Summary
ここでは、グラデーションによるナノパターン板の熱ナノイン プリントの創製とナノ構造に対するひと血管内皮前駆細胞の反応のスクリーニング方法のためのプロトコルを提案する.記述されている技術を使用して、物理的な刺激によって細胞の挙動を操作できる足場を生成することが可能です。
Abstract
ナノトポグラフィ様々 な細胞外マトリックス (Ecm) ボディのまわりで見つけることができ、細胞内反応に重要な規制措置を持っている知られています。しかし、ナノ構造のサイズと適切なスクリーニング ツールの不足のため細胞の応答との関係を決定することは困難です。ここでは、細胞応答の操作の再現性とコスト効果の高いグラデーションによるナノパターン板の開発を示します。熱インプリント法により作製したマスター金型、増加の直径範囲 [120-200 nm (GP 120/200)、200-280 nm (GP 200/280) 280-360 nm (GP 280/360)] のナノピラー グラデーションによるナノパターン板とアルミニウムの陽極酸化 (AAO) を使用して.これらのグラデーションによるナノパターン プレート ECM におけるナノトポグラフィの様々 なサイズを模倣するように設計されていた、画面のひと内皮細胞コロニー形成細胞 (hECFCs) の反応に使われました。このプロトコルでセル工学, ひと末梢血から hECFCs を育成、養殖によるナノパターン プレートに hECFCs のテクニックのグラデーションによるナノパターン プレートの加工手順をについて説明します。
Introduction
最近では、表面形状の物理的な刺激による細胞の応答細胞工学1,2,3,4の分野で脚光を浴びています。したがって、セル添付ファイル表面5三次元ナノ構造のより多くの注意が注目されています。それはセルの表面認識装置であるインテグリンが機械伝達6を通じて ECM のナノ ・ マイクロ構造による物理的な刺激を送信することが報告されています。この機械的刺激からお問い合わせガイダンス7セルの動作を調整してストレスファイバーと細胞8の剛性に加え、形状を変更する細胞骨格の再編を誘導します。
体内のひと血管内皮前駆細胞 (hEPCs) は、密接に周囲の ECM9の微小環境と対話します。これは剪断応力に由来する血流10限り、ECM の物理的な状態が特定の細胞-マトリックス接着複合体形成のための重要なパラメーターとして機能するということを示します。それが報告されて表面ナノトポグラフィ強化 hEPCs11の大規模なキャピラリー管ネットワークの体外形成システムを ECM/バイオ可溶性因子に結合機能不全基板を認識する hEPCs を有効にし、促進します。癒しの12,13を傷つけます。それにもかかわらず、ECM と hEPCs との関係は明確に理解されていません。
多くの研究者が細胞の応答と異なる基板14,15,16からの物理的な手がかりとの関係を明らかにするしようとすると、これらの研究をナノ構造体の固定サイズのみ使用またはnanopatterns ナノ構造および細胞の行動のサイズ間の関係を明らかにする制限がある不規則な手配をします。ここでの問題は、ナノ構造の最適なサイズを見つけること既存の退屈で反復的なアプローチを置き換えることができます細胞をスクリーニングするための適切なツールの欠如です。したがって、簡単な手法は、繰返しのない物理的な刺激の細胞反応をスクリーニングするため必要です。
ここでは、グラデーションによるナノパターン配列ナノピラーの直径が徐々 に増加を生産する私たち以前レポート17,18,の19で使用される方法をについて説明します。さらに、育成およびグラデーションによるナノパターン プレート細胞に物理的な刺激の効果を決定するための hECFCs の動作を分析する方法も記載されています。軽度の陽極酸化、漸進的なエッチングとスティッ キング防止層コーティング法は、グラデーションの AAO 金型を作製する使用されました。熱リソグラフィー技術を刷り込みを採用し、同じポリスチレン グラデーション nanopatterns は低コストで安易な方法で作り出されました。グラデーションの nanopatterns を使用して、ナノ構造体のサイズは、実験の 1 つのセットのセルの動作に大きな影響を判断することは不可能です。我々 は、このグラデーションによるナノパターンが血液由来の hECFC または他の細胞とナノ構造の様々 なサイズの間相互作用メカニズムを理解する上で役立つことを期待します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
本研究は、IRB 号高麗大学校安岩病院で制度の検討委員会によって承認されました。ED170495)。すべてのプロシージャは、ヘルシンキ宣言とその後の改正に基づき行われました。
1. 電解研磨によるアルミニウム (Al) 基板の作製
注意:電解研磨ソリューションは、腐食性、有毒です。ニトリル手袋、ゴーグル白衣など保護具を着用します。発煙のフードでこの手順を実行します。
- エチル アルコール (C2H5ああ、99.9%) を混合することによって電解研磨ソリューションを準備, 過塩素酸 (山積みし4 60%) 1 L ダブル ジャケット ビーカーで (C2H5OH:HClO4 = 4:1)。
- サーキュレータにダブル ジャケット ビーカーを接続し、7 ° C の温度を設定磁性攪拌器にダブル ジャケット ビーカーを置きます。7 ° c. に温度が低下するまで、少なくとも 30 分間かき混ぜてソリューションを残す
- 超高純度アルミ板に没頭 (99.999%、20 × 50 × 1 mm3) とわに口クリップと銅線を使用して電解研磨溶液にカーボン カウンター電極。アルミ板と互いに直面するカーボン カウンター電極の位置を調整します。
注:クリップを慎重にインストールする必要があるソリューションをタッチしないようにします。ソリューションに接触するとクリップから流出の不純物は、アルミ板を汚染できます。 - 直流 (DC) 電源、プラス端子とマイナス端子にカーボン カウンター電極にアルミ板を接続します。
- 磁性攪拌器を切り、4 分この状態維持対 20 の電圧を適用します。
- 磁性攪拌器をオンにし、現在、別の 6 分間の流れができます。
注:静的な状態は、アルミ板から不純物及び粗さのほとんどを削除し、動的条件電解研磨の最終的な品質を向上させます。 - 電源を切り、手動でクリップからアルミ板を分離します。厳密すべて残りのソリューションを削除する脱イオン水でアルミ板を洗います。
