Summary
肝脏捐献者数量严重不足, 肝脏捐献者的标准已经扩大。常温体外肝灌注 (NEVLP) 已发展为评价和修饰器官功能。本研究展示了 NEVLP 的大鼠模型, 并对 pegylated 过氧化氢酶的能力进行了试验, 以减轻肝脏保存损伤。
Abstract
移植的同种异体肝有很大的不足, 并在反应中扩大了供体的标准。因此, 常温体外肝灌注 (NEVLP) 作为评价和改变器官功能的一种方法。NEVLP 与低温和 subnormothermic 灌注相比有许多优点, 包括减少保存损伤、生理条件下正常脏器功能恢复、器官性能评估, 以及作为器官修复的平台。、改建和改装。对小鼠和猪 NEVLP 模型进行了描述。我们展示了一个大鼠模型的 NEVLP, 并使用该模型显示其重要的应用之一-使用的治疗分子添加到肝灌流液。过氧化氢酶是一种内源活性氧 (ROS) 清除剂, 已被证明可以减少缺血再灌注在眼, 脑, 肺。聚乙二醇化已被证明是以过氧化氢酶为靶向内皮细胞。在这里, 我们增加了 pegylated 过氧化氢酶 (PEG 猫) 的基础灌流液, 并证明了它的能力减轻肝脏保护伤害。我们的啮齿动物 NEVLP 模型的好处是它是便宜的与更大的动物模型比较。这项研究的一个局限是它目前不包括灌注后肝移植。因此, 不能肯定地预测器官移植后的功能。然而, 大鼠肝移植模型的建立是很好的, 可以与该模型结合使用。最后, 我们展示了一个廉价的, 简单的, 易于复制的 NEVLP 模型使用大鼠。该模型的应用包括测试新的 perfusates 和灌流液添加剂, 用于器官评估的测试软件, 以及用于修复器官的实验。
Introduction
在肝移植的等待名单上有14578名患者, 每年约有7000人进行移植手术,1,2。针对这一严重的捐助者短缺问题, 已扩大了肝捐献者的标准;这些通常被称为边际器官或延长的标准捐赠者, 并预期在移植后的表现不如同种异体标准标准, 具有较高的原发性移植功能障碍和延迟移植功能3, 4,5,6。结果, NEVLP 作为评价和修改器官功能6,7的方法被引入。我们设计了一个大鼠 NEVLP 模型, 并用该模型证明了它的一个重要的潜在应用--对肝脏灌流液的新型分子添加剂的检测。
NEVLP 已经被评估在鼠 (鼠) 和猪模型, 以及在被丢弃的人体器官6,8,9。NEVLP 第一次人体试验的结果最近也发表在10。虽然低温机灌注已明显成为肾脏保存的标准, 但肝机灌注的温度仍有争议。与低温和 subnormothermic 灌注相比, NEVLP 有许多建议的优点。这包括减少保存伤害, 恢复正常的器官功能在生理条件下, 能力评估器官的性能, 并作为一个平台的器官修复, 重塑和修改7,11, 12,13,14,15,16,17。
大量的研究已经完成使用猪 NEVLP 模型。尽管这些模型在考虑使用废弃人体器官或人体临床试验模型时比较便宜, 但与我们的小动物 NEVLP 模型相比, 它们是非常昂贵的。每个实验成本的一个重要组成部分是灌流液。我们能够完成4小时的灌注与300毫升的灌流液在相对较低的成本。此外, 小动物的成本, 包括大鼠是非常低的成本相比, 猪。
与其他模型的 NEVLP 在大鼠, 这里提出的模型是相对简单的实施和具有广泛的应用范围。在图 1中可以看到灌注电路。灌流液开始在灌流液水库 (1), 这是一个水套容器。灌流液是由一个滚子泵 (2) 从水库中拉出, 并推入 windkessel (3), 然后是肺 (4)。肺为逆流气体和灌流液流提供最大气体交换。灌流液然后进入加热线圈 (5) 内的灌注室, 以确保它是在生理温度, 和气泡陷阱 (6), 以防止空气气泡灌注有前器官 (7) 和后器官 (8) 样本端口, 这使得灌流液采样。灌流液然后通过门静脉插管进入肝脏。门静脉套管附在压力监测器上, 用于图表数据收集软件上的值。灌流液然后通过静脉插管退出肝脏, 并流入压力均衡器块 (9)。最后, 将灌流液从压力块中拉回, 通过滚子泵, 倒入储层中。该模型包括对门静脉进行连续灌注, 并将脉动流留到肝动脉和透析用在其他一些模型中, 每一个都需要一个单独的和额外的电路, 但以前已经证明不需要9,13。
