Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Indagine di assunzione di proteine per lesioni del DNA utilizzando 405 Nm Laser Micro-irradiazione

Published: March 20, 2018 doi: 10.3791/57410
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1, 1, 1
1Department of Biology, Université de Sherbrooke
* These authors contributed equally

Summary

Studiare la cinetica di riparazione danni del DNA richiede un sistema di indurre lesioni alle regioni definite sub-nucleare. Descriviamo un metodo per creare interruzioni di double-stranded localizzate utilizzando un microscopio confocale a scansione laser, dotato di un laser di 405 nm e forniscono procedure automatizzate per quantificare la dinamica di fattori di riparazione a queste lesioni.

Abstract

La risposta di danno del DNA (DDR) utilizza una pletora di proteine per rilevare, segnalare e riparare le lesioni del DNA. Delineazione di questa risposta è fondamentale per capire i meccanismi di manutenzione del genoma. Dal momento che il reclutamento e lo scambio di proteine alle lesioni sono altamente dinamici, il loro studio richiede la capacità di generare danni al DNA in maniera rapida e spazialmente delimitato. Qui, descriviamo le procedure per indurre localmente il danno del DNA in cellule umane utilizzando un microscopio confocale laser-scanner comunemente disponibile dotato di una linea di laser 405 nm. Accumulo di manutenzione genoma fattori alle strisce di laser possono essere valutati mediante immunofluorescenza (IF) o in tempo reale utilizzando proteine etichettati come reporter fluorescenti. Utilizzando fosforilato istone H2A. X (γ-H2A.X) e Replication Protein A (RPA) come marcatori, il metodo fornisce una risoluzione sufficiente per discriminare fattori reclutati da coloro che si sono diffuse sulla cromatina adiacente. Forniamo ulteriori script basati su ImageJ per monitorare in modo efficiente la cinetica di rilocalizzazione della proteina al DNA danni siti. Questi perfezionamenti semplificano notevolmente lo studio della dinamica della DDR.

Introduction

Le cellule sono costantemente esposti a fonti endogene ed esogene di danno del DNA che minacciano l'integrità genomica. Il DDR è un insieme di vie che rilevare, segnalare e ripristino le lesioni del DNA per sostenere la stabilità del genoma di segnalazione. Alle rotture del doppio filamento del DNA (DSBs), la DDR si verifica principalmente su due piattaforme complementari: γ-H2A.X-labeled cromatina e una regione di DNA (ssDNA) single-stranded resecata in genere rivestito con il ssDNA-associazione complessa RPA1,2.

Micro-irradiazione UV-laser delle cellule pre-sensibilizzate con la timidina analogica 5-bromo-2' deoxyuridine (BrdU) o la tintura di DNA bisbenzimide etossido triidrocloruro (Giordano, Hoechst 33342) crea una miscela di lesioni del DNA tra cui rotture del singolo filamento ( SSB) e DSBs che suscitare un DDR localizzato sulla cromatina sia ssDNA piattaforme3,4. Lavori precedenti hanno mostrato che il reclutamento di fattori di mantenimento del genoma per queste due piattaforme distinte al DSB può essere discriminata utilizzando laser a raggi UV-A ad alta energia (335-365 nm) combinato con se2,5. Microscopi dotati di tali laser sono costosi, in quanto richiedono un laser ad alta energia e obiettivi trasmettenti dedicati di UV-A che li rende molto meno prevalente in contesti accademici e farmaceutici che microscopi confocale a scansione laser con laser 405 nm linee. Lo studio di assunzione di proteine e di scambio in siti di micro-irradiati è interdetto anche dall'analisi manuale laborioso dell'immagine necessario per descrivere il comportamento dinamico di fattori di mantenimento del genoma.

Qui, indichiamo che il pre-sensibilizzazione delle cellule con BrdU o Giordano acido nucleico macchia seguita da micro-irradiazione con un laser di 405 nm su un comune microscopio confocale permette il monitoraggio delle dinamiche di fattore di manutenzione genoma a lesioni del DNA. L'utilizzo di γ-H2A.X o subunità complessa RPA come marcatori di piattaforma insieme a z-stacking per una maggiore profondità di campo e deconvoluzione per una migliore risoluzione consente lo sperimentatore di discriminare i fattori che sono reclutati localmente a DSBs da quelle che si diffondono a domini di cromatina grande che circonda la lesione iniziale. Questa sub-classificazione secondo distinti compartimenti intra-nucleare aiuta a perfezionare i potenziali ruoli delle proteine atipici reclutati ai siti di micro-irradiati. Inoltre, forniamo conveniente protocolli e ottimizzato condutture per analizzare rapidamente la dinamica dei fattori di mantenimento del genoma utilizzando il software open-source Fiji (una distribuzione ImageJ)6,7,8. Questi perfezionamenti per gli attuali metodi di micro-irradiazione rendono lo studio della DDR possibile in praticamente qualsiasi ambiente di laboratorio.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. pre-sensibilizzazione delle cellule