- 窒素、不活性ガス下でストアでアルミ板を乾燥させます。ステップ 1 と 2 のすべての実験の終わりにこの乾燥工程を行います。
注:圧縮空気を注入すると、反対側に磨かれた部分からの空気の流れを作る。逆のケースで不純物が非研磨部分から脱出し、アルミ板を汚染します。
2. グラデーション AAO 金型リン酸電解質の作製
注意:メチルアルコール、ヒュームは、眼毒性。クロムへの継続的な暴露は、深刻なクロム中毒につながることができます。発煙のフードでこの手順を実行します。
- 主な陽極酸化
- リン酸電解液 1 L を準備するには、ガラス瓶の中に 590 mL の脱イオン水を読み込みます。
- 400 mL のメチルアルコール (CH3OH、99%) を追加し、10 mL のガラス瓶にリン酸 (H3PO485%) の。または手動で揺れも磁気攪拌しながらソリューションをミックスします。
- 電解液 500 mL を 1 L ダブル ジャケット ビーカーに注ぐ。わに口クリップや銅線によるソリューションに磨かれた Al 板と炭素カウンター電極を浸します。
- 電解研磨ソリューションの表面の上の 2-3 mm の境界を検索する追加の電解液を注ぐ。
注:陽極酸化電解研磨ソリューションに触れるの境界実施しています、アルミ板は、陽極酸化中に書き込む傾向があります。 - U 字型の台座に立坑をインストールします。オーバーヘッド攪拌と羽根車の金属クランプを使用して接続します。両電極の下端近く羽根車のプロペラを配置します。200 と 300 の rpm 間オーバーヘッド攪拌機の回転速度を設定します。
- サーキュレータにダブル ジャケット ビーカーを接続し、設定温度-10 ° C温度は-10 ° C まで下がるまで攪拌下で少なくとも 1 h のシステムを残す
注:冷却剤として水を使用しません。水が低温でフリーズしたので循環が正常に動作しません。クーラントとして 1:1 の比率で水とエチルアルコールの混合物を使用することをお勧めします。 - 16 時間攪拌下 195 V の電圧を適用します。
注:現在は 50 以上上昇する場合 2 または 3 の電圧を適用する後 h 内 mA、燃焼が発生する確率が非常に高い。すぐにプロセスを停止し、新しいアルミ板に置き換えます。この問題が繰り返し発生する場合は、サーキュレータの温度制御に異常がないことを確認します。異常がない場合は、電解質を変更します。 - 電源を停止し、手動でクリップからアルミ板を分離します。すべての残りのソリューションを削除する脱イオン水で陽極酸化アルミ板を洗います。
- アルミナのエッチング
- クロム酸エッチング液 500 mL の脱イオン水で酸化クロム (CrO3)、リン酸 (H3PO485%) の 20.3 mL 9.0 g を溶解を準備します。
- エッチング液を 1 L ダブル ジャケット ビーカーに注ぐ。65 ° C の温度を設定します。
- 攪拌下で少なくとも 10 h のエッチング液で陽極酸化アルミ板を浸します。アルミ箔でビーカーの上部をシールします。
- 脱イオン水で数回エッチングの Al 板をすすいでください。
- 二次陽極酸化
- 2.1.1 に 2.1.7 のステップとして同一の実験条件を設定します。
- システムの陽極にエッチングの Al 板を読み込み、6 h の 195 V の電圧を適用します。電源をオフにし、手動でクリップからアルミ板を分離します。脱イオン水で陽極酸化アルミ板をすぐに洗ってください。
注:洗濯の時間が遅れると、AAO の気孔のサイズは残留リン酸により意図せず増加します。
- グラデーション孔拡大
- 脱イオン水 500 mL 中リン酸 5.765 g 溶解孔拡大ソリューションを準備します。ソリューションを 1 L ダブル ジャケット ビーカーに注ぐ。
- サーキュレータにダブル ジャケット ビーカーを接続し、30 ° C の温度を設定ビーカーの横に垂直方向に直線移動ステージを配置します。リニア ステージの可動部にブラケットを取り付けます。
- リニア ステージの可動部をホーム ポジションに設定します。ブラケットにクリップを装着し、陽極酸化アルミ板をロードします。
- アルミ板がソリューションの表面の真上にくるように Al 板の位置を手動で操作します。
注:この手順では、アルミ板はソリューションを触れないでください。プロセスの拡大孔をアルミ板ソリューションに達するとすぐに開始します。 - 徐々 に 120 からグラデーション サイズ 35 mm AAO 金型を作る 120 分 4.86 μ m/s の速度でソリューションにアルミ板を浸漬 200 nm nm (GP 120/200)。アルミ板ソリューションの表面に触れる瞬間にストップウォッチを開始します。
- GP 200/280 と GP 280/360 型をするためには、それぞれ 2 または 4 h のためのソリューションを拡大孔の GP 120/200 型の領域全体を浸します。
- 脱イオン水で数回グラデーションのアルミ板をすすいでください。
3 自己組織化単分子膜のグラデーション AAO 金型の離型層の堆積
注:グローブ ボックスに 3.2.1 に 3.3.3 の手順に従います。真空ポンプと乾燥窒素ガス インジェクターをグローブ ボックスに接続します。除湿プロセスの前にグローブ ボックスにサンプル、試薬、機器を配置します。グローブ ボックスから水分を十分に除去する避難と窒素ガス注入サイクル 3 回以上を繰り返します。乾燥窒素をさせる実験を通過。
- ピラニア治療 AAO 金型の水酸基の変更
- 硫酸の 140 mL を注ぐ (H2SO4, 95%) ポリテトラフルオロ エチレン (PTFE) ビーカーに。滴状の過酸化水素の 60 mL (H2O230%) を追加します。ソリューションが冷却するまで 30 分間それを残します。
注意:ピラニア ソリューションを作る非常に注意してください。過酸化水素を追加する瞬間から、ソリューションは精力的に沸騰し、高温を生成します。ヒューム フードの実験を実行します。 - 30 のためのソリューションの AAO 金型を浸す非金属ピンセットを使用して s。
- 脱イオン水で数回 AAO 金型をすすいでください。30 分のための脱イオン水でカビを浸漬し、別の 30 分のメチル アルコールでそれを置きます。
注意:使用されるピラニア ソリューションを廃棄するときは、水道水のおびただしい量のソリューションを希釈します。 - 3 h の真空下で AAO 金型を完全に乾燥させます。