为了探索新的治疗分子在灌流液中的加入, 我们选择了酶过氧化氢。过氧化氢酶是一种内源性 ROS 清除剂, 是细胞内部防御机制的一部分, 以减轻 ROS18的影响。过氧化氢酶在肝缺血再灌注损伤中的表达增加19。实验性地添加过氧化氢酶已被证明可以减少缺血再灌注眼, 脑, 肺20,21,22,23,24。聚乙二醇化已被证明的目标过氧化氢酶的内皮和帮助过氧化氢酶吸收到内皮细胞25。在减少肝缺血再灌注损伤方面, 对 PEG 进行系统的管理, 疗效有限;然而, 我们假设, 添加 PEG 猫到一个孤立的器官灌注电路将导致改善结果26,27,28。在这里, 我们添加 PEG 猫到我们的基地灌流液, 并表明其能力减轻肝脏保护伤害。
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Protocol
所有程序都是按照《机构动物保育指南》和国家研究理事会《人道护理和使用实验动物手册》 (IACUC) 进行的, 并经俄亥俄州立大学 IACUC 委员会批准。
1. 初步设置
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结合以下方法制备灌注液:86 毫升25% 白蛋白, 184 毫升的威廉姆斯的培养基, 30 毫升青霉素/链霉素 (10 的 u/毫升青霉素和0.01 毫克/毫升链霉素), 胰岛素 (50 u/升), 肝素 (0.01 u/毫升), l-谷氨酰胺 (0.292 克/升), 和氢化可松 (0.010 克/升), 总体积为300毫升。对于基灌流液和 peg 猫组, 添加 625 U/毫升的 peg 猫。
- 用三 (羟甲基) 氨基甲烷 (THAM) 将灌流液溶液缓冲到 pH 值7.4。使用动脉血气机确认灌流液 pH 值。
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设置电路 (图 1)。
- 打开水浴温暖和设置它到37°c。让风琴室暖和起来。
- 将混合和缓冲的灌流液倒入水库, 开始循环。
注: 本步骤中提到的灌流液是在步骤1.1.1 中编写的。 - 通过在线肺打开氧气气体 (95% 氧气和5% 二氧化碳) 到流量计数器。
- 打开数据收集软件, 然后单击 "开始" 以记录实验的持续时间。
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设置手术显微镜和手术室 (图 2)。
- 打开所有设备, 包括暖板, 烙, 麻醉和生命体征 (心率和氧气饱和度) 监测设备。
注: 显微镜的设置会因使用的显微镜而异, 并可根据用户的舒适度进行调整。 - 填充10毫升麻醉注射器与10毫升的液体异氟醚吸入 (分子量184.5 克/摩尔) 和放置在麻醉单位。
- 适当放置0.5 毫升肝素注射器 (50 U), 手术器械, 4-0 和7-0 丝缝合, 无菌棉签, 4 厘米 x 4 厘米无纺布纱布海绵 (图 2)。
- 打开所有设备, 包括暖板, 烙, 麻醉和生命体征 (心率和氧气饱和度) 监测设备。
- 准备异氟醚室。
2. 麻醉的诱导
- 佩戴以下个人防护设备 (PPE): 手术面罩、手术手套、一次性长袍。
- 称一下老鼠。
注意: 我们在 250–350 g 之间使用大大鼠。 - 打开氧气压缩机和异氟醚。在被称量后, 将老鼠放入异氟醚腔内, 并确保盖子的安全。用2升/分氧的6% 异氟醚诱导麻醉。
注: 确切使用异氟醚剂量将取决于所使用的特定麻醉系统。 - 用电子剪刀夹住动物的腹部毛发.
