Summary
DNA hasar onarım Kinetik eğitim lezyonlar tanımlanmış alt nükleer bölgeler itibariyle ikna etmek için bir sistem gerektirir. Biz bir yöntem bir 405 nm lazer ile donatılmış lazer tarama confocal mikroskop kullanarak yerelleştirilmiş çift iplikçikli kesmeleri oluşturmak ve tamir faktörler bu lezyonlar, dinamikleri ölçmek için otomatik yordamlar sağlar açıklar.
Abstract
DNA hasarı yanıt (DDR) proteinler bir bolluk tespit etmek, sinyal ve DNA lezyonlar onarmak için kullanır. Bu yanıtı operasyona genom bakım mekanizmalarını anlamak için önemlidir. İşe Alım ve Satım lezyonlar, proteinlerin son derece dinamik olduğundan, yaptıkları çalışmada hızlı ve dağınık şekilde ayrılmış bir şekilde DNA hasar oluşturma yeteneği gerektirir. Burada, yerel olarak bir 405 nm lazer çizgi ile donatılmış bir yaygın olarak bulunan lazer tarama confocal mikroskop kullanarak insan hücrelerinde DNA hasar ikna etmek için yordamlar açıklar. Faktörler lazer çizgili, ayirt (Eğer) veya gerçek zamanlı olarak değerlendirilebilir genom bakım birikimi proteinler ile floresan gazetecilere öğesini kullanarak. Fosforile Histon H2A kullanarak. (γ-H2A.X) x ve çoğaltma Protein A (RPA) işaretleyici olarak, yerel olarak işe faktörler üzerinde bitişik Kromatin yayılan bu ayırımcılık için yeterli çözünürlük yöntemdir. Biz daha fazla verimli bir şekilde DNA, protein relocalization Kinetik izlemek için ImageJ tabanlı komut dosyaları siteleri zarar sağlamak. Bu ayrıntılandırmaları DDR dynamics çalışmanın büyük ölçüde basitleştirir.
Introduction
Hücreler sürekli genomik kendi bütünlüğünü tehdit eden endojen ve eksojen DNA hasar kaynakları için sunulur. DDR algılayan, sinyal ve genom istikrarı sürdürmek için DNA lezyonlar onarım yolları sinyal bir topluluk var. DNA çift iplikçikli tatili (DSBs), esas olarak iki tamamlayıcı platformlarda DDR oluşur: Kromatin γ H2A.X etiketli ve genellikle ssDNA bağlama karmaşık RPA1,2ile kaplı rezeke tek iplikçikli DNA (ssDNA) bölge.
UV-lazer mikro-ile timidin analog 5-bromo-2' deoxyuridine (BrdU) veya bisbenzimide ethoxide trihydrochloride (BBET, Höchst 33342) DNA boya ile önceden sensitize hücreleri de dahil olmak üzere tek iplikçikli sonları (DNA lezyonlar karışımı oluşturur SSBs) ve Kromatin ve ssDNA platformlar3,4' te yerelleştirilmiş bir DDR temin DSBs. Önceki iş işe genom bakım faktörlerin DSB, bu iki farklı platformlar için yüksek enerji UV-A lazerler (335-365 nm) Eğer2,5ile kombine kullanarak ayrımcılık gösterdi. Yüksek enerjili lazer ve özel UV-A aktaran hedefleri 405 nm lazer ile çok daha az yaygın olarak karşılaşılan bazı akademik ve ilaç ayarlarında daha confocal mikroskoplar lazer tarama yapmak gerektiği gibi lazerler ile donatılmış mikroskoplar maliyetlidir satırları. Protein işe alım ve Satım mikro ışınlanmış sitelerdeki çalışmanın da genom bakım faktörler dinamik davranışını tanımlamak için gereken zahmetli el ile görüntü analizi tarafından durdurulmasını emretti.
İşte, BrdU veya BBET nükleik asit leke içeren hücrelerin öncesi Sensitizasyonu 405 nm lazer bir ortak confocal mikroskop genom bakım faktörü dynamics DNA lezyonlar, izleme sağlar mikro-ışınlama kullanarak takip göstermektedir. γ-H2A.X ya da RPA karmaşık alt birimleri için daha fazla alan derinliği ve deconvolution z istifleme birlikte platform işaretçileri için geliştirilmiş çözünürlük kullanarak yerel olarak DSBs için yaymak için bu işe faktörler ayırımcılık deneyci sağlar ilk lezyon çevreleyen büyük Kromatin etki alanları. Bu alt sınıflandırma ayrı intra nükleer bölmeleri göre mikro ışınlanmış sitelere işe uncharacterized proteinlerin potansiyel rolleri rafine yardımcı olur. Ayrıca, uygun iletişim kuralları sağlar ve boru hatları hızla genom bakım faktörler istimal açık kaynak yazılım Fiji (ImageJ dağıtım)6,7,8dinamiklerini analiz etmek için en iyi duruma getirilmiş. Geçerli mikro-radyoterapi yöntemleri için bu ayrıntılandırmaları DDR çalışmanın hemen hemen herhangi bir laboratuvar ortamında mümkün kılıyor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. ön Sensitizasyonu hücre
- mikro-ışınlama deneme önce 24 h tohum 1 x DMEM içeren 8-şey kültür FBS 405 nm lazer ışığı ve mükemmel görüntüleme maksimal geçirgenliği sağlamak için 170 µm kalınlığında coverslip benzeri cam/polimer dipleri ile slaytlar % 10 bir kuyu başına 40.000 U2OS hücre bir lazer tarama ile confocal mikroskop ters. Bir 8-şey microslide kullanarak medya veya çözümleri 500 µL iyi tüm sonraki tedaviler ve yıkama adımları protokolü için kullanın.