- 硫酸の 140 mL を注ぐ (H2SO4, 95%) ポリテトラフルオロ エチレン (PTFE) ビーカーに。滴状の過酸化水素の 60 mL (H2O230%) を追加します。ソリューションが冷却するまで 30 分間それを残します。
- 20 × HDFS ストック溶液の調製
注:HDFS は (観察 1,1,2,2、偏光) の略称 dimethylchloro シラン- モレキュラーシーブで 1 L n-ヘキサン ボトルの 3 分の 1 を入力します。パラフィン フィルムとボトルを密封し、24 時間乾燥窒素下で保存できます。
- ガラス製の注射器と 0.2 μ m PTFE シリンジ フィルターを用いた n-ヘキサン 200 mL をフィルター処理します。
- 100 mL ガラス瓶の中にフィルター処理された n-ヘキサンの 80 mL を注ぐ。HDFS の 2 mL を追加します。
- 自己組織化単分子膜の成膜
- フィルター処理された n-ヘキサン 100 mL ビーカーに 57 mL をロードします。AAO 金型を溶媒に浸します。
- 2.9 mM HDFS ソリューションにするためヘキサンに HDFS ストック溶液 3 mL を追加します。10 分続行への反応を待ちます。
- 新鮮な n-ヘキサンに AAO 金型を転送します。閉じてすべての試薬瓶をシールします。窒素バルブを閉じてから、グローブ ボックスからサンプルを取り出します。
注:HDFS は湿気に非常に敏感です。HDFS をデシケータ内に含まれているすべての試薬を格納します。 - Methoxynonafluorobutane (C10H6F18O299%) の 60 mL に AAO 金型を浸します。超音波 10 のビーカーに AAO 金型をきれい物理的に削除する 1 時間あたり s は HDFS の分子を吸着します。10 回クリーニング手順を繰り返します。
注:超音波 AAO 金型間隔も長い時間のために公開することと、酸化皮膜が損傷します。 - 24 h の真空下で AAO 金型を完全に乾燥させます。
注:正常に蒸着のスティッ キング防止層、超撥水ヶ月安定した乾燥器で格納されている場合です。プロトコルはここで一時停止することができます。
4. 熱インプリントによるグラデーションによるナノパターンの作製
注:クリーン ルーム内 4.7 4.2 の手順に従います。
- 3.7 mm 長いプリント回路基板 (PCB) カッターを使用して、幅 2.9 mm のサイズに 1.1 mm 厚発泡スチロール シートをカットします。
- AAO 金型ニッパーを使わず下から 35 mm をカットします。サンプル名と裏に製造年月日をマークします。
- エチルアルコールの小さな用量で 8.0"ウェーハをクリーンします。ウェハにポリスチレンのシートを配置し、AAO 金型をマウントします。
- 熱インプリンターの引き出しの中に下部のフィルムを置きます。トップ フィルムをガスケットに接続します。
- 下部フィルムにウェハを置きます。ウェハ上のガスケットを配置します。ウェハにはほこりがないかどうかを確認します。
- 熱のインプリンターの引き出しを閉じます。適用熱の 165 ° C、圧力 100 kPa 620.52 s。
- 部屋の温度にサンプルを冷却します。AAO 金型をリリースするポリスチレン シートを慎重にひねます。
5. 殺菌やグラデーションによるナノパターン プレートの親水化
- 角皿にナノパターン プレートを配置します。70% アルコールの 100 mL を注ぎ、30 分間紫外線にさらします。
- 窒素によるナノパターン プレートを乾燥させます。ナノパターン プレートを酸素プラズマ発生器に転送します。
- 1.33 に到達するまでに商工会議所を避難させるペンシルバニア州次に、30 cm3の割合で酸素を注入/分適用維持 90 の酸素プラズマ ・ w ・ 60 の高周波電力 s。
注:14 日以内のプラズマ処理によるナノパターンのプレートを使用することをお勧めします。 - トルエンのドロップを使用して細胞培養皿の底にナノパターン プレートを取り付けます。
- パウチのサンプルを密封し、低温プラズマの滅菌器で滅菌します。
6. hECFCs の栽培
注:特に断らない限りは、4 ° C ですべての遠心手続を実施します。
- 末梢血液を分離する前に単核球 (PBMCs) は 1 h の 37 ° C でコラーゲン被覆 12 ウェル培養皿を孵化させなさい。
- 1 × 滅菌リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) を使用して 12 ウェル培養皿を洗ってください。
- 50 mL のヘパリン阻害剤チューブを用いた血液を収集します。
- 親水性多糖類溶液 6 mL を 15 mL チューブに入れて、8 mL の血液を親水性の多糖類のソリューションに追加します。
注:ゆっくりと親水性の糖液に血をピペットします。 - 細胞のペレットを 20 分間 1020 x g でチューブを遠心します。
- 不透明な細胞層を収穫し、新しい 15 mL チューブに転送します。
- 10% 牛胎児血清 (FBS) を追加-PBS を含まれており、細胞のペレットを 10 分間 1020 x g でチューブを遠心分離します。
- 上澄みを除去し、赤い血セル換散バッファーを追加します。5 分間氷の上を保ちます。
- 10 %fbs 含まれる PBS を追加し、細胞のペレットを 5 分間 1020 x g でチューブを遠心します。
- 上澄みを除去し、10 %fbs 含まれる PBS を追加します。細胞のペレットを 5 分間 1020 x g でチューブを遠心します。
- 上澄みを除去し、10% を添加した内皮細胞膨張媒体の 1 mL を追加 FBS。皿ごとコラーゲン塗布用の井戸あたり種子 8.0 × 106セルです。
- 1 週間毎日培養培地を変更します。その後、培養培地 2 日ごとに変更します。
注:文化 10-14 日後 hECFCs を見つけることができます。hECFCs は、典型的な石畳のような形態を示し、位相差顕微鏡で観察できるコロニーを形成します。血管内皮細胞のカドヘリン (CD144)、フォン ・ ヴィレブランド因子 (vWF) の免疫蛍光染色も可能セル拡大後、hECFCs の特性のためです。 - HECFCs を育成するには、5 %fbs とペニシリン/ストレプトアビジン 37 ° c 5% CO2を含む加湿雰囲気で内皮細胞拡張培を使用します。一日一回、媒体を交換します。
- HECFC 誘導後通路 7 さらに実験のために細胞を成長します。