  1. 24 h prima dell'esperimento di micro-irradiazione, 40.000 U2OS cellule per pozzetto in 1 x DMEM contenente 10% FBS a 8 pozzetti cultura diapositive con fondelli 170 µm di spessore lamella-come vetro/polimeri per garantire massima trasmittanza di 405 nm luce laser e un'eccellente immagine del seme con una scansione laser confocale microscopio invertito. Se si utilizza un 8 pozzetti 2mpx, utilizzare 500 µ l di media o soluzioni per pozzetto per tutti i trattamenti successivi e le fasi di lavaggio del protocollo.
    Nota: A causa della loro morfologia piatta, buona aderenza e grandi nuclei, U2OS cellule facilitano l'accertamento di assunzione di proteine in siti di micro-irradiati, ma altri tipi di cellule aderenti possono essere utilizzati come necessario. Le cellule idealmente dovrebbero essere di circa 80% irradiati confluency al momento della micro-irradiazione per aumentare il numero di cellule per esperimento. Molto alta confluenza può comportare alterazioni del ciclo cellulare che possono perturbare le vie di riparazione specifico come ricombinazione omologa che si svolge durante le fasi S e G2 del ciclo cellulare9.
  2. Incubare le cellule durante la notte a 37 ° C con 5% CO2e quindi pre-sensibilizzare le cellule con (punto 1.3) BrdU o (punto 1.4) Giordano (Hoechst 33342).
    Nota: Per osservare dal vivo reclutamento di una proteina di interesse (PDI) per lesioni del DNA, transfect o trasducono il DNA del plasmide che trasportano una fusione tra una proteina fluorescente e un PDI 24 h dopo la semina delle cellule. 24h post-transfection/transduzione, pre-sensibilizzare e micro-irradiare le cellule per monitorare l'assunzione del PDI presso siti di danno del DNA in tempo reale.
  3. Per aumentare il numero di DSBs generati da esposizione per il laser di 405 nm, aggiungere 10 µM di BrdU ai media per 24 h prima del micro-irradiazione. Prima di micro-irradiamento, usando una micropipetta, sciacquare le cellule due volte con il mezzo senza rosso fenolo per garantire massima esposizione delle cellule al laser 405 nm.
  4. In alternativa, trattare le cellule per 15 min con Giordano a 10 µ g/mL nel mezzo appropriato in un incubatore di coltura cellulare a 37 ° C. Dopo il trattamento, lavare due volte con il mezzo senza fenolo rosso prima del micro-irradiazione.

2. micro-irradiazione delle cellule

  1. Selezionare un adatto microscopio confocale a scansione laser.
    Nota: Gli esperimenti qui presentati sono stati eseguiti su un sistema di microscopio equipaggiato con una linea 50 mW 405 nm laser e un obiettivo di olio 63 X 1.4 apertura numerica. Per generare DSBs, le cellule erano micro-irradiati a 1 X scanner zoom a 1.024 x 1.024 pixel/field (0.21 µm/pixel 63 ingrandimenti) e in modalità unidirezionale a 8 µs/pixel. La potenza del laser utilizzata è stato il 25% e l'80% per celle Giordano e BrdU-pre-sensibilizzate, rispettivamente. Per aiutare gli utenti a configurare il proprio sistema, post-l'obiettivo di potenza laser sul sistema presentato è stato misurato utilizzando un misuratore di potenza secondo le istruzioni del produttore. Le misure corrispondono a 2,6 mW e 7.0 mW per Giordano e BrdU-pre-sensibilizzate le cellule, rispettivamente.
  2. Accendere il microscopio e la camera ambientale.
    1. Impostare la camera a 37 ° C con 5% CO2 prima campioni vengono posti in incubatrice sul palco per evitare inutili stress alle cellule e garantire cinetiche omogenee di DDR attraverso esperimenti.
  3. Selezionare uno o più campi con cellule ben distribuiti, regolare la messa a fuoco e registrare la loro posizione per facilitare l'acquisizione di immagini dopo il protocollo di se. Acquisire almeno un'immagine che servirà come punto di riferimento pre-danni per monitorare la cinetica di reclutamento di proteine dopo micro-irradiazione.
    Nota: Recipienti di coltura Gridded possono anche essere utilizzati per facilitare la localizzazione delle cellule micro-irradiati a passi successivi.
    1. Per gli esperimenti se usando le cellule Giordano-etichettati, regolare il fuoco sulle cellule utilizzando il laser 405 nm con il minimo consumo di laser sufficiente per visualizzare le celle al fine di evitare ingiustificato danno del DNA.
      1. Evitare di utilizzare widefield fluorescenza per regolare il fuoco sul Giordano-macchiato le cellule, come i raggi UV emessi dalla lampada può indurre il danno del DNA in siti illuminati.
    2. Se usando le cellule di BrdU-etichettati, regolare il fuoco utilizzando imaging contrasto di fase o contrasto differenziale di interferenza (DIC) guardando sub-nucleare caratteristiche quali i nucleoli.
    3. Se utilizza cellule esprimenti POIs fluorescente-etichetta, selezionare un piano focale con l'intensità di fluorescenza rappresentativo.
      Nota: Evitare di cellule che esprimono livelli molto alti del PDI come forte sovraespressione può provocare artifactual localizzazione. Inoltre, selezionare le celle che esprimono il PDI a livelli comparabili (selezione di cloni stabili si raccomanda vivamente di minimizzare le variazioni nei livelli di espressione e reclutamento di PDI).
  4. Configurare il microscopio per il passaggio di micro-irradiazione usando il fluorescenza-recupero dopo Module photobleaching (FRAP) del sistema.
    Nota: I parametri più importanti da considerare quando messa a punto del sistema di microscopio per esperimenti di micro-irradiazione sono: la potenza di uscita del laser 405 nm, numero di iterazioni (cioè il numero di volte il laser andrà oltre le stesse coordinate), numero di pixel/campo (a 63 X ingrandimento e risoluzione di 1.024 x 1.024, 1 pixel = 0.21 µm) e tempo di permanenza al pixel. Tutti questi fattori avrà un impatto la quantità di energia che le cellule di esperienza e così la quantità e il tipo di DNA danni generati (Vedi discussione per ulteriori informazioni sull'ottimizzazione di dose).
  5. Utilizza il modulo FRAP del sistema microscopio, micro-irradiare le cellule.
    Nota: Sulla maggior parte dei sistemi micro-irradiazione di più celle può essere eseguita in un singolo campo come macchie o linee/rettangoli (in genere 1-2 µm di larghezza). Durante l'esecuzione di live-imaging delle proteine fluorescente etichettati immediatamente post-danneggiare, limitare il micro-irradiazione ad un piccolo numero di cellule per campo, perché il tempo impiegato per micro-irradiare ogni cella si tradurrà in un'induzione ritardata della DDR. Ciò è particolarmente importante durante il monitoraggio di proteine che sono reclutate molto rapidamente a lesioni del DNA.
  6. Dopo micro-irradiazione, rimessa le diapositive multi pozzetto o piastre in un incubatore a 37 ° C con 5% CO2 per la durata necessaria prima del trattamento campioni per se (sezione 5) o procedere immediatamente con live-imaging (sezione 3).
    1. Come primo passo, è necessario fissare le cellule in pochi minuti e fino a pochi dopo irradiazione di ore per il protocollo di se. A seconda del PDI, cinetica di reclutamento può variare. In genere, le proteine che sono della cromatina-associated presso DSBs e SSB localizzano molto rapidamente alla lesione e a volte vengono rimossi entro 5 min. Alcuni fattori come quelli che assemblano a ssDNA saranno reclutati intervalli successivi di tempo una volta che il macchinario di resezione è stato impegnato e vi rimangono per ore (Vedi Figura 1 e riferimento4).