Not: düz onların morfolojisi nedeniyle iyi yapışma ve büyük çekirdekler, U2OS hücreleri mikro ışınlanmış sitelerdeki protein alımı algılama kolaylaştırmak ancak diğer yapisan hücre tipleri gerektiğinde kullanılabilir. Hücreleri ideal yaklaşık % 80'i olması gerektiğini confluency sayısını artırmak için mikro-radyoterapi anda ışınlanmış hücre başına deney. Çok yüksek izdiham belirli onarım yolları hücre döngüsü9S ve G2 aşamaları sırasında gerçekleşir homolog rekombinasyon gibi huzursuz hücre döngüsü değişikliklere neden olabilir. - Gecede 37 ° C'de % 5 CO2hücreleri kuluçkaya ve hücreleri (Adım 1.3) ile önceden duyarlı BrdU veya (Adım 1.4) BBET (Höchst 33342).
Not: canlı işe bir protein DNA lezyonlar (POI) ilgi gözlemlemek için transfect veya hücre tohum sonra bir füzyon floresan bir protein ve POI 24 s arasında taşıyan plazmid DNA transduce. 24 saat sonrası-transfection/iletim, önceden duyarlı ve gerçek zamanlı olarak DNA hasarı sitelerdeki POI alımı izlemek için hücreleri mikro ışınlatayım. - Fuar için 405 nm lazer tarafından oluşturulan DSBs sayısını artırmak için mikro-Işınlama önce 24 h için medya BrdU 10 µM ekleyin. Mikro-Işınlama önce bir micropipette kullanarak, fenol maksimal maruz 405 nm lazer hücre sağlamak için kırmızı olmadan orta iki kez hücrelerle durulayın.
- Alternatif olarak, hücre, hücre kültürü kuluçka 37 ° C'de uygun ortamda 10 µg/mL BBET ile 15 dakika tedavi İki kez fenol kırmızı mikro-Işınlama önce olmadan orta ile kullanımdan sonra durulayın.
2. hücre mikro-ışınlama
- Uygun lazer tarama confocal mikroskop seçin.
Not: Burada sunulan deneyler bir 50 mW 405 nm lazer çizgi ve 63 X 1.4 sayısal diyafram petrol amacı ile donatılmış bir mikroskop sistem üzerinde gerçekleştirilmiştir. DSBs üretmek için hücreleri 1 X 1024 x 1024 piksel/Field (0,21 µm/63 X büyütme, piksel) tarama zum mikro radyasyona maruz ve tek yönlü modunda 8 µs/piksel. Kullanılan lazer güç sırasıyla % 25 ve % 80 BBET - ve BrdU-pre-duyarlı hücreler için yapıldı. Kullanıcıların kendi sistem yapılandırmasına yardımcı olmak için lazer güç sonrası amaç sunulan sistemde üreticinin yönergelerine uygun bir güç metre kullanılarak ölçülmüştür. Ölçümler 2,6 için karşılık gelen mW ve 7,0 mW için BBET - ve BrdU-pre-duyarlı hücreleri, anılan sıraya göre. -
Mikroskop ve çevre odası açın.
- Örnekleri hücrelere gereksiz stres önlemek için ve homojen DDR Kinetik deney sağlamak için sahne alanı üzerinde kombine kuluçka makinesi içine yerleştirmeden önce odayı 37 ° C % 5 CO2 ayarla.
-
İyi dağıtılmış hücrelerle alanları seçin, odağı ayarlamak ve konumlarını resim alma Eğer Protokolü sonra kolaylaştırmak için kayıt. Mikro-ışınlama sonra protein alımı Kinetik izlemek için bir ön hasar başvuru noktası olarak hizmet edecek en az bir resim elde etmek.
Not: Gridded kültür damarları da mikro ışınlanmış hücre sonraki adımlar yerelleştirme kolaylaştırmak için kullanılabilir.- BBET etiketli hücreleri kullanarak Eğer deneyler için yersiz DNA hasarı önlemek için en düşük lazer güç hücreleri görselleştirmek için yeterli 405 nm lazer kullanarak hücreleri üzerinde odak noktası ayarlayın.
- Mor ötesi ışık lamba tarafından yayılan DNA hasarı ışıklı sitelerde neden gibi BBET lekeli hücreleri üzerinde odak ayarlamak için widefield floresan kullanmaktan kaçının.
- BrdU etiketli hücreleri kullanıyorsanız, alt nükleer şekil öyle aynı derecede nükleulus bakarak fark girişim kontrast (DIC) veya faz kontrast görüntüleme kullanarak odağı ayarlayın.
- İÇY'leri Fluorescently etiketli ifade hücreleri kullanarak, bir odak düzlemi temsilcisi floresan yoğunluğu ile seçin.
Not: güçlü overexpression manipülasyonun yerelleşme neden olabileceğinden POI düzeyi çok yüksek hızlı hücreleri kaçının. Ayrıca, POI (istikrarlı klonlar yelpazesi POI ifade ve işe alım seviyeleri farklılığı en aza indirmek için önerilir) karşılaştırılabilir düzeyde hızlı hücreleri seçin.
- BBET etiketli hücreleri kullanarak Eğer deneyler için yersiz DNA hasarı önlemek için en düşük lazer güç hücreleri görselleştirmek için yeterli 405 nm lazer kullanarak hücreleri üzerinde odak noktası ayarlayın.
- Mikroskop sistem photobleaching (sıkı BAĞLAMAK) _module sonra Floresans kurtarma kullanarak mikro-ışınlama adım için yapılandırın.
Not: en önemli parametreler mikroskop sistem mikro-ışınlama deneyler için ayarlama göz önünde bulundurun: 405 nm lazer (Yani, sayı lazer üzerinde aynı koordinatlarda gidecek kez), yineleme sayısını çıkış gücü piksel/alan sayısı (63 X büyütme ve 1024 x 1024 çözünürlük, 1 piksel, 0,21 µm =) ve piksel başına Işınma Zamanı. Tüm bu faktörlerin hücreleri deneyim enerji miktarı etkisi olacak ve böylece oluşturulan (bkz: tartışma daha fazla doz en iyi duruma getirme bilgi için) miktarı ve türü DNA'sının zarar. - Mikroskop sistem sıkı BAĞLAMAK modülü kullanılarak, mikro-hücreleri ışınlatayım.
