Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

חקירה של חלבון הגיוס נגעים הדנ א באמצעות 405 ננומטר לייזר מיקרו-הקרנה

Published: March 20, 2018 doi: 10.3791/57410
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1, 1, 1
1Department of Biology, Université de Sherbrooke
* These authors contributed equally

Summary

לומד DNA נזק תיקון קינטיקה דורש מערכת לזירוז נגעים ב גרעיני תת אזורים מוגדרים. אנו מתארים שיטה ליצור מעברי גדילי זוגיות המותאמות לשפות אחרות באמצעות סריקה בלייזר מיקרוסקופ קונפוקלי מצויד 405 ננומטר לייזר ולספק שגרות אוטומטיות כדי לכמת את הדינמיקה של הגורמים תיקון הפצעים כאלה.

Abstract

התגובה נזק דנ א (DDR) משתמש שפע של חלבונים כדי לזהות אות, תיקון ה-DNA נגעים. בהתוויית תגובה זו הוא קריטי להבין מנגנונים תחזוקה הגנום. מאז הגיוס ו- exchange של חלבונים-נגעים דינמי מאוד, המחקר שלהם דורש את היכולת להפיק DNA נזק באופן מהיר ולא מופרד במרחב. כאן, אנו מתארים הליכים באופן מקומי לגרום נזק לדנ א בתאים אנושיים באמצעות זמין נפוץ סריקה בלייזר מיקרוסקופ קונפוקלי מצויד עם קו 405 ננומטר לייזר. הצטברות של תחזוקה הגנום גורמים-פסים לייזר יכול להיות מוערך על-ידי immunofluorescence (אם) או בזמן אמת באמצעות חלבונים מתויג עם כתבים פלורסנט. שימוש phosphorylated היסטון H2A. X (γ-H2A.X) שכפול חלבון A (RPA) כסמני, השיטה מספקת רזולוציה מספיק להפלות גורמים גייס באופן מקומי מאלה שהתפשט על כרומטין סמוכים. אנו מספקים עוד קבצי script מבוססי ImageJ לפקח ביעילות את קינטיקה של חלבון relocalization ב DNA נזק לאתרים. אלה ליטושים מפשטות מאוד חקר הדינמיקות DDR.

Introduction

התאים חשופים ללא הרף אנדוגני אקסוגני ומקורות של נזק לדנ א המאיימים על תקינותם גנומית. DDR הוא הרכב של איתות המסלולים לזהות, אות, ולאחר תיקון ה-DNA נגעים לקיים יציבות הגנום. ב- DNA גדילי כפול מעברי (DSBs), DDR מתרחשת בעיקר על שתי פלטפורמות משלימות: כרומטין γ-H2A.X-שכותרתו ', אזור resected חד גדילי הדנ א (ssDNA) בדרך כלל מצופה ssDNA מחייב מורכבים RPA1,2.

UV-לייזר מיקרו-הקרנה של תאים טרום רגיש עם תימידין אנלוגי 5-ברומו-2' deoxyuridine (BrdU) או לצבוע דנ א bisbenzimide ethoxide trihydrochloride (BBET, Hoechst 33342) יוצר תערובת של נגעים דנ א חד גדילי מעברי (כולל SSBs) ו- DSBs אשר להפיק DDR המותאמות לשפות אחרות של כרומטין והן ssDNA פלטפורמות3,4. העבודות הקודמות הראה כי גיוס של הגנום גורמים תחזוקה פלטפורמות אלו ברורים שני ב DSB ניתן שיפלו תוך שימוש באנרגיה גבוהה UV-A לייזרים (335-365 ננומטר) בשילוב עם אם2,5. מיקרוסקופים מצויד עם לייזרים כאלה יקרות כפי שהם דורשים לייזר באנרגיה גבוהה, ייעודי קרינת UV-A להעברת ויעדים שהופך אותם הרבה פחות נפוצות בהגדרות האקדמית ובתחום הרוקחות מיקרוסקופ קונפוקלי סריקה בלייזר עם 405 ננומטר לייזר קווים. המחקר של גיוס חלבון ו- exchange באתרים מוקרן מיקרו היא גם מנעה ידי ניתוח התמונה ידני מייגע נדרש לתאר את התנהגות דינמית של הגנום גורמים תחזוקה.

כאן, אנו מראים רגישות עולה מראש של תאים עם הכתם חומצת גרעין BrdU או BBET עקב באמצעות מיקרו-הקרנה 405 ננומטר לייזר במיקרוסקופ קונפוקלי משותף מאפשר בקרה של הגנום תחזוקה גורם דינמיקה ב DNA נגעים. שימוש γ-H2A.X או RPA subunits מורכבים סמני פלטפורמה יחד עם z-לערום יותר עומק השדה ואת deconvolution עבור רזולוציה משופרת מאפשר הנסיין להפלות גורמים אשר מגויסים באופן מקומי כדי DSBs מאלה להתפשט תחומים כרומטין גדולים סביב הנגע הראשוני. זו המשנה סיווג על פי מדורים אינטרה-גרעיני ברורים עוזר לחדד את התפקידים פוטנציאלי של חלבונים uncharacterized גייס לאתרים מוקרן-מיקרו. יתר על כן, אנו מספקים פרוטוקולים נוח, אופטימיזציה צינורות לנתח במהירות את הדינמיקה של הגנום גורמים תחזוקה באמצעות7,86,פיג'י (חלוקה ImageJ) תוכנת קוד פתוח. אלה ליטושים לשיטות מיקרו-הקרנה הנוכחי לדקלם את המחקר של DDR אפשרי כמעט בכל סביבה מעבדה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. קדם רגישות עולה של תאים