- 替换异氟醚腔内的动物。
- 打开手术室里的麻醉装置。
- 当麻醉完全诱发时, 将大鼠从异氟醚腔中取出。用脚趾捏确认麻醉深度。
3. 采购程序
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准备16克的入口袖口 (图 3)。
- 从16克 angiocatheter 开始。切割7毫米的油管。确定7毫米段的中点, 测量3.5 毫米切割在中点和移除前半部分油管。
- 用止血粉碎这个现在平坦的部分。用打火机融化 angiocatheter 的另一端, 形成唇。不要把笔尖直接放到火焰中, 否则它会着火。
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准备胆管插管。
- 取27克 angiocath, 切断注射口, 只留下导管。将此连接至27克 cannular 油管的10厘米段。
- 将大鼠的鼻子放在麻醉鼻锥中, 并将其四四肢固定。通过将显示器连接到左后肢来监测生命体征。执行脚趾捏, 以确认适当的麻醉深度。继续麻醉在4% 异氟醚 (对体重 > 250 克的动物)。
- 用70% 异丙醇喷洒动物的腹部。允许干燥。把不育的褶皱放在动物身上。
- 用锋利的剪刀和伸展皮肤 (图 4) 从剑突到耻骨进行中线切口。轻轻地进入腹膜, 切开肌肉。注意避免损害这个切口的下一面和肝脏在这个切口的上级方面的膀胱。
- 将切口侧向左侧和右侧, 在肝脏下边界的水平处形成十字。
- 将麻醉降低到 2% (为动物称重 > 250 克)。
- 用弯曲的蚊子钳和肋骨拉钩 (图 5) 收回剑突过程。
- 用锋利的剪刀切开镰、膈和 gastrohepatic 韧带。
- 在膈静脉上定位并栓上7-0 条缝合线, 尽可能靠近其原点以防止渗漏。
- 阉割用一种不育的湿棉尖涂抹器, 用0.9% 生理盐水蘸纱布包扎肠道。注意不要伸展小肠的血管。
- 解剖下腔静脉以去除多余的组织。解剖后的静脉刚好优于分岔和通过一个循环4-0 丝缝合为以后使用 (图 6)。
- 收回右肾以提供暴露在右肾上腺静脉。用纱布将肝脏的右叶缩回。用7-0 丝缝线将右肾上腺静脉系好, 尽可能接近烧灼, 并将其穿过远端的领带 (图 7)。
- 仔细解剖脾静脉, 用两条7-0 丝缝线将其绑起来, 在两条缝线之间切开。
- 如果需要的话, 在门静脉上用7-0 丝缝线缝合并结扎额外的静脉。
注: infrahepatic 在右肾上腺静脉与下肝之间有时有小的分支。 - 解剖周围的胃十二指肠动脉, 用7-0 丝缝线栓住胃十二指肠动脉, 结扎胃十二指肠动脉。
- 解剖周围的肝动脉, 然后放置7-0 丝缝合领带围绕它 (图 8)。
-
解剖出胆管。
- 检查胆管的长度。用7-0 丝缝线将远端的胆管系上。在胆管周围放置一圈7-0 丝缝线, 尽可能下部。
- 用小剪刀把管子直径的一半切成一个洞, 然后将27克导管放进胆管下部。使用罗马凉鞋领结缝合导管 (图 9)。
- 用27克针将0.5 毫升肝素 (50 U) 注入到动物的小弟弟静脉或静脉内。
注: 还可以使用27克胰岛素注射器代替。 - 用先前放置的4-0 丝缝合线钳住并系上静脉。
- 用先前放置的7-0 丝缝线栓住肝动脉。
- 用显微外科夹子夹住门静脉。用22克 angiocatheter Cannulate 门静脉。冲洗门静脉与60毫升冷0.9% 生理盐水与1毫升肝素 (100 U), 直到肝脏 blanches (图 10)。
注: 如果肝脏不立即漂白, 它可以用无菌的棉尖喷头按摩。 - 暴露 suprahepatic 的静脉, 并在胸部尽可能高的切割。
- 执行肝切除术如下。切开隔膜, 切开肝动脉, 切开静脉, 切开门静脉, 切开其他韧带, 取出肝脏。将肝脏置于冰冷的0.9% 生理盐水中 (图 11)。
- 在门静脉放置16克的血管袖口 (图 12)。将肝脏放在前体常温肝脏灌注回路中。
4.体内常温肝灌注
注: 此处使用的灌流液是在协议步骤1.1.1 中编写的。
- 将门静脉插管置于袖口的门静脉内 (图 13)。
- 在门静脉套管放置时, 保持灌流液通过电路2毫升/分钟的流量开始。观察在门静脉压力下的任何尖峰的显示器;这可能表明该船只已被堵塞, 并重新定位套管是必要的。
- 用7-0 丝缝线缝合灌流液返流的静脉插管。
- 一旦两个套管到位, 开始转动的流量在1毫升/分钟, 直到生理压力的范围内的 10–16 cmH2O 达到。
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在0、30、60、90、120、150、180、210和240分钟的灌注中, 从前、后端口中抽取1毫升样品。将1毫升样品分成两个0.5 毫升的样品。
注: 0.5 毫升的这将用于协议步骤 4.5.1, 0.5 毫升将用于协议步骤4.5.2。- 在液氮中低温管中对此样品进行0.5 毫升冻结。
- 使用剩余的0.5 毫升灌流液进行动脉血气分析。
- 在每个时间点 (0、30、60、90、120、150、180、210和240分钟) 运行血气分析后, 检查 ph 值, 并根据需要将灌流液缓冲以返回到 pH 值7.4。
- 在4小时灌注的结论中, 将肝脏与灌注回路断开。把肝脏分成 0.5 g 段。将低温管内的肝组织冷冻在液氮中。
5. 实验后分析