3. vivere-imaging di proteine identificate fluorescente

  1. Eseguire time-lapse imaging delle cellule micro-irradiati. Per proteine che sono reclutate molto rapidamente alle lesioni, pochi secondi per fotogramma saranno l'ideale, ma per le proteine che si localizzano la zona danneggiata dopo (ad es., fattori di resezione), acquisizione possono essere eseguita ogni 1-2 minuti fino a raggiunta un plateau.
    Nota: Ridurre al minimo la potenza del laser per l'acquisizione immagine per evitare lo sbiancamento per quanto possibile e garantire che assunzione di proteine nei siti di danno non raggiunge saturazione che precluderebbe segnale quantificazione e analisi successive (Vedi analisi dei dati Sezione 4). Il sistema presentato, l'imaging è stato fatto con un 63 X / olio 1.4 obiettivo utilizzando un tempo di permanenza di 8 µs/pixel, risoluzione 1.024 x 1.024, 1 X zoom e con una media di 2. Nota che questi parametri devono essere ottimizzati per altri sistemi e/o esperimenti differenti.
  2. Micro-irradiare le cellule nei campi aggiuntivi fino a misure cinetiche sono ottenute per 15-30 celle. Ripetere gli esperimenti almeno 3 volte in biologici replicati per garantire l'accuratezza e la riproducibilità della cinetica di reclutamento.
    Nota: Quando si adatta questo protocollo per uno specifico sistema confocale, può essere utile iniziare monitorando la cinetica di reclutamento di un fattore di manutenzione di genoma noto fluorescente etichettati (ad es., 53BP1-GFP, RPA32-GFP, ecc.). Utilizzando live-imaging per ottimizzare le condizioni di micro-irradiazione permetterà all'utente di testare rapidamente più parametri.

4. reclutamento analisi cinetiche

  1. Installare il plugin Microirradiation analisi10 in il Fiji image analysis software11.
  2. Aprire le immagini acquisite in Fiji. Selezionare "The danni Analyzer" dal menu a tendina plugin nella suite Microirradiation analisi. Seguire le istruzioni per definire un'area di sfondo di interesse (ROI) (in genere 3 x 3 µm) e non irradiati e irradiati ROIs in ogni cella di micro-irradiati.
    1. ROIs di uso delle stesse dimensioni per minimizzare potenziali pregiudizi nel dire le intensità del segnale. Per immagini acquisite, anche includere almeno un fotogramma pre-irradiazione che servirà come base per monitorare assunzione presso siti di micro-irradiati.
    2. Una volta che tutte le ROI dati sono stati raccolti nel corso della serie full time-lapse, salvare il file creato dal plugin contenente i risultati come file txt (file di delimitato da tabulazione) o csv (file delimitato da virgole). Questo file contiene misure di intensità media per ciascun punto di tempo e ogni ROI (dire sfondo di intensità, significa intensità Non irradiati e significa intensità irradiati).
      Nota: Il plugin automaticamente sottrae l'intensità di sfondo (iob) dall'intensità della ROIs irradiati (s) e il ROIs non irradiati (hon). Calcola automaticamente anche un rapporto fra entrambi i valori (Vedi la formula qui sotto) per correggere per photobleaching (irradiata/Non-irradiati).
      Equation 1
      Il plugin inoltre calcola una normalizzazione tra il primo punto di tempo (valore impostato su 1) e tutti gli altri punti di tempo per ogni nucleo (rapporto rispetto al primo punto temporale). Ulteriori informazioni sono reperibili sul sito Web plugin10.
  3. Eseguire l'analisi utilizzando il plugin per tutti i micro-irradiati cellule (almeno 15-30) e rappresentare graficamente l'arricchimento medio relativo alle regioni di micro-irradiati nel corso del tempo. Calcolare gli errori standard della media per ogni punto e tracciarle.
    1. Confermare le differenze nella cinetica di reclutamento tra due condizioni sperimentali mediante l'esecuzione di Student t-test per ogni punto dati.

