Summary
Submandibular 동맥을 지역 약물 전달 및 새로운 치료제의 개발에 대 한 이해 침 샘 생물학에서입니다. 선물이 배달 정확성과 실험의 재현성을 향상 시키는 업데이트 및 상세한 retroductal 주입 프로토콜. 여기에 소개 하는 응용 프로그램은 고분자 나노 입자의 배달.
Abstract
침 샘 치료의 두 가지 일반적인 목표는 조직 장애 중 다음의 예방 및 치료 면역 또는 방사선 상해. 로컬 침 샘에 생리 활성 화합물을 함으로써, 큰 조직 농도 조직의 관리 대 안전 하 게 구현할 수 있습니다. 또한, 대상 조직에서 물자의 여분 선 축적 효과 수 극적으로 감소 될. 이와 관련, retroductal 주사 침 샘 생물학과 이상 조사를 위해 널리 사용 되는 방법입니다. Retroductal 관리 성장 요인, 일차 전지, adenoviral 벡터, 그리고 작은 분자 약물의 상해의 설정에서 기능을 지원 하기 위해 표시 되었습니다. 우리는 이전 조사를 다음과 같은 기능을 유지 하기 위해 주입 retroductally 나노 siRNA 전략의 효능을 보여주었다. 여기, 왓슨의 덕트를 통해 murine submandibular 동맥에 나노 소재를 관리 하는 매우 효과적이 고 재현 방법에 대 한 자세한 (그림 1). 우리 구강 접근을 설명 하 고 더 관측 절차에 걸쳐 품질 검사로 재직 cannulate와 튼의 덕트, 하는 데 필요한 단계를 개요.
Introduction
침 샘 기능 장애는 많은 etiologies, Sjögren의 증후군, 기능성 분 비 조직, 그리고 방사선 유발 hyposalivation (RIH), 머리와 목 암 방사선 치료1의 일반적인 sequella의 자기 면역 중재 손실을 포함 하 여 있다. 어느 조건 때문에 침 기능 손실 구두 및 조직의 감염, 충 치, 소화 하 고 삼 키는 기능 장애, 언어 장애, 그리고 주요 우울증1,2,3에 개인을 걸리기. 결과적으로, 삶의 질 크게 겪고 있다, 중재 치료4보다는 증상의 일시적 완화에 국한. Vivo에서새로운 치료 조사, 침 샘에 직접 생리 활성 화합물을 관리 하는 관심입니다.
Retroductal 주사 침 샘에 직접 생리 활성 화합물을 제공 하 고 질병, 부상, 또는 정상 조직의 항상성에서 효능을 테스트 하는 귀중 한 방법입니다. 3 개의 주요 침 샘은 귀 밑 (PG), submandibular (서울시), 그리고 삶의 (SLG), 배설 덕트를 통해 구강에는 빈의 모든. murine의 해부학 SMG cannulation 혀5아래 입의 바닥에 있는 왓슨의 덕트를 통해 직접 액세스를 허용 합니다. Cannulation, solvated 마약 SMG에 직접 관리할 수 있습니다. Retroductal 배달, 다음 외 선의 확산 구조6주위 물자의 교류를 통제 하는 주변 조직 캡슐에 의해 제한 됩니다. SMG와 그 덕트 마찬가지로 인간에서는, 구조는 SMG 수술 및 sialoendoscopy7중에 정기적으로 액세스. 인간과 쥐에서 PG는 마찬가지로 볼 점 막8에서 Stensen의 덕트를 통해 액세스할 수 있습니다.
RIH murine 모델, SMG retroductal 주입 치료제 등 성장 요인, 일차 전지, adenoviral 벡터, cytokines, 부상, 세포질 응답을 조절 하 고 그 결과 감소 하는 항 산화 화합물을 제공 하는 데 사용 되었습니다. 조직 손상5,9,10,11,12,13,14,,1516. Retroductal 주입의 가장 주목할 만한 임상 성공이 이다 (Aquaporin 1; 물 채널의 표현을 직접 adenoviral vector의 관리 AQP1) 머리와 목 암17방사선 환자에.
이전에 우리는 개발과 RIH11,18,,1920에서 침 샘 기능을 보호 하기 위해 retroductally 주입 고분자 나노-siRNA 시스템의 효능 표시. 우리의 과거 작품의 확장, 여기, 우리 우리의 프로토콜 로드 하 고 그렇지 않으면 가난 하 게 녹는 제공 붙일 레이블된 나노 (NP)를 사용 하 여 retroductal 서울시 주입 약21,22, 설명 23.
