema microscópio, microirradiar as células.
    Nota: Na maioria dos sistemas, microirradiação de várias células pode ser realizada em um único campo como pontos ou linhas/retângulos (tipicamente 1-2 µm de largura). Ao realizar imagens ao vivo de proteínas fluorescente-labeled imediatamente pós-danificar, limitar a microirradiação para um pequeno número de células por campo, porque o tempo tomado para microirradiar cada célula irá resultar em uma indução atrasada da DDR. Isto é particularmente importante quando as proteínas que são recrutadas muito rapidamente de lesões do ADN de monitoramento.
  6. Após a microirradiação, devolver o bem vários slides ou placas na incubadora a 37 ° C com 5% de CO2 para a duração necessária antes do processamento de amostras para se (secção 5) ou proceder de imediato com imagens ao vivo (secção 3).
    1. Como primeiro passo, consertar as células dentro de alguns minutos e até alguns pós-irradiação de horas para o protocolo de IF. Dependendo do POI, cinética de recrutamento pode variar. Normalmente, as proteínas que estão associadas a cromatina em DSBs e SSBs irão localizar rapidamente com a lesão em às vezes são removidas dentro de 5 min. Alguns fatores tais como aquelas que se reunir no ssDNA serão recrutados em pontos de tempo mais tarde uma vez que a maquinaria de ressecção tem-se empenhado e permanecem lá por horas (ver Figura 1 e referência4).

3. viver de imagem de proteínas fluorescente-labeled

  1. Execute o lapso de tempo de imagem das células micro irradiados. Para proteínas que são recrutadas muito rapidamente a lesões, alguns segundos por quadro serão ideal, mas para proteínas que localizar a área danificada mais tarde (por exemplo, ressecção de fatores), a aquisição podem ser realizada a cada 1 – 2 min até um platô seja alcançado.
    Nota: Minimizar a potência do laser para aquisição de imagem para evitar descoramento tanto quanto possível e para garantir que recrutamento de proteína em locais de dano não alcança saturação que impediria a quantificação do sinal e análises subsequentes (ver a análise de dados Secção 4). No sistema apresentado, a imagem foi feita com um 63 X 1.4 óleo objetiva usando um tempo de pausa de 8 µs/pixel, resolução de 1.024 x 1.024 1 X zoom e uma média de 2. Observe que esses parâmetros podem precisar de ser otimizado para outros sistemas e/ou experiências diferentes.
  2. Microirradiar as células em campos adicionais até medições cinética são obtidas por 15-30 células. Repeti os experimentos pelo menos 3 vezes em repetições biológicos para garantir a precisão e a reprodutibilidade da cinética do recrutamento.
    Nota: Quando adaptar este protocolo para um sistema específico de confocal, pode ser útil iniciar, monitorando a cinética de recrutamento de um fator de manutenção do genoma conhecido fluorescente-etiquetadas (por exemplo, 53BP1-GFP, RPA32-as boas práticas agrícolas, etc.). Usar imagens ao vivo para otimizar as condições microirradiação permitirá ao usuário testar vários parâmetros rapidamente.