  1. 24 שעות לפני הניסוי מיקרו-הקרנה, זרע תאים U2OS 40,000 לכל טוב 1 x DMEM המכיל 10% FBS בתרבות 8-ובכן שקופיות עם ישבנים 170 מיקרומטר-עבה coverslip דמוי זכוכית/פולימר כדי להבטיח מקסימלי להדמיה של 405 ננומטר לייזר אור והדמיה מעולה עם סריקה בלייזר הפוך מיקרוסקופ קונפוקלי. אם משתמש של microslide 8-ובכן, להשתמש µL 500 של מדיה או פתרונות לכל טוב עבור כל הטיפולים הבאים והשלבים שטיפה של הפרוטוקול.
    הערה: עקב שלהם מורפולוגיה שטוח, תאים U2OS הדבקות טובה, וגרעינים גדולים, להקל הגילוי של חלבון גיוס באתרים מוקרן מיקרו אך סוגי תאים חסיד אחרים ניתן להשתמש לפי הצורך. תאים אידיאלי להיות בסביבות 80% confluency בזמנו של מיקרו-הקרנה כדי להגדיל את המספר מוקרן תאים לכל ניסוי. זרימה גבוהה מאוד עלול לגרום שינויים מחזור התא זה יכול perturb שמסלולי התיקון ספציפיים כגון רקומבינציה הומולוגית אשר מתרחש במהלך השלבים S ו G2 של מחזור התא9.
  2. דגירה התאים בן לילה ב 37 ° C עם 5% CO2ולאחר מכן מראש לרגש את התאים עם (שלב 1.3) BrdU או (שלב 1.4) BBET (Hoechst 33342).
    הערה: כדי לצפות בשידור חי גיוס של חלבון בעל עניין (פוי) ה-DNA נגעים, transfect או מגלי פלסמיד ה-DNA נושא שילוב בין חלבון פלואורסצנטי בגודל 24 פוי h לאחר תא זריעה. h 24 שעות ביממה פוסט-transfection/התמרה חושית, מראש לרגש, מיקרו-להאיר את התאים כדי לפקח על הגיוס של הנקו באתרי ה-DNA נזק בזמן אמת.
  3. כדי להגדיל את מספר DSBs שנוצר על ידי תערוכות 405 ננומטר לייזר, להוסיף 10 מיקרומטר של BrdU המדיה עבור 24 שעןת לפני מיקרו-הקרנה. לפני מיקרו-הקרנה, שימוש של micropipette, יש לשטוף את התאים פעמיים עם בינונית ללא פנול אדום כדי להבטיח חשיפה מירבית של התאים 405 ננומטר לייזר.
  4. לחלופין, יטפל בתאים למשך 15 דקות עם BBET-µg/mL 10 ב המדיום המתאים בחממה תרבית תאים ב 37 º C. לאחר הטיפול, לשטוף פעמיים עם בינונית ללא פנול אדום לפני מיקרו-הקרנה.

2. מיקרו-הקרנה של תאים

  1. בחר מתאים לסריקת לייזר מיקרוסקופ קונפוקלי.
    הערה: הניסויים שהוצגו כאן בוצעו על מערכת מיקרוסקופ מצוידים 50 mW 405 ננומטר לייזר קו מטרה שמן 63 X 1.4 מפתח נומרי. כדי ליצור DSBs, התאים היה מוקרן מיקרו-1 X זום סריקה 1,024 x 1,024 פיקסלים/שדה (0.21 מיקרומטר לפיקסל בהגדלה X 63), במצב חד כיווני-8 µs לפיקסל. עוצמת הלייזר בשימוש היה 25% ו- 80% עבור תאים BBET - ו BrdU-טרום-רגיש, בהתאמה. כדי לסייע למשתמשים להגדיר את תצורת המערכת, לייזר כוח שלאחר המטרה על מערכת הציג נמדדה באמצעות מד צריכת החשמל על-פי הוראות היצרן. המדידות תואמות 2.6 mW ו- 7.0 mW עבור BBET - ו BrdU-טרום-רגיש תאים, בהתאמה.
  2. הפעל את המיקרוסקופ ואת תא סביבתיים.
    1. להגדיר את התא עד 37 ° C עם 5% CO2 לפני דגימות ממוקמים בתוך החממה על הבמה כדי למנוע לחץ מיותר על התאים וכדי להבטיח קינטיקה DDR הומוגנית לאורך ניסויים.
  3. בחר שדות עם תאים מבוזר היטב, להתאים את המוקד, לרשום את עמדתם כדי להקל על ייבוא תמונות לאחר בפרוטוקול אם. רוכשים תמונה אחת לפחות שישמש כנקודת התייחסות לנזק מראש כדי לנטר את קינטיקה של חלבון הגיוס לאחר מיקרו-הקרנה.
    הערה: תרבות Gridded כלי עשוי לשמש גם כדי להקל על הלוקליזציה של תאים מיקרו-מוקרן על והשלבים.
    1. אם הניסויים באמצעות תאים התווית על-ידי BBET, להתאים את המוקד על תאים באמצעות הלייזר 405 ננומטר-עוצמת הלייזר הנמוך מספיק כדי להמחיש את התאים על מנת למנוע נזק לדנ א מוצדקות.
      1. הימנע מלהשתמש widefield זריחה כדי להתאים את המוקד על תאים שהוכתמו BBET כמו אור UV הנפלטת המנורה. יגרום נזק לדנ א באתרים מואר.
    2. אם באמצעות תאים התווית על-ידי BrdU, להתאים את המוקד באמצעות התערבות דיפרנציאלית ניגודיות (DIC) או שלב-ניגודיות הדמיה מלהסתכל גרעיני תת תכונות כגון nucleoli.
    3. אם באמצעות תאים המבטאים שכותרתו fluorescently POIs, בחר מטוס מוקד בעוצמה פלורסצנטיות נציג.
      הערה: להימנע תאים המבטאים רמות גבוהות מאוד של הנקו ביטוי חזק עלול לגרום בלוקליזציה מלאכותית. בנוסף, בחר בתאים המבטאים הנקו ברמות דומות (בחירה של שיבוטים יציב מומלץ מאוד כדי למזער בווריאציות ביטוי פוי ורמות גיוס).
  4. קביעת התצורה של המיקרוסקופ על הצעד מיקרו-הקרנה באמצעות קרינה פלואורסצנטית-ההתאוששות לאחר _module photobleaching (FRAP) של המערכת.
    הערה: את הפרמטרים החשובים ביותר שיש לקחת בחשבון בעת הגדרת-up למערכת מיקרוסקופ עבור מיקרו-הקרנה ניסויים הם: הכוח פלט של 405 ננומטר לייזר, מספר האיטראציות (קרי, מספר הפעמים הלייזר יעבור באותן הקואורדינטות). מספר פיקסלים/שדה (ב- 63 X הגדלה והרזולוציה 1,024 x 1,024, 1 פיקסל = 0.21 מיקרומטר), וזמן להתעכב לפיקסל. כל הגורמים הללו תשפיע על כמות האנרגיה להיתקל התאים, ובכך כמות וסוג DNA נזק שנוצר (ראה דיון למידע נוסף במינון אופטימיזציה).
  5. באמצעות מודול FRAP של מערכת מיקרוסקופ, מיקרו-להאיר את התאים.
    הערה: ברוב המערכות, מיקרו-הקרנה של תאים מרובים יכול להתבצע בשדה יחיד נקודות או קווים/מלבנים (בדרך כלל 1-2 מיקרומטר רחב). בעת ביצוע הדמיה חיה של חלבונים עם התווית fluorescently מיד לאחר נזק, להגביל את המיקרו-ההקרנה למספר קטן של תאים לכל שדה כי לוקחים את הזמן כדי מיקרו-להאיר בכל תא תגרום אינדוקציה מושהית של DDR. הדבר חשוב במיוחד בעת פיקוח על חלבונים אשר מגויסים במהירות רבה כדי DNA נגעים.
  6. לאחר מיקרו-הקרנה, להחזיר את השקופיות רב טוב או צלחות באינקובטור ב 37 ° C עם 5% CO2 למשך פרק הזמן הנדרש לפני עיבוד הדגימות עבור אם (סעיף 5) או פנה/י מיד עם הדמיה לחיות (סעיף 3).
    1. כצעד ראשון, לתקן את התאים בתוך דקות ספורות ועד כמה שעות הקרנה שלאחר עבור פרוטוקול IF. בהתאם הנקו, קינטיקה הגיוס עשוי להשתנות. בדרך כלל, חלבונים הנמצאים כרומטין-הקשורים DSBs, SSBs בתרגום במהירות רבה כדי הנגע, מוסרות לעיתים בתוך 5 דקות. כמה גורמים כגון אלה באותו ssDNA גויס בנקודות זמן מאוחר יותר, ברגע המכונות כריתה עוסקת ולהישאר שם במשך שעות (ראה איור 1 עם הפניה4).

