Summary
Locaux de médicaments vers les glandes sous-maxillaires est intéressant en biologie de glande salivaire de compréhension et pour le développement de nouvelles thérapeutiques. Nous présentons un protocole d’injection retroductal mise à jour et détaillées, destiné à améliorer la précision de livraison et de la reproductibilité expérimentale. L’application présentée ici est la livraison de nanoparticules polymériques.
Abstract
Deux objectifs communs de la glande salivaire thérapeutique sont la prévention et le traitement des dysfonctions tissulaires suivant une auto-immunes ou rayonnements des blessures. En fournissant localement des composés bioactifs vers les glandes salivaires, teneurs plus élevées en tissu peuvent être réalisées en toute sécurité par rapport à l’administration systémique. En outre, hors tissu cible peuvent être réduites considérablement les effets d’extra glandulaire accumulation de matière. À cet égard, l’injection de retroductal est une méthode largement utilisée pour l’étude des glandes salivaires biologie et la physiopathologie. Retroductal administration de facteurs de croissance, les cellules primaires, vecteurs viraux et médicaments à petites molécules a été démontrée à l’appui de la glande dans le cadre de la blessure. Nous avons déjà montré l’efficacité d’une stratégie de nanoparticules-siARN retroductally injecté pour maintenir la fonction de la glande après irradiation. Ici, une méthode très efficace et reproductible pour administrer des nanomatériaux pour la glande submandibulaire murine par canal de Wharton est détaillée (Figure 1). Nous décrivons accéder à la cavité buccale et décrivent les étapes nécessaires au canal de Wharton cannulate, outre les observations servant de contrôles qualité tout au long de la procédure.
Introduction
Dysfonctionnement des glandes salivaires a plusieurs étiologies, y compris le syndrome de Sjögren, une perte de médiation auto-immune du tissu sécréteur fonctionnel et rayonnement induit hypoptyalisme (RIH), une commune séquelle de radiothérapie du cancer tête et du cou1. Perte de fonction salivaire en raison ou l’autre condition prédispose les individus à infections buccodentaires et systémiques, la carie, dysfonction digestive et déglutition, trouble de la parole et dépression majeure1,2,3. En conséquence, qualité de vie souffre considérablement, avec des interventions limitées à la palliation des symptômes plutôt que de guérir4. Afin d’étudier de nouveaux traitements en vivo, il est intéressant d’administrer les composés bioactifs directement à la glande salivaire.
Retroductal injection est une méthode utile pour livrer des composés bioactifs directement vers les glandes salivaires et de tester l’efficacité dans les maladies, blessures, ou en vertu de l’homéostasie tissulaire normale. Les trois glandes salivaires principales sont la glande parotide (PG), la sous-maxillaire (SMG) et la sublinguale (SLG), tous de quel vide dans la cavité buccale par l’intermédiaire de conduits excréteurs. L’anatomie de la murine SMG permet un accès direct par le biais de canulation du canal de Wharton, situé dans le plancher de la bouche sous la langue5. Après la canulation, solvatés médicaments peuvent être administrés directement à la SMG. Suite retroductal livraison, diffusion extra glandulaire est restreinte par la capsule de tissu environnant qui régit l’échange de documents avec entourant les structures6. Le SMG et sa gaine sont structurés de la même façon chez les humains et sont systématiquement accessibles au cours de la SMG chirurgie et sialoendoscopy7. Chez les humains et les souris, le PG est également accessible par l’intermédiaire de Sténon dans la muqueuse buccale8.
Dans les modèles murins de RIH, injection retroductal SMG a été utilisée pour livrer des produits thérapeutiques, y compris les facteurs de croissance, les cellules primaires, vecteurs viraux, cytokines et composés antioxydants pour moduler la réponse cellulaire à l’injure et réduire le les tissus des dommages5,9,10,11,12,13,14,15,16. Le plus notable succès clinique de retroductal injection est l’administration d’un vecteur adénoviral pour diriger l’expression d’un canal d’eau (aquaporine 1 ; AQP1) chez les patients ayant le rayonnement pour la tête et du cou, cancer du17.
Auparavant, nous avons développé et démontré l’efficacité d’un système de nanoparticules polymériques-siARN retroductally injecté pour protéger la glande salivaire de RIH11,18,19,20. Ici, dans le prolongement de nos travaux antérieurs, nous démontrons notre protocole pour l’injection de SMG retroductal à l’aide d’une NANOPARTICULE fluorescent étiquetée (NP) capable de charger et livrer autrement peu solubles médicaments21,22, 23.
Nous avons synthétisé la NP d’un copolymère à deux blocs de poly (styrène-alt-maléique anhydride)-b-poly(styrene) (LMFP) par le biais de polymérisation de fragmentation (RAFT) chaîne addition réversible, comme décrit plus haut21. Grâce à l’échange de solvant, ces polymères spontanément s’auto-assembler en structures NP micelle avec un hydrophobe intérieur et hydrophile extérieur21. Les NPs sont étiquetés avec un fluorophore Texas-rouge pour permettre la vérification de la livraison de NP dans les glandes sans pour autant sacrifier l’animal. Vivre l’imagerie animale et immunohistochimie SMG est affiché à 1 h et 1 jour après l’injection.
Cette mise à jour et protocole reproductible canulation devrait permettre à d’autres réaliser l’injection de retroductal. Gageons que cette technique raffinée deviendra critique pour des études in vivo et développement thérapeutiques24,25.
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Protocol
Toutes les procédures en vivo décrites ci-dessous ont été approuvés par le Comité Université sur les ressources animales à l’Université de Rochester, Rochester, NY.
1. préparation
- Utilisez un tuyau de 32G cathéter intracrânienne avec incrustation de fil, couper 3 cm du tube pour former une extrémité biseautée, environ 45° à l’axe longitudinal. Confirmer que le fil soit au moins 1 cm de plus que le tube.
- Charge 50 µL de solution de nanoparticules LMFP (Figure 1), ou autre matériel d’injection, une seringue de Hamilton. Pour réduire la probabilité de barotraumatisme pendant l’injection, fixer la tubulure du cathéter, avec le stylet enlevé, à la seringue et expulser le volume mort.
- Inspecter la solution d’injection afin d’assurer que la nanoparticule est entièrement solvatés pour éviter l’obstruction canalaire après l’administration.
- Préparer la solution de l’atropine à 0,1 mg/mL.
Remarque : Parce que l’atropine est sensible à la lumière et se dégrade au fil du temps, cette solution devrait être faite le jour de l’injection et abrie de la lumière jusqu'à ce que les administrés.
2. accès et visualisation de Point d’entrée canalaire
- Peser les souris C57/BL6 en utilisant une balance analytique.
- À l’aide d’une seringue 0,5 mL avec aiguille 29 x ½", anesthésier la souris avec une solution saline stérile injectée par voie intrapéritonéale de xylazine kétamine et 10 mg/kg de 100 mg/kg. Passez à l’étape suivante lorsque la souris ne répond plus aux stimuli, qui survient généralement dans les 5 à 10 min après l’injection.
Remarque : Cette procédure peut également être réalisée sous isoflurane, mais nécessitera un cône de nez personnalisé qui permet l’accès à la cavité buccale. - Pour prévenir le dessèchement pendant la procédure, appliquer du lubrifiant sur les yeux et placez la souris dans une position couchée sur une scène personnalisée.
Remarque : Pour maintenir des conditions appropriées pour procédure intra-buccaux, outils devraient être désinfectés ou stérilisés avant chaque utilisation. - Ouvrir la cavité buccale en sécurisant les incisives maxillaires sur une poutre métallique et une bande élastique permet d’appliquer une tension vers le bas derrière les incisives mandibulaires (Figure 2 a).
- Aligner la souris sous le microscope à dissection, telle que la base de la mâchoire est visualisée.
- Afin d’élargir la bouche, utiliser un enrouleur acier incurvé, personnalisé pour appliquer une tension sur le plan bilatéral à la muqueuse buccale.
- Pour visualiser les papilles sous-mandibulaire, saisir et soulevez doucement la langue du plancher de la bouche avec une pincette émoussé.
Remarque : Les papilles seront affiche comme deux protubérances pâles située sous la langue (Figure 2 b). - Pour faciliter la visualisation et la manipulation plus loin dans la cavité buccale, placez le coton entre la langue et la muqueuse buccale.
3. canalaire canulation et Placement de la ligne
- Employer les fine pince courbée, saisir tubulure du cathéter avec l’encart de fil. Pour un contrôle manuel optimal pendant la canulation, aligner le tube avec la courbure de la pince (Figure 3 a).