우리 diblock 공중 합체 폴 리 (스 티 렌-alt-maleic anhydride)-b-poly(styrene) 가역 추가 체인 조각화 (뗏목) 중 합, 앞에서 설명한21통해 (PSMA)의 구성에서 NP를 합성 할. 솔벤트 교류를 통해 이러한 고분자 자발적으로 자기 조립 micelle NP 구조는 소수 성 내부와 친수성 외부21에. NPs는 동물을 희생 하지 않고도 동맥에 NP 배달의 확인을 허용 하도록 텍사스 레드 fluorophore와 함께 표시 됩니다. 동물 영상 라이브와 SMG immunohistochemistry 1 시간 그리고 1 일 주사를 다음에 표시 됩니다.
이 업데이트 하 고 재현할 수 cannulation 프로토콜 retroductal 주입을 달성 하기 위해 다른 사람을 사용 해야 합니다. 우리는이 세련 된 기술을 vivo에서 연구 및 치료 개발24,25에 대 한 중요 한 될 것입니다 기대 합니다.
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Protocol
아래에 설명 된 모든 vivo에서 절차는 로체스터의 대학, 로체스터, 뉴욕에서 동물 자원에 대학 위원회에 의해 승인 되었다.
1입니다. 준비
- 와이어 삽입과 32 G intracranial 카 테 테 르 튜브를 사용 하 여, 3 cm 긴 축에 약 45 ° 경사진된 끝을 형성 하 고 튜브의 컷. 와이어 튜브 보다 1 cm 이상 되는지 확인 합니다.
- 해밀턴 주사기를 50 µ L PSMA 나노 솔루션 (그림 1), 또는 다른 주입 재료를 로드 합니다. 주입 동안 barotrauma의 확률을 줄이기 위해, 주사기를 제거 stylet와 카 테 테 르 튜브를 연결 하 고 죽은 볼륨을 추방.
- 나노는 완벽 하 게 관리 다음 ductal 방해를 방지 하기 위해 solvated 되도록 주입 솔루션을 검사 합니다.
- 0.1 mg/mL에서 아트로핀 솔루션을 준비 합니다.
참고: 아트로핀은 빛에 민감한 시간이 지남에 저하 됩니다 때문에이 솔루션 주입의 하루와 있어야 관리까지 빛 으로부터 보호 합니다.
2. 액세스 및 Ductal 진입점을 시각화
- C57/BL6 마우스 사용 하 여 분석 균형 무게.
- 29G x ½"바늘 0.5 mL 주사기를 사용 하 여, 100 mg/kg 케 타 민 고 10 mg/kg xylazine의 intraperitoneally 주입 된 살 균 염 분 솔루션 마우스 anesthetize. 마우스 이상에 응답 자극, 일반적으로 주사를 따라 5 ~ 10 분 이내 발생 하는 경우 다음 단계로 진행 합니다.
참고:이 절차 또한 isoflurane, 아래 수행 될 수 있습니다 하지만 구강에 대 한 액세스를 허용 하는 사용자 지정 코 콘이 필요 합니다. - 절차 동안 건조를 방지 하기 위해 눈에 윤활제를 적용 하 고 사용자 지정 단계에 발생 하기 쉬운 위치에 마우스를 놓습니다.
참고: 내 구두 절차에 대 한 적절 한 조건을 유지, 도구 해야 될 소독 하거나 각 사용 전에 소독 합니다. - 금속 빔에 상 악 앞 니를 확보 하 여 구강을 열고 신축성 밴드를 사용 하 여 악의 앞 니 (그림 2A) 뒤에 아래 긴장을 적용 합니다.
- 턱의 시각화 되도록 해 현미경 아래 마우스를 맞춥니다.
- 입 확대, 양측 뺨 점 막에 긴장을 적용할 사용자 지정 곡선된 강철 견인을 사용 합니다.
- Submandibular 용의자를 시각화 하려면 파악 하 고 부드럽게 혀 무뚝뚝한 집게를 사용 하 여 입의 바닥에서 들어올립니다.
참고:은 papillae 혀 (그림 2B) 아래 두 창백 돌출으로 표시 됩니다. - 구강 내에서 시각화 및 조작 추가 완화, 면 혀와 볼 점 막 사이 배치 합니다.
3. ductal Cannulation 및 선 배치
- 잘 사용 하 여, 곡선된 겸 자, 와이어 삽입 된 카 테 테 르 튜브 파악. Cannulation 동안 최적의 수동 제어를 위한 겸 자 (그림 3A)의 곡률으로 튜브를 맞춥니다.
- 보기의 필드에 집게와 와이어를 이동 해 현미경을 사용 하 여.