Not: çoğu sistemde mikro-ışınlama birden fazla hücreyi tek bir alanda noktalar ya da çizgiler/dikdörtgenler (geniş genellikle 1-2 µm) olarak gerçekleştirilebilir. Canlı görüntüleme fluorescently etiketli proteinlerin gerçekleştirirken hemen sonrası hasar, mikro ışınlatayım-her hücre için geçen süre DDR gecikmiş bir indüksiyon içinde neden olur çünkü mikro-ışınlama küçük bir alan başına hücre sayısı için sınırlama. Bu proteinler DNA lezyonlar için çok hızlı bir şekilde işe izlerken özellikle önemlidir. -
Mikro-ışınlama, çok iyi slaytlar veya tabak bir kuluçka %5 CO2 37 ° C'de işleme örnekleri için önce gerekli süre için koy (Bölüm 5) sonra veya hemen canlı görüntüleme ile devam (Bölüm 3).
- İlk adım olarak, bir kaç dakika içinde ve en fazla bir kaç saat sonrası radyoterapi Eğer iletişim kuralı için hücreleri tamir. İşe Alım Kinetik POI bağlı olarak değişebilir. Genellikle, DSBs ve SSBs Kromatin ilişkili proteinler çok hızlı bir şekilde lezyon için yerelleştirilmesine ve bazen 5 dk içinde kaldırılır. Bu da ssDNA bir araya gibi bazı faktörler rezeksiyon makine meşgul olan bir kez daha sonraki zaman noktalarda alınacaktır ve orada saat için (bkz: şekil 1 ve başvuru4) kalır.
3. canlı görüntüleme Fluorescently etiketli proteinlerin
- Mikro ışınlanmış hücre zaman hata görüntüleme gerçekleştirmek. Bir plato elde kadar her 1-2 dk lezyonlar için çok hızlı bir şekilde işe, bir kaç saniye kare başına ideal olacaktır, ancak hasarlı bölgeyi için daha sonra (örneğin, rezeksiyon faktörleri), satın alma yerelleştirmek proteinler için olabilir proteinler gerçekleştirilen için.
Not: mümkün olduğu kadar ağartma önlemek için ve protein alımı hasar sitelerdeki sinyal miktar engel doygunluk ulaşmak değil emin olmak için resim alma için lazer gücü en aza indirmek ve sonraki inceliyor (bkz: veri analizi Bölüm 4). Sunulan sistemde görüntüleme 63 X ile yapıldı / 1.4 petrol kullanarak bir 8 µs/piksel Işınma Zamanı, 1024 x 1024 çözünürlük, 1 X zoom, objektif ve 2 / ortalama. Not Bu parametreler diğer sistemleri ve/veya farklı deneyler için optimize edilmiş olması gerekebilir. - Mikro ışınlatayım-Kinetik ölçümleri kadar ek alanlar hücrelerde için 15-30 hücre elde edilir. Doğruluk ve işe alım Kinetik tekrarlanabilirlik emin olmak için en az 3 kez biyolojik çoğaltır deneylerde yineleyin.
Not: Bu iletişim kuralı belirli bir confocal sistemine adapte, o bilinen fluorescently etiketli genom bakım faktörü işe alım Kinetik izleyerek başlatmak yararlı olabilir (örneğin, 53BP1-GFP, RPA32-GFP, vb). Mikro-ışınlama koşulları optimize etmek için canlı görüntüleme kullanarak kullanıcının birden çok parametre hızla test etmek izin verir.
4. işe alım Kinetik analizi
- Microirradiation analiz eklenti10 içinde Fiji görüntü analiz yazılımı11yükleyin.
-
Fiji'de alınan görüntüleri açın. "Hasar Analyzer" Microirradiation Analysis Suite açılan plugins menüsünden seçin. Bir arka plan bölgesi faiz (ROI) (genellikle 3 x 3 µm) ve sigara ışınlanmış ve ışınlanmış ROIs her mikro ışınlanmış hücre tanımlamak için istemleri izleyin.
- Potansiyel önyargıları en aza indirmek için kullanım ROIs aynı büyüklükte sinyal yoğunluklarda demek. Elde edilen görüntüler için de temel olarak işe mikro ışınlanmış sitelerde izlemek için kullanılan en az bir ön ışınlama çerçeve içerir.
- Tam hızlandırılmış serisi üzerinde tüm yatırım Getirisi veri topladıktan sonra sonuçlarını içeren bir csv (virgülle ayrılmış dosya) veya txt dosyası (sekmeyle ayrılmış) olarak eklenti tarafından oluşturulan dosyayı kaydedin. Bu dosya her zaman noktası ve her ROI (yani yoğunluğu arka plan, yani yoğunluğu olmayan ışınlanmış ve demek ışınlanmış yoğunluğu) için ortalama yoğunluk ölçümleri içerir.
Not: Eklenti otomatik olarak arka plan yoğunluğu çıkarır (benb) düşük radyasyonlu ROIs yoğunluğu (bens) ve sigara ışınlanmış ROIs (benn). Ayrıca photobleaching (ışınlanmış/sigara-ışınlanmış) düzeltmek için (bkz. aşağıdaki formül) her iki değer arasında bir oranı hesaplar.
Eklenti Ayrıca bir normalleştirme arasında ilk zaman noktası (değeri 1 olarak ayarlayın) ve tüm hesaplar (oranı ilk kez noktaya göre) her çekirdek için diğer zaman puan. Ek bilgi-ebilmek bulunmak üstünde eklenti web sitesi10.
-
Tüm mikro ışınlanmış hücreleri için (en az 15-30) eklentisi kullanarak Çözümlemeyi gerçekleştirmek ve zaman içinde ortalama göreli zenginleştirme mikro radyasyona maruz bölgeler itibariyle grafiğini çizer. Her veri için ortalama standart hataları işaret ve onları arsa hesaplayın.
- İşe Alım Kinetik öğrencinin tgerçekleştirerek iki deneysel koşullar arasında farklılıklar onaylamak-testler her veri noktası için.