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使用商业色度测定试剂盒测定灌流液中丙氨酸转氨酶 (ALT) 水平0、30、60、90、120、150、180、210和240分钟。
- 简而言之, 用37摄氏度的反应混合试剂孵化灌流液60分钟. 使用微板块读取器测量 570 nm 的光学密度值。
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融汇0.5 克肝组织, 100 µL 裂解缓冲液, 分析三磷酸腺苷 (ATP)、谷胱甘肽 (GSH) 和丙二醛 (MDA) 的组织裂解。
- 简而言之, 使用商业化验试剂盒测量肝脏组织样品的 ATP 水平。将样品与反应缓冲剂混合, 室温孵育30分钟. 使用微板块读取器测量 570 nm 的光学密度。
- 使用商业化验试剂盒测量肝组织样品的 GSH 含量。将组织样品与化验鸡尾酒混合。测量405–414纳米的光学密度值。
- 使用商业化验试剂盒测量肝脏组织样品的 MDA 水平。将样品与 TBA 和热量混合到95摄氏度, 60 分钟离心反应物, 将上清液转移到96井板上。测量光学密度在532毫微米。
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融汇0.5 克的肝组织与100µL 的裂解缓冲, 并分析组织裂解剂的相对 caspase-3/7 活动使用商业化验试剂盒。
- 将组织裂解剂与 caspase-3-7 试剂检测缓冲器混合, 室温孵育30分钟。
- 使用微板块读取器测量每个井中的荧光水平。
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使用商业原位死亡检测试剂盒确定肝脏组织样本中凋亡细胞的水平。
- 用 10 U/毫升蛋白酶 K 的0.5 克组织切片预处理10分钟, 然后用反应混合物在37°c 上孵育60分钟. 用荧光显微镜进行分析。
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Representative Results
每组三只老鼠的样本大小被使用。ALT 测量了 0, 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210, 和240分钟的灌注。我们使用学生的t检验, 以比较的结果之间的基础灌流液和基地灌流液加上 PEG 猫组在每个时间点。在比较基灌流液和基灌流液加上 peg-猫组, 有显着少 (p < 0.05) ALT 在基灌流液加上 PEG 猫组在 150, 180, 210 和240分钟 (图 14A)。
为了分析基底灌流液和基灌流液加 PEG-猫组的组织损伤, 采购了肝脏组织。我们利用学生的t检验来比较基灌流液和基灌流液加 PEG-猫组之间的结果。组织 ATP 是维持在基地灌流液加 PEG 猫组相比, 基本灌流液单独组 (图 14B, p < 0.05)。基灌流液组的组织 MDA 产量明显高于基灌流液加 PEG 组 (图 14C, p < 0.05)。总谷胱甘肽维持在基灌流液加上 PEG 猫组相比, 基灌流液单独组 (图 14D, p < 0.05)。
为分析细胞凋亡, 对照组对肝组织 caspase 3/7 活性进行比较。每井都测量荧光。我们利用学生的t检验来比较基灌流液和基灌流液加 PEG-猫组之间的结果。Caspase 3/7 活性显著下降的基础灌流液加 PEG 猫组相比, 基灌流液单独组 (图 15A, p < 0.05)。采用末端 deoxynucleotidyl 转移酶 (TdT) dUTP 标记 (隧洞) 染色法比较组间细胞凋亡。与基灌流液单独组相比, 基底灌流液和 PEG 组的凋亡细胞比例明显低于 (图 15B、 p < 0.05)。
图 1: 灌注电路.电路元件被标记。灌流液开始在灌流液水库 (1), 这是一个水套容器。灌流液是由一个滚子泵 (2) 从水库中拉出, 并推入 windkessel (3), 然后是肺 (4)。肺为逆流气体和灌流液流提供最大气体交换。灌流液然后进入加热线圈 (5) 内的灌注室, 以确保它是在生理温度, 和一个气泡陷阱 (6), 以防止空气泡沫的灌注。有前器官 (7) 和后器官 (8) 样本端口, 允许灌流液取样。灌流液然后通过门静脉插管进入肝脏。门静脉套管附有压力显示器, 调控压力均衡器 (9)。最后, 将灌流液从压力块中拉回, 通过滚子泵, 倒入储层中。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: 手术室和手术器械的设置.手术显微镜 (1) 应调整为用户适当的高度和放大倍数。异氟醚可预装入麻醉机 (2)。动物的鼻子被放置在鼻子锥体 (3)。手术器械应该放在可以方便地访问的地方 (4)。附近有烙 (5) 是有帮助的。缝线 (6) 应预先切割, 以便在需要时可以快速获得零件, 额外的应可用 (7)。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3: 准备16克门静脉袖套.从16克 angiocatheter 开始。切割7毫米的油管。通过测量3.5 毫米切割在这里, 并删除前半部分油管, 确定7毫米段的中点。用止血粉碎这个现在平坦的部分。使用打火机刻录 angiocatheter 的另一端以创建唇形。不要把笔尖直接放到火焰中, 否则它会着火。请单击此处查看此图的较大版本.