참고: 와이어 튜브에서 돌기 한다. - 부드럽게 작은, 표면, 점 막 펑크 (0.076 m m 직경) 카 테 테 르 튜브 (0.25 m m 직경)의 최신 항목을 촉진 합니다 생성 하는 삽입 된 와이어를 사용 하 여 하나의 submandibular 시의 기지에 압력을 적용. 저항을 발생 하는 경우 날카로운가 위를 해 튜브 및 와이어 삽입에 신선한 경사진된 끝을 잘라.
- 항목에 따라는 stylet을 철회 하 고 펑크 사이트에서 타 액의 존재를 확인 해 현미경을 사용 하 여. 강력한 또는 갑자기 (철수 또는 삽입)의 움직임을 stylet 출혈이 발생할 수 있습니다 또는 ductal 무결성을 손상 하지 마십시오.
- (그림 3B) 배관 내 stylet을 철회.
- 주입 튜브 여 튼의 덕트에 맞는 것을 보장 하기 위해, 이전 만든된 펑크 (그림 2 C)으로 딱딱한 가이드로는 stylet을 포함 하는 튜브를 삽입 합니다.
참고: 경우에 신속 하 게 수행 하지 로컬 붓기 다시 삽입을 방지할 수 있습니다. - 장기간된 ductal 방해에서 다시 압력을 방지 하기 위해 튜브를 철회 한다. 개방, 현미경, 아래 보이는 submandibular 시에서 볼 수 있습니다 확인 하려면 검사 합니다. 보이는 출혈이 발생 하는 경우는 stylet을 제거 하 고 반대 submandibular 용의자에 3.2 단계에서 다시 시도.
- 마우스를 이동 하지 않고 절차 동안 타 액 분 비를 줄이기 위해 1 mg/kg 아트로핀 솔루션의 복 주입을 관리 합니다. 5-10 분을 기다립니다.
- 주사기 튜브의 끝을 잡고 고 해 현미경 (그림 3C)를 사용 하 여 구멍에 삽입 합니다. 저항을 발생 하는 경우 튜브를 reattempt 신선한 경사진된 끝을 잘라.
- 일단 튜브 submandibular 시 내에, 덕트에 3-5 m m 진행 천천히. 릴리스는 집게에서 튜브입니다.
- 관과 submandibular 시 사이 물개를 개선 하기 위해 부드럽게 1 분 거 즈와 blotting에 의해 인터페이스를 건조.
- 튜브의 위치는 건조 하는 동안 이동 하지 확인 하려면 검사 합니다.
4입니다. 주입
- 자료는 마우스 sedated 있고 (그림 2D) 고통의 표시 표시 되지 않는 확인 하는 검사 약 10 µ L/분의 속도로 주입.
참고: 15-50 µ L의 주사는 잘 용납입니다. 더 큰 볼륨의 주입 barotrauma 발생할 수 있습니다. - 주입, 따라와 튼의 덕트와 SMG (그림 4) 자료의 보존을 향상 시키기 위해 5 분 동안 주사기 압력을 유지 합니다. Submandibular 시 튜브 ductal 구멍을 종료 하지 않습니다 보장 하기 위해 정기적으로 검사 합니다.
- 미세 집게를 사용 하 여 파악 하 고 부드럽게 submandibular 용의자에서 튜브를 철회.
참고: 그것은 용의자에서 일부 유체 출구를 관찰 정상입니다. - 스테이지에서 마우스를 이동 하기 전에 견인 및 코 튼 구강에서 제거 합니다.
참고: 동물 하지 맡겨야 한다 무인 sternal recumbency를 유지 하기 위해 충분 한 의식 회복 될 때까지. 또한, 마우스 하지 완전히 복구 될 때까지 다른 마우스와 보관 되어 있는지 확인 합니다.
5. 확인 및 분석
참고:는 vivo에서 이미징 시스템 (IVIS) 사용할 수 있습니다 (으로 표시 된 1 시간 그리고 그림 5에서 주사 후 24 h) 주입 다음 붙일 레이블된 나노 입자의 보존을 평가 하기 위해.
- 피부를 통해 서울시 내의 형광 신호를 더 나은 시각화 하려면 overlying SMGs 하거나 면도 하거나 화학 탈모를 사용 하 여 복 부 털을 제거 합니다.
참고: 안락사, 다음 서울시 조직 또한 수확 수 있습니다, 고정 (4 %paraformaldehyde)에서 1 박, 그리고 붙일 레이블된 NP의 지 속성 주사 (그림 6)에 따라 1 일 것인지 immunohistochemistry를 사용 하 여 스테인드.