3. חיים הדמיה של חלבונים עם התווית Fluorescently

  1. לבצע הדמיה בצילום מואץ של התאים מוקרן-מיקרו. עבור חלבונים אשר מגויסים במהירות רבה כדי נגעים, כמה שניות לכל מסגרת יהיה אידיאלי, אך עבור חלבונים בתרגום האזור הפגוע מאוחר יותר (למשל, כריתה גורמים), רכישת ייתכן לבצע כל 1-2 דקות עד מישור מושגת.
    הערה: למזער את עוצמת הלייזר עבור רכישת התמונה כדי למנוע הלבנת ככל האפשר, כדי להבטיח כי חלבון גיוס באתרים נזק לא מגיעים לרוויה אשר למנוע אות כימות וניתוחים עוקבות (ראה ניתוח נתונים סעיף 4). במערכת שהוצגו, ההדמיה נעשתה עם 63 X / 1.4 שמן אובייקטיבית באמצעות זמן להתעכב של 8 µs לפיקסל, רזולוציה 1,024 x 1,024, 1 X זום, חישוב ממוצע של 2. שימו לב כי הפרמטרים האלה אולי צריך להיות אופטימיזציה עבור מערכות אחרות ו/או ניסויים שונים.
  2. מיקרו-להאיר התאים בתחומים נוספים עד קינטיקה מדידות מתקבלים עבור תאים 15-30. חזור על הניסויים לפחות 3 פעמים ב משכפל ביולוגי כדי להבטיח את הדיוק ואת הפארמצבטית של קינטיקה גיוס.
    הערה: בעת התאמת פרוטוקול זה למערכת קונאפוקלית ספציפי, זה עשוי להיות שימושי להתחיל על-ידי ניטור של קינטיקה גיוס של גורם תחזוקה הגנום הידועים fluorescently התווית על-ידי (לדוגמה, 53BP1-ה-GFP, RPA32-GFP, וכו '). באמצעות הדמיה לחיות כדי למטב את תנאים מיקרו-הקרנה יאפשר למשתמש לבחון פרמטרים מרובים במהירות.

4. גיוס קינטיקה ניתוח

  1. התקן את התוסף Microirradiation ניתוח10 התוכנה11ניתוח התמונה פיג'י.
  2. פתח תמונות שנרכשו בפיג'י. בחר "מנתח הנזק" מתוך התפריט הנפתח תוספים בסוויטת ניתוח Microirradiation. בצע את ההוראות להגדרת אזור רקע של עניין (ROI) (בדרך כלל 3 x 3 מיקרומטר), שאינו מוקרן ו לקרינה ROIs בכל תא מוקרן-מיקרו.
    1. שימוש ROIs בגודל זהה כדי למזער הטיות אפשריות ב אומר עוצמות האות. לתמונות הנרכש, כוללים גם מסגרת הקרנה קדם אחד לפחות אשר ישמש כקו כדי לפקח על גיוס באתרים מוקרן-מיקרו.
    2. לאחר שכל הנתונים רועי שנאסף על הסדרה מלא זמן לשגות, לשמור את הקובץ שנוצר על ידי תוסף המכיל את התוצאות ה-csv (מופרד באמצעות קובץ) או כקובץ txt (קובץ מופרד באמצעות טאבים). קובץ זה מכיל מדידות של עוצמת כלומר עבור כל נקודת זמן על כל ההשקעה (כלומר רקע בעוצמה, מתכוון בעוצמה בלתי-בלייזר, וכן אומר בעוצמה מוקרן).
      הערה: התוסף מפחית אוטומטית את עוצמת רקע (אניb) בעצימות של ROIs לקרינה (אניs), את שאינו מוקרן ROIs (אניn). הוא גם מחשב יחס בין שני הערכים (ראה להלן הנוסחה) לתיקון photobleaching (Irradiated/Non-מוקרן).
      Equation 1
      התוסף גם מחשב נורמליזציה בין נקודת בפעם הראשונה (ערך מוגדר כ- 1), וכל שאר הדברים זמן עבור כל גרעין (יחס יחסית לנקודת הזמן הראשון). פרטים נוספים ניתן למצוא באתר האינטרנט תוסף10.
  3. לבצע את הניתוח באמצעות התוסף עבור כל מיקרו-מוקרן התאים (תאים לפחות 15-30), גרף את העשרת יחסי מרושע בבית מוקרן מיקרו אזורים לאורך זמן. לחשב השגיאות תקן של הממוצע עבור כל נתוני הצבע מגרש אותם.
    1. לאשר את ההבדלים גיוס קינטיקה בין שני תנאים ניסיוני על ידי ביצוע של התלמיד t-בדיקות עבור כל נקודת נתונים.