5. Se protocollo

  1. Preparare soluzioni di se. Preparare la soluzione di pre/post-extraction (ghiacciata 1X PBS contenente 0,25% Triton X-100), soluzione di lavaggio (1x PBS contenente 0.05% Tween-20), soluzione di blocco (1x PBS contenente 3% BSA e 0.05% Tween-20) e soluzione di fissazione (paraformaldeide 3% + 2% di saccarosio in PBS 1 x) in provette coniche in polipropilene.
    Nota: Per un singolo 8 pozzetti 2mpx, 10 mL di soluzione pre/post-extraction, 50 mL di soluzione, 10 mL di soluzione bloccante e 5 mL di soluzione di fissazione di lavaggio sono necessari.
    1. Preparare la soluzione di fissaggio.
      1. Sotto una cappa chimica, mescolare 400 mL di acqua bidistillata (ddH2O) con 15 g di paraformaldeide e 30 µ l di NaOH 10 N in una beuta da 1 L.
      2. Chiudere il contenitore e il calore a 65 ° C su una piastra calda agitatore magnetico, mescolando per solubilizzare il paraformaldeide completamente.
      3. Utilizzando una pipetta 25 mL, aggiungere 50 mL di 10X PBS, mescolare e filtro utilizzando un filtro da 0,45 µm.
      4. Aggiungere 10 g di saccarosio e portare a 500 mL con ddH2O.
      5. Aliquota della soluzione in provette coniche da 15 mL; conservare a-20 ° C fino all'utilizzo.
    2. Preparare i nuclei soluzione di colorazione diluendo una soluzione madre di 1 mg/mL di 4,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI) 1:1,000 in PBS 1X.
  2. Usando una micropipetta, rimuovere attentamente il supporto dai pozzi le diapositive di microscopia multi pozzetto o piastre e lavare immediatamente con 500 µ l di soluzione di lavaggio se modificando la soluzione due volte senza attesa.
    Nota: I dati se qui presentati sono stati ottenuti utilizzando cellule sviluppate nelle diapositive di microscopia di 8 pozzetti che sono stati lavati e incubati in 500 µ l di tutte le soluzioni. Volumi dovrebbero essere regolati secondo i contenitori di cultura cellulare utilizzati da sperimentatori. Inoltre, eseguire il protocollo se con estrema cura, come le cellule possono staccare facilmente dal fondo di vetro/polimero. Utilizzare una micropipetta per tutte le modifiche di soluzione per ridurre al minimo la perdita delle cellule.
  3. Incubare in ghiaccio per 5 min con 500 µ l di ghiacciata se soluzione pre/post-extraction e ricciolo delicatamente a mano per 15 – 30 s eseguire pre-l'estrazione passo che rimuove più proteine citoplasmiche e adrenocorticale e massimizza il segnale dalla cromatina / Fattori DNA-collegati.
  4. Lavare due volte con 500 µ l di soluzione di lavaggio se.
  5. Incubare per 15 min a temperatura ambiente in 500 µ l di soluzione di fissaggio se. In alternativa, è possibile utilizzare una soluzione di paraformaldeide precostruito (3 – 4%) per il passaggio di fissazione.
  6. Lavare due volte con 500 µ l di soluzione di lavaggio se.
  7. Incubare in ghiaccio per 5 min in 500 µ l di ghiacciata se pre/post-extraction soluzione e agitare la diapositiva delicatamente a mano per eseguire il passaggio di permeabilizzazione.
  8. Lavare due volte con 500 µ l di soluzione di lavaggio se.
  9. Incubare per almeno 30 min a temperatura ambiente con 500 µ l di soluzione bloccante se.
  10. Rimuovere la soluzione bloccante utilizzando una micropipetta e incubare per una notte in una camera umidificata a 4 ° C con gli anticorpi primari µ l 250 diluiti in soluzione di blocco.
    Nota: È buona norma eseguire l'incubazione con gli anticorpi primari in sequenza per evitare potenziali artefatti di co-localizzazione. Una volta che sono stati effettuati controlli appropriati, incubare simultaneamente gli anticorpi primari per accelerare il processo.
  11. Lavare quattro volte per 5 min in 500 µ l di soluzione di lavaggio se con movimentazione delicata (60 rpm in un rotatore).
  12. Incubare per 1h a 37 ° C con 250 µ l di anticorpi secondari diluito in soluzione bloccante in una camera umidificata.
    Nota: Proteggere i campioni dalla luce con l'aggiunta di anticorpi secondari fluorescente etichettati.
  13. Lavare 4 volte ciascuno per 5 min in 500 µ l di soluzione di lavaggio se con agitazione delicata.
  14. Incubare a temperatura ambiente per 5 min in 500 µ l di 1X PBS contenente 1 µ g/mL DAPI a macchiare i nuclei.
  15. Lavare due volte con 500 µ l di PBS 1X e lasciare le cellule in 500 µ l di soluzione di PBS per l'imaging: 1x.
  16. Utilizzando gridded diapositive o posizioni di fase registrati, trovare le celle con micro-irradiati utilizzando un indicatore di danni del DNA ben caratterizzato (ad es., γ-H2A.X, RPA32, ecc.).
  17. Immagine la cultura multi-pozzetto diapositive o piastre in tutti i canali pertinenti utilizzando le impostazioni appropriate su un microscopio confocale a scansione laser.
    Nota: Il sistema presentato, l'imaging è stato fatto con un 63 X / olio 1.4 obiettivo utilizzando un tempo di permanenza di 8 µs/pixel, risoluzione 1.024 x 1.024, 1 X zoom e con una media di 2. Nota che questi parametri devono essere ottimizzati per altri sistemi e/o esperimenti differenti.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

A seguito di micro-irradiamento, le cellule sono autorizzate a recuperare per un determinato periodo di tempo a seconda della natura del genoma manutenzione proteine1,12. DSBs saranno trattati dall'azione delle nucleasi, più estesamente durante le fasi S e G2 del ciclo cellulare, per creare una regione limitata di ssDNA che rapidamente è rivestita da RPA e altri fattori di mantenimento del genoma9. Questa regione di ssDNA è circondata da cromatina che è ampiamente modificata durante la DDR per regolare il reclutamento e lo scambio di altri fattori DDR13. Assunzione di proteine per micro-irradiati regioni può essere monitorato da IF (Figura 1A). Fattori della cromatina-collegati (ad es., γ-H2A.X, 53BP1, ecc.) sono in genere rilevabili alle precedenti (1 – 5 min) tempo punti rispetto alle proteine associato a ssDNA perché nucleasi-mediata di resezione del DSB estremità è necessaria per generare la piattaforma RPA-ssDNA (≥ 10 min.). Per facilitare l'analisi dell'immagine e la pubblicazione, abbiamo messo a punto un Fiji lo script (The Outliner)10 che delinea automaticamente nuclei cellulari utilizzando un canale di tintura-collegato del DNA (ad es., DAPI), rendendo più facile distinguere micro-irradiazione strisce e singole celle lasciando fuori uninformative macchiatura del DNA dalle immagini finali pur conservando nucleare definizione (Figura 1B).