图 4: 中线切口.用锋利的剪刀从剑突 (1) 到耻骨 (2) 进行中线切口, 通过皮肤和肌肉伸展。请单击此处查看此图的较大版本.
图 5: 获得足够的撤回.用弯曲的蚊子钳 (2) 和肋骨拉钩 (3, 4) 收回剑突过程 (1)。请单击此处查看此图的较大版本.
图 6: 下腔静脉夹层.翻转肝脏以暴露右肾 (1) 和门静脉 (2)。解剖周围的静脉 (3) 和放置一个循环7-0 缝合, 以供将来使用。请单击此处查看此图的较大版本.
图 7: 结扎右肾上腺静脉.收回右肾 (1), 以提供接触右肾上腺静脉。把右肾上腺静脉系好, 穿过它。在这种机动过程中, 可以使用湿纱布 (2) 来保护肝脏。请单击此处查看此图的较大版本.
图 8: 肝动脉夹层.解剖周围和放置一个领带周围的肝动脉 (1) 附近的地方, 它通过门静脉 (2)。请单击此处查看此图的较大版本.
图 9: 胆管插管.Cannulate 胆管 (1) 使用27克 angiocatheter (2) 连接到27克管 (3)。这将有助于收集胆汁在灌注过程中。请单击此处查看此图的较大版本.
图 10: 肝脏冲洗.用1克 angiocatheter (16) 冲洗肝脏 (1), 用60毫升冷0.9% 生理盐水与 100 U (2 毫升) 肝素。请单击此处查看此图的较大版本.
图 11: 肝切除术后.做肝切除术, 把肝脏放在冰冷的盐水中。小心不要把胆管插管取出来。请单击此处查看此图的较大版本.
图 12: 门静脉掴.找到门静脉。使用一个大钳 (1) 来保持静脉留下几个毫米唇的静脉钳。使用显微外科钳 (2, 3) 在门静脉放置 16 G 血管袖 (4)。请单击此处查看此图的较大版本.
图 13: 门静脉袖带和上静脉插管.Cannulate 门静脉袖套 (1) 和上静脉 (2)。必须非常小心, 不要取出胆管套管 (3)。另外, 注意不要扭过上腔。请单击此处查看此图的较大版本.
图 14: 分析基灌流液和基灌流液和加 PEG-猫组的组织损伤 (N = 3/组).误差线表示标准偏差。丙氨酸转氨酶 (ALT) 水平。在比较基灌流液和基灌流液加 pegylated 过氧化氢酶 (PEG 猫) 组之间的 alt 水平时, 基部灌流液加 PEG-猫组在150、180、210和240分钟 (p < 0.05) 上的 alt 明显减少。(B) 三磷酸腺苷水平。组织三磷酸腺苷 (ATP) 维持在基灌流液和 PEG 猫组相比, 基灌流液单独组(p <0.05)。丙二醛水平。基灌流液组的组织丙二醛 (MDA) 产量明显高于基灌流液加 PEG-猫组 (p < 0.05)。(D) 谷胱甘肽水平。总谷胱甘肽 (GSH) 维持在基地灌流液加 PEG 猫组相比, 基灌流液单独组 (p < 0.05)。请单击此处查看此图的较大版本.