5. אם פרוטוקול

  1. להכין אם פתרונות. להכין פתרון טרום/פוסט-extraction (PBS קר כקרח x 1 המכיל 0.25% טריטון X-100), שטיפת פתרון (1 x PBS המכילה 0.05% Tween-20), חסימת פתרון (1 x PBS המכיל 3% BSA ל- 0.05% Tween-20), קיבוע הפתרון (Paraformaldehyde 3% + סוכרוז 2% ב- PBS 1 x) חרוט צינורות פוליפרופילן.
    הערה: עבור microslide יחיד 8-ובכן, 10 מ של טרום/פוסט-extraction פתרון, 50 מ של כביסה פתרון, 10 מ של פתרון חסימה ו 5 מ של קיבעון פתרון הינם נדרשים.
    1. להכין את הפתרון קיבעון.
      1. ברדס כימי, מערבבים 400 מ ל מים מזוקקים-כפול (ddH2O) עם 15 גרם של paraformaldehyde ו- µL 30 של 10 N NaOH בבקבוקון Erlenmeyer 1 ליטר.
      2. סגור את מיכל וחום -65 מעלות צלזיוס על פלטה חמה פגים תוך כדי ערבוב כדי solubilize את paraformaldehyde לחלוטין.
      3. בעזרת פיפטה של 25-mL, להוסיף 50 מ של 10 X PBS, מערבבים, מסנן באמצעות מסנן 0.45 מיקרומטר.
      4. להוסיף 10 גרם של סוכרוז ולהשלים עד 500 מ"ל עם ddH2O.
      5. Aliquot הפתרון צינורות חרוט 15 מ"ל; לאחסן ב-20 ° C עד השימוש.
    2. להכין גרעינים מכתים פתרון על ידי דילול פתרון מניות של 1 מ"ג/מ"ל של 4, 6-Diamidino-2-phenylindole 1:1,000 (דאפי) ב 1 x PBS.
  2. שימוש של micropipette, הסר בזהירות את המדיה מן הבארות של שקופיות מיקרוסקופ רב טוב או צלחות ולשטוף מיד עם 500 µL של אם הכביסה פתרון על-ידי שינוי הפתרון פעמיים ללא המתנה.
    הערה: אם הנתונים המובאים כאן התקבלו באמצעות תאים גדל שקופיות מיקרוסקופ 8-ובכן היו נשטפים, מודגרות ב 500 µL של כל הפתרונות. צריך להיות מותאם אמצעי אחסון בהתאם המכולות תרבות תא בשימוש על ידי ניסויים. בנוסף, ביצוע בפרוטוקול אם בזהירות מרבית כמו תאים ניתן לנתק בקלות מהחלק התחתון זכוכית/פולימר. השתמש micropipette של כל פתרון שינויים כדי למזער את איבוד תאים.
  3. דגירה על קרח במשך חמש דקות עם 500 µL של קרח אם פתרון טרום/פוסט-extraction ו מערבולת בעדינות ביד עבור 15-30 s לבצע את החילוץ קדם צעד זה מסיר ביותר חלבונים cytoplasmic ו nucleoplasmic ומגדיל את האיתות כרומטין / גורמים הקשורים הדנ א.
  4. לשטוף פעמיים עם 500 µL של אם הכביסה פתרון.
  5. תקופת דגירה של 15 דקות בטמפרטורת החדר 500 µL של אם הקיבעון פתרון. לחלופין, השתמש פתרון paraformaldehyde מוכנות מראש (3-4%) לשלב קיבוע.
  6. לשטוף פעמיים עם 500 µL של אם הכביסה פתרון.
  7. דגירה על קרח למשך 5 דקות ב- 500 µL של קרח אם קדם/פוסט-extraction פתרון ו מערבולת השקופית בעדינות ביד כדי לבצע את השלב permeabilization.
  8. לשטוף פעמיים עם 500 µL של אם הכביסה פתרון.
  9. דגירה לפחות 30 דקות בטמפרטורת החדר עם 500 µL של פתרון אם החסימה.
  10. הסרת חסימה פתרון באמצעות micropipette של, דגירה ללון בתוך תא humidified ב 4 ° C עם 250 µL הראשית נוגדנים מעורבבת עם חסימת פתרון.
    הערה: זה תרגול טוב כדי לבצע הדגירה עם ראשי נוגדנים באופן רציף כדי למנוע בחפצים שונים לוקליזציה שותף פוטנציאלי. הפקדים המתאימים פעם בוצעו, בו זמנית דגירה נוגדנים הראשי כדי להאיץ את התהליך.
  11. רחץ ארבע פעמים במשך 5 דקות ב- 500 µL של אם הפתרון כביסה עם עצבנות עדין (60 rpms ב rotator).
  12. תקופת דגירה של h 1 ב 37 ° C עם 250 µL של נוגדנים משניים מדולל בפתרון חסימה בתוך תא humidified.
    הערה: להגן על הדגימות אור על תוספת של נוגדנים משניים עם התווית fluorescently.
  13. יש לשטוף ארבע פעמים כל אחד עבור 5 דקות ב- 500 µL של אם הפתרון כביסה עם עצבנות עדין.
  14. דגירה בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות ב- 500 µL ל- PBS x 1 המכיל 1 µg/mL דאפי כתם גרעינים.
  15. לשטוף פעמיים עם µL 500 ל- PBS 1 x ולהשאיר בתאים µL 500 1 x PBS פתרון דימות.
  16. באמצעות שקופיות gridded או שלב רשום עמדות, לחפש את התאים מוקרן מיקרו באמצעות סמן נזק DNA מאופיין היטב (למשל, γ-H2A.X, RPA32, וכדומה).
  17. תמונה של תרבות רב טוב שקופיות או הצלחות כל הערוצים הרלוונטיים באמצעות ההגדרות המתאימות על מיקרוסקופ קונפוקלי סורק לייזר.
    הערה: על מערכת הציג, ההדמיה נעשתה עם 63 X / 1.4 שמן אובייקטיבית באמצעות זמן להתעכב של 8 µs לפיקסל, רזולוציה 1,024 x 1,024, 1 X זום, חישוב ממוצע של 2. שימו לב כי הפרמטרים האלה אולי צריך להיות אופטימיזציה עבור מערכות אחרות ו/או ניסויים שונים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