- En utilisant le microscope à dissection, déplacer la pince et le fil dans le champ de vision.
Remarque : Le fil doit dépasser de la tubulure. - Exercez une légère pression sur la base d’une papille sous-maxillaire, en utilisant le fil encastré pour produire une perforation petite, superficielle, muqueuse (0,076 mm de diamètre) qui facilitera l’entrée plus tardive de la tubulure du cathéter (0,25 mm de diamètre). Cas de résistance, coupées fraîches conseils biseautés sur le tube et le médaillon de fil avec des ciseaux de dissection pointu.
- Suite à l’entrée, retirer le stylet et, en utilisant le microscope à dissection, confirment la présence de la salive sur le site de ponction. Évitez le mouvement énergique ou soudaine (retrait ou insertion) du stylet qui peut provoquer des saignements ou compromettre l’intégrité canalaire.
- Rétracter le stylet dans le tube (Figure 3 b).
- Afin d’assurer que tube d’injection s’adaptera dans un conduit de Wharton ouverture, insérer le tube contenant le stylet comme un guide rigide dans la ponction faite précédemment (Figure 2 C).
Remarque : Si ne pas exécutés rapidement, gonflement local peut empêcher de ré-insertion. - Pour empêcher la contre-pression de l’obstruction canalaire prolongée, retirer le tube. Inspecter pour vérifier qu’une ouverture, visible en microscopie, peut être vu dans la papille sous-maxillaire. En cas de saignement visible, retirer le stylet et retentez de l’étape 3.2 sur les papilles sous-maxillaire adverses.
- Sans bouger la souris, administrer une injection intrapéritonéale de la solution de l’atropine 1 mg/kg, pour réduire la salivation lors de la procédure. Attendre 5-10 min.
- Saisir l’extrémité de la tubulure de la seringue et l’insérer dans l’orifice en utilisant le microscope à dissection (Figure 3). Cas de résistance, couper une extrémité biseautée fraîche pour le tubage et la reattempt.
- Une fois que le tube est en place au sein de la papille sous-mandibulaire, avancer lentement 3-5 mm dans le conduit. Communiqué de la tubulure de la pince.
- Afin d’améliorer l’étanchéité entre le tube et la papille sous-mandibulaire, sécher l’interface en tamponnant doucement avec de la gaze pendant 1 min.
- Inspecter pour confirmer que la position du tuyau n’a pas changé pendant le séchage.
4. injection
- Injecter le matériau à un taux de 10 µL/min. inspecter pour confirmer que la souris reste sous sédation et ne montre pas de signes de détresse (Figure 2D).
NOTE : Les Injections de 15 à 50 µL sont bien tolérées. Barotraumatisme peut entraîner l’injection de plus gros volumes. - Suite à l’injection, maintenir la pression de la seringue pendant 5 min améliorer la rétention des matières dans SMG (Figure 4) et le canal de Wharton. Inspecter la papille sous-maxillaire périodiquement pour s’assurer que tube ne ferme pas l’orifice du canal artériel.
- À l’aide de pinces fines, saisir et retirer délicatement le tube les papilles sous-maxillaire.
Remarque : Il est normal d’observer certains évacuation fluide de la papille. - Supprimer l’enrouleur et le coton de la cavité buccale avant de passer la souris de la scène.
Remarque : L’animal ne doit pas être laissé sans surveillance jusqu'à ce qu’il a repris connaissance suffisante pour maintenir le décubitus sternal. En outre, assurez-vous que la souris n’est pas logée avec d’autres souris jusqu'à ce que complètement guéri.
5. vérification et analyse
Remarque : An in vivo Imaging System (IVIS) peut être utilisé pour évaluer la rétention des nanoparticules fluorescent étiquetés après injection (comme indiqué 1 h et 24 h après l’injection dans la Figure 5).
- Pour mieux visualiser un signal fluorescent au sein de la SMG à travers la peau, enlever la fourrure ventrale recouvrant le SMGs soit par rasage ou à l’aide d’un dépilatoires chimiques.
Remarque : Après l’euthanasie, SMG tissu peut aussi être récolté, fixe (nuit à la paraformaldéhyde à 4 %) et souillé par immunohistochimie pour confirmer la persistance du NP fluorescent étiqueté un jour après l’injection (Figure 6).
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Representative Results
Retroductal injection peut être utilisée pour administrer NPs à la SMG murin (Figure 1). Ici, nous livrons 50 µg LMFP NPs étiqueté avec Texas Red fluorophore.
Positionnement correct de la souris permet l’accès facile et visualisation du plancher de la bouche (Figure 2 a-B). Les papilles sous-maxillaires sont identifiées comme deux protubérances charnues située sous la langue. Suite à la canulation (Figure 2) et l’injection d’atropine, tube de la seringue peut être placé dans les papilles sous-maxillaire (Figure 2D).
Afin de faciliter la canulation, une petite perforation dans la papille submandibulaire est d’abord faite en utilisant le stylet de fil à l’intérieur de la tubulure du cathéter (Figure 3 a). Une fois cela fait, le stylet doit être rétracté dans le tube à servir de guide rigide alors qu’une plus grande ouverture est faite (Figure 3 b). Le stylet a un diamètre de 0,076 mm, tandis que la tubulure du cathéter a un diamètre extérieur de 0,25 mm. Suite à la création de cette plus grande ouverture, le cathéter pré-chargés tube, attaché à la seringue d’injection, peut ensuite guidé dans l’orifice canalaire (Figure 3).
Suite à l’injection, il est recommandé que la seringue être immobilisé et injection pression maintenue. Si la pression n’est pas appliquée, livraison sera couronnée de succès, mais avec moins d’efficacité et reproductibilité. Cela est démontré en injectant 50 µL de colorant de bleu de toluidine 1 % sur le plan bilatéral et en observant une coloration plus pâle dans la glande sans pression maintenue après l’injection (Figure 4).
Pour vérifier la livraison de NP, l’IVIS peut être utilisé pour détecter le signal fluorescent au sein de la souris, ce qui est latéralisée à l’administration de post de 1 h de la région injectée (Figure 5). Cette approche permet la confirmation sans euthanasie la souris et peut être poursuivie longitudinalement jusqu'à ce que le signal n’est plus détectable26,27.
Pour confirmer la persistance du NP dans la SMG 24 h après l’injection, glandes peuvent être sectionnés et lus par imagerie de fluorescence. Aqp5 et Krt5 IHC marquent les cellules sécrétrices et canalaires de la SMG, respectivement et montrent NPs dans les deux compartiments (Figure 6).
Figure 1 . Rétrograde injection schématique. Après canulation canalaire et placement de la seringue, 50 µL de solution NP polymère de 1 mg/mL est injecté dans la SMG. Représentant (TEM) au microscope électronique montre monodisperses (indice de polydispersité = 0,2) population NP. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 . Rétrograde étapes injection. (A) accéder à la cavité buccale en séparant les incisives maxillaires et mandibulaires. (B) visualiser les papilles (en boîte) sous la langue sur le plancher de la bouche, qui marquent l’emplacement du canal de Wharton. (C) en utilisant un cathéter avec incrustation de fil, canule doucement dans la base de la papille sous-maxillaire. (D) après canulation, les tubes peuvent être échangées avec la tuyauterie de la seringue s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 . Un positionnement efficace de cathéter et stylet pour canulation de canal de Wharton. (A) Alignez le tube avec la courbure de la pince et couper un bout biseauté sur le tube et fil d’abord percer la papille sublinguale. (B) retirer le stylet dans le tube pour faire un guide rigide pour insérer le tuyau dans la papille sublinguale. (C) Insérez tubulure du cathéter (stylet enlevé), s’est joint à la seringue à injection, au sein de l’orifice déjà faite. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 . Maintenant qui suit pression seringue injection améliore la conservation matérielle. Suite à des injections de retroductal de 50 µL de 1 % de bleu de toluidine, pression de seringue a été soit maintenue pendant 5 min (droit SMG - première injection) ou la seringue a été retirée immédiatement après l’injection (gauche SMG - deuxième injection). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5 . Confirmation de l’injection de post livraison retroductal NP. (A) In vivo Imaging System (IVIS) montre la latéralisation du signal fluorescent rouge sur le côté (gauche) traité de l’injection de post de 1 h de souris. (B) signal IVIS NP après 24 h a considérablement diminué. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 6 . Confirmation de l’injection de post retroductal NP persistance 24h. A, C. Contrôle non SMG colorées pour Aqp5 et Krt5, marquage des cellules acineuses et ductal sécrétoire, respectivement. B, D. Dans retroductal NP injecté SMG, Aqp5 et Krt5 taches Voir la morphologie de la glande normale et NPs repris dans les acini et canaux (barreaux de l’échelle : 75 µm). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Retroductal injection est critique pour la livraison de drogue localisé à la glande salivaire. Cette technique possède des applications dans le dépistage des agents thérapeutiques pour les conditions, y compris le syndrome de Sjögren et RIH9,10,28. Administration des médicaments directement dans le SMG par injection retroductal fournit un avantage clé sur une administration systémique dans son potentiel à réduire les effets hors cible, y compris de l’activation immunitaire11. La capacité de maximiser la livraison de drogue local, sans accumulation dans les tissus environnants peut aussi permettre des essais thérapeutiques dans un large éventail de doses que ce pourrait être réalisé systématiquement.
Nous présentons ce protocole, avec qualité et Dépannage Vérifiez les étapes, comme une méthode détaillée et à jour pour livrer des nanomatériaux polymériques via le canal de Wharton au SMG murine20. Par exemple, utilisation correcte d’un guide fil facilite le placement de la canule. En outre, en utilisant le buvard sec au lieu de colles cyanoacrylate pour maintenir la canule en place pendant l’injection, le risque de traumatisme muqueux est minimisé. Cette méthode peut être utilisée pour traiter des souris avec une gamme de composés et peut être effectuée sur plusieurs jours avec la même souris pour évaluer un timecourse d’administration répétée,11.
Sécrétion de la glande normale qui fournira un mécanisme de dégagement simple et directe pour excès charge utile, bien que cette stratégie doit être optimisée pour différentes applications par une sélection rigoureuse de la substance injectée et titrage de la dose de l’atropine. Dans ce cas, NPs persistent dans le SMG pendant au moins 24 h. À l’aide de NPs capables de chargement de la drogue, ou nanomatériaux similaires, de futures applications de ce travail sont surmonter la limite de solubilité qui empêcherait, sinon les agents hydrophobes avec injection de retroductal20,21test.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Recherche rapporté dans cette publication a été financée par le National Institute of Dental et recherche Craniofacial (NIDCR) et le National Cancer Institute (NCI) de la National Institutes of Health, sous attribution numéro R56 DE025098 et UG3 DE027695 F30 CA206296. Le contenu est la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement l’opinion officielle de la National Institutes of Health. Ce travail a été également soutenu par la NSF DMR 1206219 et de l’Innovation de l’AIRD en Oral Care Award (2016).
Nous tenons à remercier Jayne Gavrity pour son aide dans des expériences d’IVIS. Nous tenons à remercier Karen Bentley pour son entrée et l’assistance dans l’exercice de EM. Nous tenons à remercier Weng Pei-Lun pour son aide avec IHC. Nous tenons à remercier Matthew Ingalls pour son aide dans la préparation de la figure. Nous tenons à remercier le Dr Elaine Smolock et Emily Wu pour une lecture critique de ce manuscrit.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pilocarpine hydrochloride | Sigma Aldrich | P6503 | Pilocarpine |
| Student Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 91500-9 | Spring Scissors for Tracheostomy |
| Sterile Saline Solution | Medline | RDI30296H | Saline |
| Dumont #7 Forceps | Fine Science Tools | 11274-20 | Curved Forceps |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | Straight Forceps |
| Standard Pattern Forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | Blunt Forceps |
| Fine Scissors- Tungsten Carbide | Fine Science Tools | 14568-09 | Dissection Scissors |
| Microhematocrit Heparinized Capillary Tubes | Fisher Scientific | 22362566 | Capillary tubes |
| Lubricant Eye Ointment | Refresh | N/A | Refresh Lacri-Lube |
| Goat polyclonal anti-Nkcc1 | Santa Cruz Biotech | SC-21545 | Nkcc1 Antibody |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | DAPI |
| GraphPad Prism | GraphPad | ver6.0 | Statistical Software |
| Cotton tipped applicator | Medline | MDS202000 | Applicator for eye ointment |
| 0.5cc Insulin Syringe, 29G x 1/2" | BD | 7629 | Syringe for intraperitoneal injection |
References
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