7. 細胞播種やグラデーションによるナノパターン板文化
注:手順 7 は、グラデーションによるナノパターン プレートに hECFCs の文化をについて説明しますが、他の細胞源も使用できます。
- 1 ml 0.1% 蛋白質のコーティング溶液は、室温で 10 分間の PBS でのグラデーションによるナノパターン プレートをコートします。
注:0.1% 蛋白質のコーティングは、ナノピラー機能をカバーしていません。 - トリプシンを用いた標準セル分割法による培養皿から hECFCs の懸濁液を作る。
- 目的の合流点を達成するために細胞懸濁液を希釈します。グラデーションによるナノパターン板とフラット コントロール (例えば、1.0 × 104セル/cm2) の上に hECFCs をシードします。
注:HECFCs は 1.0 × 104セル/cm2のグラデーションによるナノパターン プレートでシードされ、細胞密度は、通常 2 日後 70 〜 80% に達する。 - インキュベーターで 2 日間のフラットまたはグラデーションによるナノパターン プレート上の細胞を培養します。
8. 観測と解析
- 走査型電子顕微鏡 (SEM) イメージング
- 一晩 4 ° C で 2.5% グルタルアルデヒドでフラットまたはグラデーションによるナノパターン プレート上で培養した hECFCs を修正します。
- 室温で 1 時間 1% オスミウム四酸化を扱います。PBS でサンプルを洗います。
- エチルアルコールを低から高濃度 (50%、70%、80%、90% と 100%) 10 分各ステップごとにサンプルを脱水します。
- 室温で 15 分間ヘキサメチルジシラザン (HMDS) を扱います。その後、新鮮な HMD とサンプルを洗浄し、残留の HMD が完全に蒸発するまで少なくとも 1 日ヒューム フードの下でサンプルのまま。
- 5 分プラチナ スパッタ コーターとサンプルのコートし、SEM を使用サンプルを調べる
- 透過型電子顕微鏡 (TEM) イメージング
- 一晩 2% パラホルムアルデヒドと 2.5% グルタルアルデヒド混合物で PBS で 4 ° C でフラットまたはグラデーションによるナノパターン プレート上で培養した hECFCs を修正します。
- ポスト固定を実行 1% オスミウム四酸化 8.1.3 メソッドを使用してサンプルを脱水しています。
- エポキシ樹脂に試料を埋め込みます。ブロックから 60 nm 厚いセクションを行い TEM グリッド上のセクションに配置します。
- 10 mg で 100 mL のメチルアルコール酢酸ウランと 100 ml の蒸留水に 0.1 mg の鉛のクエン酸の混合物のセクションを染色します。電子顕微鏡の画像を取得します。
- 蛍光染色
- 15 分間室温で 4% パラホルムアルデヒドでフラットまたはグラデーションによるナノパターン プレート上で培養した hECFCs を修正します。
- Permeabilize し、5% ヤギ血清および 0.1% オクチルフェノールエトキシ室温 30 分間、PBS (PBST) レートでサンプルをブロックします。
- 抗ひとビンキュリン一次抗体 (pbst; の 1: 500) 3 回 PBST と 2 の h. リンス サンプルの室温でのサンプルをインキュベートします。
- 試料蛍光標識ファロイジン (pbst; で 1:1, 000)、蛍光共役二次抗体 (pbst; で 1:1, 000) pbst; を使用して 3 回 2 h. リンス サンプルを室温で孵化させなさい。
- サンプル 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI、PBST で縮尺) を 5 分間室温でインキュベートします。
- グラデーションによるナノパターンの表面に取り付け中の 10 μ L をドロップします。メディアをマウントの coverslip の場所。
- 試料ステージ上逆さまサンプルを配置し、共焦点蛍光顕微鏡を用いた画像を取得します。
- 画像解析
- 画像解析システムを hECFCs の捕獲されたイメージを転送します。
- ファロイジン染色像のランダムなフィールドを選択します。しきい値を調整し、細胞が異なる背景からバイナリ画像を作成します。
- セル面積と外周を測定し、手動で糸状細胞数をカウントするセルの周りに輪郭線を描画します。
- ビンキュリン染色像のランダムなフィールドを選択します。しきい値を調整し、焦点接着領域のバイナリ イメージを作成します。
注:人工以上- または下-filling 焦点接着部を避けるために、イメージのしきい値を適切に調整します。 - 各細胞の焦点接着の数をカウントします。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
図 1では、型および位置に従って作製したグラデーション AAO 金型の SEM 像を示しています。図 2は、グラデーションによるナノパターン板定期的に丸めナノピラーの SEM 画像と図 3は、ナノピラー直径の定量化データ。表 1は、作製したナノピラーの特性を示します。
図 4 aは、血液由来 hECFCs の耕作のスキームを示しています。図 4Bショー thecultivated hECFCs の位相コントラスト。図 4は、hECFC マーカー染色 CD144 (緑)、(赤)、vWF と核 (青) を示しています。図 5 aは、フラットの文化、GP 120/200、GP 200/280、GP 280/360 版の 2 日後 hECFCs の代表的な SEM 画像を示しています。図 5 bおよび C は、セル面積と外周フラットに比べて量的データを描いています。定量データでは、小さいサイズのナノピラー表面上に成長した細胞は減らされた細胞の面積と周長を示したことを明らかにしました。図 5は、既存の糸状の形態を示す hECFCs の代表的な SEM 画像です。図 5 eフラットと比較して突起の数で定量的なデータを示しています。Filopodial の重要な副産物は、フラットに比べ GP200/280 または GP280/360 で大きな変化認められなかった一方 GP 120/200 上で培養された細胞で観察されました。図 5 階は、フラット、グラデーションによるナノパターン プレート上の文化の 2 日後 hECFCs の代表の TEM 像を示しています。