图 15: 对基灌流液和基灌流液的细胞凋亡和加 PEG 猫组的分析 (N = 3/组).误差线表示标准偏差。(A) Caspase-3/7 活动. Caspase 3/7 的活性显著降低, 基灌流液和 PEG 猫组相比, 基灌流液单独组 (p < 0.05)。(B) 终端 deoxynucleotidyl 转移酶 (TdT) dUTP 尼克末端标记 (隧洞) 染色。图像是用4X 荧光显微镜拍摄的。与基灌流液 (p < 0.05) 相比, 基灌流液和 PEG-猫组的凋亡细胞的百分比明显降低。绿色: 凋亡细胞。蓝色: 核。鳞片棒 = 1000 µm 细胞通过计数细胞从4个随机微观领域的量化。请单击此处查看此图的较大版本.
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Discussion
移植的同种异体肝有很大的不足, 在反应中, 捐献者的标准已经扩大了1、2、3、4、5。由于捐助者短缺, NEVLP 已被引入作为评估和修改器官功能6,7的方法。我们设计了一种 NEVLP 的大鼠模型。此外, 我们使用这个模型来证明它的一个重要的潜在应用-测试新的分子添加剂的肝脏灌流液。在这里, 我们加入了 PEG 猫的基础灌流液, 并证明了它的能力, 减轻肝脏保护伤害。
关键步骤
肝脏灌注回路未经修改即可购买和使用。该电路可以在图 1中可视化。灌流液水库是一种水套容器, 用于保持灌流液在生理温度。从水库灌流液被泵浦和推挤入一个 windkessel 房间被拉扯。这个会议厅有助于抑制灌流液的脉动流, 使其更层流进入器官。在 windkessel 室以后灌流液流动到肺。肺为逆流气体和灌流液流提供最大气体交换到灌流液与95% 氧气。灌流液然后进行加热线圈, 以确保它仍然在生理温度。在器官防止气泡的灌注之前, 一个泡沫陷阱。然后将灌流液从气泡陷阱中抽出, 通过门静脉插管进入肝脏。门静脉套管有一个小分支关闭它为压力显示器。传感器上的油管应该是液体而不是空气, 因此对传感器没有压力损失。在氧气器官后, 灌流液从肝脏流出, 通过下静脉插管到压力均衡器。压力均衡器块有助于防止电路或机构过压。最后, 将灌流液从压力块中拉回, 通过滚子泵, 倒入储层中。
在开始之前, 必须对电路进行每次灌注目视检查, 以识别电路元件或油管上的任何损坏或积聚。如果有细菌或其他物质在电路中积聚, 应更换或清洁部件, 如果可能的话。其次, 清洁剂解决方案, 维护内部组件应冲洗出来。当部件被冲洗出来时, 压力传感器和压力线应清除任何气泡与去离子水。此外, 流量应定期调整, 以确保压力读数是适当响应的变化。如果压力传感器没有正确响应, 则应在必要时检查和重新校准管线中的所有物料。在灌注开始的时候, 确保肝脏的血管在连接到电路时不会变得纠结或扭曲是至关重要的。如果发生这种情况, 在显示器上会出现一个对数趋势的立即压力峰值。最常见的错误是门静脉内有一个定位不当的套管的扭结。这个问题可以解决, 通过把船移到一个更自然的位置, 把它稍稍拉出和矫直的门静脉。压力监测器表明这个问题的解决与压力下降和改进的一致性。其次, 当连接门静脉袖带到门静脉套管时, 血管会变成扭曲的阻碍器官的灌注。调整袖口和纠正这一错误将导致门静脉压力突然激增, 然后立即返回到一个较低的压力和水平保持一致的流量。纠结或扭曲的下腔可以很快地被发现, 从套管和膨胀的血管没有流动。这两种错误在腔静脉也会导致增加的压力, 但不像门静脉的问题, 这种压力施加于器官, 应尽快解决。此问题应在10分钟内解决, 否则应取消试验。一个立即的迹象, 取消实验是看到明显水肿的器官在前20分钟。
如果有从肝脏或套管连接之一的泄漏, 这将是重要的监测灌流液水库水平。灌流液和抽气可能会对实验造成灾难性的后果。一旦空气被泵入管线, 就不可能暂停实验, 并重新对油管进行重排。唯一可能的修正是气泡陷阱捕捉注入的空气。
修改和疑难解答
一旦电路被刷新, 肺就可以被放在线上, 然后电路就可以灌流液。适当地清除空气从肺可以采取几分钟, 但是一个关键的步骤, 以确保空气栓塞不是产生在中间的灌注。在肺完全准备灌流液之后, 气泡陷阱应该被填满, 以捕捉任何形成的气泡。在这一点上, 电路流应设置为1或2毫升/分钟的流量, 以保持灌流液移动, 直到肝脏准备插管。
在 cannulating 门静脉和肝静脉后, 压力应增加, 然后水平。随着流量增加到正常的生理压力, 记录的压力应该开始以类似的渐进方式增加。一旦达到预期的流量 (8–16 mmHg), 压力应该保持相当恒定。我们的目标是 10 mmHg 的压力, 并相应地调整流量。所需的流量达到 10 mmHg 的压力可能会因器官而异。可能有轻微的灌流液从器官的泄漏, 但这灌流液可以收集和返回到水库。
在每次灌流后, 应清洗电路, 以维持燃烧室和储层, 并保存一次性油管和端口。所有灌流液应从电路中移除。该电路应立即刷新至少300毫升的去离子水。而去离子水冲洗电路油管时, 应适当清洗外部部件。外部组件应漂洗或轻轻擦拭, 并允许空气干燥。电路元件易碎, 容易损坏。因此, 最重要的是要轻轻地清洁它。在不使用的情况下, 在去离子水的碱性洗涤剂的5% 溶液中应保留内部电路。该电路中的洗涤剂有助于延长油管的寿命, 防止在其他部件上积聚, 如气泡陷阱和压力均衡器。
在每次使用后, 在电路的彻底清洗和维护下, 可以防止电路的大多数困难。这有助于确保没有积累的残余灌流液, 可能导致堵塞油管或套管。电路元件和油管应定期检查, 并在每次使用前更换, 以确保没有污染或流量的限制。
限制
这种小动物 NEVLP 模型的局限性在于它目前不包括灌注后移植。因此, 对移植后肝移植的功能评价是不可能的。这是未来研究的一个重要领域。此外, 利用小动物电路需要知识和技能。
关于现有模式的意义
本文对猪和小鼠的低温、subnormothermic、常温体外肝灌注模型进行了文献描述。尽管在灌注温度方面仍存在争议, 但该机灌注可改善肝移植术的功能, 无论温度为9。本文介绍的 NEVLP 模型简单、易复制、成本低廉, 具有广泛的应用前景。该模型不包括透析或脉动流到肝动脉, 这是包括在其他一些模型, 因为他们已经被证明是不必要的9,13。此外, 首次使用 NEVLP 的人体试验结果表明, 这是一种有效的肝脏保存方法-因此, 该模型是一个理想的检测未来应用的活体肝脏灌注10。
未来应用
文中提出了 NEVLP 的各种应用前景。每一个都需要在动物模型中进行有条不紊的测试, 然后再在被丢弃的人体器官和人类肝脏中进行测试。这里提出的模型是测试这些新的未来应用的理想, 因为它易于复制, 消除无关的步骤, 并低成本。这一模型最重要的潜在应用之一就是这里展示的--新型药理灌流液添加剂的测试。其他建议的应用包括修复受损器官, 脱脂肝脏, 允许移植脂肪变性器官, 引入丙型肝炎病毒抵抗, 间充质干细胞治疗, 基因修饰和灌注免疫抑制剂剂 11,31,32,33,34,35,36,37,38。
结论
最后, 我们展示了一个廉价的, 易于复制的 NEVLP 模型使用大鼠。使用这个模型需要仔细的准备, 实践和知识, 但可以以低成本执行。该模型的应用可以包括测试新的灌流液添加剂, 如在代表性的结果中证明。该模型的其他应用可能包括用于器官评估、不同 perfusates、人工或血红蛋白的氧载体和用于修复器官的药物的测试软件。
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Disclosures
所有作者都报告说, 他们没有相关的披露。
Acknowledgments
这项工作得到了美国国立卫生研究院 T32AI 106704-01A1 和俄亥俄州立大学器官移植、灌注、工程和再生的 t 鲁道夫·弗莱切基金的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Perfusate | |||
| 8% Albumin | CLS Behring, King of Prussia, PA | 0053-7680-32 | |
| Williams Media | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | W1878 | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | P4333 | |
| Insulin | Eli Lilly, Indianapolis, IL | 0002-8215-91 | |
| Heparin | Fresnius Lab, Lake Zurich, IL | C504701 | |
| L-glutamine | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | G3126 | |
| Hydrocortisone | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | H0888 | |
| THAM | Hospira, Inc, | 0409-1593-04 | |
| Polyethylene Glycol - Catalase | Sigma Aldrich | S9549 SIGMA | |
| Personal Protective Equipment | |||
| Surgical Mask | Generic | N/A | |
| Protective Gown | Generic | N/A | |
| Surgical Gloves | Generic | N/A | |
| Liver Procurement | |||
| Sprague-Dawley Rat | Harlan Sprague Dawley Inc. | 250 -350 grams | |
| Surgical Microscope | Leica | M500-N w/ OHS | |
| Charcoal Canisters | Kent Scientific | SOMNO-2001-8 | |
| Isoflurane | Piramal Healthcare | N/A | |
| Pressure-Lok Precision Analytical Syringe | Valco Instruments Co, Inc. | SOMNO-10ML | |
| Electrosurgical Unit | Macan | MV-7A | |
| Warming Pad | Braintree Scientific | HHP2 | |
| SomnoSuite Small Animal Anesthesia System | Kent Scientific | SS-MVG-Module | |
| PhysioSuite | Kent Scientific | PS-MSTAT-RT | |
| Isoflurane chamber | Kent Scientific | SOMNO-0530LG | |
| SurgiVet | Isotec | CDS 9000 Tabletop | |
| Oxygen | Praxair | 98015 | |
| Rib retractors | Kent Scientific | INS600240 | |
| GenieTouch | Kent Scientific | GenieTouch | |
| Normal Saline | Baxter | NDC 0338-0048-04 | |
| 4x4 Non-Woven Sponges | Criterion | 104-2411 | |
| Sterile Q-Tips | Henry Schein Animal Health | 1009175 | |
| U-100 27 Gauge Insulin Syringe | Terumo | 22-272328 | |
| 5mL Syringe | BD | REF 309603 | |
| 4-0 Braided Silk Suture | Deknatel, Inc. | 198737LP | |
| 7-0 Braided Silk Suture | Teleflex Medical | REF 103-S | |
| 16 gauge Catheters | BBraun Introcan Safety | 4252586-02 | |
| 14 gauge Catheters | BBraun Introcan Safety | 4251717-02 | |
| Bile Duct Cannular Tubing | Altec | 01-96-1727 | |
| Liver Perfusion Circuit Components | |||
| Water Bath Warmer | Lauda Ecoline Staredition | E103 | |
| Data Collection Software | ADInstruments | Labchart 7 | |
| Liver Perfusion Circuit | Harvard Apparatus | 73-2901 | |
| Membrane Oxygenator | Mediac SPA | M03069 | |
| Roller Pump | Ismatec | ISM827B | |
| Gas (95% oxygen and 5% carbon dioxide) | Praxair | 98015 | |
| Organ Chamber | Harvard Apparatus | ILP-2 | |
| 1.8 mL Arcticle Cryogenic Tube | USA Scientific | 1418-7410 | |
| Mucasol | Sigma-Aldrich | Z637181 | |
| Microsurgical Instruments | |||
| Small Scissors | Roboz | RS-5610 | |
| Large Scissors | S&T | SAA-15 | |
| Forceps - Large Angled | S&T | JFCL-7 | |
| Forceps - Small Angled | S&T | FRAS-15 RM-8 | |
| Clip Applier | ROBOZ | RS-5440 | |
| Scissors - non micro | FST 14958-11 | 14958-11 | |
| Forceps - Straight Tip | S&T | FRS-15 RM8TC | |
| Large Microsurgical Clip | Fine Scientific Tools | 18055-01 | |
| Small Microsurgical Clip | Fine Scientific Tools | 18055-01 | |
| Small Microsurgical Clip | Fine Scientific Tools | 18055-02 | |
| Small Microsurgical Clip | Fine Scientific Tools | 18055-03 | |
| Small Mosquito Clamps | Generic | N/A | |
| Post-Experiment Analysis | |||
| Alanine Aminotransferase (ALT) Activity Colorimetric/Fluorometric Assay Kit | BioVision | K752 | |
| Adenosine Triphosphate (ATP) Colorimetric/Fluorometric Assay Kit | BioVision | K354 | |
| Glutathione Assay Kit | Cayman Chemical | 703002 | |
| Lipid Peroxidation (MDA) Assay Kit | Abcam | ab118970 | |
| Caspase-Glo 3/7 Assay Systems | Promega | G8090 | |
| POLARstar OMEGA Microplate Reader | BMG LABTECH | N/A |
References
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