5. Eğer iletişim kuralı
-
Eğer çözümleri hazırlayın. Pre/post-extraction çözüm hazırlamak (% 0.25 içeren buz gibi 1 x PBS Triton X-100), çözüm yıkama (1 x PBS % 0.05 içeren ara-20), çözüm engelleme (% 3 BSA ve %0,05 içeren 1 x PBS ara-20) ve fiksasyon çözüm (Paraformaldehyde % 3 + sukroz %2 PBS 1 içinde x) konik polipropilen borular içinde.
Not: tek bir 8-şey microslide için pre/post-extraction çözüm, çözüm, engelleme çözüm 10 mL ve 5 mL fiksasyon çözeltisi yıkama 50 mL 10 mL gereklidir.- Fiksasyon çözüm hazırlamak.
- Kimyasal bir başlık altında çift distile su (GKD2O) 400 mL paraformaldehyde 15 g ve 1 L Erlenmeyer şişeye 10 N NaOH 30 µL karıştırın.
- Konteyner ve manyetik karıştırıcı sıcak tabakta 65 ° C ısıda paraformaldehyde tamamen solubilize için karıştırarak kapatın.
- 25 mL pipet kullanarak, 50 mL 10 X PBS, heyecan ve 0,45 µm filtre kullanarak filtre ekleyin.
- 10 g Sükroz ekleyin ve 500 ml GKD2O. ile tamamlamak
- Aliquot 15 mL konik tüpler çözümde; -20 ° C'de kullanmak kadar saklamak.
- Çözüm 1 mg/mL 4,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI) 1:1,000 1 x PBS içinde stok çözeltisi sulandrarak boyama çekirdeklerin hazırlayın.
- Fiksasyon çözüm hazırlamak.
- Bir micropipette kullanarak, dikkatle medyayı çok iyi mikroskobu slaytlar veya tabak kuyulardan çıkarıp hemen çözüm iki kez beklemeden değiştirerek Eğer çamaşır çözüm 500 µL ile yıkayın.
Not: Burada sunulan Eğer veri yıkanmış ve tüm çözümler 500 µL içinde inkübe 8-şey mikroskobu slaytlar yetiştirilen hücreleri kullanılarak elde edilmiştir. Birimleri Denemecileri tarafından kullanılan hücre kültürü kapları bağlı olarak ayarlanmalıdır. Ayrıca, hücreleri kolayca cam/polimer alttan bağlantısını kesin olarak aşırı kaygı eğer protokolüyle gerçekleştirin. Bir micropipette tüm çözüm değişiklikleri için hücre kaybı en aza indirmek için kullanın. - Buz gibi Eğer pre/post-extraction çözüm ve girdap hafifçe el ön ayıklama gerçekleştirmek 15-30 s tarafından bu adım 500 µL ile 5 dk en sitoplazmik ve nucleoplasmic proteinleri kaldırır ve Kromatin sinyalini en üst düzeye çıkarır buz üzerinde kuluçkaya / DNA ilişkili faktörler.
- Eğer çamaşır çözüm 500 µL ile iki kez yıkayın.
- Eğer fiksasyon çözeltinin 500 µL oda sıcaklığında için 15 dk kuluçkaya. Alternatif olarak, önceden yapılmış paraformaldehyde çözüm (3-%4) fiksasyon adım için kullanın.
- Eğer çamaşır çözüm 500 µL ile iki kez yıkayın.
- On Ice buz gibi Eğer pre/post-extraction çözüm 500 µL içinde 5 min için kuluçkaya ve sürgüyü yavaşça elle permeabilization adımı gerçekleştirmeniz için girdap.
- Eğer çamaşır çözüm 500 µL ile iki kez yıkayın.
- Eğer engelleme çözüm olarak 500 µL oda sıcaklığında en az 30 dk kuluçkaya.
- Bir micropipette kullanarak engelleme çözümü kaldırmak ve gecede 4 ° C'de oksijen odasında çözüm engelleme seyreltilmiş 250 µL birincil antikorlar ile kuluçkaya.
Not: Kuluçka ardışık olarak potansiyel eş yerelleştirme eserleri önlemek için birincil antikorlar ile gerçekleştirmek için iyi bir yöntemdir. Bir kez uygun denetimleri gerçekleştirilmiş, aynı anda sürecini hızlandırmak için birincil antikorlar kuluçkaya. - Eğer çamaşır çözüm nazik ajitasyon (bir rotator üzerinde 60 rpm) ile 5 dakika içinde 500 µL için dört kez yıkayın.
- Oksijen odası engelleme çözümde seyreltilmiş ikincil antikorların 250 µL ile 37 ° C'de 1 h için kuluçkaya.
Not: ikincil antikorlar fluorescently etiketli eklenmesi üzerine ışık örnekleri korumak. - Dört kez her 5 min için 500 µL Eğer çamaşır çözüm nazik ajitasyon ile yıkayın.
- 1 x PBS 1 µg/mL çekirdek leke DAPI içeren 500 µL içinde 5 min için oda sıcaklığında kuluçkaya.
- 1 x PBS 500 µL ile iki kez yıkayın ve görüntüleme için PBS çözüm x 1 500 µL hücrelerde bırakın.
- Gridded slaytlar veya kayıtlı sahne pozisyonları kullanarak, iyi karakterize bir DNA hasarı işaretçisi kullanarak mikro ışınlanmış hücreleri bulma (örneğin, γ-H2A.X, RPA32, vb).
- Görüntü çok iyi kültür slaytlar veya uygun ayarlar üzerinde lazer tarama confocal mikroskop kullanarak tüm ilgili Kanallar levha.
Not: 63 X ile görüntüleme sunulan sistemde yapılan / 1.4 petrol kullanarak bir 8 µs/piksel Işınma Zamanı, 1024 x 1024 çözünürlük, 1 X zoom, objektif ve 2 / ortalama. Not Bu parametreler diğer sistemleri ve/veya farklı deneyler için optimize edilmiş olması gerekebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mikro-ışınlama hücreleri genom bakım proteinler1,12niteliğine bağlı olarak belirli bir süre için yeniden elde etmek için izin verilir. DSBs enzimler tarafından en yaygın olarak hızla RPA ve diğer genom bakım faktörler9tarafından kaplı ssDNA sınırlı bir bölge oluşturmak için hücre döngüsünün S ve G2 aşamaları sırasında işlenir. Bu ssDNA bölgede yaygın olarak işe alım ve Satım diğer DDR faktörler13düzenleyen DDR sırasında değiştirilmiş Kromatin çevrilidir. Protein alımı mikro radyasyona maruz bölgeler için Eğer tarafından izlenen (şekil 1A). Genellikle, Kromatin ilişkili faktörler (örneğin, γ-H2A.X, 53BP1, vb) daha önceki (1 – 5 dk az) tespit kez Puan ssDNA bağlı proteinler daha nükleaz aracılı rezeksiyon DSB biter RPA-ssDNA platformu oluşturmak için gerekli çünkü (≥10 dk.) Görüntü analizi ve yayın kolaylaştırmak için otomatik olarak bir DNA boya ilişkili kanalı (örneğin, DAPI), kullanarak hücre çekirdeği özetlendiği bir Fiji komut dosyası (Outliner)10 tasarladılar mikro-ışınlama ayırt etmek kolaylaşır çizgili ve tek tek hücreler bilmeyengeceler DNA son görüntülerden nükleer tanımı (şekil 1B) koruyarak boyama dışarı bırakarak.
Γ-H2A.X ve RPA karmaşık alt birimleri için faktörler, Kromatin ve ssDNA ilgili işaretleri sırasıyla görevi. RPA-ssDNA punctate foci γ-H2A.X antikor (şekil 1 c) tarafından dekore edilmiş büyük floresan Kromatin çizgili çevrili olarak görünür. Bu işaretçileri olan eş yerelleştirme tam olarak genom bakım faktörler DNA lezyonlar, konumunu tanımlamak için kullanılabilir. Örneğin, 53BP1, DSB onarım yolu seçim denetleyen bir Kromatin ilişkili protein de γ-H2A.X sinyal13ile birlikte yerelleştirir. Tersine, PRP19, ATR harekete geçirmek ve DNA tamiri tanıtmak için RPA-ssDNA işlevlerine yakından RPA32 dağıtım14,15,16,17 maç punctate foci işe ki bir E3 Ubikuitin ligaz (Şekil 1 d). Dikkat, bazı faktörler de ilk lezyonlar bitişik Kromatin üzerinde işe ama DSBs γ-H2A.X ve 53BP1 gibi çevreleyen büyük etki alanlarına yaymak değil. Bu gibi durumlarda, bu faktörler punctate foci görünür ama mükemmel ssDNA bağlı proteinler ile birlikte yerelleştirilmesine değil.
Imaging, canlı hücre hücreleri floresan bir marker ile öğesini bir POI ifade olabilir için mikro radyasyona maruz ve gerçek zamanlı olarak yansıması son derece elde etmek için işe alım Kinetik (şekil 2A-C) ayrıntılı. Floresan etiketlerine hayalice birbirinden ayrılabilir şartıyla birden fazla farklı proteinler aynı anda görülebilir. Zaman serisi analizi kolaylaştırmak için kullanıcının zaman serileri bilgi (Movie Maker, şekil 2C Online ek malzeme olarak bkz: Film) içeren film dosyaları üretmek ve protein ölçmek için izin iki Fiji komut dosyası oluşturduk İşe Alım mikro ışınlanmış siteleri (hasar Analyzer)10. Normal bir protein davranışını tanımlamak için gerekli zaman alan el ile görüntü küratörlüğü yerine zarar Analyzer komut dosyası sinyal zenginleştirme siteleri, mikro radyasyona maruz iken otomatik olarak izlemek aerodinamik adımlarda kullanıcı kılavuzları hücre hareketi için düzeltme, görüntü drift, arka plan sinyal ve ağartma puanı deneme ne zaman istersen. Oluşturulan veri daha sonra kolayca bir elektronik tablo uygulaması derlenmiş ve gerekli (şekil 2B) çizilen.
Şekil 1: Genom bakım yerelleştirilmesini faktörler Kromatin ve mikro ışınlama bağlı lezyonlar RPA-ssDNA platformları için. (A)lazer mikro-ile önceden duyarlilasmis hücrelerdeki endo - ve exo-ssDNA oluşturmak için enzimler tarafından rezeke DNA çift iplikçikli sonları üretimine yol açar. SsDNA alt bölmenin punctate foci kullanarak çoğaltma Protein A karşı antikor veya diğer ssDNA lokalize faktörler görüntülenmeyecektir. Buna ek olarak, protein veya büyük Kromatin etki alanlarına yayılmış değişiklikler mikro ışınlanmış sitesinde fosforile Histon değişken H2A hedefleme antikorlar ile gözlenen desen benzer büyük çizgiler olarak görünür. (γ-H2A.X) X. (B) hücreleri ile BBET önceden sensitize veya BrdU mikro ışınlanmış, önceden ayıklanan, sabit ve belirtilen proteinler için lekeli. 12-bit görüntüleri 1 X yakınlaştırma toplanmıştır ve Outliner Fiji komut dosyası kullanılarak işlenebilir. (C) Z-istifleme BBET veya BrdU önceden duyarlilasmis hücre ssDNA ve Kromatin ilişkili faktörler (maksimum yoğunluk Z-projeksiyon gösterilen) çözünürlük sağlar. (D) kullanma bu yöntem, 53BP1 ve PRP19 genom bakım faktörler Kromatin ve ssDNA ilgili, anılan sıraya göre sınıflandırılabilir. Ölçek çubukları 10 µm; = d aynı ölçekte görüntülerdir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 : Canlı görüntüleme RPA karmaşık işe alım siteleri için DNA hasarı. (A)sabit veya geçici transfection aday protein flüoresan gazetecilere mikro-ışınlama transfected hücreleri tarafından takip edilen kodlama Plazmidler, sağlar gerçek zamanlı olarak DNA lezyonlar için protein alımı izleme. (B) hücreleri bir pDEST47-RPA32-GFP plazmid ile transfected ve daha sonra 24 saat lysed. Protein ifade immunoblotting tarafından doğrulandı. (C) hücreleri ile pDEST-SFB EGFP transfected veya pDEST47 RPA32-GFP plazmid BrdU ile önceden sensitize mikro radyasyona maruz ve 12-bit adlı bir kez başına dakika sonrası ışınlama 1 X vınlamak, yansıma. Zamanlama dakika sonrası radyoterapi var. 00:00 saat noktası görüntü mikro-Işınlama önce çekildi. Film dosyaları Movie Maker Fiji komut dosyası kullanılarak oluşturulan ve anahtar çerçeveler gösterilir. Ölçek çubukları 10 µm. (D) = işe alım, RPA32-GFP mikro-ışınlama şeritler için kantitatif izlenen hasar Analyzer Fiji komut dosyası kullanarak. Çıktı verilerini Microsoft Excel kullanarak çizildi. RPA32-GFP öncesi ışınlama sinyali göre mikro ışınlanmış sitelerdeki ortalama zenginleştirme kapaðýný siyah çizgidir ve hata çubukları 15 bağımsız olarak mikro ışınlanmış hücrelerin ortalamasını standart hatasını temsil eder. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Film 1: mikro-ışınlama SFB-GFP ifade hücreleri hızlandırılmış. Geçici bir pDEST-SFB GFP plazmid ile transfected hücreleri vardı önceden duyarlilasmis 24 h BrdU, mikro radyasyona maruz ve görüntülü 29 dakika süreyle dakikada bir kez ile Bu film indirmek için buraya tıklayınız.