図 1。グラデーションの AAO 金型。グラデーションの SEM 画像 AAO 金型金型の位置に応じて GP 120/200、GP 200/280 と GP 280/360 版。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2.グラデーションによるナノパターン板。ピラー型グラデーションによるナノパターン プレートの SEM 画像プレートの位置に応じて GP 120/200、GP 200/280 と GP 280/360 版のため。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3.ナノピラーの直径のサイズ グラデーションします。GP 120/200、GP 200/280、GP 280/360 板にそれぞれナノピラー直径の勾配を示す定量化データ。バーは、標準のエラーを表します。この図は、[Acta Biomaterialia] から変更されました。20.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| ヤング率 (GPa) | ナノピラー直径 (nm) | ナノピラー ピッチ (nm) | 中心距離 (海里) | ナノピラー高さ (nm) | ナノピラー剛性 (N/m) | |
| フラット | 2.43±0.19 | - | - | - | - | - |
| GP 120/200 | 1.74±0.11 | 120-200 | 320-240 | 440 | 276.9±21.9 | 9.35 |
| GP 200/280 | 2.01±0.05 | 200-280 | 240-160 | 440 | 268.1±25.9 | 55.78 |
| GP 280/360 | 2.1±0.13 | 280-360 | 160-80 | 440 | 293.6±23.6 | 134.15 |
テーブル 1。作製したナノピラーの特性。ヤング率、直径、ピッチ、中心距離、高さ、および試作したナノピラーの剛性を示す定量化されたデータ。[Acta Biomaterialia] からこのテーブルが変更されました。20。
図 4.HECFCs の性格描写。(A)成人末梢血由来 hECFCs の模式図を示すスケジュール。HECFC コロニーの(B)位相差画像は 14 日に成人の末梢血から派生します。(C)蛍光画像 CD144 (緑) を見せて、vWF (赤) と細胞核染色 DAPI (青)。この図は、[Acta Biomaterialia] から変更されました。20.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5. hECFCs 2 日間フラットとグラデーションのナノパターン プレート上で培養しました。(A) GP 280/360、GP 200/280、GP 120/200 フラット プレート上で培養した hECFCs の代表的な SEM 像。(B と C)エリア、hECFCs の境界の定量化データ (n = 50)。* p.05 < フラットに比べて。フラットとグラデーションのナノパターン プレート hECFCs のリーディング エッジの(D)代表的な SEM 画像。(E)定量データ 1 hECFC あたりの糸状の数 (n = 20)。* p.05 < フラットに比べて。(F) hECFC の代表の TEM 像はフラットとグラデーションによるナノパターン プレート培養。白い矢印は、hECFCs と基板表面との間の相互作用ポイントを示します。この図は、[Acta Biomaterialia] から変更されました。20.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
附則図 1。原始的な AAO と HDFS の水接触角処理 AAO 。HDFS の疎水性特性を示す接触角測定は自己治療後の前に単分子層(A) 、 (B)を組織しました。この図をダウンロードするここをクリックしてください。
補足図 2 。同じ AAO 金型で作製したグラデーションによるナノパターン プレートの SEM 画像。AAO 金型の耐久性を検証するため比較の SEM 画像を設定します。(A)勾配によるナノパターン板たて金型で製作。(B)勾配によるナノパターン プレートは、15 回をインプリント後 AAO 金型で製作。この図をダウンロードするここをクリックしてください。
補足図 3。蛋白質のコーティングの影響。GP 280/360 や GP 200/280、GP 120/200 勾配によるナノパターンで培養した hECFCs の SEM 画像なし(A)または(B)の蛋白質のコーティングをプレートします。この図は、[Acta Biomaterialia] から変更されました。20この図をダウンロードするここをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
しばしば AAO の作製は亀裂などと書き込み、毛穴の不規則な形状の欠陥に苦しみます。これらの欠陥の主な理由は、陽極酸化される金属基板の性質と電解質21の抵抗によって強く影響を受ける電解のブレーク ダウンと呼ばれます。電解質の抵抗はその温度により異なります、電極から連続的に熱を排除する高電圧陽極酸化条件で安定した電解質の位置の温度を維持するために重要なポイントです。このプロトコルでは増田の 2 段階陽極22,23を変更することにより AAO 金型を作製しました。メチルアルコールでほぼ半分の電解質を置き換えるだけでなく電解質が低温で凍結するを防ぐ、また細孔24の下の蒸発によって熱の電極を奪います。磁性攪拌器ではなくオーバーヘッド攪拌機・ インペラを使用する理由は、温度管理を実現してもです。典型的な電磁攪拌機は磁気バーの偶発的なずれにより長期的な操作中にアイドリングの確率が高い。この問題は、不適切な循環電解質の温度を上げると燃焼につながるを誘導します。
AAO 金型サイズ グラデーションを与える、我々 は徐々 にエッチング液リン酸で AAO を浸漬。図 1に示すように、エッチング液で、AAO の滞在時間に比例して毛穴が拡大変換されます。この条件下で平均孔拡大率は 0.67 nm/分浸漬速度と時間を操作するは、AAO 勾配と最大孔径の斜面を変更です。最大可能な孔径は 400 nm。細孔径が 400 を超えると nm、孔間間隔壁なり薄いので熱転写プロセスの間に圧力を容認できません。