Γ-H2A.X e RPA subunità complessa funzione come marcatori per la cromatina e ssDNA associati fattori, rispettivamente. RPA-ssDNA appare come fuochi punctati circondati da strisce di cromatina fluorescente grande decorati dall'anticorpo γ-H2A.X (Figura 1). Co-localizzazione con questi indicatori può essere utilizzato per definire precisamente la posizione di fattori di mantenimento del genoma alle lesioni del DNA. Per esempio, 53BP1, una proteina associata della cromatina che controlla la scelta di percorso di riparazione DSB, co-localizza con il segnale di γ-H2A.X13. Al contrario, PRP19, una E3 ubiquitina ligasi che funzioni su RPA-ssDNA per promuovere l'attivazione di ATR e riparazione del DNA viene reclutato come fuochi punctati che rispecchiano fedelmente il RPA32 distribuzione14,15,16,17 (Figura 1). Di nota, alcuni fattori possono essere assunti anche sulla cromatina adiacente le lesioni iniziali ma non si diffondono al domini di grandi dimensioni che circondano il DSBs come γ-H2A.X e 53BP1. In tali casi, questi fattori sembrerebbe come fuochi punctati ma non sarebbero perfettamente co-localizza con ssDNA-proteine.

Per live cell imaging, le cellule che esprimono un PDI contrassegnato con un marcatore fluorescente può essere micro-irradiati e ripreso in tempo reale per ottenere altamente dettagliata cinetica di reclutamento (Figura 2A–C). Più proteine differenti possono essere osservati contemporaneamente purché loro etichette fluorescenti possono essere spettralmente separate gli uni dagli altri. Per facilitare l'analisi delle serie temporali, abbiamo creato due script di Fiji, che consentono all'utente di produrre filmati contenenti informazioni temporali (Movie Maker, vedere i film della Figura 2 come materiale supplementare Online) e di quantificare proteina assunzioni presso siti di micro-irradiati (danni Analyzer)10. Invece il curation manuale dell'immagine richiede tempo normalmente richiesto per descrivere il comportamento di una proteina, lo script danno Analyzer guida l'utente attraverso passaggi snelle che monitorare il segnale arricchimento alle micro-irradiati siti, mentre automaticamente correzione per il movimento delle cellule, immagine deriva, segnale di fondo e lo sbiancamento affatto tempo punti dell'esperimento. I dati generati possono essere facilmente compilati in un'applicazione di foglio di calcolo e tracciati come necessari (Figura 2D).

Figure 1
Figura 1: Fattori di localizzazione di manutenzione genoma alla cromatina e RPA-ssDNA piattaforme alle lesioni indotte da micro-irradiazione. (A) micro-irradiazione Laser nelle cellule pre-sensibilizzate conduce alla produzione di rotture del doppio filamento del DNA, che sono resecato da endo - ed exo-nucleasi per generare ssDNA. Il sotto-vano ssDNA possa essere visualizzato come fuochi punctati utilizzando anticorpi contro la proteina replica A o altri fattori ssDNA localizzato. Al contrario, proteine o modifiche che si diffondono a domini di cromatina grandi appaiono come grandi strisce presso il sito di micro-irradiati simile a quello osservato con gli anticorpi targeting per la variante di fosforilata istone H2A. X (Γ-H2A.X). (B) cellule pre-sensibilizzate con Giordano o BrdU erano micro-irradiati, pre-estratti, fisso e tinto per le proteine indicate. 12-bit immagini sono stati raccolti a 1 X zoom ed elaborate utilizzando lo script Outliner Fiji. (C) Z-impilamento delle cellule pre-sensibilizzate Giordano o BrdU permette la risoluzione di ssDNA e cromatina associati fattori (intensità massima Z-proiezione mostrato). (D) usando che questo metodo, 53BP1 e PRP19 possono essere classificati come fattori di mantenimento del genoma della cromatina e ssDNA associati, rispettivamente. Barre di scala = 10 µm; immagini di D sono tutti alla stessa scala. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2 : Live-imaging di reclutamento complesso RPA ai siti di danno del DNA. (A) transfezione stabile o transitoria di plasmidi che codificano le proteine candidato etichettati come reporter fluorescenti seguito da micro-irradiazione delle cellule transfettate permette il monitoraggio dell'assunzione di proteine per lesioni del DNA in tempo reale. (B) le cellule transfected con un plasmide pDEST47-RPA32-GFP e lisate 24 ore più tardi. Espressione della proteina è stata confermata dall'immunoblotting. (C) le cellule trasfettate con del pDEST-SFB EGFP o pDEST47 RPA32-GFP plasmidi pre-sensibilizzate con BrdU erano micro-irradiati e ripreso a 12-bit a 1 zoom X una volta al minuto dopo irradiazione. Tempismo è in post-irradiazione minuti. L'immagine del punto di tempo 00:00 è stata presa prima del micro-irradiazione. I filmati sono stati creati utilizzando lo script Movie Maker Fiji e vengono visualizzati i fotogrammi chiave. Barre di scala = 10 µm. (D) assunzione di RPA32-GFP per micro-irradiazione strisce quantitativamente è stata monitorata utilizzando lo script di danni Analyzer Fiji. I dati di output sono stati tracciati utilizzando Microsoft Excel. La linea nera è la media arricchimento-piega di RPA32-GFP in siti di micro-irradiati rispetto al segnale di pre-irradiazione e le barre di errore rappresentano l'errore standard della media dei 15 celle indipendentemente micro-irradiati. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Movie 1
Movie 1: Micro-irradiazione time-lapse di cellule esprimenti SFB-GFP. Le cellule transfettate transitoriamente con un plasmide GFP del pDEST-SFB erano pre-sensibilizzate 24h con BrdU, micro-irradiati e immaginata una volta al minuto per un minimo di 29 Clicca qui per scaricare questo film.