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Representative Results
Retroductal 주입 murine SMG (그림 1)에 NPs를 관리를 사용할 수 있습니다. 여기, 우리는 50 µ g PSMA NPs 텍사스 레드 fluorophore와 함께 표시를 제공 합니다.
마우스의 적절 한 배치는 손쉬운 액세스와 입 (그림 2A-B)의 바닥의 시각화 수 있습니다. Submandibular papillae 혀 아래 두 살 돌출으로 식별 됩니다. (그림 2C) cannulation 및 아트로핀 주사, 주사기 튜브 submandibular 용의자 (그림 2D)에 배치할 수 있습니다.
cannulation 촉진 하기 submandibular 시에서 작은 펑크 처음 이루어집니다 (그림 3A) 카 테 테 르 튜브 내부 와이어 stylet을 사용 하 여. 이 완료 되 면는 stylet 튜브 딱딱한 가이드 역할을 하는 동안 더 큰 개통은 (그림 3B)를 내에서 제거 한다. 카 테 테 르 튜브는 0.25 m m의 외부 직경은 stylet 0.076 m m의 직경이 있다. 이 더 큰 개통의 창조 다음 로드 카 테 테 르 튜브, 분사 주사기에 부착 된 수 다음 안내 ductal 구멍 (그림 3C)으로.
주입, 다음 주사기 움직일 수 하는 것이 좋습니다 하 고 사출 압력 유지. 압력 적용 되지 않으면, 배달 될 것입니다 성공, 이기는 하지만 더 적은 효율성과 재현성. 이 양측 1% 톨루이 파란색 염료의 50 µ L를 주입 및 주입 (그림 4)에 따라 유지 압력 없이 동맥에 약해요 얼룩을 관찰 하 여 보여 줍니다.
NP 배달 확인, 삽입 된 지역 1 시간 게시물 관리 (그림 5) lateralized 마우스 내 형광 신호를 감지 하는 IVIS는 사용할 수 있습니다. 이 방법은 euthanizing 마우스 없이 확인 가능 하 고 신호는 더 이상 감지26,27까지 경도 계속 될 수 있다.
서울시 24 h 다음 주입 지 속성 NP를 확인 하려면 땀 샘 sectioned, 고 형광 영상 볼 수 수 있습니다. Aqp5 및 Krt5 IHC는 SMG의 분 비 그리고 ductal 세포를 각각 표시 하 고 두 구획 (그림 6)에서 NPs를 보여줍니다.
그림 1 . 사출 도식 역행. Ductal cannulation 및 주사기 배치, 1 mg/mL 고분자 NP 해결책의 50 µ L SMG에 주입 됩니다. 대표 전송 전자 현미경 (TEM) 사진 보여준다 단 분산 (증가할수록 인덱스 = 0.2) NP 인구. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 . 주입 단계 역행. (A)는 구강 상 악 및 악의 앞 니를 분리 하 여 액세스할. (B) 시각화와 튼의 덕트의 위치를 표시 하는 입의 바닥에 혀 아래 (박스형) 용의자. (C) 와이어 삽입 된 카 테 터를 사용 하 여, 부드럽게 submandibular 시의 cannulate. (D) 다음 cannulation, 카 테 테 르 튜브 교환 될 수 있다 주사기 튜브와 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 . 카 테 터와 튼의 덕트 cannulation 위한 stylet의 효과적인 위치. (A)는 집게의 곡률과 튜브를 정렬 하 고 튜브 및 와이어 처음 설 시 펑크에 비스듬한 끝을 잘라. (B) 설 시 내 튜브를 삽입 하는 경직 된 가이드를 만들려고 튜브 내의 stylet을 철회. (C) 삽입 카 테 테 르 튜브 (stylet 제거), 이전 만든된 구멍 내 주입 주사기에 가입 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 . 주사기 압력 다음 유지 주입 향상 소재 보존. Retroductal 1% 톨루이 블루의 50 µ L의 주사, 다음 주사기 압력 중 5 분 (오른쪽 SMG-처음 주입) 유지 되었다 또는 주사기 (왼쪽 SMG-두 번째 주입) 주사 후 즉시 철회 되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5 . Retroductal NP 배달 포스트 주입의 확인. (A) Vivo에서 이미징 시스템 (IVIS) 치료 () 왼쪽 마우스 1 h 포스트 주입의 빨간 형광 신호 lateralization을 보여줍니다. (B) 에서 24 h NP IVIS 신호는 크게 감소 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6 . Retroductal NP 지 속성 24 h 포스트 주입의 확인. A, C입니다. Uninjected 제어 SMG 스테인드 각각 Aqp5 및 Krt5, 표시 분 비 포상 그리고 ductal 세포. B, D입니다. Retroductal NP 주입 SMG, Aqp5 및 Krt5 얼룩 정상 선 형태와 NPs acini에 덕트 채택 (바 규모: 75 µ m). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
Retroductal 주사 침 샘에 지역화 된 약물 전달에 대 한 중요 하다. 이 기술은 응용 프로그램 Sjogren 증후군 및 RIH9,,1028를 포함 하 여 조건에 대 한 치료제를 심사에 있다. Retroductal 주입을 통해 서울시에 직접 약물 전달 주요 이점이 그것의 잠재력을 줄이기 위해 오프 대상 효과, 면역 활성화11를 포함 하 여 조직의 관리를 제공 합니다. 지역 약물 전달, 주변 조직에 축적 없이 최대화 수 치료 복용량 광범위에서 보다 체계적으로 달성 될 수 있는 테스트를 사용할 수도 있습니다.