HDFS の自己組織化単分子膜は、25材料表面に疎水性のプロパティを追加することができる知られています。HDFS 分子ピラニア治療26によって導入された AAO 表面に水酸基イオンと強い共有結合になります。したがって、補足の図 1に示すように、基板表面に水酸基の数が多いがある場合固体自己組織化単分子膜を形成できます。HDFS の自己組織化単分子膜の最適な品質、除湿された雰囲気の中で反応を行うお勧めします。HDFS は、湿気にさらされて、水側の反応は二量体、スチレンダイマーともシラン分子オリゴマーを形成し、自己組織化単分子膜の全体的な品質を減少します。
熱ナノイン プリントのサイズ グラデーション、AAO 金型の使用時にナノピラーのグラデーションで細胞培養皿は、図 2と図 3を得られました。熱ナノイン プリント法 1 つ AAO マスター型を使用して、同一のナノパターン板の大量を作り出すことができるという点で利点があります。補足の図 2に示します新しい AAO 金型によるナノパターンに比べて 15 のインプリント プロセス後も生産によるナノパターンの品質に違いはありません。ナノパターンを転送するための材料としてポリスチレンを選ぶ理由は、ポリスチレンは、熱転写、適切なガラス転移温度 (100 ° C)、商業細胞培養皿で用い、透明で無毒のプロパティ。
熱ナノイン プリント法を用いた高アスペクト比を持つナノ構造を作製することは難しいです。プロセス条件、圧力と時間の増加など金型になる深く金型を基板から分離することが難しく、高分子基板に埋め込まれます。したがって、1:3 または私たちのナノイン プリント技術を用いた複数のアスペクト比を有する nanopatterns を生成する非常に困難です。しかし、図 5観察 TEM 画像によると、我々 は nanopatterns の細胞の膜によるナノパターンの下部に接触してなかった興味深い事実を発見しました。つまり、細胞の応答を操作することができますすべての物理的な刺激によるナノパターンのトップ部分から発信されました。したがって、この研究では、我々 はありませんでしたによるナノパターンに対する細胞の反応の勉強にアスペクト比を考慮します。補足図 3に示すとおり、0.1% 蛋白質のコーティング液ないに影響を与えた hECFCs の添付ファイル ナノピラー表面上。さらに、セル領域と hECFCs の増加 filopodial 副産物図 5境界グラデーションによるナノパターン プレートからこれらのナノスケールの刺激が減少しました。
要約すると、hECFCsの in vitroの応答を操作することによってグラデーションによるナノパターン プレートを設立しました。セルが大きく影響を受けるとナノ構造の正確なサイズを知って、今後の作業は、ナノピラーの径勾配と最小-最大の傾きを調整することによって細胞特定サイズのナノピラーを設計に必要です。同様にセルとナノ構造の相互作用を画面サイズで、ナノ構造を自由に調整できる高度な細胞ニッチを提供する魅力的なツールであることこのグラデーションによるナノパターンを見込んでいます。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
この仕事は基本的な科学研究開発プログラムを通じて、国立研究財団の韓国 (NRF) 文部省、科学および技術 (MEST) [NRF 2015R1D1A1A01060397] バイオ ・医療技術開発によって資金を供給に支えられ科学省 ICT ・将来計画 [NRF 2017M3A9C6029563] によって資金を供給された NRF のプログラムです。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Perchloric acid 60% | Daejung Chemicals & Metals | 6512-4100 | |
| Ethyl alcohol, absolute 99.9% | Daejung Chemicals & Metals | 4118-4100 | |
| Phosphoric acid 85% | Daejung Chemicals & Metals | 6532-4400 | |
| Methyl alcohol 99.5% | Daejung Chemicals & Metals | 5558-4400 | |
| Chromium(VI) oxide | Daejung Chemicals & Metals | 2558-4400 | |
| Sulfuric acid 95% | Daejung Chemicals & Metals | 7781-4100 | |
| Hydrogen peroxide 30% | Daejung Chemicals & Metals | 4104-4400 | |
| n-hexane 95% | Daejung Chemicals & Metals | 4081-4400 | |
| Toluene 99.5% | Daejung Chemicals & Metals | 8541-4400 | |
| (heptadecafluoro-1,1,2,2,-tetrahydrodecyl)dimethylchlorosilane | Gelest | SIH5840.4 | Moisture sensitive |
| Methoxynonafluorobutane 99% | Sigma aldrich | 464309 | |
| Collagen solution | Stemcell | #4902 | |
| Gelatin | Sigma aldrich | G1890 | Protein coating solution |
| Ficoll-Paque | GE Heathcare | 17-1440-03 | Hydrophilic polysaccharide solution |
| EGM-2MV | Lonza | CC-3202 | Endothelial cell expansion medium |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Phosphate buffered saline | Gibco | 10010031 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 12483-020 | |
| Paraformaldehyde | Sigma aldrich | P6148 | |
| Glutaraldehyde | Sigma aldrich | G5882-100ML | |
| Osmium tetroxide | Sigma aldrich | 201030-1G | |
