Tredimensionella organotypic kulturer av murina utricle och snäckan i optiskt klart kollagen jag geler bevara medfödda vävnad morfologi, möjliggöra mekanisk stimulering genom justering av matrix stelhet och tillåta virus-medierad gen leverans.
De sensoriska organen i innerörat är utmanande för att studera hos däggdjur deras otillgänglighet till experimentella manipulation och optisk observation. Dessutom även om befintliga kultur tekniker tillåter biokemiska störningar, ger dessa metoder inte ett sätt att studera effekterna av mekanisk kraft och vävnad stelhet under utvecklingen av innerörat sensoriska organ. Här beskriver vi en metod för tredimensionella organotypic kultur intakt murina utricle och snäckan som övervinner dessa begränsningar. Tekniken för justering av en tredimensionell matris stelhet beskrivs här tillåter manipulering av elastisk kraft motsatta vävnadstillväxt. Denna metod kan därför användas för att studera rollen av mekaniska krafter under innerörat utveckling. Dessutom, ger kulturerna virus-medierad gen leverans, som kan användas för vinst – och förlust-av-funktion experiment. Denna kultur metod bevarar medfödda hårcellerna och stöder celler och fungerar som ett potentiellt överlägset alternativ till den traditionella tvådimensionella kulturen av vestibulära och auditiv sinnesorgan.
Studien av de flesta aspekter av däggdjur orgel utveckling har underlättats av in vitro- system. Två huvudsakliga metoder används nu för kulturen i vestibulära sensoriska organ: fritt flytande1 och vidhäftande2 preparat. Båda metoderna tillåta utredning av hår cell sårbarheter3 och förnyelse1,4 in vitro. De utvecklingsmässiga rollerna av Notch5,6, Wnt7,8, och epidermal tillväxtfaktor receptor (EGFR)9,10 signalering cascades i innerörat har dessutom fastställts, delvis med hjälp av in vitro- kulturer av sensorisk epitel. Dock är celltillväxt och differentiering kontrollerade, inte bara genom signalering av morphogens, men också genom fysiska och mekaniska signaler såsom intercellulära kontakter, styvheten hos extracellulärmatrix, och mekanisk stretching eller sammandragning. Rollen av sådana mekaniska stimuli är utmanande att undersöka i utvecklingsländer innerörat i vivo. Dessutom passar befintliga friflytande och vidhäftande kultur metoder inte sådana studier in vitro. Här beskriver vi en metod för tredimensionella organotypic kultur i kollagen geler jag varierande styvhet. Denna metod till stor del bevarar i vivo arkitekturen av de vestibulära och cochlear sinnesorgan och tillåter undersökning av effekterna av mekanisk kraft på tillväxt och differentiering11.
Eftersom mekaniska stimuli är känd för att aktivera nedströms molekylära händelser, såsom flodhästen signalering utbildningsavsnitt12,13,14,15, är det viktigt att kunna kombinera mekanisk stimulering med biokemiska och genetiska manipulationer. Metoden kultur beskrivs här tillåter virus-medierad gen leverans och kan därför användas för att studera både mekanisk och molekylär signalering under innerörat utveckling11.
De molekylära signaler som medla tillväxt och differentiering i innerörat under utveckling har studerats ingående5,6,7,8,9,10. Bevisning som erhållits från utricular modell systemet tyder dock på att mekaniska ledtrådar, kände igenom cellen korsningar och aktivering av Hippo signalering, också spela en viktig roll i…
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Dr A. Jacobo, Dr. J. Salvi och A. Petelski för deras bidrag till den ursprungliga forskningen som detta protokoll baseras. Vi tackar också J. lamor och W. Makmura för tekniskt bistånd och djurhållning. Vi erkänner NIDCD utbildning grant T32 DC009975, NIDCD bevilja R01DC015530, Robertson terapeutiska utvecklingsfonden och stiftelsen Caruso familj för finansiering. Slutligen, vi erkänner stöd från Howard Hughes Medical Institute, som Dr Hudspeth är en utredare.
#10 Surgical Blades | Miltex | 4-110 | |
#5 Forceps | Dumont | 11252-20 | |
100 mm Petri dish | Sigma | P5856-500EA | |
250 uL large orifice pipette tips | USA Scientific | 1011-8406 | |
30 mm glass-bottom Petri dish | Matsunami Glass USA Corporation | D35-14-1.5-U | |
4 well plate | Thermo Fisher Scientific | 176740 | |
4-Hydroxytamoxifen | Sigma | H7904 | |
60 mm Petri dish | Thermo Fisher Scientific | 123TS1 | |
Acetic acid | Sigma | 537020 | |
Ad-GFP | Vector Biolabs | 1060 | |
Anti-GFP, chicken IgY fraction | Invitrogen | A10262 | |
Anti-Myo7A | Proteus Biosciences | 25-6790 | |
Anti-Sox2 Antibody (Y-17) | Santa Cruz | sc-17320 | |
Bicinchoninic acid assay | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
Click-iT EdU Alexa Fluor 647 Imaging Kit | Thermo Fisher Scientific | C10340 | |
Collagenase I | Gibco | 17100017 | |
D-glucose | Sigma | G8270 | |
DMEM/F12 | Gibco | 11320033 | |
Epidermal growth factor | Sigma | E9644 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 16140063 | |
Fibroblast growth factor | Sigma | F5392 | |
Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-97 | |
Glutamine | Sigma | G8540 | |
HBSS | Gibco | 14025092 | |
Hemocytometer | Daigger | EF16034F | |
HEPES | Sigma | H4034 | |
Insulin | Sigma | I3536 | |
Iridectomy scissors | Zepf Medical Instruments | 08-1201-10 | |
Microinjector | Narishige | IM-6 | |
Nicotinamide | Sigma | N0636 | |
PBS (10X), pH 7.4 | Gibco | 70011044 | |
PBS (1X), pH 7.4 | Gibco | 10010023 | |
Phenol Red pH indicator | Sigma | P4633 | |
Pure Ethanol, 200 Proof | Decon Labs | 2716 | |
RFP antibody | ChromoTek | 5F8 | |
Sodium bicarbonate | Sigma | S5761 | |
Sodium hydroxide | Sigma | S8045 | |
Sodium selenite | Sigma | S5261 | |
Tabletop vortex | VWR | 97043-562 | |
Transferrin | Sigma | T8158 | |
Trypan blue | Sigma | T6146 |