우리는이 프로토콜을 제시, murine 서울시20왓슨의 덕트를 통해 고분자 나노 재료를 제공 하는 상세 하 고 업데이트 방법으로 단계, 문제 해결 및 품질 확인. 예를 들어, 와이어 가이드의 적절 한 사용 정 배치를 촉진 한다. 또한, 사용 하 여 건조 cyanoacrylate 접착제 대신 blotting는 정 장소에 주입 하는 동안, 점 막 외상의 위험이 최소화 됩니다. 이 방법은 다양 한 화합물, 쥐를 치료에 사용 될 수 있습니다 그리고 반복 관리11timecourse 평가를 같은 마우스와 함께 여러 일 동안 수행할 수 있습니다.
비록이 전략 주입된 물질의 신중한 선택과 아트로핀 복용량의 적정에 의해 다른 응용 프로그램에 대 한 최적화 되어야 합니다 정상 샘 분 비 과잉 페이로드는 단순 하 고 간단 정리 메커니즘을 제공 합니다. 이 경우 NPs는 적어도 24 h에 대 한 서울시에 지속. 이 작품의 약물 로드 또는 유사한 나노 소재, 미래 응용 프로그램 수 있는 NPs를 사용 하 여 retroductal 주입20,21소수 에이전트를 테스트 하지 그렇지 않으면 가용성 제한 극복 포함 됩니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 간행물에 보고 된 연구는 국립 연구소의 치과 Craniofacial 연구 (NIDCR)와 보너스 번호 R56 DE025098, UG3 DE027695, 및 CA206296 F30 국립 보건원의 국립 암 연구소 (NCI)에 의해 지원 되었다. 내용은 전적으로 저자의 책임 이며 반드시 국립 보건원의 공식 의견을 대표 하지 않는다. 이 작품 또한 NSF DMR 1206219와 IADR 혁신 구강 케어 상 (2016)에 의해 지원 되었다.
우리는 제인 Gavrity IVIS 실험 수행에 그녀의 도움에 감사 하 고 싶습니다. 우리는 그들에 그녀의 지원과 입력 카 렌 벤틀리 감사 하 고 싶습니다. 우리는 페이 Lun Weng IHC와 그의 지원에 대 한 감사 하 고 싶습니다. 우리는 매튜 잉 그림 준비에 그의 원조에 대 한 감사 하 고 싶습니다. 우리는이 논문의 중요 한 읽기 박사 Elaine Smolock, 에밀리 우 감사 하 고 싶습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pilocarpine hydrochloride | Sigma Aldrich | P6503 | Pilocarpine |
| Student Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 91500-9 | Spring Scissors for Tracheostomy |
| Sterile Saline Solution | Medline | RDI30296H | Saline |
| Dumont #7 Forceps | Fine Science Tools | 11274-20 | Curved Forceps |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | Straight Forceps |
| Standard Pattern Forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | Blunt Forceps |
| Fine Scissors- Tungsten Carbide | Fine Science Tools | 14568-09 | Dissection Scissors |
| Microhematocrit Heparinized Capillary Tubes | Fisher Scientific | 22362566 | Capillary tubes |
| Lubricant Eye Ointment | Refresh | N/A | Refresh Lacri-Lube |
| Goat polyclonal anti-Nkcc1 | Santa Cruz Biotech | SC-21545 | Nkcc1 Antibody |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | DAPI |
| GraphPad Prism | GraphPad | ver6.0 | Statistical Software |
| Cotton tipped applicator | Medline | MDS202000 | Applicator for eye ointment |
| 0.5cc Insulin Syringe, 29G x 1/2" | BD | 7629 | Syringe for intraperitoneal injection |
References
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