| Hexamethyldisilazane | Sigma aldrich | 440191 | |
| Triton X-100 | Sigma aldrich | X100-100ML | Octylphenol ethoxylate |
| Goat serum | Gibco | 26050-088 | |
| anti-human vinculin primary antibody | Sigma aldrich | V9131 | |
| F-actin probe | Molecular Probes | A12379 | Fluorescence-conjugated phalloidin |
| Alexa Fluor 488-conjugated anti-mouse IgG antibody | Molecular Probes | A11001 | Fluorescence-conjugated secondary antibody |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole | Sigma aldrich | D9542 | |
| Mounting medium | DAKO | S3023 | |
| Anti-human vWF primary antibody | DAKO | A0082 | |
| Anti-human CD144 primary antibody | BD Biosciences | #555661 | |
| Eponate 12™ Embedding Kit, with BDMA | Ted Pella | 18012 | Epoxy resin |
| Uranyl Acetate, 25g | Ted Pella | 19481 | |
| Lead Citrate, Trihydrate, 10g | Ted Pella | 19312 | |
| Ultra pure aluminum plate | Goodfellow | 26050-088 | |
| Polystyrene sheet | Goodfellow | ST313120 | |
| 8.0" silicon wafer | Siltron | 29-01024-03 | Single side polished, 725 µm thick |
| Vacuum desiccator, 4.4 L | Kartell | KA.230 | |
| Vacuum pump | Vacuumer | V3.VOP100 | |
| Power supply | Unicorntech | UDP-3003 | |
| Magnetic stirrer | Daihan scientific | SL.SMS03022 | |
| Overhead stirrer | Daihan scientific | HT120DX | |
| Circulator | Daihan scientific | WCR-P12 | |
| Linear moving stage | Zaber | A-LSQ300A-E01-KT07 | |
| Angle bracket, 90 degrees | Zaber | AB90M | Accessory of the linear moving stage |
| PMP forcep, 145 mm | Vitlab | 67995 | Nonmetallic tweezer |
| PTFE beaker, 250 mL | Cowie | CW007.25 | |
| Ultrasonic cleaner | Branson | B2510MTH | |
| PCB cutter | Hozan Tool Industrial | K-110 | |
| Nanoimprint device | Nanonex | NX-2000 | |
| Oxygen plasma generator | Femto Science | CUTE | |
| Low temperature sterilizer | Lowtem | Crystal 50 | |
| CO2 Incubator | Panasonic | MCO-18AC | |
| Confoal laser scanning microscope | Carl Zeiss | LSM700 | |
| Scanning electron microscope | JEOL | JSM6701 | |
| Transmission electron microscope | Hitachi | H-7500 |
References
- Dalby, M. J., Gadegaard, N., Oreffo, R. O. Harnessing nanotopography and integrin-matrix interactions to influence stem cell fate. Nature materials. 13 (6), 558-569 (2014).
- Qian, W., Gong, L., Cui, X., Zhang, Z., Bajpai, A., Liu, C., Castillo, A., Teo, J. C., Chen, W. Nanotopographic Regulation of Human Mesenchymal Stem Cell Osteogenesis. ACS Applied Materials & Interfaces. 9 (48), 41794-41806 (2017).
- Naganuma, T. The relationship between cell adhesion force activation on nano/micro-topographical surfaces and temporal dependence of cell morphology. Nanoscale. 9 (35), 13171-13186 (2017).
- Han, J., Lin, K. H., Chew, L. Y. Study on the regulation of focal adesions and cortical actin by matrix nanotopography in 3D environment. Journal of Physics: Condensed Matter. 29 (45), 455101 (2017).