בעקבות מיקרו-הקרנה, תאים מותר להתאושש במשך תקופה מסוימת של זמן בהתאם לאופי הגנום תחזוקה חלבונים1,12. DSBs תטופל על ידי nucleases, באופן מקיף ביותר במהלך שלבי S ו G2 של מחזור התא, כדי ליצור אזור מוגבל ssDNA שהטיחה במהירות על-ידי RPA אחרים גורמים תחזוקה הגנום9. אזור ssDNA זה מוקף כרומטין אשר בהרחבה משתנה במהלך DDR לווסת את גיוס ו- exchange של גורמים אחרים DDR13. ניתן לנטר חלבון גיוס לאזורים מיקרו-מוקרן על ידי אם (איור 1 א'). לרוב, גורמים הקשורים כרומטין (למשל, γ-H2A.X, 53BP1, וכו ') הן לזיהוי ב קודמות (1 – 5 דקות) נקודות מאשר חלבונים ssDNA מכורך זמן מאחר בתיווך נוקלאז כריתה של DSB מסתיים נדרשת כדי ליצור פלטפורמת RPA-ssDNA (≥ 10 דקות). כדי להקל על ניתוח תמונות והפרסום, המצאנו של התסריט (מחלק לרמות) פיג'י10 אשר מתווה באופן אוטומטי את גרעין התא באמצעות DNA לצבוע-הקשורים ערוץ (למשל, דאפי) להבחין בין מיקרו-הקרנה להקל פסים, תאים בודדים על ידי ומתחמקות DNA מכתים מן התמונות הסופי תוך שמירה על ההגדרה הגרעינית (איור 1B).

Γ-H2A.X ו- subunits מורכבים RPA לפעול סמנים עבור כרומטין, ssDNA-גורמים הקשורים, בהתאמה. RPA-ssDNA מופיע מוקדים punctate מוקף פסים כרומטין פלורסנט גדול מעוצב על ידי הנוגדן γ-H2A.X (איור 1C). לוקליזציה שיתוף עם סמנים אלה ניתן להגדיר במדויק את המיקום של הגנום גורמים תחזוקה ב DNA נגעים. למשל, 53BP1, חלבון הקשורים כרומטין אשר שולטת הבחירה מסלול תיקון DSB, רגישה במשותף עם האות וγ-H2A.X13. לעומת זאת, PRP19, ליגאז אוביקוויטין E3 כי פונקציות על RPA-ssDNA על מנת לקדם ATR הפעלה ותיקון דנ א הוא גויס כמו מוקדים punctate מקרוב תואמים את RPA32 הפצה14,15,16,17 (דמות 1D). ראוי לציין, כמה גורמים עשויים גם גויס על כרומטין הסמוכים נגעים הראשונית אך לא התפשט לתחומים גדולים המקיפים את DSBs כמו γ-H2A.X ו- 53BP1. במקרים כאלה, גורמים אלה יופיעו מוקדים punctate אבל לא לגמרי במשותף לשפה עם חלבונים ssDNA מאוגד.

עבור תא חי הדמיה, התאים לבטא נקודת משחק לחץ עם סמן פלורסנט התגית יכול להיות מוקרן מיקרו עם תמונה בזמן אמת כדי להשיג מאוד מפורט קינטיקה גיוס (איור 2A–C). יכול להיות שנצפו חלבונים שונים מרובים בו זמנית ובלבד תוויות פלורסנט שלהם יכול להיות מופרדים spectrally אחד מהשני. כדי להקל על ניתוח של הזמן, יצרנו שני תסריטים פיג'י אשר מאפשרים למשתמש להפיק סרט קבצים המכילים מידע זמן-סדרות (Movie Maker, ראה סרטים של איור 2C כחומר משלים מקוון), לכמת חלבון גיוס ב אתרי מוקרן-מיקרו (נזק מנתח)10. במקום curation התמונה ידנית גוזלת זמן והמסמכים הנדרשים כדי לתאר את אופן הפעולה של חלבון, הסקריפט נזק מנתח מדריך את המשתמש באמצעות צעדים יעילים לפקח אות העשרה באתרי מוקרן מיקרו, בעוד באופן אוטומטי תיקון עבור תנועת התא, הסחף תמונת רקע אות, הלבנת בכלל נקודות זמן של הניסוי. הנתונים המופקים יכול להיות בקלות הידור יישום גליונות אלקטרוניים ואז התווה הדרושים (איור דו-ממדי).

Figure 1
איור 1: לוקליזציה של תחזוקה הגנום גורמים כרומטין, פלטפורמות RPA-ssDNA-נגעים מיקרו-הקרנה-induced. (א) מיקרו לייזר-הקרנה בתאים טרום sensitized מוביל לייצור של מעברי כפול גדילי הדנ א, אשר הם resected מאת endo - ו exo-nucleases ליצירת ssDNA. תא תת ssDNA להיות visualized כמו מוקדים punctate באמצעות נוגדנים נגד שכפול חלבון א' או גורמים אחרים מותאם לשפות אחרות ssDNA. לעומת זאת, חלבונים או שינויים התפשט לתחומים כרומטין גדול להופיע פסים גדולים ב דומה לתבנית נצפתה עם נוגדנים מיקוד variant היסטון phosphorylated H2A אתר מיקרו-מוקרן. X (Γ-H2A.X). (B) תאים טרום רגיש עם BBET או BrdU היו מוקרן מיקרו שחולצו מראש, קבוע, ויטראז'ים של החלבונים המצוין. 12 סיביות תמונות שנאספו ב 1 X זום, מעובד באמצעות קובץ ה-script מחלק לרמות פיג'י. (ג) Z-הערמה של תאים טרום sensitized BBET או BrdU מאפשר את הרזולוציה של ssDNA וכרומטין-גורמים הקשורים (העוצמה המקסימלית Z-ההקרנה המוצגים). (ד) שימוש בשיטה זו, 53BP1, PRP19 ניתן לסווג כרומטין, ssDNA-הגנום תחזוקה גורמים הקשורים, בהתאמה. גודל ברים = 10 מיקרומטר; תמונות ברה הינם כולם באותו הסולם. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2 : לחיות-הדמיה של גיוס מורכבים RPA לאתרים של נזק לדנ א. (א) יציבה או ארעי תקנים של פלסמידים קידוד חלבונים המועמד מתויג עם כתבים פלורסנט ואחריו מיקרו-הקרנה של תאים transfected מאפשר פיקוח על הגיוס חלבון ה-DNA נגעים בזמן אמת. (B) התאים היו transfected עם פלסמיד pDEST47-RPA32-GFP, lysed 24 שעות מאוחר יותר. ביטוי חלבון אושר ע י immunoblotting. (ג) תאים transfected עם pDEST-SFB EGFP או pDEST47 RPA32-GFP פלסמידים רגיש מראש עם BrdU היו מוקרן מיקרו, עם תמונה-12 סיביות-1 X זום פעם אחת בכל הקרנה שלאחר דקה. התזמון הוא פוסט-הקרנה דקות. 00:00 זמן נקודת התמונה צולמה לפני מיקרו-הקרנה. קבצי סרט נוצרו באמצעות קובץ ה-script Movie Maker פיג'י, מסגרות מפתח מוצגים. גודל ברים = 10 מיקרומטר. (D) גיוס של RPA32-GFP כדי מיקרו-הקרנה פסים נוטרו באופן כמותי באמצעות קובץ ה-script נזק מנתח פיג'י. נתוני הפלט שורטטו באמצעות Microsoft Excel. הקו השחור הוא מתכוון ההעשרה-הקיפול של RPA32-GFP באתרים מיקרו-מוקרן ביחס האות הקרנה קדם ולייצג קווי השגיאה שגיאת התקן של הממוצע של תאים 15 מיקרו-מוקרן באופן עצמאי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Movie 1
סרט 1: מיקרו-הקרנה בצילום מואץ של תאים לביטוי SFB-GFP. היו תאים transiently transfected עם פלסמיד GFP pDEST-SFB sensitized מראש 24 שעות עם BrdU, מיקרו-מוקרן ולאחר שבעורך פעם לדקה מינימלית 29 אנא לחץ כאן כדי להוריד את הסרט הזה.