4. recrutamento cinética análise

  1. Instale o plugin de análise Microirradiation10 no de software de análise de imagem Fiji11.
  2. Abra as imagens adquiridas em Fiji. Selecione "O analisador de danos" no menu suspenso plugins na suíte de análise Microirradiation. Siga as instruções para definir uma região de fundo de interesse (ROI) (normalmente 3 x 3 µm) e ROIs irradiados e não irradiados em cada célula micro irradiados.
    1. ROIs de uso do mesmo tamanho para minimizar potenciais vieses nos dizer intensidades de sinal. Para imagens adquiridas, também incluem pelo menos um quadro de pre-irradiação que será usado como base para monitorar o recrutamento em locais irradiados micro.
    2. Uma vez que foram coletados durante o lapso de tempo completo de todos os dados ROI, salve o arquivo criado pelo plugin que contenha o resultado como um txt (arquivo delimitado por tabulação) ou csv (arquivo delimitado por vírgula). Este arquivo contém as medições de intensidade média para cada ponto de tempo e cada ROI (quer dizer fundo de intensidade, significa intensidade não irradiados e significa intensidade irradiada).
      Nota: O plugin automaticamente subtrai a intensidade de fundo (eub) da intensidade do ROIs irradiado (eus) e o não irradiados ROIs (eun). Ele também calcula uma relação entre os dois valores (ver a fórmula abaixo) para corrigir para fotobranqueamento (irradiada/não-irradiados).
      Equation 1
      O plugin também calcula uma normalização entre o primeiro ponto do tempo (valor definido como 1) e todos os outros pontos de tempo para cada núcleo (proporção em relação ao primeiro ponto de tempo). Informações adicionais podem ser encontradas no site plugin10.
  3. Realizar a análise usando o plugin para todos irradiados micro células (pelo menos 15-30) e o enriquecimento relativo médio em irradiados micro regiões ao longo do tempo do gráfico. Calcule os erros-padrão da média para cada dados aponte e parcela-las.
    1. Confirmar as diferenças na cinética de recrutamento entre duas condições experimentais através da realização do aluno t-testes para cada ponto de dados.

5. se protocolo

  1. Prepare soluções de IF. Preparar a solução de pré/pós-extraction (gelada 1X PBS contendo 0,25% Triton X-100), solução de lavagem (1X PBS contendo 0,05% Tween-20), solução de bloqueio (1X PBS contendo 3% de BSA e 0,05% Tween-20) e solução de fixação (paraformaldeído 3% + 2% de sacarose em PBS 1 x) em tubos de polipropileno cônicos.
    Nota: Para um único microslide 8 poços, 10 mL de pré/pós-extraction solução, 50 mL de solução, 10 mL de solução de bloqueio e 5 mL de solução de fixação de lavagem são necessários.
    1. Prepare a solução de fixação.
      1. Sob uma capa de química, misture 400 mL de água bidestilada (ddH2O) com 15 g de paraformaldeído e 30 µ l de NaOH 10 de N em um frasco de Erlenmeyer de 1L.
      2. Feche o recipiente e calor a 65 ° C, um prato quente de agitador magnético, agitando para solubilizar o paraformaldeído completamente.
      3. Utilizando uma pipeta de 25 mL, adicione 50 mL de PBS, agitar e filtro usando um filtro de 0,45 µm de 10x.
      4. Adicionar 10 g de sacarose e completar a 500 mL com DDQ2O.
      5. Alíquota da solução em tubos cônico de 15 mL; armazenar a-20 ° C até o uso.
    2. Prepare os núcleos coloração solução diluindo uma solução stock de 1 mg/mL de 4,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI) 1:1,000 em 1X PBS.
  2. Utilizando uma micropipeta, cuidadosamente, remova a mídia dos poços das placas ou lâminas de microscopia multi bem e lave imediatamente com 500 µ l de solução de lavagem se mudando a solução duas vezes sem esperar.
    Nota: Os dados se aqui apresentados foram obtidos usando células cultivadas em lâminas de microscopia de 8 poços que foram lavadas e incubadas em 500 µ l de todas as soluções. Volumes devem ser ajustadas dependendo dos recipientes de cultura celular usados por experimentadores. Além disso, execute o protocolo se com extremo cuidado, como células podem facilmente separar da parte inferior de vidro/polímero. Use uma micropipeta para todas as alterações de solução para minimizar a perda de células.
  3. Incubar no gelo por 5 min com 500 µ l de gelado se pre/post-extraction solução e redemoinho delicadamente à mão para 15 – 30 s realizar a pré-extração de passo que remove mais proteínas citoplasmáticas e auxílio e maximiza o sinal da cromatina / Fatores associados DNA.
  4. Lave duas vezes com 500 µ l de solução de lavagem se.
  5. Incube durante 15 minutos à temperatura ambiente em 500 µ l de solução de fixação se. Como alternativa, use uma solução de paraformaldeído pré-fabricados (3 – 4%) para a etapa de fixação.
  6. Lave duas vezes com 500 µ l de solução de lavagem se.
  7. Incubar no gelo por 5 min em 500 µ l de gelado se pre/post-extraction solução e agite o slide delicadamente à mão para executar a etapa de permeabilização.
  8. Lave duas vezes com 500 µ l de solução de lavagem se.
  9. Incube a pelo menos 30 min em temperatura ambiente com 500 µ l de solução de bloqueio se.
  10. Remover a solução de bloqueio utilizando uma micropipeta e incubar durante uma noite em uma câmara umidificada a 4 ° C com 250 µ l os anticorpos primários diluídos em solução de bloqueio.
    Nota: É recomendável realizar a incubação com os anticorpos primários sequencialmente para evitar potenciais artefatos de localização co. Uma vez que foram realizados controlos adequados, incube simultaneamente anticorpos primários para acelerar o processo.
  11. Lave-se quatro vezes por 5 min em 500 µ l de solução de lavagem se com agitação suave (60 RPM em rotacao).
  12. Incube durante 1 h a 37 ° C com 250 µ l de anticorpos secundários diluído em solução de bloqueio em uma câmara umidificada.
    Nota: Protege as amostras de luz sobre a adição de fluorescente etiquetado anticorpos secundários.
  13. Lave quatro vezes cada um por 5 min em 500 µ l de solução de lavagem se com agitação suave.
  14. Incube a temperatura ambiente por 5 min em 500 µ l de 1X PBS contendo 1 µ g/mL DAPI manchar núcleos.
  15. Lave duas vezes com 500 µ l de PBS 1x e deixar as células em 500 µ l de solução de PBS para a imagem latente de 1x.
  16. Usando slides em grade ou posições de estágio registrado, encontrar as células irradiadas de micro usando um marcador de dano de DNA bem caracterizado (e.g., γ-H2A.X, RPA32, etc.).
  17. Imagem da cultura multi bem slides ou placas em todos os canais relevantes usando as configurações apropriadas em um microscópio confocal de varredura a laser.
    Nota: O sistema apresentado, a imagem foi feita com um 63 X 1.4 óleo objetiva usando um tempo de pausa de 8 µs/pixel, resolução de 1.024 x 1.024 1 X zoom e uma média de 2. Observe que esses parâmetros podem precisar de ser otimizado para outros sistemas e/ou experiências diferentes.

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Representative Results

Após microirradiação, as células estão autorizadas a recuperar para um período específico de tempo, dependendo da natureza do genoma proteínas manutenção1,12. DSBs serão processados por nucleases, mais extensivamente durante as fases S e G2 do ciclo celular, para criar uma região limitada do ssDNA que rapidamente é revestida por RPA e outros de fatores de manutenção do genoma9. Esta região do ssDNA está rodeada de cromatina que é modificada extensivamente durante a DDR para regular o recrutamento e a troca de outros fatores DDR13. Recrutamento de proteína para irradiados micro regiões pode ser monitorado por IF (figura 1A). Normalmente, a cromatina associada a factores (por exemplo, γ-H2A.X, 53BP1, etc.) são detectáveis às anterior (1-5 min) tempo pontos do que proteínas ssDNA ligados porque mediada por nuclease ressecção das extremidades DSB é necessário para gerar a plataforma RPA-ssDNA (≥ 10 min). Para facilitar a análise de imagem e publicação, criámos um Fiji roteiro (The Outliner)10 que automaticamente contornos do núcleo de células usando um DNA canal tintura-associados (por exemplo, DAPI), tornando mais fácil distinguir microirradiação listras e células individuais deixando-out uninformative DNA manchando as imagens finais, preservando a definição nuclear (figura 1B).

Γ-H2A.X e complexas subunidades RPA funcionam como marcadores para fatores associados a cromatina e ssDNA, respectivamente. RPA-ssDNA aparece como punctate focos rodeados por listras de cromatina fluorescente grande decoradas pelo anticorpo γ-H2A.X (Figura 1). Localização de co com estes marcadores pode ser usada para definir precisamente a posição de fatores de manutenção do genoma em lesões do ADN. Por exemplo, o 53BP1, uma proteína associada a cromatina, que controla a escolha de caminho de reparação DSB, co localiza bem com o sinal de γ-H2A.X13. Por outro lado, a PRP19, uma ligase de ubiquitina E3 que funções na RPA-ssDNA para promover a ativação de ATR e reparação do DNA é recrutado como punctate focos que aproximam a RPA32 distribuição14,15,16,17 (Figura 1). Digno de nota, alguns fatores também podem ser recrutados na cromatina adjacente para as lesões iniciais, mas não se espalhou para grandes domínios circundantes as DSBs como γ-H2A.X e 53BP1. Em tais casos, esses fatores apareceriam como punctate focos, mas que não perfeitamente co localizar com proteínas ssDNA-limite.

Para célula viva de imagem, células expressando um POI marcado com um marcador fluorescente pode ser micro irradiados e imagem em tempo real obter altamente detalhadas cinética de recrutamento (Figura 2A–C). Várias proteínas diferentes podem ser observadas simultaneamente, desde que suas etiquetas fluorescentes podem ser espectralmente separadas uns dos outros. Para facilitar a análise de séries temporais, criámos dois scripts de Fiji, que permitem que o usuário para produzir o filme arquivos contendo informações de séries temporais (Movie Maker, ver filmes de Figura 2 como Material complementar on-line) e a quantificação da proteína recrutamento em sites micro irradiados (analisador de danos)10. Em vez da curadoria de imagem manual demorada normalmente necessária para descrever o comportamento de uma proteína, o script de danos Analyzer guia o usuário através de passos simplificados que monitorar sinal enriquecimento em locais irradiados micro, enquanto automaticamente corrigindo para o movimento celular, deriva de imagem, sinal de fundo e branqueamento tempo em todos os pontos da experiência. Os dados gerados podem ser facilmente compilados em um aplicativo de planilha e plotados como necessário (Figura 2D).

Figure 1
Figura 1: Localização da manutenção do genoma fatores para as plataformas de RPA-ssDNA em lesões induzidas por microirradiação e cromatina. (A) microirradiação do Laser nas células pré-sensibilizadas leva à produção de quebras de dupla-hélice do DNA, que são ressecados por endo - e exo-nucleases para gerar ssDNA. O compartimento sub ssDNA pode ser visualizado como punctate focos usando anticorpos contra a proteína de replicação A ou outros fatores ssDNA-localizada. Em contraste, as proteínas ou modificações que se espalhou para domínios de cromatina grandes aparecem como grandes listras no site irradiados micro semelhante para o padrão observado com anticorpos visando a variante fosforilada histona H2A. X (Γ-H2A.X). (B) células pré-sensibilizadas com BBET ou BrdU foram irradiados micro, pre-extraída, fixo e manchada para as proteínas indicadas. imagens de 12 bits foram coletadas em 1 zoom X e processados usando o script de Fiji Outliner. (C) Z-empilhamento de BBET ou BrdU pré-sensibilizadas células permite a resolução do ssDNA e cromatina-associada a factores (mostrado Z-projeção de intensidade máxima). (D) usando que esse método, 53BP1 e PRP19 podem ser classificados como cromatina e ssDNA-associada a factores de manutenção do genoma, respectivamente. Barras de escala = 10 µm; imagens em D estão na mesma escala. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2 : Imagens ao vivo de recrutamento complexo RPA para sites de dano do ADN. (A) estável ou transitória transfection de plasmídeos codificação proteínas candidato com repórteres fluorescentes, seguidos por microirradiação de células transfectadas permite o monitoramento de recrutamento de proteína para lesões de DNA em tempo real. (B) células foram transfectadas com um plasmídeo pDEST47-RPA32-GFP e lysed 24h depois. Expressão da proteína foi confirmada pelo immunoblotting. (C) células transfectadas com pDEST-SFB EGFP ou plasmídeos de pDEST47 RPA32-GFP pré-sensibilizados com BrdU foram irradiados micro e fotografados em 12 bits em 1 zoom X uma vez por minuto pós-irradiação. Timing é em pós-irradiação minutos. A imagem de ponto de tempo de 00:00 foi tirada antes da microirradiação. Arquivos de filme foram criados usando o script do Movie Maker Fiji e quadros-chave são mostrados. Barras de escala = 10 µm. (D) recrutamento de RPA32-GFP para microirradiação listras foi monitorada quantitativamente usando o script de Fiji de analisador de danos. Saída de dados foram plotadas usando o Microsoft Excel. A linha preta é a média enriquecimento-dobra de RPA32-GFP em sites micro irradiados em relação o sinal pre-irradiação e as barras de erro representam o erro padrão da média de 15 células independentemente micro irradiados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Movie 1
Filme 1: Microirradiação do tempo-lapso de células expressando SFB-GFP. Células transitoriamente transfectadas com um plasmídeo GFP pDEST-SFB foram pré-sensibilizadas 24h com BrdU, micro irradiados e imagem uma vez por minuto de 29 min. clique aqui para baixar este filme.

Movie 2
Movie 2: Microirradiação do tempo-lapso de células expressando GFP-RPA32. Células transitoriamente transfectadas com um plasmídeo de GFP-RPA32 de pDEST47 foram pré-sensibilizadas 24h com BrdU, micro irradiados e imagem uma vez por minuto de 29 min. clique aqui para baixar este filme.

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Discussion

Usando os métodos descritos acima, 405 nm laser microirradiação de células pré-sensibilizadas com BBET ou BrdU permite a geração localizada de lesões do ADN incluindo DSBs dentro dos núcleos de células humanas de aderentes. Cinética de DDR para estes DSBs são semelhantes aos gerados com outros métodos em células eucarióticas9,18,19. Ressecção de ORL em locais irradiados micro leva a ssDNA-geração, que pode ser seguido usando um anticorpo RPA32-direcionamento ou uma fusão de RPA32-GFP. Fatores associados a cromatina, por outro lado, podem ser localizados usando γ-H2A.X como referência. Alguns fatores associados a cromatina não podem espalhar longe o ORL inicial tanto como γ-H2A.X e aparecerão como punctate focos que podem ser distintos de focos ssDNA-proteínas.

Uma vez DSBs são gerados, recrutamento de proteínas e liberação de sites de danos podem ser monitorados por se em células fixas. Realizando estas experiências requer apenas um anticorpo se adequado contra o POI. Se se compatíveis com os anticorpos estão indisponíveis, plasmídeos podem ser projetados transportar genes de interesse em frame com epítopos específicos (por exemplo: bandeira, sua marca) ou proteínas fluorescentes. Transitória ou estável transfeccao/transdução destes plasmídeos em células aderentes então pode ser usada para determinar se um fator específico é recrutado ativamente para DNA danificado. Superexpressão de proteínas pode levar à localização mis e artificialmente pode impulsionar o seu recrutamento para microirradiados listras. Para obter resultados que são mais representativos das proteínas endógenas, CRISPR-Cas9 tecnologia agora pode ser usada rotineiramente para marcar qualquer gene de interesse com epitopos adequado20,21.

Os scripts de Python fornecidos no Plugin Fiji análise microirradiação facilitam a visualização, apresentação, publicação e análise da cinética de proteínas DDR. Este pacote de análise é aberto e funciona independentemente da plataforma de microscópio usado para realizar experimentos de microirradiação e aquisição de imagem. Tudo o que é necessário é que as imagens captadas na plataforma de microscopia ser salvo como Bio-formatos compatíveis de arquivos22. Desde o fundo, à deriva e correções de branqueamento são executadas automaticamente, análise dos níveis de proteína em sites de dano do ADN com os scripts fornecidos é simples e muito rápido em comparação com a quantificação do sinal manual típico realizada com software de aquisição de imagem de microscópio.

Conforme descrito no protocolo, os usuários devem cuidadosamente configurar seu respectivo-varredura a laser sistemas microscópio confocal para atingir a quantidade adequada de danos e induzir DSBs que seguem a cinética DDR normal. Com efeito, a quantidade e o tipo de lesões do DNA gerado pelo microirradiação dependerá no comprimento de onda do laser e dose, bem como sobre os métodos de pre-sensibilização. Os usuários precisam ter em mente que, apesar de DSBs são gerados por condições descritas aqui, 405 nm laser microirradiação de células photosensitized também irá gerar uma mistura de outras lesões do ADN, incluindo cyclopyrimidine dímeros (CPDs), SSBs e oxidado bases, que pode variar entre sistemas de microscópio e configurações23,24,25. Assim, um acompanhamento atento das lesões em locais irradiados micro precisa ser executada para obter uma visão global dos danos gerados e a resposta que suscitou. Importante, para estudar a resposta de DSBs, cada sistema do microscópio deve ser otimizado, monitorando a cinética da canonical proteínas de dano do ADN e modificações borne-translational em locais irradiados micro. Por exemplo, γ-H2A.X e as subunidades de complexos de RPA (RPA70, RPA32 ou RPA14) podem ser usadas convenientemente, como eles são bastante fáceis de detectar e rapidamente se acumulam no DSBs. Como regra geral, γ-H2A.X sinal deve ser visualizada como listras no início (5 min) e tarde (até 3 – 4 h) vez aponta pós-danos Considerando que RPA deve começar a acumular-se como focos punctate aproximadamente 10-15 min pós-microirradiação. Se for observado um sinal de γ-H2A.X pan-nuclear, a quantidade de energia recebida pelas células é não-fisiológico e irá resultar em morte celular rápida.

Existem algumas limitações que devem ser considerados quando se utiliza o laser 405 nm para o estudo das vias de reparo de DNA específicos. Por exemplo, embora a combinação de nm BBET-405 prontamente produz uma combinação de SSBs e DSBs, não gera photoproducts 6-4 (6-4. PPs) e, por conseguinte, a cinética de recrutamento de proteínas de reparo de excisão de nucleotídeos são diferentes daqueles observadas usando microirradiação de UV-C. A cinética e a extensão de recrutamento de várias proteínas envolvidas na resposta ao DSBs também podem variar de acordo com o DNA prejudicial método que está sendo usado23. Devido a estas variações, recomendamos que os usuários adaptarem os seus sistemas para maximizar o tipo de lesões que potencialmente são reconhecidos por seus PDIs. Embora esses sistemas são menos amplamente disponíveis, usando outros tipos de lasers incluindo UV-A (337-355 nm) ou femtosecond infravermelha (800 nm) junto com os reagentes de sensibilização diferentes (por exemplo: psoraleno tri-metil) pode permitir que os usuários gerar mais lesões de DNA específicas dependendo do DNA reparar caminhos sob estudo24,26.

Sempre que estão a ser testadas novas condições, é conveniente usar fluorescente-etiquetadas bem-estabelecida proteínas de reparação de DNA para testar doses, comprimentos de onda e pre-sensibilizador combinações e certifique-se de que a lesão de interesse eficientemente é gerada. Por exemplo, PARP1 e XRCC1 podem funcionar como marcadores para SSB e reparação de base-excisão, XPA é um bom indicador de reparo de excisão de nucleotídeos e 53BP1 serão recrutados para DSBs e função em não-homóloga final-adesão (referencia23,25 de27, ,28). Anticorpos que reconhecem as modificações associadas a tipos específicos de dano do ADN também podem ser usadas para quantificar os níveis de DNA adutos ou quebra. Assim, é possível monitorar bases oxidadas, dímeros de cyclopyrimidine, 6-4 PPs, SSBs (usando anticorpo de poli-ADP ribose) e DSBs (γ-H2A.X e 53BP1) por se e determinar os parâmetros que irão atingir o mais alto nível da desejada lesões23, 27 , 29. com monitorização cuidadosa, os usuários devem ser capazes de estudar a sua via de reparo de interesse usando microirradiação.

No total, o uso de ampla varredura a laser confocal microscópios equipados com linhas de laser 405 nm para gerar DSBs localizadas, combinado com marcadores de dano de DNA específico da plataforma sub classificar dados simplificados e fatores de manutenção do genoma com a ajuda do plugin Fiji análise microirradiação de processamento, deve processar o estudo da dinâmica de fatores DDR mais acessível do que nunca para ambos experientes e novatos investigadores do campo de manutenção do genoma.

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Disclosures

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado pelas ciências naturais e engenharia Conselho de pesquisa do Canadá [Discovery grant 5026 da manhã] e por uma geração de cientistas bolsa da sociedade de pesquisa de câncer [21531 para Marlene]. Agradecemos a Jean-François Lucier para fornecer excelente controle de qualidade dos scripts Python Fiji e conselhos na análise estatística. Agradecemos a receita de solução de fixação se Dr. Stephanie A. Yazinski. Agradecemos a Paul-Ludovic Karsenti para ajuda com medições de potência do laser.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Olympus FLUOVIEW FV3000 resonant laser scanning confocal microscope Olympus
FluoView FV3000 software (version 2.1) Olympus
405 nm laser Coherent Radiation source
Microscope incubator AIO-UNO-OLYUS-1 Okolab OKO-UNO-1
60X /1.4 Objective Olympus Oil immersion objective
8-well culture slides on coverglass (X-well) Sarstedt 94.6190.802
U2OS osteosarcoma human cell line ATCC HTB-96 Stable cell lines 
4’,6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) ThermoFisher D1306 Caution toxic
5-bromo-2′-deoxyuridine (BrdU)  Sigma-Aldrich 59-14-3
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 30525-89-4 Caution toxic
Bisbenzimide H 33342 (Hoechst 33342) ThermoFisher 62249
Bovine serum albumin (BSA) ThermoFisher BP1600-100
Trypsin EDTA 0.1%  ThermoFisher 15400-054
Triton X-100  BioShop TRX777.100
Tween-20  ThermoFisher BP337-500
Sucrose  BioShop SUC507
JetPRIME transfection reagent  Polyplus 114-07
ProLong Diamond Antifade mountant with DAPI  ThermoFisher P36962
DMEM 1X, + phenol red Wisent  319-005-CL
DMEM 1X, - phenol red Wisent 319-051-CL
Fetal bovine serum (FBS) Wisent  080-150
Mouse anti-RPA32 antibody Abcam ab2175 1:500 for IF
Rabbit anti-γ-H2A.X antibody Cell Signaling  9718S 1:500 for IF
Rabbit Anti-53BP1 antibody Cell Signaling  4937S 1:500 for IF
Rabbit Anti-PRP19 antibody Abcam ab27692 1:500 for IF
Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 647 Cell Signaling  4414S 1:250 for IF
Goat anti-mouse  IgG Alexa Fluor 488  Cell Signaling  4408S 1:250 for IF
Fiji image analysis open-source software  https://fiji.sc
1918-K Power meter  with a 918D-SL-0D3 sensor Newport

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Gaudreau-Lapierre, A., Garneau, D., Djerir, B., Coulombe, F., Morin, T., Marechal, A. Investigation of Protein Recruitment to DNA Lesions Using 405 Nm Laser Micro-irradiation. J. Vis. Exp. (133), e57410, doi:10.3791/57410 (2018).

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