- Liu, X., Wang, S. Three-dimensional nano-biointerface as a new platform for guiding cell fate. Chemical Society Reviews. 43 (8), 2385-2401 (2014).
- Turner, L. A., Dalby, M. J. Nanotopography-potential relevance in the stem cell niche. Biomaterials science. 2 (11), 1574-1594 (2014).
- Driscoll, M. K., Sun, X., Guven, C., Fourkas, J. T., Losert, W. Cellular contact guidance through dynamic sensing of nanotopography. ACS nano. 8 (4), 3546-3555 (2014).
- Yim, E. K., Darling, E. M., Kulangara, K., Guilak, F., Leong, K. W. Nanotopography-induced changes in focal adhesions, cytoskeletal organization, and mechanical properties of human mesenchymal stem cells. Biomaterials. 31 (6), 1299-1306 (2010).
- Davis, G. E., Senger, D. R. Endothelial extracellular matrix. Circulation research. 97 (11), 1093-1107 (2005).
- Nakayama, K. H., Surya, V. N., Gole, M., Walker, T. W., Yang, W., Lai, E. S., Ostrowski, M. A., Fuller, G. G., Dunn, A. R., Huang, N. F. Nanoscale patterning of extracellular matrix alters endothelial function under shear stress. Nano letters. 16 (1), 410-419 (2015).
- Bettinger, C. J., Zhang, Z., Gerecht, S., Borenstein, J. T., Langer, R. Enhancement of in vitro capillary tube formation by substrate nanotopography. Advanced materials. 20 (1), 99-103 (2008).
- Katz, B. Z., Zamir, E., Bershadsky, A., Kam, Z., Yamada, K. M., Geiger, B. Physical state of the extracellular matrix regulates the structure and molecular composition of cell-matrix adhesions. Molecular biology of the cell. 11 (3), 1047-1060 (2000).
- Deanfield, J. E., Halcox, J. P., Rabelink, T. J.
- Tajima, S., Chu, J., Li, S., Komvopoulos, K. Differential regulation of endothelial cell adhesion, spreading, and cytoskeleton on low-density polyethylene by nanotopography and surface chemistry modification induced by argon plasma treatment. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 84 (3), 828-836 (2008).
- Mohiuddin, M., Pan, H. A., Hung, Y. C., Huang, G. S. Control of growth and inflammatory response of macrophages and foam cells with nanotopography. Nanoscale research letters. 7 (1), 394 (2012).
- Kyle, D. J., Oikonomou, A., Hill, E., Bayat, A. Development and functional evaluation of biomimetic silicone surfaces with hierarchical micro/nano-topographical features demonstrates favourable in vitro foreign body response of breast-derived fibroblasts. Biomaterials. 52, 88-102 (2015).
- Seo, H. R., Joo, H. J., Kim, D. H., Cui, L. H., Choi, S. C., Kim, J. H., Cho, S. W., Lee, K. B., Lim, D. S. Nanopillar Surface Topology Promotes Cardiomyocyte Differentiation through Cofilin-Mediated Cytoskeleton Rearrangement. ACS Applied Materials & Interfaces. 9 (20), 16803-16812 (2017).
- Hwang, J. H., Lee, D. H., Byun, M. R., Kim, A. R., Kim, K. M., Park, J. I., Oh, H. T., Hwang, E. S., Lee, K. B., Hong, J. H. Nanotopological plate stimulates osteogenic differentiation through TAZ activation. Scientific Reports. 7 (1), 3632 (2017).
- Bae, D., Moon, S. H., Park, B. G., Park, S. J., Jung, T., Kim, J. S., Lee, K. B., Chung, H. M. Nanotopographical control for maintaining undifferentiated human embryonic stem cell colonies in feeder free conditions. Biomaterials. 35 (3), 916-928 (2014).
- Cui, L. H., Joo, H. J., Kim, D. H., Seo, H. R., Kim, J. S., Choi, S. C., Huang, L. H., Na, J. E., Lim, I. R., Kim, J. H. Manipulation of the response of human endothelial colony-forming cells by focal adhesion assembly using gradient nanopattern plates. Acta biomaterialia. 65, 272-282 (2017).
- Lee, W., Park, S. J. Porous anodic aluminum oxide: anodization and templated synthesis of functional nanostructures. Chemical reviews. 114 (15), 7487-7556 (2014).
- Masuda, H., Fukuda, K. Ordered metal nanohole arrays made by a two-step replication of honeycomb structures of anodic alumina. science. 268 (5216), 1466 (1995).
- Masuda, H., Satoh, M. Fabrication of gold nanodot array using anodic porous alumina as an evaporation mask. Japanese Journal of Applied Physics. 35 (1B), L126 (1996).
- Zaraska, L., Sulka, G. D., Jaskuła, M. The effect of n-alcohols on porous anodic alumina formed by self-organized two-step anodizing of aluminum in phosphoric acid. Surface and Coatings Technology. 204 (11), 1729-1737 (2010).
- Yang, K. Y., Kim, J. W., Byeon, K. J., Lee, H. Selective deposition of the silver nano-particles using patterned the hydrophobic self-assembled monolayer patterns and zero-residual nano-imprint lithography. Microelectronic engineering. 84 (5), 1552-1555 (2007).
- Park, B. G., Lee, W., Kim, J. S., Lee, K. B. Superhydrophobic fabrication of anodic aluminum oxide with durable and pitch-controlled nanostructure. Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects. 370 (1), 15-19 (2010).