Movie 2
Movie 2: Micro-irradiazione time-lapse di cellule esprimenti RPA32-GFP. Le cellule transfettate transitoriamente con un plasmide di pDEST47 RPA32-GFP sono stati pre-sensibilizzate 24 h con BrdU, micro-irradiati e immaginata una volta al minuto per un minimo di 29 Clicca qui per scaricare questo film.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Utilizzando i metodi descritti sopra, 405 nm laser micro-irradiazione delle cellule pre-sensibilizzate con Giordano o BrdU consente la generazione localizzata delle lesioni del DNA compreso DSBs all'interno dei nuclei delle cellule umane aderenti. Cinetica della DDR a questi DSBs sono simili a quelli generati con altri metodi in cellule eucariotiche9,18,19. Resezione di DSB presso siti di micro-irradiati conduce a ssDNA-generazione che può essere seguito utilizzando un anticorpo RPA32-targeting o una fusione RPA32-GFP. Fattori della cromatina-collegati, d'altra parte, possono essere individuati utilizzando γ-H2A.X come riferimento. Alcuni fattori della cromatina-collegato non possono diffondersi dal DSB iniziale tanto quanto γ-H2A.X e verranno visualizzato come i fuochi punctati che possono essere distinti dai fuochi di proteine che legano il ssDNA.

Una volta che vengono generati DSBs, assunzione di proteine e liquidazione da siti di danno possono essere monitorati da IF su celle fisse. Eseguire questi esperimenti è necessario solo un anticorpo se adatto contro il PDI. Se gli anticorpi compatibili se non sono disponibili, i plasmidi possono essere progettati in portatori di geni di interesse in telaio con epitopi specifici (ad es.: bandiera, His-tag) o proteine fluorescenti. Trasfezione transiente o stabile/trasduzione di questi plasmidi in cellule aderenti quindi può essere utilizzato per determinare se un fattore specifico è attivamente reclutato al DNA danneggiato. Sovraespressione di proteine può portare a mis-localizzazione e può amplificare artificialmente la loro assunzione a strisce micro-irradiati. Per ottenere risultati che sono più rappresentativi di proteine endogene, CRISPR-Cas9 tecnologia ora può essere utilizzata ordinariamente per etichettare qualsiasi gene di interesse con gli epitopi adatto20,21.

Gli script di Python forniti nel micro-irradiazione analisi Fiji Plugin facilitano la visualizzazione, presentazione, pubblicazione e analisi della cinetica di proteine DDR. Questo pacchetto di analisi è open-source e funzioni indipendentemente dalla piattaforma microscopio utilizzato per eseguire esperimenti di micro-irradiazione e acquisizione di immagini. Tutto ciò che è richiesto è che le immagini scattate sulla piattaforma microscopia salvati come Bio-formati compatibili file22. Dal fondo, alla deriva e sbianca le correzioni vengono eseguite automaticamente, analisi dei livelli della proteina presso siti di danni del DNA con gli script forniti è semplice e molto veloce rispetto con la quantificazione di tipico segnale manuale eseguita con software di acquisizione immagine microscopio.

Come descritto nel protocollo, gli utenti devono configurare attentamente loro rispettiva scansione laser sistemi di microscopia confocale per ottenere la giusta quantità di danni ed indurre DSBs che seguono la normale cinetica di DDR. Infatti, la quantità e il tipo di lesioni del DNA generato da micro-irradiazione dipenderà la lunghezza d'onda laser e la dose così come sui metodi pre-sensibilizzazione. Gli utenti devono tenere a mente che, anche se DSBs vengono generati dalle condizioni qui descritte, 405 nm laser micro-irradiazione delle cellule fotosensibilizzate genererà anche una miscela di altre lesioni del DNA, compreso cyclopyrimidine dimeri (CPDs), SSB e ossidato basi, che variano tra sistemi di microscopia e impostazioni23,24,25. Così, un attento monitoraggio delle lesioni alle micro-irradiati siti deve essere eseguita per ottenere un quadro completo del danno generato e la risposta suscitata. Cosa importante, per studiare la risposta di DSBs, ogni sistema di microscopio dovrebbe essere ottimizzato monitorando la cinetica del canonici proteine di danni del DNA e modificazioni post-traduzionali in siti di micro-irradiati. Per esempio, γ-H2A.X e le subunità del complesse di RPA (RPA70, RPA32 o RPA14) possono essere utilizzate comodamente come sono abbastanza facili da rilevare e rapidamente si accumulano DSBs. Come regola generale, γ-H2A.X segnale deve essere visualizzato come strisce a presto (5 min) e tempo di ritardo (fino a 3 – 4 h) punti post-danni considerando che RPA dovrebbe iniziare ad accumulare come fuochi punctati circa 10-15 min post-micro-irradiazione. Se si osserva un segnale di pan-nucleare γ-H2A.X, la quantità di energia ricevuta da parte delle cellule è non-fisiologica e si tradurrà in morte rapida delle cellule.

Ci sono alcune limitazioni che devono essere considerati quando si utilizza un laser di 405 nm per lo studio di specifiche vie di riparazione del DNA. Ad esempio, anche se la combinazione di Giordano-405 nm prontamente produce una combinazione di SSB e DSBs, non genera photoproducts 6 – 4 (6 – 4 PPs) e di conseguenza, la cinetica di assunzione di proteine di riparazione di asportazione del nucleotide sono diversi da quelli osservato utilizzando micro-irradiazione UV-C. La cinetica e l'estensione del reclutamento di varie proteine coinvolte nella risposta al DSBs può anche variare a seconda il DNA danneggiando il metodo che viene usato23. A causa di queste variazioni, si consiglia che gli utenti adattano i loro sistemi per ottimizzare il tipo di lesioni potenzialmente riconosciuti dal loro POIs. Anche se tali sistemi sono meno ampiamente disponibili, utilizzando altri tipi di laser compreso UV-A (337 – 355 nm) o femtosecondi vicino infrarosso (800 nm) insieme con i reagenti differenti sensibilizzazione (ad es.: psoralen tri-metile) può consentire agli utenti di generare più le lesioni del DNA specifiche a seconda del DNA ripristino sotto Studio24,26.

Ogni volta che nuove condizioni sono in fase di test, è conveniente usare fluorescente etichettati una consolidata proteine di riparazione del DNA per verificare le dosi, lunghezze d'onda e combinazioni pre-sensibilizzante e per garantire che la lesione di interesse è generata in modo efficiente. Ad esempio, PARP1 e XRCC1 può funzionare come marcatori per SSB e riparazione di base-asportazione, XPA è un buon indicatore della riparazione di asportazione del nucleotide e 53BP1 saranno reclutati DSBs e funzione in fine-unirsi non-omologo (fa riferimento23,25 ,27,28). Gli anticorpi che riconoscono modificazioni associate a tipi specifici di danno del DNA possono essere utilizzati anche per quantificare i livelli di DNA addotti o si rompe. È così possibile monitorare basi ossidate, cyclopyrimidine dimeri, 6 – 4 PPs, SSB (usando poli-ADP ribosio anticorpo) e DSBs (γ-H2A.X e 53BP1) da IF e determinare i parametri che potranno di conseguire il massimo livello delle lesioni desiderata23, 27 , 29. con attento monitoraggio, gli utenti dovrebbero essere in grado di studiare la loro via di riparazione di interesse utilizzando micro-irradiazione.

Complessivamente, l'uso di microscopi confocali scansione laser diffusa dotato di 405 nm laser linee per generare DSBs localizzata, combinato con indicatori di danno del DNA specifico della piattaforma per sub-classificare i fattori di mantenimento del genoma e dati semplificati lavorazione con l'aiuto del plugin Fiji di analisi micro-irradiazione, dovrebbe rendere lo studio della dinamica di fattori DDR più accessibile che mai sia vissuto e gli investigatori novizio del campo di manutenzione di genoma.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato supportato da scienze naturali e ingegneria Research Council of Canada [Discovery sovvenzione 5026 Agresta] e da una nuova generazione di scienziati di borsa di studio dalla società di ricerca cancro [21531 per Agresta]. Ringraziamo Jean-François Lucier per fornire il controllo di qualità eccellente degli script Python Fiji e consulenza sull'analisi statistica. Ringraziamo il Dr. Stephanie A. Yazinski per la ricetta di soluzione di fissazione se. Ringraziamo Paul-Ludovic Karsenti per aiuto con le misurazioni di potenza laser.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Olympus FLUOVIEW FV3000 resonant laser scanning confocal microscope Olympus
FluoView FV3000 software (version 2.1) Olympus
405 nm laser Coherent Radiation source
Microscope incubator AIO-UNO-OLYUS-1 Okolab OKO-UNO-1
60X /1.4 Objective Olympus Oil immersion objective
8-well culture slides on coverglass (X-well) Sarstedt 94.6190.802
U2OS osteosarcoma human cell line ATCC HTB-96 Stable cell lines 
4’,6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) ThermoFisher D1306 Caution toxic
5-bromo-2′-deoxyuridine (BrdU)  Sigma-Aldrich 59-14-3
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 30525-89-4 Caution toxic
Bisbenzimide H 33342 (Hoechst 33342) ThermoFisher 62249
Bovine serum albumin (BSA) ThermoFisher BP1600-100
Trypsin EDTA 0.1%  ThermoFisher 15400-054
Triton X-100  BioShop TRX777.100
Tween-20  ThermoFisher BP337-500
Sucrose  BioShop SUC507
JetPRIME transfection reagent  Polyplus 114-07
ProLong Diamond Antifade mountant with DAPI  ThermoFisher P36962
DMEM 1X, + phenol red Wisent  319-005-CL
DMEM 1X, - phenol red Wisent 319-051-CL
Fetal bovine serum (FBS) Wisent  080-150
Mouse anti-RPA32 antibody Abcam ab2175 1:500 for IF
Rabbit anti-γ-H2A.X antibody Cell Signaling  9718S 1:500 for IF
Rabbit Anti-53BP1 antibody Cell Signaling  4937S 1:500 for IF
Rabbit Anti-PRP19 antibody Abcam ab27692 1:500 for IF
Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 647 Cell Signaling  4414S 1:250 for IF
Goat anti-mouse  IgG Alexa Fluor 488  Cell Signaling  4408S 1:250 for IF
Fiji image analysis open-source software  https://fiji.sc
1918-K Power meter  with a 918D-SL-0D3 sensor Newport