Movie 2: mikro-ışınlama RPA32-GFP ifade hücreleri hızlandırılmış. Geçici bir pDEST47 RPA32-GFP plazmid ile transfected hücreleri vardı önceden duyarlilasmis 24 h BrdU, mikro radyasyona maruz ve görüntülü 29 dakika süreyle dakikada bir kez ile Bu film indirmek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Yukarıda belirtilen yöntemlerle, 405 nm lazer mikro-ile BBET veya BrdU ile önceden sensitize hücre DNA lezyonlar DSBs yapisan insan hücrelerinin çekirdekleri içinde dahil yerelleştirilmiş nesil sağlar. Bu DSBs, DDR Kinetik ökaryotik hücreler9,18,19diğer yöntemleri ile oluşturulan benzer. DSB rezeksiyon mikro ışınlanmış sitelerdeki ssDNA-üretimi RPA32 hedefleme antikor veya bir RPA32-GFP füzyon kullanarak takip edilecek yol açar. Kromatin ilişkili faktörler, öte yandan, γ-H2A.X referans olarak kullanarak bulunabilir. Bazı Kromatin ilişkili faktörler uzak ilk DSB γ-H2A.X kadar yayılabilir değil ve ssDNA bağlanıcı proteinler foci farklı olabilir punctate foci olarak görünür.
Bir kez DSBs oluşturulur, protein alımı ve izni hasar sitelerden Eğer sabit hücrelerde tarafından izlenebilir. Bu deneyler gerçekleştirmek için yalnızca bir uygun eğer antikor POI karşı gerekir. Eğer uyumlu antikorlar kullanılamıyorsa, plazmidleri, genler belirli epitopları çerçeveyle ilgi taşıyan tasarlanmış (örneğin: bayrak, O'nun etiketi) veya floresan proteinler. Geçici veya sabit transfection/iletim bu Plasmid'ler yapışık hücreleri içine, daha sonra belirli bir faktör DNA hasar için aktif olarak işe olup olmadığını belirlemek için kullanılabilir. Proteinlerin overexpression mis localization-e doğru yol açabilir ve yapay olarak onların işe alım için mikro ışınlanmış çizgili artırmak. Endojen proteinlerin daha fazla temsilcisi sonuçları elde etmek için CRISPR-Cas9 teknolojisi artık rutin olarak uygun epitopları20,21ile ilgi herhangi bir gen etiketlemek için kullanılabilir.
Mikro-ışınlama analiz Fiji eklenti sağlanan Python komut dosyaları görselleştirme, sunum, yayın ve DDR proteinler Kinetik analizi kolaylaştırır. Açık kaynak ve mikro-ışınlama deneyleri ve resim alma gerçekleştirmek için kullanılan mikroskop platform ne olursa olsun işlevlerini bu analiz paketidir. Gerekli olan tek şey22biyo-formatları uyumlu dosyaları olarak mikroskobu platformda çekilen görüntüler kaydedilmesi. Arka plan beri sürüklenen ve düzeltmeler beyazlatma otomatik olarak gerçekleştirilir, DNA hasarı sitelerde sağlanan komut dosyaları ile protein düzeyleri ile gerçekleştirilen tipik el ile sinyal miktar ile karşılaştırıldığında basit ve çok hızlı analizidir mikroskop imge toplama bilgisayar yazılımı.
İletişim kuralında açıklandığı gibi kullanıcılar dikkatlice onların anılan sıraya göre lazer tarama yapılandırmanız gerekir confocal mikroskop sistemleri hasar uygun miktarda elde etmek ve normal DDR Kinetik izleyin DSBs ikna etmek için. Nitekim, miktarını ve türünü mikro-ışınlama tarafından oluşturulan DNA lezyonların lazer dalga boyu ve doz yanı sıra ön Sensitizasyonu yöntemleri bağlı olacaktır. Kullanıcı lüzum DSBs burada açıklanan koşullar tarafından oluşturulan rağmen 405 nm lazer mikro-ile photosensitized hücrelerinin de cyclopyrimidine dimer (CPDs), SSBs, dahil olmak üzere diğer DNA lezyonlar karışımı oluşturmak akılda tutulması gereken ve oksitlenmiş Tabanlar, mikroskop sistemleri ve ayarları23,24,25arasında değişir. Bu nedenle, lezyonlar sitelerdeki mikro ışınlanmış bir dikkatli izlenmesi oluşturulan hasar ve elde edildi yanıt, kapsamlı bir görünümünü elde etmek için gerçekleştirilmesi gerekir. Önemlisi, DSBs cevaben çalışmaya, her mikroskop Sistem Kinetik kurallı DNA hasarı proteinler ve mikro ışınlanmış sitelerdeki translasyonel modifikasyonlar izleyerek optimize edilmelidir. Örneğin, γ-H2A.X ve RPA karmaşık alt birimleri (RPA70, RPA32 veya RPA14) kullanılabilir uygun tespit etmek oldukça kolay ve hızlı bir şekilde DSBs birikir. Kural olarak çizgili erken (5 dk) olarak γ-H2A.X sinyal görüntülenmeyecektir ve geç (en fazla 3-4 h) zaman puan sonrası hasar RPA punctate foci biriken başlayacaktır ise yaklaşık 10-15 dk sonrası-micro-ışınlama. Bir pan-nükleer γ-H2A.X sinyal gözlem yapılırsa, hücreler tarafından alınan enerji miktarı fizyolojik olmayan ve hızlı hücre ölümüne neden olur.
405 nm lazer belirli DNA onarım yolları çalışma için kullanırken dikkate alınması gereken bazı sınırlamalar vardır. Örneğin, her ne kadar BBET-405 nm kombinasyonu kolayca SSBs ve DSBs bir arada üretir, 6 – 4 photoproducts (6 – 4 PPs) oluşturmaz ve sonuç olarak, Kinetik nükleotid eksizyon tamir protein alımı daha farklı UV-C mikro-ışınlama kullanarak görülmektedir. Kinetik ve ölçüde işe DSBs cevaben dahil çeşitli proteinlerin de kullanılan23olma yöntemi zarar DNA göre değişiklik gösterebilir. Bu varyasyonlar nedeniyle kullanıcıların potansiyel olarak onların POI'ler tarafından tanınan lezyonlar türünü en üst düzeye çıkarmak için sistemlerine adapte öneririz. Bu sistemlerin daha az geniş mevcut olmasına rağmen diğer türleri kullanarak lazerler UV-A da dahil olmak üzere (337-355 nm) veya femtosecond yakın kızılötesi (800 nm) ile birlikte farklı Sensitizasyonu reaktifler (örneğin: tri metil psoralen) kullanıcıların daha fazla üretmek izin verebilirsiniz DNA bağlı olarak belirli DNA lezyonlar yolları çalışma24,26altında onarın.
Ne zaman yeni koşulları test edilen dozlarda, dalga boyu ve ön derhal kombinasyonları test etmek ve ilgi lezyon verimli bir şekilde oluşturulur emin olmak için köklü DNA onarım proteinler fluorescently etiketli kullanmak uygun olur. Örneğin, PARP1 ve XRCC1 imleyicileri SSB ve baz eksizyon tamir için işlev görebilir, XPA nükleotid eksizyon tamir, iyi bir göstergedir ve 53BP1 DSBs ve işlev homolog sonu-(23,25 başvuran katılmak için işe ,27,28). DNA hasarı belirli türleri ile ilişkili değişiklikler de DNA düzeylerini ölçmek için kullanılabilir tanımak antikorlar adducts veya tatili. Böylece oksitlenmiş bazlar, cyclopyrimidine dimer, 6 – 4 PPs, SSBs (Poli-ADP riboz antikor kullanarak) ve DSBs (γ-H2A.X ve 53BP1) tarafından Eğer izlemek ve istenen lezyonlar23, en üst düzeyde başaracaktır parametreleri belirlemek mümkündür 27 , 29. dikkatli kontrolü ile kullanıcılar kendi onarım yolu ilgi mikro-ışınlama kullanarak çalışma gerekir.
Tamamen yerelleştirilmiş DSBs oluşturmak için 405 nm lazer çizgilerle donatılmış geniş-yayılım lazer tarama confocal mikroskoplar kullanımı genom bakım faktörler ve aerodinamik biçimli veri alt sınıflandırmak için platforma özgü DNA hasarı işaretleri ile kombine mikro-ışınlama analiz Fiji eklenti yardımı ile işleme, DDR faktörler dynamics deneyimli her ikisi de daha erişilebilir daha önce hiç olmadığı kadar çalışma ve acemi müfettişler genom bakım alanının oluşturması gerektiğini.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Bu eser Doğa Bilimleri ve mühendislik Araştırma Konseyi Kanada [keşif grant 5026 A.M için] ve yeni nesil bilim adamları bursu Kanser Araştırma Derneği [A.M 21531] tarafından desteklenmiştir. Jean-François Lucier üzerinde istatistiksel analiz Fiji Python komut dosyaları ve tavsiye mükemmel kalite kontrolü sağlamak için teşekkür ederiz. Dr Stephanie A. Yazinski Eğer fiksasyon çözüm tarifi için teşekkür ederiz. Paul-Ludovic Karsenti lazer gücü ölçümleri ile yardım için teşekkür.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Olympus FLUOVIEW FV3000 resonant laser scanning confocal microscope | Olympus | ||
| FluoView FV3000 software (version 2.1) | Olympus | ||
| 405 nm laser | Coherent | Radiation source | |
| Microscope incubator AIO-UNO-OLYUS-1 | Okolab | OKO-UNO-1 | |
| 60X /1.4 Objective | Olympus | Oil immersion objective | |
| 8-well culture slides on coverglass (X-well) | Sarstedt | 94.6190.802 | |
| U2OS osteosarcoma human cell line | ATCC | HTB-96 | Stable cell lines |
| 4’,6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) | ThermoFisher | D1306 | Caution toxic |
| 5-bromo-2′-deoxyuridine (BrdU) | Sigma-Aldrich | 59-14-3 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 30525-89-4 | Caution toxic |
| Bisbenzimide H 33342 (Hoechst 33342) | ThermoFisher | 62249 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | ThermoFisher | BP1600-100 | |
| Trypsin EDTA 0.1% | ThermoFisher | 15400-054 | |
| Triton X-100 | BioShop | TRX777.100 | |
| Tween-20 | ThermoFisher | BP337-500 | |
| Sucrose | BioShop | SUC507 | |
| JetPRIME transfection reagent | Polyplus | 114-07 | |
| ProLong Diamond Antifade mountant with DAPI | ThermoFisher | P36962 | |
| DMEM 1X, + phenol red | Wisent | 319-005-CL | |
| DMEM 1X, - phenol red | Wisent | 319-051-CL | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Wisent | 080-150 | |
| Mouse anti-RPA32 antibody | Abcam | ab2175 | 1:500 for IF |
| Rabbit anti-γ-H2A.X antibody | Cell Signaling | 9718S | 1:500 for IF |
| Rabbit Anti-53BP1 antibody | Cell Signaling | 4937S | 1:500 for IF |
| Rabbit Anti-PRP19 antibody | Abcam | ab27692 | 1:500 for IF |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 647 | Cell Signaling | 4414S | 1:250 for IF |
| Goat anti-mouse IgG Alexa Fluor 488 | Cell Signaling | 4408S | 1:250 for IF |
| Fiji image analysis open-source software | https://fiji.sc | ||
| 1918-K Power meter with a 918D-SL-0D3 sensor | Newport |
References
- Ciccia, A., Elledge, S. J. The DNA damage response: making it safe to play with knives. Molecular cell. 40 (2), 179-204 (2010).
- Bekker-Jensen, S., et al. Spatial organization of the mammalian genome surveillance machinery in response to DNA strand breaks. The Journal of Cell Biology. 173 (2), 195-206 (2006).
- Limoli, A. C. L., Ward, J. F., May, N. A New Method for Introducing Double-Strand Breaks into Cellular DNA. Radiation Research. 134 (2), 160-169 (1993).
- Polo, S. E., Jackson, S. P. Dynamics of DNA damage response proteins at DNA breaks: a focus on protein modifications. Genes & development. 25 (5), 409-433 (2011).
- Lukas, C., Falck, J., Bartkova, J., Bartek, J., Lukas, J. Distinct spatiotemporal dynamics of mammalian checkpoint regulators induced by DNA damage. Nature cell biology. 5 (3), 255-260 (2003).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Collins, T. J.
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Symington, L. S., Gautier, J. Double-strand break end resection and repair pathway choice. Annual review of genetics. 45, 247-271 (2011).
- Garneau, D., Maréchal, A. Microirradiation Analysis Fiji Plugin. , Available from: https://bitbucket.org/daniel_garneau/microirradiation_analysis/ (2017).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Izhar, L., et al. A Systematic Analysis of Factors Localized to Damaged Chromatin Reveals PARP-Dependent Recruitment of Transcription Factors. Cell Reports. 11 (9), 1-15 (2015).
- Panier, S., Boulton, S. J. Double-strand break repair: 53BP1 comes into focus. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (1), 7-18 (2013).
- Maréchal, A., et al. PRP19 Transforms into a Sensor of RPA-ssDNA after DNA Damage and Drives ATR Activation via a Ubiquitin-Mediated Circuitry. Molecular Cell. 53 (2), 235-246 (2014).
- Dubois, J. -C., et al. A phosphorylation-and-ubiquitylation circuitry driving ATR activation and homologous recombination. Nucleic Acids Research. 45 (15), 8859-8872 (2017).
- Wan, L., Huang, J. The PSO4 Complex Associates with RPA and Modulates the Activation of ATR. The Journal of Biological Chemistry. 289 (10), 6619-6626 (2014).
- Abbas, M., Shanmugam, I., Bsaili, M., Hromas, R., Shaheen, M. The role of the human Psoralen 4 (hPso4) complex in replication stress and homologous recombination. The Journal of Biological Chemistry. 289 (20), 14009-14019 (2014).
- Chung, W. H., Zhu, Z., Papusha, A., Malkova, A., Ira, G. Defective resection at DNA double-strand breaks leads to de novo telomere formation and enhances gene targeting. PLoS Genetics. 6 (5), (2010).
- Hicks, W. W. M., Yamaguchi, M., Haber, J. E. Real-time analysis of double-strand DNA break repair by homologous recombination. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (8), 3108-3115 (2011).
- Lackner, D. H., et al. A generic strategy for CRISPR-Cas9-mediated gene tagging. Nature Communications. 6, 10237 (2015).
- Ratz, M., Testa, I., Hell, S. W., Jakobs, S. CRISPR/Cas9-mediated endogenous protein tagging for RESOLFT super-resolution microscopy of living human cells. Scientific Reports. 5 (9592), (2015).
- Linkert, M., et al. Metadata matters: Access to image data in the real world. Journal of Cell Biology. 189 (5), 777-782 (2010).
- Dinant, C., et al. Activation of multiple DNA repair pathways by sub-nuclear damage induction methods. Journal of Cell Science. 120 (15), 2731-2740 (2007).
- Kong, X., et al. Comparative analysis of different laser systems to study cellular responses to DNA damage in mammalian cells. Nucleic Acids Research. 37 (9), e68 (2009).
- Holton, N. W., Andrews, J. F., Gassman, N. R. Application of Laser Micro-irradiation for Examination of Single and Double Strand Break Repair in Mammalian Cells. Journal of Visualized Experiments. (127), (2017).
- Thazhathveetil, A. K., Liu, S. T., Indig, F. E., Seidman, M. M. Psoralen conjugates for visualization of genomic interstrand cross-links localized by laser photoactivation. Bioconjugate Chemistry. 18 (2), 431-437 (2007).
- Mortusewicz, O., Amé, J. C., Schreiber, V., Leonhardt, H. Feedback-regulated poly(ADP-ribosyl)ation by PARP-1 is required for rapid response to DNA damage in living cells. Nucleic Acids Research. 35 (22), 7665-7675 (2007).
- Kleiner, R. E., Verma, P., Molloy, K. R., Chait, B. T., Kapoor, T. M. Chemical proteomics reveals a γH2AX-53BP1 interaction in the DNA damage response. Nature Chemical Biology. 11 (10), 807-814 (2015).
- Soultanakis, R. P., et al. Fluorescence detection of 8-oxoguanine in nuclear and mitochondrial DNA of cultured cells using a recombinant Fab and confocal scanning laser microscopy. Free Radical Biology and Medicine. 28 (6), 987-998 (2000).