Movie 2
סרט 2: מיקרו-הקרנה בצילום מואץ של תאים לביטוי RPA32-GFP. תאים transiently transfected עם פלסמיד RPA32-GFP pDEST47 היו sensitized מראש 24 שעות עם BrdU, מיקרו-מוקרן ולאחר שבעורך פעם לדקה מינימלית 29 אנא לחץ כאן כדי להוריד את הסרט הזה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

באמצעות השיטות שפורטו לעיל, 405 ננומטר לייזר מיקרו-הקרנה של תאים טרום רגיש עם BBET או BrdU מאפשר הדור המותאמות לשפות אחרות של נגעים DNA לרבות DSBs בתחום הגרעינים של תאים אנושיים חסיד. קינטיקה של DDR-DSBs אלה דומים לאלה שנוצר עם שיטות אחרות התאים האיקריוטים9,18,19. כריתה DSB באתרים מוקרן מיקרו מוביל ssDNA הדור אשר יכול לבוא באמצעות נוגדן של פילוח RPA32 או היתוך של RPA32-GFP. גורמים הקשורים כרומטין, מצד שני, יכול להיות ממוקם באמצעות γ-H2A.X התייחסות. כמה גורמים הקשורים כרומטין לא עלול להתפשט הרחק DSB הראשונית ככל γ-H2A.X והוא יופיע בתור מוקדים punctate שעשויים להיות נבדל ssDNA מחייב חלבונים מוקדים.

ברגע DSBs נוצרים, חלבון הגיוס ואישור מאתרי נזק ניתן יהיה פיקוח על ידי אם בתאי קבוע. ביצוע ניסויים אלה דורש רק אם נוגדנים מתאימים נגד הנקו. אם אם תואמי נוגדנים אינן זמינות, פלסמידים. ניתן לתכנן נושאת הגנים של עניין בתוך מסגרת עם epitopes ספציפיים (למשל: דגל, שלו-תג) או חלבונים פלורסנט. ארעי או יציבה תרביות תאים/התמרה חושית של פלסמידים אלה לתוך תאים חסיד יכול לשמש לאחר מכן כדי לקבוע אם הוא גורם ספציפי באופן פעיל גויס אל הדנ א פגום. ביטוי של חלבונים יכול להוביל לוקליזציה שגויה, עשוי להגביר שלהם הגיוס פסים מוקרן-מיקרו. כדי להשיג תוצאות מייצגים יותר חלבונים אנדוגני, CRISPR-Cas9 טכנולוגיה עכשיו ניתן להשתמש באופן שגרתי כדי לתייג כל הגן עניין עם20,epitopes מתאימים21.

קבצי script של פייתון הניתנים תוסף פיג'י ניתוח מיקרו-הקרנה להקל על ויזואליזציה, פרסום, וניתוחם של קינטיקה חלבונים DDR. חבילה ניתוח זו היא מקור פתוח ופונקציות ללא התחשבות פלטפורמת מיקרוסקופ המשמש לביצוע ניסויים מיקרו-הקרנה ורכישת תמונות. כל שנדרש הוא כי התמונות שצולמו על פלטפורמת מיקרוסקופ להינצל כפי תואמת ביו-תבניות קבצים22. מאז רקע, נסחף, הלבנת התיקונים מבוצעים באופן אוטומטי, ניתוח של רמות החלבון באתרים נזק DNA עם קבצי ה-script שסופק הוא פעולה פשוטה ומהירה מאוד לעומת כימות טיפוסי האות ידנית המבוצעת עם מיקרוסקופ תמונה רכישת תוכנה.

כמפורט בפרוטוקול, משתמשים בקפידה את תצורתו שלהם בהתאמה סריקה בלייזר מיקרוסקופ קונפוקלי מערכות על מנת להשיג את הכמות המתאימה של נזק, זירוז DSBs בעקבות קינטיקה DDR רגיל. ואכן, כמות וסוג נגעים DNA שנוצר על-ידי מיקרו-הקרנה תהיה תלויה על אורך גל לייזר, מינון, כמו גם על שיטות רגישות עולה מראש. המשתמשים צריכים לזכור כי למרות DSBs הנוצרים על-ידי התנאים המתוארים כאן, 405 ננומטר לייזר מיקרו-הקרנה של תאים photosensitized גם יפיק תערובת של נגעים DNA אחרים, לרבות הדימרים cyclopyrimidine (CPDs), SSBs, ו מחמצנים בסיסים, כי ישתנה בין מערכות מיקרוסקופ הגדרות23,24,25. לפיכך, ניטור זהיר של נגעים באתרים מוקרן מיקרו צריך להתבצע כדי לקבל תמונה מקיפה של הנזק שנוצר ואת התגובה elicited. חשוב ללמוד בתגובה DSBs, צריך אופטימיזציה לכל מערכת מיקרוסקופ על-ידי ניטור של קינטיקה של הקנוני DNA נזק חלבונים ושינויים post-translational באתרים מוקרן מיקרו. למשל, ניתן להשתמש γ-H2A.X וב -subunits מורכבים של RPA (RPA70, RPA32 או RPA14) כפי שהם די קל לזהות ליריד במהירות ובנוחות לצבור בבית DSBs. כלל אצבע, אות וγ-H2A.X צריך להיות דמיינו כמו פסים בשעה מוקדמת (5 דקות) ונקודות מאוחר (עד 3-4 h) הזמן שלאחר הנזק ואילו RPA צריך להתחיל לצבור כמו מוקדים punctate כ 10-15 דקות פוסט-micro-הקרנה. אם אות וγ גרעיני פאן-H2A.X הוא ציין, כמות האנרגיה התקבל על ידי התאים הוא הלא-פיזיולוגיים והתוצאה מוות תאים מהירה.

ישנן כמה מגבלות שיש לקחת בחשבון בעת שימוש 405 ננומטר לייזר לחקר שמסלולי התיקון ה-DNA ספציפיים. לדוגמה, למרות BBET-405 ננומטר שילוב בקלות מייצר שילוב של SSBs DSBs, זה אינו יוצר photoproducts 6-4 (4-6 PPs), אפוא, קינטיקה של הגיוס של נוקלאוטיד כריתה תיקון חלבונים שונים מאלה נצפתה באמצעות UV-C מיקרו-הקרנה. קינטיקה של היקף הגיוס של חלבונים שונים המעורבים בתגובה DSBs גם עשויים להשתנות בהתאם ה-DNA נזק שיטה שהייתה בשימוש23. בגלל וריאציות אלה, אנו ממליצים כי המשתמשים להתאים את המערכות שלהם על מנת למקסם את הסוג של נגעים שעשויות להיות מזוהים על-ידי POIs שלהם. למרות מערכות כאלה זמינים פחות בהרחבה, באמצעות סוגים אחרים של לייזרים כולל קרינת UV-A (337 – 355 ננומטר) או בפמטושניות-סגול (800 ננומטר) יחד עם ריאגנטים רגישות עולה שונים (למשל: תלת-מתיל פסוראלן) מאפשר למשתמשים להפיק יותר נגעים DNA ספציפיים בהתאם ה-DNA לתקן מסלולים תחת מחקר24,26.

בכל פעם נבדקות תנאים חדשים, זה נוח לשימוש עם התווית fluorescently חלבונים תיקון ה-DNA ומבוססת לבדיקת מינונים אורכי גל, שילובים sensitizer מראש, וכדי להבטיח כי הנגע עניין מופק בצורה יעילה. לדוגמה, PARP1, XRCC1 יכול לתפקד כסמני חלטורה ותיקון בסיס-כריתה XPA הוא אינדיקטור טוב של נוקלאוטיד כריתה תיקון, 53BP1 להתגייס כדי DSBs ותפקוד להצטרף שאינם הומולוגיים סוף-(הפניות23,25 27, ,28). נוגדנים לזהות שינויים הקשורים עם סוגים מסוימים של נזק לדנ א יכול לשמש גם כדי לכמת את רמות ה-DNA adducts או נשבר. זה אפשרי ובכך לפקח בסיסים מחמצנים, הדימרים cyclopyrimidine, 6-4 PPs, SSBs (באמצעות נוגדן ריבוז פולי-ADP) ו DSBs (γ-H2A.X ו- 53BP1) על ידי אם ולקבוע את הפרמטרים תוכלו להשיג את הרמה הגבוהה ביותר של נגעים הרצוי23, 27 , 29. עם פיקוח קפדני, המשתמשים צריכים להיות כדי ללמוד את מסלול התיקון שלהם עניין באמצעות מיקרו-הקרנה.

בסך הכל, שימוש רחב התפשט לסריקת לייזר קונפוקלי מיקרוסקופים מצויד 405 ננומטר לייזר קווים כדי ליצור DSBs לשפות אחרות, בשילוב עם סמנים נזק DNA ספציפיים לפלטפורמה לסווג תת גורמים תחזוקה הגנום, נתונים יעיל עיבוד בעזרת התוסף פיג'י ניתוח מיקרו-הקרנה, צריך לדקלם חקר הדינמיקה גורמים DDR יותר נגיש מאשר אי פעם בעבר שניהם מנוסים, המתחיל חוקרים בתחום אחזקה הגנום.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי מדעי הטבע הנדסה מחקר המועצה של קנדה [גילוי מענק 5026 התעוררנו] ועל ידי של הדור הבא של מדענים מלגה מן האגודה לחקר סרטן [21531 כדי לפנות בוקר. השכל]. אנו מודים ז'אן פרנסואה Lucier על מתן בקרת איכות מעולה של סקריפטים פיתון פיג'י, עצות על ניתוח סטטיסטי. אנו מודים ד ר סטפני א Yazinski על המתכון פתרון אם קיבוע. אנו מודים פול-לודוויק Karsenti על העזרה עם מדידות חשמל לייזר.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Olympus FLUOVIEW FV3000 resonant laser scanning confocal microscope Olympus
FluoView FV3000 software (version 2.1) Olympus
405 nm laser Coherent Radiation source
Microscope incubator AIO-UNO-OLYUS-1 Okolab OKO-UNO-1
60X /1.4 Objective Olympus Oil immersion objective
8-well culture slides on coverglass (X-well) Sarstedt 94.6190.802
U2OS osteosarcoma human cell line ATCC HTB-96 Stable cell lines 
4’,6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) ThermoFisher D1306 Caution toxic
5-bromo-2′-deoxyuridine (BrdU)  Sigma-Aldrich 59-14-3
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 30525-89-4 Caution toxic
Bisbenzimide H 33342 (Hoechst 33342) ThermoFisher 62249
Bovine serum albumin (BSA) ThermoFisher BP1600-100
Trypsin EDTA 0.1%  ThermoFisher 15400-054
Triton X-100  BioShop TRX777.100
Tween-20  ThermoFisher BP337-500
Sucrose  BioShop SUC507
JetPRIME transfection reagent  Polyplus 114-07
ProLong Diamond Antifade mountant with DAPI  ThermoFisher P36962
DMEM 1X, + phenol red Wisent  319-005-CL
DMEM 1X, - phenol red Wisent 319-051-CL
Fetal bovine serum (FBS) Wisent  080-150
Mouse anti-RPA32 antibody Abcam ab2175 1:500 for IF
Rabbit anti-γ-H2A.X antibody Cell Signaling  9718S 1:500 for IF
Rabbit Anti-53BP1 antibody Cell Signaling  4937S 1:500 for IF
Rabbit Anti-PRP19 antibody Abcam ab27692 1:500 for IF
Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 647 Cell Signaling  4414S 1:250 for IF
Goat anti-mouse  IgG Alexa Fluor 488  Cell Signaling  4408S 1:250 for IF
Fiji image analysis open-source software  https://fiji.sc
1918-K Power meter  with a 918D-SL-0D3 sensor Newport

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ciccia, A., Elledge, S. J. The DNA damage response: making it safe to play with knives. Molecular cell. 40 (2), 179-204 (2010).
  2. Bekker-Jensen, S., et al. Spatial organization of the mammalian genome surveillance machinery in response to DNA strand breaks. The Journal of Cell Biology. 173 (2), 195-206 (2006).
  3. Limoli, A. C. L., Ward, J. F., May, N. A New Method for Introducing Double-Strand Breaks into Cellular DNA. Radiation Research. 134 (2), 160-169 (1993).
  4. Polo, S. E., Jackson, S. P. Dynamics of DNA damage response proteins at DNA breaks: a focus on protein modifications. Genes & development. 25 (5), 409-433 (2011).
  5. Lukas, C., Falck, J., Bartkova, J., Bartek, J., Lukas, J. Distinct spatiotemporal dynamics of mammalian checkpoint regulators induced by DNA damage. Nature cell biology. 5 (3), 255-260 (2003).
  6. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  7. Collins, T. J. ImageJ for microscopy. BioTechniques. 43 (1 Suppl), 25-30 (2007).
  8. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  9. Symington, L. S., Gautier, J. Double-strand break end resection and repair pathway choice. Annual review of genetics. 45, 247-271 (2011).
  10. Garneau, D., Maréchal, A. Microirradiation Analysis Fiji Plugin. , Available from: https://bitbucket.org/daniel_garneau/microirradiation_analysis/ (2017).
  11. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  12. Izhar, L., et al. A Systematic Analysis of Factors Localized to Damaged Chromatin Reveals PARP-Dependent Recruitment of Transcription Factors. Cell Reports. 11 (9), 1-15 (2015).
  13. Panier, S., Boulton, S. J. Double-strand break repair: 53BP1 comes into focus. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (1), 7-18 (2013).
  14. Maréchal, A., et al. PRP19 Transforms into a Sensor of RPA-ssDNA after DNA Damage and Drives ATR Activation via a Ubiquitin-Mediated Circuitry. Molecular Cell. 53 (2), 235-246 (2014).
  15. Dubois, J. -C., et al. A phosphorylation-and-ubiquitylation circuitry driving ATR activation and homologous recombination. Nucleic Acids Research. 45 (15), 8859-8872 (2017).
  16. Wan, L., Huang, J. The PSO4 Complex Associates with RPA and Modulates the Activation of ATR. The Journal of Biological Chemistry. 289 (10), 6619-6626 (2014).
  17. Abbas, M., Shanmugam, I., Bsaili, M., Hromas, R., Shaheen, M. The role of the human Psoralen 4 (hPso4) complex in replication stress and homologous recombination. The Journal of Biological Chemistry. 289 (20), 14009-14019 (2014).
  18. Chung, W. H., Zhu, Z., Papusha, A., Malkova, A., Ira, G. Defective resection at DNA double-strand breaks leads to de novo telomere formation and enhances gene targeting. PLoS Genetics. 6 (5), (2010).
  19. Hicks, W. W. M., Yamaguchi, M., Haber, J. E. Real-time analysis of double-strand DNA break repair by homologous recombination. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (8), 3108-3115 (2011).
  20. Lackner, D. H., et al. A generic strategy for CRISPR-Cas9-mediated gene tagging. Nature Communications. 6, 10237 (2015).
  21. Ratz, M., Testa, I., Hell, S. W., Jakobs, S. CRISPR/Cas9-mediated endogenous protein tagging for RESOLFT super-resolution microscopy of living human cells. Scientific Reports. 5 (9592), (2015).
  22. Linkert, M., et al. Metadata matters: Access to image data in the real world. Journal of Cell Biology. 189 (5), 777-782 (2010).
  23. Dinant, C., et al. Activation of multiple DNA repair pathways by sub-nuclear damage induction methods. Journal of Cell Science. 120 (15), 2731-2740 (2007).
  24. Kong, X., et al. Comparative analysis of different laser systems to study cellular responses to DNA damage in mammalian cells. Nucleic Acids Research. 37 (9), e68 (2009).
  25. Holton, N. W., Andrews, J. F., Gassman, N. R. Application of Laser Micro-irradiation for Examination of Single and Double Strand Break Repair in Mammalian Cells. Journal of Visualized Experiments. (127), (2017).
  26. Thazhathveetil, A. K., Liu, S. T., Indig, F. E., Seidman, M. M. Psoralen conjugates for visualization of genomic interstrand cross-links localized by laser photoactivation. Bioconjugate Chemistry. 18 (2), 431-437 (2007).
  27. Mortusewicz, O., Amé, J. C., Schreiber, V., Leonhardt, H. Feedback-regulated poly(ADP-ribosyl)ation by PARP-1 is required for rapid response to DNA damage in living cells. Nucleic Acids Research. 35 (22), 7665-7675 (2007).
  28. Kleiner, R. E., Verma, P., Molloy, K. R., Chait, B. T., Kapoor, T. M. Chemical proteomics reveals a γH2AX-53BP1 interaction in the DNA damage response. Nature Chemical Biology. 11 (10), 807-814 (2015).
  29. Soultanakis, R. P., et al. Fluorescence detection of 8-oxoguanine in nuclear and mitochondrial DNA of cultured cells using a recombinant Fab and confocal scanning laser microscopy. Free Radical Biology and Medicine. 28 (6), 987-998 (2000).

Tags

גנטיקה גיליון 133 נזק לדנ א שני גדילי ה-DNA מעברי מיקרוסקופ קונפוקלי מיקרו-הקרנה immunofluorescence הדמיה בזמן אמת ניתוח תמונות אוטומטית
חקירה של חלבון הגיוס נגעים הדנ א באמצעות 405 ננומטר לייזר מיקרו-הקרנה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gaudreau-Lapierre, A., Garneau, D.,… More

Gaudreau-Lapierre, A., Garneau, D., Djerir, B., Coulombe, F., Morin, T., Marechal, A. Investigation of Protein Recruitment to DNA Lesions Using 405 Nm Laser Micro-irradiation. J. Vis. Exp. (133), e57410, doi:10.3791/57410 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter