Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para a fabricação de placas de gradiente nanopattern através de nanoimprinting térmica e o método de triagem respostas de células progenitoras endoteliais humanas para as nanoestruturas. Usando a tecnologia descrita, é possível produzir um andaime que pode manipular o comportamento de célula por estímulos físicos.
Abstract
Nanotopography pode ser encontrado em várias matrizes extracelulares (ECMs) em torno do corpo e é conhecido por ter importantes acções regulamentares sobre reações celulares. No entanto, é difícil determinar a relação entre o tamanho de um nanostructure e as respostas das células devido à falta de ferramentas de triagem adequada. Aqui, nós mostramos o desenvolvimento de placas de nanopattern gradiente reprodutível e de baixo custo para a manipulação de respostas celulares. Usando o óxido de alumínio anódico (AAO) como um molde mestre, placas de gradiente nanopattern com nanopillars de intervalos de diâmetro crescente [120-200 nm (GP 120/200), 200-280 nm (GP 200/280) e 280-360 nm (GP 280/360)] foram fabricados por uma térmica impressão técnica. Estas placas de gradiente nanopattern foram projetadas para imitar os vários tamanhos de nanotopography em ECM e foram usadas para a tela de respostas do humanas formadoras células endoteliais (hECFCs). Neste protocolo, descrevemos o procedimento passo a passo de fabricação de placas de gradiente nanopattern para celular, técnicas de cultivo hECFCs de sangue periférico humano e cultivo hECFCs em placas de nanopattern de engenharia.
Introduction
Recentemente, a resposta das células por estimulação física de topografia da superfície tem sido em destaque no campo da célula engenharia1,2,3,4. Portanto, mais atenção tem sido focada em nanoestruturas tridimensionais no celular acessório superfície5. Tem sido relatado que a integrina, que é o dispositivo de reconhecimento de superfície da célula, transmite o estímulo físico conduzido pelas estruturas micro-nano de ECM a transdução mechano6. Esta estimulação mecânica regula o comportamento da célula através de de orientação contato7 e induz a reorganização do citoesqueleto para mudar de forma, além de aderências focais e rigidez de células8.
Células progenitoras endoteliais humanas (hEPCs) no corpo interagem estreitamente com o microambiente do ECM circundante9. Isso indica que o estado físico de ECM atua como um parâmetro importante para a formação de complexos adesão célula-matriz específica como tensão de cisalhamento derivado de fluxo de sangue10. É relatado que nanotopography superfície aumenta a formação de redes de tubo capilar extensa de hEPCs11 em vitro e que um fator solúvel ECM/bio combinado sistema permite hEPCs reconhecer substratos disfuncionais e promove ferida cura12,13. No entanto, a relação entre ECM e hEPCs não é claramente entendida.
Embora muitos pesquisadores tentaram esclarecer a relação entre as respostas de célula e sinais físicos de diferentes substratos14,15,16, estes estudos usado apenas o tamanho fixo de um nanostructure ou nanopatterns com arranjos irregulares que possuem uma limitação para elucidar a relação entre o tamanho do comportamento nanostructure e celular. O problema é a falta de instrumentos adequados para a seleção de respostas celulares que podem substituir as abordagens existentes tediosas e iterativas para encontrar o tamanho ideal do nanostructure. Portanto, uma técnica simples é necessária para reações de célula em estímulos físicos sem repetição de triagem.
Aqui, descrevemos um método usado em nossos anteriores relatórios17,18,19 , para produzir um gradiente nanopattern em que o diâmetro da nanopillars arranjado aumenta gradualmente. Além disso, também descrevemos como cultivar e analisar o comportamento de hECFCs em placas de gradiente nanopattern para determinar o efeito de estímulos físicos sobre as células. Um suave anodização, gravura gradual e método de revestimento de camada decolagem foram usados para fabricar o molde AAO gradiente. Adotando uma térmica impressão técnica de litografia, nanopatterns gradientes poliestireno idênticos foram produzidas de forma econômica e fácil. Usando gradiente nanopatterns, é possível determinar qual o tamanho de nanostructure tem um grande efeito sobre o comportamento da célula em um conjunto de experiência. Esperamos que este gradiente nanopattern será útil na compreensão dos mecanismos de interação entre hECFC derivados de sangue ou outras células e vários tamanhos de nanoestruturas.
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Protocol
Este estudo foi aprovado pelo Conselho de revisão institucional Hospital Coreia universitário Anam (IRB no. ED170495). Todos os procedimentos foram realizados em conformidade com a declaração de Helsinki e suas alterações posteriores.
1. preparação do substrato de alumínio (Al) por polimento electrolítico
Atenção: Solução de polimento electrolítico é corrosivo e tóxico. Use equipamento de proteção pessoal, incluindo luvas de nitrila, óculos e jaleco. Execute esta etapa em uma coifa.
- Preparar a solução de polimento electrolítico através da mistura de etil álcool (C2H5OH, 99,9%) e ácido perclórico (HClO4, 60%) num copo de revestimento duplo de 1L (C2H5OH:HClO4 = 4:1).
- Conectar o copo duplo revestimento para um circulador e definir a temperatura a 7 ° C. Colocar o copo duplo revestimento em um agitador magnético. Deixar a solução sob agitação durante pelo menos 30 minutos até que a temperatura cai para 7 ° C.
- Mergulhe a placa Al ultrapura (99,999%, 20 × 50 × 1 mm3) e eletrodo contador de carbono para a solução de polimento electrolítico usando clipes de crocodilo e fio de cobre. Ajuste a posição da placa do Al e o elétrodo contrário de carbono que nos enfrentar.
Nota: É necessário instalar os clipes com cuidado para não tocar a solução. Quando em contato com a solução, fluindo de clips de impurezas podem contaminar a placa de Al. - Conecte a placa de Al para o terminal positivo e o eletrodo contador de carbono para o terminal negativo, de uma corrente contínua (DC) fonte de alimentação.
- Desligue o agitador magnético e aplicar uma tensão de 20 V. manter esse estado por 4 min.
- Ligue o agitador magnético e permitir que a corrente flua por mais 6 minutos.
Nota: A condição estática remove a maioria das impurezas e rugosidade da chapa de Al, e a condição dinâmica melhora a qualidade final do polimento electrolítico. - Desligue a alimentação e separar manualmente a placa de Al do clip. Rigorosamente, lave a placa de Al com água desionizada para remover todos os restante da solução.
- Seque a placa de Al com nitrogênio e loja sob gás inerte. Conduza este processo de secagem no final de todas as experiências na etapa 1 e 2.
Nota: Ao injetar ar comprimido, certifique-se de fluxo de ar da parte polida para o lado oposto. No caso contrário, impurezas podem escapar da parte não-polido e contaminar a placa de Al.
2. fabricação do molde de gradiente AAO com o eletrólito de ácido fosfórico
Atenção: Álcool metílico e seus fumos são tóxicos ocular. Contínua exposição ao crómio pode levar a intoxicação por cromo grave. Execute esta etapa em uma coifa.
- Anodização primária
- Para preparar 1 L de eletrólito de ácido fosfórico, carrega 590 mL de água destilada em uma garrafa de vidro.
- Adicione 400 mL de álcool metílico (CH3OH, 99%) e 10 mL de ácido fosfórico (H3PO4, 85%) para o frasco de vidro. Misture a solução bem agitando manualmente ou com agitação magnética.
- Despeje num copo de revestimento duplo de 1L 500ml do eletrólito. Imergir o polido Al prato e carbono elétrodo contrário a solução com clipes de crocodilo e fio de cobre.
- Despeje o eletrólito adicional para localizar o limite de polimento electrolítico 2-3 mm acima da superfície da solução.
Nota: Se anodização é efectuada com o limite de polimento electrolítico tocar a solução, a placa de Al tende a queimar durante a anodização. - Instale um eixo vertical em um pedestal em forma de U. Anexe um agitador sobrecarga e impulsor usando grampos de metal. Posição da hélice do rotor perto da extremidade inferior de ambos os eletrodos. Defina a velocidade de rotação do agitador sobrecarga entre 200 e 300 rpm.
- Conectar o copo duplo revestimento para um circulador e seleccionar a temperatura de-10 ° c. Deixe o sistema pelo menos 1 h, sob agitação até a temperatura desce a-10 ° C.
Nota: Não use água como líquido de arrefecimento. Porque a água congela em baixas temperaturas, a circulação não funcionará normalmente. Recomenda-se usar uma mistura de água e álcool etílico na proporção de 1:1 como o líquido de arrefecimento. - Aplica uma tensão de 195 V sob agitação por 16 h.
Nota: Se a corrente sobe mais de 50 mA dentro de 2 ou 3 h após a aplicação da tensão, que queima irá ocorrer a probabilidade é muito alta. Imediatamente parar o processo e substituir a placa de Al com um novo. Se esse problema ocorrer repetidamente, verificar que não há nenhuma anormalidade no controle de temperatura do circulador. Se não há nenhuma anormalidade, mude o eletrólito. - Parar a alimentação e separar manualmente a placa de Al do clip. Lave a placa de Al anodizada com água desionizada para remover todos os restante da solução.
- Gravura da alumina
- Prepare o ácido crômico, ácido solução dissolvendo 9,0 g de óxido de cromo (CrO3) e 20,3 mL de ácido fosfórico (H3PO4, 85%) em 500 mL de água desionizada.
- Despeje a solução de condicionamento para o copo de jaqueta dupla 1 L. Seleccionar a temperatura de 65 ° c.
- Mergulhe a placa Al anodizada na solução de condicionamento pelo menos 10 h, sob agitação. Sele o topo do copo com folha de alumínio.
- Lave a placa Al gravada várias vezes com água desionizada.
- Anodização secundária
- Defina as mesmas condições experimentais como passo 2.1.1 para 2.1.7.
- Carregar a placa de Al gravada para o ânodo do sistema e aplicar uma tensão de 195 V para 6 h. Em seguida, desligue a alimentação e separar manualmente a placa de Al do clip. Lave imediatamente a placa Al anodizada com água desionizada.
Nota: Quando o tempo de lavagem é atrasado, o tamanho dos poros da AAO involuntariamente aumenta devido o ácido fosfórico residual.
- Alargamento dos poros gradiente
- Prepare uma solução de alargamento dos poros, dissolvendo 5,765 g de ácido fosfórico em 500 mL de água desionizada. Despeje a solução num copo de revestimento duplo de 1 L.
- Conectar o copo duplo revestimento para o circulador e definir a temperatura a 30 ° C. Um palco em movimento linear verticalmente ao lado o copo de lugar. Fixe um suporte para a parte móvel da fase linear.
- Defina a parte móvel da fase linear para a posição inicial. Prender o clipe para o suporte e carregar a placa de Al anodizada.
- Manipule a posição da placa de Al manualmente para que a placa de Al virá bem acima da superfície da solução.
Nota: Nesta etapa, a placa de Al não deve tocar a solução. O poro alargamento processo começa assim que a placa de Al atinge a solução. - Mergulhar a placa Al gradualmente a solução a uma velocidade de 4,86 µm/s para 120 min fazer um molde AAO de 35 milímetros com um tamanho de gradiente de 120 nm a 200 nm (GP 120/200). Inicie um cronômetro no momento que a placa Al toca a superfície da solução.
- Para fazer moldes de GP 200/280 e GP 280/360, mergulhe toda a área do molde de GP 120/200 nos poros alargamento solução para 2 ou 4 h, respectivamente.
- Lave a placa Al gradiente várias vezes com água desionizada.
3. deposição de camada de decolagem no molde de gradiente AAO com self-Assembled Monolayer
Nota: Execute etapas 3.2.1 para 3.3.3 em uma caixa de luva. Conecte uma bomba de vácuo e injector de gás nitrogênio seco para o porta-luvas. Coloque todas as amostras, reagentes e aparelhos no porta luvas antes do processo de desumidificação. Repita o ciclo de injeção de gás de evacuação e nitrogênio mais de três vezes para remover a umidade adequada de luvas. Deixe o nitrogênio seco flua através do experimento.
- Modificação de hidroxila de molde AAO com tratamento de Piranha
- Despeje 140 mL de ácido sulfúrico (H2SO4, 95%) num copo de politetrafluoretileno (PTFE). Adicione 60 mL de gota a gota de peróxido de hidrogênio (H2O2, 30%). Deixe por 30 min até arrefecer a solução.
Atenção: Tenha muito cuidado ao fazer solução de Piranha. Desde o momento da adição de peróxido de hidrogênio, a solução vigorosamente ferve e gera altas temperaturas. Realizar o experimento em uma coifa. - Mergulhe o molde AAO na solução por 30 s usando uma pinça não metálica.
- Lave o molde AAO várias vezes com água desionizada. Mergulhe o molde em água desionizada para 30 min e colocá-lo em álcool metílico por mais 30 minutos.
Atenção: Quando se desfizer da solução Piranha, dilua a solução com uma quantidade abundante de água da torneira. - Seque completamente o molde AAO sob vácuo para 3h.
- Despeje 140 mL de ácido sulfúrico (H2SO4, 95%) num copo de politetrafluoretileno (PTFE). Adicione 60 mL de gota a gota de peróxido de hidrogênio (H2O2, 30%). Deixe por 30 min até arrefecer a solução.
- Preparação da solução estoque de HDFS × 20
Nota: HDFS é uma abreviação de (heptadecafluoro-1,1,2,2, - tetrahydrodecyl) dimethylchloro-silano- Encha um terço de uma garrafa de n-hexano 1L com peneiras moleculares. Tapar o frasco com a película de parafina e armazená-lo sob nitrogênio seco por 24 h.
- Filtre os 200 mL de n-hexano utilizando uma seringa de vidro e filtro de seringa 0,2 µm PTFE.
- Despeje a 80 mL de n-hexano filtrado em um frasco de vidro de 100 mL. Adicione 2 mL de HDFS.
- Deposição de monocamadas auto montado
- Carrega 57 mL de n-hexano filtrada em um copo de 100 mL. Mergulhe o molde AAO o solvente.
- Adicione 3 mL de solução-mãe HDFS para o n-hexano para fazer 2,9 mM HDFS solução. Espere 10 min para a reação prosseguir.
- Transfira o molde da AAO para fresco n-hexano. Fechar e selar todos os frascos de reagente. Feche a válvula de nitrogênio e, em seguida, puxe para fora as amostras da caixa de luva.
Nota: HDFS é extremamente sensível à umidade. Armazene todos os reagentes que contenham HDFS num exsicador. - Mergulhe o molde AAO em 60 mL de methoxynonafluorobutane (C10H6F18O2, 99%). Proceder a limpeza do molde AAO num copo para 10 s por um tempo para remover fisicamente adsorvida moléculas HDFS. Repita o procedimento de limpeza 10 vezes.
Nota: Expondo o molde da AAO de ultra-som por um longo tempo sem intervalos irá danificar a camada de óxido. - Seque completamente o molde AAO sob vácuo durante 24 h.
Nota: Uma camada de decolagem com sucesso depositada é estável por meses quando armazenado num exsicador e super repelente de água. O protocolo pode ser pausado aqui.
4. fabricação de placas de gradiente Nanopattern pela impressão térmica
Nota: Execute etapas 4.2 para 4,7 em uma sala limpa.
- Corte uma folha de isopor grossa 1,1 mm para um tamanho de 2,9 mm de largura por 3,7 mm de comprimento, usando um cortador de placa (PCB) de circuito impresso.
- Corte o molde da AAO 35mm do fundo usando uma pinça. Marca o nome de amostra e data de fabrico no verso.
- Limpe uma bolacha 8.0" com uma pequena dose de álcool etílico. Coloque as folhas de poliestireno sobre a bolacha e, em seguida, monte o molde da AAO.
- Colocar o filme de fundo na gaveta de uma impressora térmica. Anexe o filme top para a junta.
- Colocar a bolacha sobre o filme de fundo. Coloque a junta sobre a bolacha. Certifique-se de que não há nenhuma poeira sobre a bolacha.
- Feche a gaveta da impressora térmica. Aplicar a 165 ° C de calor e 620.52 kPa de pressão para 100 s.
- Refrigerar a amostra à temperatura ambiente. Torça delicadamente a folha de isopor para liberar o molde AAO.
5. esterilização e hidrofílica modificação do gradiente Nanopattern placas
- Coloca as placas de nanopattern em um prato quadrado. Despeje 100 mL de álcool etílico a 70% e expor à luz ultravioleta por 30 min.
- Seca as placas de nanopattern com nitrogênio. Transferi as placas de nanopattern para um gerador de plasma de oxigênio.
- Evacuar a câmara até atingir 1.33 PA. Em seguida, injetar o oxigênio a uma taxa de 30 cm3/min. aplicam-se uma potência de rádio frequência de 60 w. manter o plasma de oxigênio para 90 s.
Nota: Recomenda-se usar placas nanopattern tratados com plasma dentro de 14 dias. - Fixe a placa de nanopattern no fundo de um prato de cultura de células usando uma gota de tolueno.
- Selar as amostras em uma bolsa e esterilizar com esterilizador de plasma de baixa temperatura.
6. cultivo de hECFCs
Nota: Realizar todos os procedimentos de centrifugação a 4 ° C a menos que indicado o contrário.
- Antes de isolar o sangue periférico (PBMC), de células mononucleares incubar numa placa de cultura de 12-poços de colágeno-revestido a 37 ° C por 1h.
- Lave o prato de cultura 12-poços utilizando 1 × de soro fisiológico estéril tamponado de fosfato (PBS).
- Colete 50 mL de sangue humano, usando um tubo de inibidor de heparina.
- Colocar um tubo de 15 mL 6 mL de solução de polissacarídeo hidrófilo e adicionar 8 mL de sangue para a solução de polissacarídeo hidrófilo.
Nota: Lentamente, pipete o sangue para a solução de polissacarídeo hidrófilo. - Centrifugar o tubo a 1020 x g por 20 min para as células de Pelotas.
- Colha a camada de células opaco e transferir para um novo tubo de 15 mL.
- Adicionar 10% de soro fetal bovino (FBS)-contida PBS e centrifugar o tubo a 1020 x g durante 10 minutos para as células de Pelotas.
- Remover o sobrenadante e adicionar tampão de lise celular-vermelho-sangue. Manter-se no gelo por 5 min.
- Adicionar 10% FBS-contido PBS e centrifugar o tubo a 1020 x g por 5 min para as células de Pelotas.
- Remover o sobrenadante e adicionar 10% FBS-contido PBS. Centrifugar o tubo a 1020 x g por 5 min para as células de Pelotas.
- Remover o sobrenadante e adicionar 1 mL de meio de expansão de células endoteliais suplementado com 10% FBS. Sementes de 8,0 × 106 células por poço para cada prato de colágeno-revestido.
- Altere o meio de cultura todos os dias durante 1 semana. Em seguida, altere o meio de cultura em 2 dias.
Nota: hECFCs pode ser encontrado após cultura dia 10-14. hECFCs mostrar morfologia típica, como paralelepípedos e formam uma colônia que pode ser observada em microscopia de contraste de fase. Mancha da imunofluorescência de caderina endotelial vascular (CD144) e fator de von Willebrand (vWF) pode ser realizado também para a caracterização do hECFCs após a expansão celular. - Cultivar a hECFCs, use suplementado com 5% FBS e penicilina/streptavidin a 37 ° C numa atmosfera umidificada contendo 5% CO2expansão endothelial da pilha. Substitua o meio uma vez por dia.
- Após a indução de hECFC, crescem as células de passagem 7 para novas experiências.
7. propagação de pilha e cultura com as placas do gradiente Nanopattern
Nota: Passo 7 descreve a cultura de hECFCs na placa de gradiente nanopattern, mas outras fontes de células também podem ser usados.
- Revesti as placas de gradiente nanopattern com 1 mL da solução de revestimento de proteína de 0,1% em PBS por 10 minutos em temperatura ambiente.
Nota: O revestimento de proteína 0,1% não abrange as características de nanopillar. - Faça uma suspensão de hECFCs do prato de cultura por um método de divisão de célula padrão usando a tripsina.
- Dilua a suspensão de células para alcançar a desejado confluência. Semente do hECFCs para o gradiente nanopattern placas e controle plana (por exemplo, 1,0 × 104 células/cm2).
Nota: Quando hECFCs são semeados de 1,0 × 104 células/cm2 em placas nanopattern gradiente, a confluência de célula geralmente atinge a 70-80% depois de 2 dias. - Cultura de células em placas planas ou gradiente nanopattern por 2 dias na incubadora.
8. observação e análise
- Imagem de microscópio eletrônico de varredura (MEV)
- Fix hECFCs cultivadas em placas planas ou gradiente nanopattern com glutaraldeído 2,5% a 4 ° C para a noite.
- Trate o tetróxido de ósmio 1% por 1h à temperatura ambiente. Lave as amostras com PBS.
- Desidrata-se amostras com álcool etílico de baixa a alta concentração (50%, 70%, 80%, 90% e 100%) por 10 min por cada passo.
- Trate hexamethyldisilazane (HMDS) durante 15 minutos à temperatura ambiente. Depois disso, lavar as amostras com HMDS fresco e deixar amostras sob a coifa pelo menos 1 dia até o HMDS residual se evapore completamente.
- Revestir as amostras com platina sputter coater por 5 min e examinar as amostras com um SEM.
- Imagem de microscópio eletrônico (TEM) de transmissão
- Fix hECFCs cultivadas em placas planas ou gradiente nanopattern com 2% paraformaldeído e 2,5% glutaraldeído mistura em PBS a 4 ° C para a noite.
- Realizar pós-fixação usando o tetróxido de ósmio 1% e desidratar amostras usando o método em 8.1.3.
- Incorpore amostras em resina epóxi. Fazer 60 seções espessas de nm de blocos e coloque uma seção em uma grade de dez.
- Manche a seção com a mistura de acetato de uranilo 10 mg em 100 mL de álcool metílico e citrato de chumbo 0,1 mg em 100 mL de água destilada. Obter imagens com um TEM.
- Fluorescência de coloração
- Fix hECFCs cultivadas em placas planas ou gradiente nanopattern com paraformaldeído 4% à temperatura ambiente por 15 min.
- Permeabilize e bloquear as amostras com 5% cabra soro e 0,1% Octilfenol etoxilato em PBS (PBST) à temperatura ambiente por 30 min.
- Incube as amostras com anticorpo anti-humano vinculina primário (1: 500 em PBST) à temperatura para amostras de 2 h. lavar três vezes com PBST.
- Incube as amostras com fluorescência-conjugados faloidina (1:1, 000 em PBST), conjugados a fluorescência anticorpo secundário (1:1, 000 em PBST) à temperatura ambiente para amostras de 2 h. lavar três vezes com PBST.
- Incube as amostras com 4' 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, 1:1,000 em PBST) à temperatura ambiente por 5 min.
- Queda de 10 µ l de meio de montagem na superfície do gradiente nanopattern. Coloque uma lamela sobre o meio de montagem.
- Colocar a amostra de cabeça para baixo na fase de amostra e adquirir imagens usando o microscópio de fluorescência confocal.
- Análise de imagem
- Transferi imagens capturadas do hECFCs para um sistema de análise de imagem.
- Escolha o campo aleatório de faloidina, manchando a imagem. Ajustar o limite e criar uma imagem binária, na qual as células são distintas do fundo.
- Desenhe os contornos em torno de células para medir a área celular e perímetro e manualmente, contar o número de filopodia por célula.
- Escolha o campo aleatório da vinculina manchando a imagem. Ajustar o limite e criar uma imagem binária das áreas de adesão focal.
Nota: Ajuste o limite de imagem adequadamente para evitar artificial over - ou under - filling das áreas de adesão focal. - Conte o número de adesão focal de cada célula.
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Representative Results
A Figura 1 mostra SEM imagens dos moldes AAO gradientes fabricados de acordo com seu tipo e posição. A Figura 2 mostra SEM imagens das placas de gradiente nanopattern com nanopillars regular-arredondado, e a Figura 3 é dados de quantificação do diâmetro nanopillar. A tabela 1 lista as características da nanopillars fabricados.
A figura 4A mostra o esquema de cultivo de hECFCs de hemoderivados. Figura 4B mostra a imagem de contraste de fase de hECFCs de thecultivated. A Figura 4 mostra marcadores hECFC manchadas com CD144 (verde), vWF (vermelho) e núcleo (azul). Figura 5A mostra imagens SEM representante de hECFCs depois de 2 dias de cultura em plano, GP 120/200, GP 200/280 e placas GP 280/360. Figura 5B e C mostram dados quantitativos sobre a célula área e perímetro em comparação com o plano. Os dados de quantificação revelaram que as células cultivadas na nanopillar superfícies de tamanho menor mostraram célula reduzida área e perímetro. Figura 5 é as imagens SEM representante de hECFCs, que mostram a morfologia da filopodia existente. Figura 5E retrata os dados quantitativos sobre filopodia número em comparação com o plano. Consequência de filopodial significativa foi observada em células cultivadas no GP 120/200, enquanto nenhuma mudança significativa foi observada em GP200/280 ou GP280/360, em comparação com o plano. Figura 5F mostra imagens TEM representante de hECFCs depois de 2 dias de cultura em placas planas e gradiente nanopattern.
Figura 1. Molde AAO gradiente. Imagens SEM do gradiente AAO moldes para GP 120/200, 200/280 de GP e GP 280/360 placas de acordo com a posição dos moldes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 . Placas de gradiente nanopattern. Imagens SEM placas de gradiente nanopattern pilar-tipo de para GP 120/200, 200/280 de GP e GP 280/360 placas de acordo com a posição das placas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 . Gradiente de tamanho de diâmetro nanopillar. Dados de quantificação mostrando o gradiente de diâmetros de nanopillar para GP 120/200, 200/280 de GP e GP 280/360 placas, respectivamente. Barras representam o erro padrão. Esta figura foi modificada de [Acta Biomaterialia] 20. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Módulo de Young (GPa) | Nanopillar diâmetro (nm) | Nanopillar Pitch (nm) | Distância de centro a centro (nm) | Altura do Nanopillar (nm) | Rigidez de Nanopillar (N/m) | |
| Apartamento | 2.43±0.19 | - | - | - | - | - |
| GP 120/200 | 1.74±0.11 | 120-200 | 320-240 | 440 | 276.9±21.9 | 9.35 |
| GP 200/280 | 2.01±0.05 | 200-280 | 240 – 160 | 440 | 268.1±25.9 | 55.78 |
| GP 280/360 | 2.1±0.13 | 280-360 | 160-80 | 440 | 293.6±23.6 | 134.15 |
Tabela 1. Características dos fabricados nanopillars. Dados quantificados, mostrando o módulo de Young, diâmetro, densidade, distância de centro a centro, altura e rigidez dos nanopillars fabricados. Esta tabela foi modificada de [Acta Biomaterialia] 20.
Figura 4 . Caracterização de hECFCs. (A) horário de exibição Diagrama esquemático de hECFCs derivado do sangue periférico adulto. Imagem de contraste de fase (B) da colônia de hECFC, derivado de sangue periférico adulto no dia 14. (C) imunofluorescência imagens mostrando CD144 (verde), vWF (vermelho) e o núcleo da célula manchada com DAPI (azul). Esta figura foi modificada de [Acta Biomaterialia] 20. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5 . hECFCs cultivadas em placas planas e gradiente nanopattern por 2 dias. (A) imagem SEM representante de hECFCs cultivadas em placas de Flat, GP 120/200, 200/280 de GP e GP 280/360. (B e C) Dados de quantificação da área e perímetro de hECFCs (n = 50). * p <.05 em comparação com o plano. (D) imagens de SEM representante da vanguarda do hECFCs em placas planas e gradiente nanopattern. (E) dados de quantificação do número de filopodia por um hECFC (n = 20). * p <.05 em comparação com o plano. (F) imagem TEM representante de hECFC cultivadas no Flat e gradiente nanopattern placas. Setas brancas indicam os pontos de interação entre hECFCs e substrato de superfície. Esta figura foi modificada de [Acta Biomaterialia] 20. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Complementar Figura 1. Ângulo de contato da água da AAO imaculada e HDFS tratados AAO. Medições de ângulo de contato mostrando propriedades hidrofóbicas do HDFS Self montado monocamada (A) antes e, (B) após o tratamento. Clique aqui para baixar esta figura.
Complementar Figura 2. Imagens SEM das placas nanopattern gradiente fabricados com o mesmo molde AAO. Imagem de SEM comparativo define para verificar a durabilidade do molde da AAO. (A) placa de nanopattern gradiente produzido com molde feito recentemente. (B) placa de nanopattern gradiente produzido com molde AAO após impressão 15 vezes. Clique aqui para baixar esta figura.
Complementar Figura 3. Influência do revestimento da proteína. Imagens SEM de hECFCs que foram cultivados na GP 120/200, GP 200/280 ou GP 280/360 gradiente nanopattern placas da (A) sem e (B) o revestimento de proteína. Esta figura foi modificada de [Acta Biomaterialia] 20 Clique aqui para baixar esta figura.
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Discussion
Fabricação de um AAO frequentemente sofre de defeitos tais como fissuras, formas irregulares de poros e queimando. A principal razão para esses defeitos é chamada uma repartição eletrolítica, que é fortemente afetada pela natureza das substratos metálicos sendo anodizado e a resistividade do eletrólito21. Desde que a resistividade do eletrólito varia de acordo com sua temperatura, eliminar o calor continuamente de eletrodos é o ponto crítico para manter a temperatura locacionais do eletrólito como estável em tal uma condição anodização de alta tensão. Neste protocolo, temos fabricado moldes AAO modificando Two-Step anodização22,23 do Masuda. Substituir o eletrólito quase metade com álcool metílico não só impede que o eletrólito de congelamento a baixas temperaturas, mas também priva o eléctrodo de calor por evaporação na parte inferior do poro24. A razão para usar um misturador de sobrecarga e impulsor em vez de um agitador magnético é também para garantir o controle de temperatura. O agitador magnético típico tem uma alta probabilidade de marcha lenta devido o desalinhamento acidental da Barra magnética durante a operação de longo prazo. Este problema induz a divulgação indevida do eletrólito, aumentando sua temperatura e levando a queima.
Para dar um gradiente de tamanho para o molde da AAO, estamos gradualmente imerso da AAO em um ácido fosfórico, ácido solução. Os poros são alargados na proporção do tempo que da AAO permanece na solução de gravura, como mostrado na Figura 1. Sob esta condição, a taxa média de poro-alargamento é 0.67 nm/min. manipulando a velocidade de imersão e tempo irá alterar a inclinação do diâmetro do poro gradiente e máximo tamanho da AAO. O diâmetro dos poros possível máxima é de 400 nm. Quando o diâmetro dos poros excede 400 nm, a parede de espaçamento entre os poros torna-se tão fina que ele não pode tolerar a pressão durante o processo de impressão térmica.
Uma monocamada auto montada HDFS é conhecida por ser capaz de adicionar uma propriedade hidrofóbica para o material de superfície25. A molécula do HDFS faz uma forte ligação covalente com os grupos hidroxila na superfície AAO introduzida pela Piranha tratamento26. Portanto, conforme mostrado na Figura complementar 1, uma monocamada auto montada sólida pode ser formada quando um grande número de grupos hidroxila está presente na superfície do substrato. Para optimização da qualidade com uma monocamada auto montada HDFS, sugerimos realizar a reação em um ambiente desumidificado. Quando HDFS é exposto à umidade, uma reação lateral com água forma dímeros, trímeros e mesmo oligómeros de moléculas de silano e diminui a qualidade geral da Self montada monocamada.
Ao usar o molde da AAO com um gradiente de tamanho em nanoimprinting térmico, placas de cultura de células com um gradiente de nanopillars foram obtidas Figura 2 e Figura 3. O método de nanoimprinting térmica tem uma vantagem em que pode produzir uma grande quantidade de placas idênticas nanopattern usando um molde de mestre AAO. Complementar a Figura 2 mostra que não há diferença na qualidade do nanopattern produzido, mesmo depois de quinze processos de impressão, em comparação com o nanopattern produzido pelo novo molde AAO. O motivo para a escolha de poliestireno como um material para a transferência de um nanopattern é que o poliestireno tem uma temperatura de transição de vidro apropriado (100 ° C) para impressão térmica, e é amplamente utilizado em pratos de cultura celular comercial devido à sua Propriedades de transparentes e atóxico.
Fabricação de nanoestruturas com alta proporção usando o método de nanoimprinting térmica é difícil. Porque, quando condições de processo, tais como aumento da pressão e do tempo, o molde torna-se profundamente enraizado no substrato de polímero, tornando-se difícil separar o molde do substrato. Portanto, é muito desafiador para produzir nanopatterns tendo uma proporção de 1:3 ou mais usando a nossa técnica de nanoimprinting. No entanto, de acordo com imagens de temperatura, observamos a Figura 5, encontramos um fato interessante que a membrana das células em nanopatterns não estava em contacto com o fundo do nanopattern. Em outras palavras, todos os estímulos físicos que podem manipular uma resposta das células foram originaram as partes superiores do nanopattern. Portanto, neste estudo, não tivemos de considerar a relação de aspecto em estudar respostas da célula para o nanopattern. Como mostrado na Figura 3de complementar, 0,1% solução de revestimento de proteína não tinha nenhuma influência sobre a fixação de hECFCs nas superfícies de nanopillar. Além disso, estes estímulos nanométricos das placas nanopattern gradiente diminuíram a célula área e perímetro de hECFCs e consequência aumento filopodial Figura 5.
Em resumo, nós estabelecemos gradiente nanopattern placas manipulando uma resposta de hECFCs em vitro. Para saber exatamente qual o tamanho de nanoestruturas, as células são grandemente afetadas, um trabalho futuro é necessário para projetar uma célula específica-tamanho nanopillar, ajustando a inclinação do diâmetro de gradiente e mínimo-máximo do tamanho da nanopillars. Esperamos que este gradiente nanopattern para ser uma ferramenta fascinante para a interação entre as células e nanoestruturas de tela, bem como fornecer nichos celulares avançados em que nanoestruturas podem ser livremente ajustadas em tamanho.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pelo programa de pesquisa de ciência básica através da nacional Research Foundation de Coreia (NRF) financiado pelo Ministério da educação, ciência e tecnologia (MEST) [NRF-2015R1D1A1A01060397] e Bio & desenvolvimento de tecnologia médica Programa da NRF financiado pelo Ministério da ciência, TIC & futuro planejamento [NRF-2017M3A9C6029563].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Perchloric acid 60% | Daejung Chemicals & Metals | 6512-4100 | |
| Ethyl alcohol, absolute 99.9% | Daejung Chemicals & Metals | 4118-4100 | |
| Phosphoric acid 85% | Daejung Chemicals & Metals | 6532-4400 | |
| Methyl alcohol 99.5% | Daejung Chemicals & Metals | 5558-4400 | |
| Chromium(VI) oxide | Daejung Chemicals & Metals | 2558-4400 | |
| Sulfuric acid 95% | Daejung Chemicals & Metals | 7781-4100 | |
| Hydrogen peroxide 30% | Daejung Chemicals & Metals | 4104-4400 | |
| n-hexane 95% | Daejung Chemicals & Metals | 4081-4400 | |
| Toluene 99.5% | Daejung Chemicals & Metals | 8541-4400 | |
| (heptadecafluoro-1,1,2,2,-tetrahydrodecyl)dimethylchlorosilane | Gelest | SIH5840.4 | Moisture sensitive |
| Methoxynonafluorobutane 99% | Sigma aldrich | 464309 | |
| Collagen solution | Stemcell | #4902 | |
| Gelatin | Sigma aldrich | G1890 | Protein coating solution |
| Ficoll-Paque | GE Heathcare | 17-1440-03 | Hydrophilic polysaccharide solution |
| EGM-2MV | Lonza | CC-3202 | Endothelial cell expansion medium |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Phosphate buffered saline | Gibco | 10010031 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 12483-020 | |
| Paraformaldehyde | Sigma aldrich | P6148 | |
| Glutaraldehyde | Sigma aldrich | G5882-100ML | |
| Osmium tetroxide | Sigma aldrich | 201030-1G | |
| Hexamethyldisilazane | Sigma aldrich | 440191 | |
| Triton X-100 | Sigma aldrich | X100-100ML | Octylphenol ethoxylate |
| Goat serum | Gibco | 26050-088 | |
| anti-human vinculin primary antibody | Sigma aldrich | V9131 | |
| F-actin probe | Molecular Probes | A12379 | Fluorescence-conjugated phalloidin |
| Alexa Fluor 488-conjugated anti-mouse IgG antibody | Molecular Probes | A11001 | Fluorescence-conjugated secondary antibody |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole | Sigma aldrich | D9542 | |
| Mounting medium | DAKO | S3023 | |
| Anti-human vWF primary antibody | DAKO | A0082 | |
| Anti-human CD144 primary antibody | BD Biosciences | #555661 | |
| Eponate 12™ Embedding Kit, with BDMA | Ted Pella | 18012 | Epoxy resin |
| Uranyl Acetate, 25g | Ted Pella | 19481 | |
| Lead Citrate, Trihydrate, 10g | Ted Pella | 19312 | |
| Ultra pure aluminum plate | Goodfellow | 26050-088 | |
| Polystyrene sheet | Goodfellow | ST313120 | |
| 8.0" silicon wafer | Siltron | 29-01024-03 | Single side polished, 725 µm thick |
| Vacuum desiccator, 4.4 L | Kartell | KA.230 | |
| Vacuum pump | Vacuumer | V3.VOP100 | |
| Power supply | Unicorntech | UDP-3003 | |
| Magnetic stirrer | Daihan scientific | SL.SMS03022 | |
| Overhead stirrer | Daihan scientific | HT120DX | |
| Circulator | Daihan scientific | WCR-P12 | |
| Linear moving stage | Zaber | A-LSQ300A-E01-KT07 | |
| Angle bracket, 90 degrees | Zaber | AB90M | Accessory of the linear moving stage |
| PMP forcep, 145 mm | Vitlab | 67995 | Nonmetallic tweezer |
| PTFE beaker, 250 mL | Cowie | CW007.25 | |
| Ultrasonic cleaner | Branson | B2510MTH | |
| PCB cutter | Hozan Tool Industrial | K-110 | |
| Nanoimprint device | Nanonex | NX-2000 | |
| Oxygen plasma generator | Femto Science | CUTE | |
| Low temperature sterilizer | Lowtem | Crystal 50 | |
| CO2 Incubator | Panasonic | MCO-18AC | |
| Confoal laser scanning microscope | Carl Zeiss | LSM700 | |
| Scanning electron microscope | JEOL | JSM6701 | |
| Transmission electron microscope | Hitachi | H-7500 |
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