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ciccia, A., Elledge, S. J. The DNA damage response: making it safe to play with knives. Molecular cell. 40 (2), 179-204 (2010).
  2. Bekker-Jensen, S., et al. Spatial organization of the mammalian genome surveillance machinery in response to DNA strand breaks. The Journal of Cell Biology. 173 (2), 195-206 (2006).
  3. Limoli, A. C. L., Ward, J. F., May, N. A New Method for Introducing Double-Strand Breaks into Cellular DNA. Radiation Research. 134 (2), 160-169 (1993).
  4. Polo, S. E., Jackson, S. P. Dynamics of DNA damage response proteins at DNA breaks: a focus on protein modifications. Genes & development. 25 (5), 409-433 (2011).
  5. Lukas, C., Falck, J., Bartkova, J., Bartek, J., Lukas, J. Distinct spatiotemporal dynamics of mammalian checkpoint regulators induced by DNA damage. Nature cell biology. 5 (3), 255-260 (2003).
  6. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  7. Collins, T. J. ImageJ for microscopy. BioTechniques. 43 (1 Suppl), 25-30 (2007).
  8. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  9. Symington, L. S., Gautier, J. Double-strand break end resection and repair pathway choice. Annual review of genetics. 45, 247-271 (2011).
  10. Garneau, D., Maréchal, A. Microirradiation Analysis Fiji Plugin. , Available from: https://bitbucket.org/daniel_garneau/microirradiation_analysis/ (2017).
  11. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  12. Izhar, L., et al. A Systematic Analysis of Factors Localized to Damaged Chromatin Reveals PARP-Dependent Recruitment of Transcription Factors. Cell Reports. 11 (9), 1-15 (2015).
  13. Panier, S., Boulton, S. J. Double-strand break repair: 53BP1 comes into focus. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (1), 7-18 (2013).
  14. Maréchal, A., et al. PRP19 Transforms into a Sensor of RPA-ssDNA after DNA Damage and Drives ATR Activation via a Ubiquitin-Mediated Circuitry. Molecular Cell. 53 (2), 235-246 (2014).
  15. Dubois, J. -C., et al. A phosphorylation-and-ubiquitylation circuitry driving ATR activation and homologous recombination. Nucleic Acids Research. 45 (15), 8859-8872 (2017).
  16. Wan, L., Huang, J. The PSO4 Complex Associates with RPA and Modulates the Activation of ATR. The Journal of Biological Chemistry. 289 (10), 6619-6626 (2014).
  17. Abbas, M., Shanmugam, I., Bsaili, M., Hromas, R., Shaheen, M. The role of the human Psoralen 4 (hPso4) complex in replication stress and homologous recombination. The Journal of Biological Chemistry. 289 (20), 14009-14019 (2014).
  18. Chung, W. H., Zhu, Z., Papusha, A., Malkova, A., Ira, G. Defective resection at DNA double-strand breaks leads to de novo telomere formation and enhances gene targeting. PLoS Genetics. 6 (5), (2010).
  19. Hicks, W. W. M., Yamaguchi, M., Haber, J. E. Real-time analysis of double-strand DNA break repair by homologous recombination. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (8), 3108-3115 (2011).
  20. Lackner, D. H., et al. A generic strategy for CRISPR-Cas9-mediated gene tagging. Nature Communications. 6, 10237 (2015).
  21. Ratz, M., Testa, I., Hell, S. W., Jakobs, S. CRISPR/Cas9-mediated endogenous protein tagging for RESOLFT super-resolution microscopy of living human cells. Scientific Reports. 5 (9592), (2015).
  22. Linkert, M., et al. Metadata matters: Access to image data in the real world. Journal of Cell Biology. 189 (5), 777-782 (2010).
  23. Dinant, C., et al. Activation of multiple DNA repair pathways by sub-nuclear damage induction methods. Journal of Cell Science. 120 (15), 2731-2740 (2007).
  24. Kong, X., et al. Comparative analysis of different laser systems to study cellular responses to DNA damage in mammalian cells. Nucleic Acids Research. 37 (9), e68 (2009).
  25. Holton, N. W., Andrews, J. F., Gassman, N. R. Application of Laser Micro-irradiation for Examination of Single and Double Strand Break Repair in Mammalian Cells. Journal of Visualized Experiments. (127), (2017).
  26. Thazhathveetil, A. K., Liu, S. T., Indig, F. E., Seidman, M. M. Psoralen conjugates for visualization of genomic interstrand cross-links localized by laser photoactivation. Bioconjugate Chemistry. 18 (2), 431-437 (2007).
  27. Mortusewicz, O., Amé, J. C., Schreiber, V., Leonhardt, H. Feedback-regulated poly(ADP-ribosyl)ation by PARP-1 is required for rapid response to DNA damage in living cells. Nucleic Acids Research. 35 (22), 7665-7675 (2007).
  28. Kleiner, R. E., Verma, P., Molloy, K. R., Chait, B. T., Kapoor, T. M. Chemical proteomics reveals a γH2AX-53BP1 interaction in the DNA damage response. Nature Chemical Biology. 11 (10), 807-814 (2015).
  29. Soultanakis, R. P., et al. Fluorescence detection of 8-oxoguanine in nuclear and mitochondrial DNA of cultured cells using a recombinant Fab and confocal scanning laser microscopy. Free Radical Biology and Medicine. 28 (6), 987-998 (2000).

Tags

Genetica problema 133 danno del DNA doppia elica del DNA si rompe micro-irradiazione confocale microscopia immunofluorescenza formazione immagine in tempo reale analisi dell'immagine automatizzata
Indagine di assunzione di proteine per lesioni del DNA utilizzando 405 Nm Laser Micro-irradiazione
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gaudreau-Lapierre, A., Garneau, D.,… More

Gaudreau-Lapierre, A., Garneau, D., Djerir, B., Coulombe, F., Morin, T., Marechal, A. Investigation of Protein Recruitment to DNA Lesions Using 405 Nm Laser Micro-irradiation. J. Vis. Exp. (133), e57410, doi:10.3791/57410 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter