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Bioengineering

Fabricación de Nanopattern gradiente térmico Nanoimprinting técnica y proyección de la respuesta de células formadoras de colonias endoteliales humanas

Published: July 1, 2018 doi: 10.3791/57661
Automatic Translation
*1, *2, 2, 2, 2, 2, 1
1School of Biomedical Engineering, Korea University, 2Department of Cardiology, Korea University Anam Hospital
* These authors contributed equally

Summary

Aquí, presentamos un protocolo para la fabricación de placas nanopattern gradiente vía térmica nanoimprinting y el método de proyección de las respuestas de las células progenitoras endoteliales humanas a las nanoestructuras. Usando la tecnología descrita, es posible producir un andamio que puede manipular el comportamiento de la célula por los estímulos físicos.

Abstract

Nanotopography puede encontrarse en diversas matrices extracelulares (ECMs) alrededor del cuerpo y se sabe que tienen importantes acciones reglamentarias sobre reacciones celulares. Sin embargo, es difícil determinar a la relación entre el tamaño de una nanoestructura y las respuestas de las células debido a la falta de herramientas de proyección adecuada. A continuación, os mostramos el desarrollo de placas nanopattern gradiente rentable y reproducible para la manipulación de respuestas celulares. Con óxido de aluminio anódico (AAO) como molde maestro, placas del gradiente nanopattern con nanopillars de gamas de diámetro creciente [120-200 nm (GP 120/200) 200-280 nm (GP 200/280) y 280-360 nm (GP 280/360)] fueron fabricados por un térmico impresión técnica. Estas placas nanopattern gradiente fueron diseñadas para imitar los diversos tamaños de nanotopography en el ECM y se utilizaron para las respuestas de células endoteliales humanas formadoras de colonias (hECFCs) de la pantalla. En este protocolo, se describe el procedimiento paso a paso de la fabricación de placas de gradiente nanopattern de ingeniería, técnicas de cultivo de hECFCs de sangre periférica humana y hECFCs en nanopattern las placas de cultivo celular.

Introduction

Recientemente, la respuesta de las células por la estimulación física de la topografía de la superficie ha sido destacó en el campo de la célula ingeniería1,2,3,4. Por lo tanto, más atención se ha centrado en nanoestructuras tridimensionales en el accesorio de celular superficial5. Se ha reportado que la integrina, que es el dispositivo de reconocimiento de superficie de la célula, transmite el estímulo físico por las estructuras micro-nano de ECM a través de la Mecano-transducción6. Este estímulo mecánico regula el comportamiento de la célula a través de la dirección de contacto7 e induce reorganización citoesquelética a cambiar de forma, además de adherencias focales y la rigidez de las células8.

Las células progenitoras endoteliales humanas (hEPCs) en el cuerpo cerca interactúan con el microambiente de la ECM circundante9. Esto indica que el estado físico de lo ECM actúa como un parámetro importante para la formación de complejos de adhesión célula-matriz específica en cuanto a tensión de esquileo derivado del flujo de sangre10. Se divulga que aumenta la superficie nanotopography en vitro la formación de redes extensas de tubo capilar de hEPCs11 y que un factor soluble de ECM/bio sistema combinado permite hEPCs reconocer sustratos disfuncionales y promueve de la herida curativo de12,13. Sin embargo, la relación entre ECM y hEPCs no se entiende claramente.

Aunque muchos investigadores trataron de aclarar la relación entre las respuestas celulares y señales físicas de diferentes sustratos14,15,16, estos estudios utilizaron solamente el tamaño fijo de una nanoestructura o nanopatrones con arreglos irregulares que tienen una limitación para aclarar la relación entre el tamaño del comportamiento de nanoestructura y celular. El problema es la falta de herramientas adecuadas para la detección de respuestas celulares que pueden sustituir a los enfoques existentes tediosos e iterativos para encontrar el tamaño óptimo de la nanoestructura. Por lo tanto, una técnica sencilla se requiere para la detección de las reacciones celulares en estímulos físicos sin repetición.

Aquí, describimos un método utilizado en nuestros anteriores informes17,18,19 para producir un gradiente nanopattern que aumenta gradualmente el diámetro de la nanopillars dispuesto. Además, también hemos descrito cómo cultivar y analizar el comportamiento de hECFCs en placas nanopattern gradiente para determinar el efecto de los estímulos físicos en las células. Un suave anodizado grabado gradual y método de recubrimiento de la capa anti-sticking fueron utilizados para fabricar molde AAO degradado. Mediante la adopción de un térmico impresión técnica de litografía, idénticos nanopatrones gradiente poliestireno fueron producidos de manera rentable y fácil. Utilizando el gradiente nanopatrones, es factible determinar que tamaño de nanoestructura tiene un gran efecto sobre el comportamiento de células en un sistema del experimento. Esperamos que este gradiente nanopattern será útil en la comprensión de los mecanismos de interacción entre hECFC de derivados de sangre u otras células y varios tamaños de nanoestructuras.

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Protocol

Este estudio fue aprobado por la Junta de revisión institucional en el Hospital de Anam de la Universidad de Corea (IRB no. ED170495). Todos los procedimientos se llevaron a cabo con arreglo a la declaración de Helsinki y sus enmiendas posteriores.

1. preparación del sustrato de aluminio (Al) por electropulido

PRECAUCIÓN: Solución de electropulido es corrosivo y tóxico. Use equipo de protección personal como guantes de nitrilo, gafas protectoras y bata de laboratorio. Realizar este paso en una campana de humos.

  1. Preparar la solución de electropulido mezclando ethyl alcohol (C2H5OH, 99.9%) y ácido perclórico (HClO4, 60%) en un vaso de precipitado de doble chaqueta de 1 L (C2H5OH:HClO4 = 4:1).
  2. Conectar el vaso de doble chaqueta con un circulador y ajustar la temperatura a 7 ° C. Poner el vaso de doble camisa en un agitador magnético. Deje la solución bajo agitación durante al menos 30 minutos hasta que la temperatura baja a 7 ° C.
  3. Sumerja la placa Al alta pureza (99.999%, de 20 × 50 × 1 mm3) y contraelectrodo de carbono en la solución de electropulido con pinzas y el alambre de cobre. Ajustar la posición de la placa de Al y el contraelectrodo de carbono frente a frente.
    Nota: Es necesario instalar los clips con cuidado para no tocar la solución. En contacto con la solución, las impurezas que sale de los sujetadores pueden contaminar la placa Al.
  4. La placa Al conectar el terminal positivo y el electrodo de carbono del contador a la terminal negativa, de una corriente directa (DC) fuente de alimentación.
  5. Apague el agitador magnético y aplique un voltaje de 20 V. mantener este estado durante 4 minutos.
  6. Encender el agitador magnético y permitir que la corriente fluya por otro min 6.
    Nota: La condición estática quita la mayor parte de las impurezas y la rugosidad de la placa de Al, y la condición dinámica mejora la calidad final del electropulido.
  7. Apague la fuente de alimentación y separar manualmente la placa del clip. Lave rigurosamente la placa con agua desionizada para eliminar toda la solución restante.
  8. Secar la placa Al nitrógeno y tienda bajo gas inerte. Llevar a cabo este proceso de secado al final de todos los experimentos en el paso 1 y 2.
    Nota: Al inyectar aire comprimido, asegúrese de flujo de aire de la parte Brillante hacia el lado opuesto. En caso contrario, las impurezas pueden escapar de la parte no pulida y contaminar la placa Al.

2. fabricación del molde de la AAO degradado con electrolito de ácido fosfórico

PRECAUCIÓN: Alcohol metílico y sus vapores son tóxicos oculares. Continua exposición al cromo puede conducir a intoxicación con cromo grave. Realizar este paso en una campana de humos.

  1. Anodización primaria
    1. Para preparar 1 L de ácido fosfórico del electrólito, cargar 590 mL de agua desionizada en un frasco de vidrio.
    2. Añadir 400 mL de alcohol metílico (CH3OH, 99%) y 10 mL de ácido fosfórico (H3PO4, 85%) en la botella de vidrio. Mezcle la solución bien agitando manualmente o con agitación magnética.
    3. Vierta 500 mL de electrólito en un vaso de precipitados de 1 L doble. Sumerja el pulido Al plato y carbono contador electrodo en la solución con pinzas y el alambre de cobre.
    4. Vierta el electrólito adicional para localizar el límite de 2-3 mm sobre la superficie de la solución de electropulido.
      Nota: Si la anodización se lleva a cabo con el límite de contacto con la solución de electropulido, la placa Al tiende a quemar durante la anodización.
    5. Instalar un eje vertical sobre un pedestal en forma de U. Coloque un agitador arriba y el impulsor con abrazaderas metálicas. Posición de la hélice del ventilador cerca del extremo inferior de ambos electrodos. Ajustar la velocidad de rotación del agitador arriba entre 200 y 300 rpm.
    6. Conectar el vaso de doble chaqueta con un circulador y ajustar la temperatura a-10 ° C. Salir del sistema para al menos 1 h bajo agitación hasta que la temperatura baja a-10 ° C.
      Nota: No use agua como refrigerante. Porque el agua se congela a bajas temperaturas, la circulación no funcionará normalmente. Se recomienda utilizar una mezcla de agua y alcohol etílico en una proporción de 1:1 como el refrigerante.
    7. Aplique un voltaje de 195 V bajo agitación por 16 h.
      Nota: Si la corriente eleva más de 50 mA dentro de 2 o 3 h después de aplicar el voltaje, la probabilidad de que se produzca ardor es muy alta. Inmediatamente, detener el proceso y vuelva a colocar la placa con una nueva. Si este problema se produce repetidamente, compruebe que no hay ninguna anormalidad en el control de temperatura del circulador. Si no hay ninguna anormalidad, cambiar el electrolito.
    8. Detenga la fuente de alimentación y separar manualmente la placa del clip. Lave la placa Al anodizado con agua desionizada para eliminar toda la solución restante.
  2. Grabado de alúmina
    1. Preparar el ácido crómico aguafuerte solución disolviendo 9,0 g de óxido de cromo (CrO3) y 20,3 mL de ácido fosfórico (H3PO4, 85%) en 500 mL de agua desionizada.
    2. Vierta la solución de la aguafuerte en el vaso de doble chaqueta de 1 L. Ajustar la temperatura a 65 ° C.
    3. Sumerja la placa anodizada de en la solución de la aguafuerte para al menos 10 h bajo agitación. Selle la parte superior del vaso con papel de aluminio.
    4. Enjuagar la placa Al grabado varias veces con agua desionizada.
  3. Anodización secundaria
    1. Establecer las mismas condiciones experimentales como paso 2.1.1 a 2.1.7.
    2. Cargue la placa Al grabado al ánodo del sistema y aplicar una tensión de 195 V para 6 h. A continuación, apague la fuente de alimentación y separar manualmente la placa del clip. Inmediatamente Lave la placa Al anodizado con agua desionizada.
      Nota: Cuando se retrasa el tiempo de lavado, el tamaño del poro del AAO aumenta sin querer debido al ácido fosfórico residual.
  4. Ensanchamiento del gradiente poro
    1. Preparar una solución de ampliación de poro disolviendo 5,765 g de ácido fosfórico en 500 mL de agua desionizada. Verter la solución en un vaso de precipitados de 1 L doble.
    2. Conectar el vaso de doble chaqueta con circulador y ajustar la temperatura a 30 ° C. Lugar una etapa móvil lineal verticalmente al lado de la taza. Coloque una abrazadera a la parte móvil de la etapa lineal.
    3. Ajuste la parte móvil de la etapa lineal a la posición inicial. Conecte la pinza al soporte y cargar la placa Al anodizado.
    4. Manipular manualmente la posición de la placa Al modo que la placa Al llegará justo por encima de la superficie de la solución.
      Nota: En este paso, la placa Al no debe tocar la solución. El poro ampliación proceso empieza tan pronto como la placa Al llega a la solución.
    5. Poco a poco, sumerja la placa en la solución a una velocidad de 4,86 μm/s 120 min hacer un molde AAO de 35 mm con un tamaño de gradiente de 120 nm a 200 nm (GP 120/200). Poner en marcha un cronometro en el momento de que la placa Al toque la superficie de la solución.
    6. Para hacer los moldes de GP 200/280 y 280/360 GP, sumerja el área entera del molde de la GP 120/200 en el poro ampliación solución para 2 o 4 h, respectivamente.
    7. Enjuagar la placa Al gradiente varias veces con agua desionizada.

3. deposición de capa anti-que se pega en AAO gradiente molde con uno mismo-montado monocapa

Nota: Realice los pasos 3.2.1 a 3.3.3 en una caja de guantes. Conecte una bomba de vacío y el inyector de gas de nitrógeno seco a la guantera. Colocar todas las muestras, reactivos y aparatos en la guantera antes del proceso de deshumidificación. Repetir el ciclo de inyección de gas nitrógeno y evacuación más de tres veces para eliminar adecuadamente la humedad de la guantera. Dejar que el nitrógeno seco atraviesa el experimento.

  1. Modificación del oxhidrilo del molde de la AAO con tratamiento de piraña
    1. Vierta 140 mL de ácido sulfúrico (H2SO4, 95%) en un vaso de precipitados de politetrafluoroetileno (PTFE). Añadir 60 mL de peróxido de hidrógeno gota a gota (H2O2, 30%). Dejar durante 30 minutos hasta que la solución se ha enfriado.
      PRECAUCIÓN: Sea extremadamente cuidadoso cuando solución piraña. Desde el momento de la adición de peróxido de hidrógeno, la solución se hierve vigorosamente y genera altas temperaturas. Realizar el experimento en una campana de humos.
    2. Sumerja el molde de la AAO en la solución durante 30 s utilizando un no-metálico pinzas.
    3. Enjuague el molde AAO varias veces con agua desionizada. Sumerja el molde en agua desionizada durante 30 min y ponerla en alcohol metílico durante otros 30 minutos.
      PRECAUCIÓN: Cuando se deshaga la solución Piraña, diluir la solución con una cantidad abundante de agua.
    4. Secar completamente el molde AAO bajo vacío durante 3 horas.
  2. Preparación de solución madre de 20 × HDFS
    Nota: HDFS es una abreviatura de (heptadecafluoro-1,1,2,2, - tetrahydrodecyl) dimethylchloro-silano
    1. Llene un tercio de una botella de 1 L n-hexano con tamices moleculares. Sello de la botella con la película de parafina y guárdelo bajo nitrógeno seco durante 24 horas.
    2. Filtro de 200 mL de n-hexano con una jeringa de vidrio y filtro de PTFE de la jeringuilla de 0,2 μm.
    3. Vierta los 80 mL de n-hexano filtrada en una botella de vidrio de 100 mL. Añadir 2 mL de HDFS.
  3. Deposición de capa monomolecular uno mismo-montado
    1. Carga 57 mL de n-hexano filtrado en un vaso de precipitados de 100 mL. Sumerja el molde de la AAO en el solvente.
    2. Añadir 3 mL de solución madre de HDFS a n-hexano para hacer solución de HDFS 2,9 mM. Esperar 10 minutos para la reacción proceder.
    3. Transferir el molde AAO a fresco n-hexano. Cierre y selle todas las botellas de reactivo. Cierre la válvula de nitrógeno, luego saque las muestras de la guantera.
      Nota: HDFS es extremadamente sensible a la humedad. Conservar todos los reactivos que contienen HDFS en un desecador.
    4. Sumerja el molde de la AAO en 60 mL de methoxynonafluorobutane (C10H6F18O2, 99%). Limpie ultrasónicamente el molde de la AAO en un vaso de precipitados de 10 s por eliminar físicamente una vez adsorbidas moléculas HDFS. Repita el procedimiento de limpieza 10 veces.
      Nota: Exponer el molde AAO a ultrasonidos durante mucho tiempo sin intervalos dañan la capa de óxido.
    5. Secar completamente el molde de la AAO en vacío durante 24 horas.
      Nota: Una capa anti-que se pega con éxito depositada es super repelente al agua y estable durante meses si se almacena en un desecador. El protocolo puede hacer una pausa aquí.

4. fabricación de placas de Nanopattern gradiente de impresión térmica

Nota: Realice los pasos 4.2 a 4.7 en una sala limpia.

  1. Cortar una lámina de poliestireno espesor de 1.1 mm a un tamaño de 2,9 mm de ancho por 3,7 mm de largo con un cortador de circuito impreso (PWB).
  2. Cortar el molde de la AAO 35 mm desde la parte inferior con una pinza. Marque el nombre de la muestra y fecha de fabricación en la parte posterior.
  3. Limpiar un 8.0" oblea con una pequeña dosis de alcohol etílico. Poner las hojas de poliestireno en la oblea, luego Monte el molde de la AAO.
  4. Puso la película de fondo en el cajón de un imprinter termal. Fije la película superior a la Junta.
  5. Poner la oblea en la película de fondo. Coloque la Junta en la oblea. Asegúrese de que no hay polvo en la oblea.
  6. Cierre el cajón del imprinter termal. Aplicar 165 ° C de calor y 620.52 kPa de presión de 100 s.
  7. Enfriar la muestra a temperatura ambiente. Gire con cuidado la lámina de poliestireno para soltar el molde de la AAO.

5. esterilización e hidrofílico modificación del gradiente Nanopattern placas

  1. Coloque las placas de nanopattern en un plato cuadrado. Vierta 100 mL de alcohol etílico al 70% y exponer a la luz ultravioleta durante 30 minutos.
  2. Secar las placas de nanopattern con nitrógeno. Transferir las placas de nanopattern a un generador de plasma de oxígeno.
  3. Evacuar la cámara hasta llegar a 1.33 PA. A continuación, inyectar oxígeno a una velocidad de 30 cm3/min aplica una potencia de frecuencia de radio de 60 w. de mantener el plasma de oxígeno para 90 s.
    Nota: Se recomienda utilizar placas de nanopattern tratados con plasma dentro de 14 días.
  4. Coloque la placa de nanopattern en la parte inferior de una placa de cultivo celular con una gota de tolueno.
  5. Sellar las muestras en una bolsa y esterilizar con el esterilizador del plasma de baja temperatura.

6. cultivo de hECFCs

Nota: Llevar a cabo todos los procedimientos de centrifugación a 4 ° C a menos que se indique lo contrario.

  1. Antes de aislar de la sangre periférica células mononucleares (PBMCs), incubar una placa de colágeno cubierto 12-bien cultivo a 37 ° C por 1 h.
  2. Lave la placa de cultivo de 12 pozos con 1 × tamponada de fosfato estéril salino (PBS).
  3. Recoger 50 mL de sangre humana mediante un tubo de inhibidor de la heparina.
  4. Poner 6 mL de solución de polisacárido hidrofílico en un tubo de 15 mL y añadir 8 mL de sangre a la solución de polisacárido hidrofílico.
    Nota: Lentamente pipetee la sangre en la solución de polisacárido hidrofílico.
  5. Centrifugar el tubo a 1020 x g por 20 min para que sedimenten las células.
  6. La capa opaca de la célula de la cosecha y traslado a un nuevo tubo de 15 mL.
  7. Agregar 10% de suero bovino fetal (FBS)-contenía PBS y centrifugar el tubo a 1020 x g durante 10 minutos para que sedimenten las células.
  8. Quite el sobrenadante y añadir tampón de lisis de glóbulos rojos. Mantener en hielo durante 5 minutos.
  9. Agregar 10% FBS contenía PBS y centrifugar el tubo a 1020 x g durante 5 minutos para que sedimenten las células.
  10. Quite el sobrenadante y añadir 10% FBS contenía PBS. Centrifugar el tubo a 1020 x g durante 5 minutos para que sedimenten las células.
  11. Quite el sobrenadante y agregar 1 mL de células endoteliales expansión suplementado con 10% FBS. 8,0 x 106 células por pozo para cada plato cubierto de colágeno de la semilla.
  12. Cambiar el medio de cultivo cada día durante 1 semana. A continuación, cambiar el medio de cultivo cada 2 días.
    Nota: hECFCs se puede encontrar después de 10-14 día de la cultura. hECFCs Mostrar típica empedradas-como morfología y forma una colonia que se observan en microscopía de contraste de fase. Tinción de inmunofluorescencia de cadherin endotelial vascular (CD144) y factor de von Willebrand (vWF) se puede realizar también para la caracterización de la hECFCs después de la expansión celular.
  13. Para cultivar el hECFCs, usar células endoteliales expansión suplementado con 5% FBS y penicilina/estreptavidina a 37 ° C en una atmósfera humidificada con 5% CO2. Reemplazar el medio una vez al día.
  14. Después de la inducción hECFC, crecen las células al paso 7 para experimentos adicionales.

7. siembra de células y de la cultura en las placas de Nanopattern gradiente

Nota: Paso 7 describe la cultura de hECFCs en la placa del gradiente nanopattern, pero también se pueden utilizar otras fuentes de células.

  1. Capa la gradiente nanopattern placas con 1 mL de solución de recubrimiento de proteína de 0.1% en PBS por 10 min a temperatura ambiente.
    Nota: La capa de proteína 0,1% no cubre las características de nanopillar.
  2. Hacer una suspensión de hECFCs de la placa de cultivo por un método estándar de separación de células mediante tripsina.
  3. Diluir la suspensión de células para lograr la confluencia deseada. La hECFCs en las placas de nanopattern gradiente y plano control (por ejemplo, 1,0 × 104 células/cm2) de la semilla.
    Nota: Cuando hECFCs se siembran en 1,0 × 104 células/cm2 en las placas de nanopattern gradiente, la confluencia de células generalmente alcanza a 70-80% después de 2 días.
  4. Las células en las placas planas o gradiente nanopattern de la cultura durante 2 días en la incubadora.

8. observación y análisis

  1. Proyección de imagen de microscopio electrónico de barrido (SEM)
    1. Fix hECFCs cultivadas en placas de nanopattern plano o degradado con glutaraldehído al 2,5% a 4 ° C para pasar la noche.
    2. Tratar el tetraóxido de osmio 1% durante 1 h a temperatura ambiente. Muestras de lavado con PBS.
    3. Deshidratan las muestras con alcohol etílico de baja a alta concentración (50%, 70%, 80%, 90% y 100%) durante 10 minutos por cada paso.
    4. Tratar hexamethyldisilazane (HMDS) durante 15 min a temperatura ambiente. Después, lavar las muestras con HMDS fresco y dejar las muestras bajo la campana por lo menos 1 día hasta los HMDS residual se evapora completamente.
    5. Cubrir las muestras con Barnizadora a Farfulle platino durante 5 minutos y examinar las muestras con un SEM.
  2. Imagen de microscopio electrónico (MET) de transmisión
    1. Fix hECFCs cultivadas en placas de nanopattern plano o degradado con 2% paraformaldehído y 2.5% glutaraldehído en PBS a 4 ° C para pasar la noche.
    2. Realizar la fijación con tetróxido de osmio 1% y deshidratar muestras utilizando el método en 8.1.3.
    3. Incrustar las muestras en resina de epoxy. Hacer secciones de 60 nm espesor de bloques y colocar una sección en una cuadrícula TEM.
    4. Mancha de la sección con la mezcla de acetato de uranilo de 10 mg en 100 mL de alcohol de metilo y citrato de plomo de 0.1 mg en 100 mL de agua destilada. Obtener imágenes con un TEM.
  3. Tinción de fluorescencia
    1. Fix hECFCs cultivadas en placas de nanopattern plano o degradado con paraformaldehído al 4% a temperatura ambiente durante 15 minutos.
    2. Permeabilizar y bloque de muestras con cabra 5% suero y 0.1% Octilfenol etoxilato de nonilfenol en PBS (SAFT) a temperatura ambiente durante 30 minutos.
    3. Incubar las muestras con anticuerpo primario contra vinculina (1: 500 en SAFT) a temperatura ambiente para muestras de 2 h. Enjuague tres veces con SAFT.
    4. Incubar las muestras con fluorescencia conjugado phalloidin (1:1, 000 en SAFT), conjugado fluorescencia de anticuerpo secundario (1:1, 000 en SAFT) a temperatura ambiente para muestras de 2 h. Enjuague tres veces con SAFT.
    5. Incubar las muestras con 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, 1:1,000 en SAFT) a temperatura ambiente durante 5 minutos.
    6. Colocar 10 μl de medio de montaje en la superficie del gradiente nanopattern. Coloque un cubreobjetos sobre el medio de montaje.
    7. Coloque la muestra boca abajo en el escenario de la muestra y adquirir imágenes con el microscopio de fluorescencia confocal.
  4. Análisis de imagen
    1. Transferencia de imágenes capturadas de la hECFCs a un sistema de análisis de imagen.
    2. Seleccione el campo al azar de phalloidin coloración de imagen. Ajustar el umbral y crear una imagen binaria en el que las células son distintas del fondo.
    3. Dibujar contornos alrededor de las células para medir el área de la célula y perímetro y contar manualmente el número de filopodios por la célula.
    4. Seleccione el campo al azar de la vinculina manchando la imagen. Ajustar el umbral y crear una imagen binaria de áreas focales de adherencia.
      Nota: Ajuste umbral de imagen para evitar artificial sobre - o debajo - filling de áreas focales de adherencia.
    5. Contar el número de adherencia focal de cada célula.

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Representative Results


La figura 1 muestra imágenes de SEM de los moldes fabricados de AAO gradiente según su tipo y posición. La figura 2 muestra imágenes de SEM de placas gradiente nanopattern con nanopillars regular-redondeadas y figura 3 cuantificación datos del diámetro del nanopillar. La tabla 1 enumera las características de la nanopillars fabricado.

Figura 4A muestra el esquema de cultivo de hECFCs derivadas de sangre. Figura 4B muestra la imagen de contraste de fase de hECFCs de thecultivated. Figura 4 muestra los marcadores de hECFC teñidos con CD144 (verde), vWF (rojo) y el núcleo (azul). Figura 5A muestra imágenes representativas del SEM del hECFCs después de 2 días de cultura en el plano, GP 120/200, GP 200/280 y 280/360 GP placas. Figura 5B y C representan datos cuantitativos sobre célula área y perímetro en comparación con el piso. Los datos de cuantificación revelaron que las células cultivadas en nanopillar superficies de menor tamaño celular reducida área y perímetro. Figura 5 es las imágenes representativas de la SEM de hECFCs que muestran la morfología de los filopodios. Figura 5E representa datos cuantitativos número de filopodios en comparación con el piso. Consecuencia filopodial significativa fue observada en células cultivadas en la GP 120/200, mientras que ningún cambio significativo se observó en GP200/280 o GP280/360 en comparación con el piso. Figura 5F muestra imágenes representativas del TEM de hECFCs después de 2 días de cultivo en placas de nanopattern plano y degradado.

Figure 1
Figura 1. Molde AAO gradiente. Imágenes de SEM de gradiente AAO moldes para placas de GP 120/200, 200/280 de GP y GP 280/360 según la posición de moldes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2 . Placas de gradiente nanopattern. Imágenes de SEM de placas de tipo Pilar degradado nanopattern para placas GP 120/200 GP 200/280 y 280/360 GP según posición de placas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3 . Gradiente de tamaño de diámetro nanopillar. Datos de cuantificación que muestra el gradiente de diámetros nanopillar para GP 120/200, GP 200/280 y 280/360 GP placas, respectivamente. Las barras representan el error estándar. Esta figura fue modificada de [Acta Biomaterialia] 20. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Módulo de Young (GPa) Nanopillar diámetro (nm) Nanopillar tono (nm) Distancia de centro a centro (nm) Altura de Nanopillar (nm) Nanopillar rigidez (N/m)
Plano 2.43±0.19 – – – – –
GP 120/200 1.74±0.11 120 – 200 320-240 440 276.9±21.9 9.35
GP 200/280 2.01±0.05 200 – 280 240-160 440 268.1±25.9 55.78
GP 280/360 2.1±0.13 280-360 160-80 440 293.6±23.6 134.15

Tabla 1. Características de los falsos nanopillars. Datos cuantificados que muestra el módulo de Young, diámetro, paso, distancia de centro a centro, altura y rigidez de nanopillars fabricados. Esta tabla fue modificada de [Acta Biomaterialia] 20.

Figure 4
Figura 4 . Caracterización de hECFCs. (A) horario de muestra esquema de hECFCs derivados de la sangre periférica de adultos. Imagen de contraste de fase (B) de Colonia del hECFC, derivados de sangre periférica de adultos el día 14. (C) inmunofluorescencia imágenes mostrando CD144 (verde), vWF (rojo) y núcleo de las células teñidas con DAPI (azul). Esta figura fue modificada de [Acta Biomaterialia] 20. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5 . hECFCs cultivadas en placas de nanopattern plano y degradado por 2 días. (A) imagen SEM representante de hECFCs cultivadas en placas de piso, GP 120/200, GP 200/280 y 280/360 GP. (B y C) Datos de cuantificación del área y el perímetro de hECFCs (n = 50). * p.05 < en comparación con el piso. (D) imágenes de SEM representativos de la vanguardia del hECFCs en las placas de nanopattern plano y degradado. (E) datos de cuantificación del número de filopodios por un hECFC (n = 20). * p.05 < en comparación con el piso. (F) imagen de TEM representante de hECFC cultivadas en plano y gradiente nanopattern placas. Las flechas blancas indican los puntos de interacción entre hECFCs y sustrato de la superficie. Esta figura fue modificada de [Acta Biomaterialia] 20. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Complementarias Figura 1. Ángulo de contacto de agua prístina AAO y HDFS tratados AAO. Mediciones de ángulo de contacto con propiedades hidrofóbicas de HDFS habían montado uno monocapa (A) antes y (B) después del tratamiento. Haga clic aquí para descargar esta figura.

Suplementario Figura 2. Imágenes de SEM de placas nanopattern gradiente fabricado con el mismo molde AAO. Imagen de SEM comparativo establece para verificar la durabilidad del molde de la AAO. (A) placa de nanopattern gradiente producido con molde recién hecha. (B) placa de nanopattern gradiente producido con molde AAO después impresión 15 veces. Haga clic aquí para descargar esta figura.

Suplementario Figura 3. Influencia de la capa de proteína. Imágenes de SEM de hECFCs que fueron cultivadas en GP 120/200 GP 200/280 y 280/360 GP nanopattern gradiente placas (A) sin o (B) con la capa de proteína. Esta figura fue modificada de [Acta Biomaterialia] 20 Haga clic aquí para descargar esta figura.

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Discussion

Fabricación de un AAO a menudo adolece de defectos tales como grietas, formas irregulares de los poros y la quema. La razón principal de estos defectos se llama un desglose electrolítico, que es fuertemente afectado por la naturaleza de los sustratos de metal está anodizado y la resistividad del electrólito21. Puesto que la resistividad del electrolito varía dependiendo de su temperatura, eliminar calor continuamente de electrodos es el punto crítico para mantener la temperatura localización del electrólito como estable en un estado anodización en alta tensión. En este protocolo, fabrican moldes AAO modificando dos etapas anodización22,23 de Masuda. Reemplazar casi la mitad el electrolito con alcohol metílico no sólo impide que el electrolito de congelación a bajas temperaturas pero también priva el electrodo de calor por evaporación en la parte inferior del poro24. La razón para el uso de un agitador de arriba y el impulsor en lugar de un agitador magnético es también para el control de temperatura. El agitador magnético típico tiene una alta probabilidad de ralentí debido a la desalineación accidental de la barra magnética durante el funcionamiento a largo plazo. Este problema provoca la circulación inadecuada de electrolitos, aumentando su temperatura y lleva a la quema.

Para hacer un degradado de tamaño el molde de la AAO, que gradualmente inmersos la AAO en un ácido fosfórico, solución de la aguafuerte. Los poros se ensanchan en proporción con el tiempo que la AAO permanece en la solución de la aguafuerte, como se muestra en la figura 1. Bajo esta condición, la tasa promedio de poro mayor es 0.67 nm/min manipular la velocidad y el tiempo de inmersión va a cambiar la pendiente del diámetro de poro de gradiente y máximo tamaño de la AAO. El diámetro de poro posible máximo es 400 nm. Cuando el diámetro supera los 400 nm, la pared de separación entre los poros se vuelve tan fina que no pueden tolerar la presión durante la termal impresión proceso.

Una monocapa uno mismo-montado HDFS es conocido por ser capaz de añadir una propiedad hidrofóbica a la superficie material25. La molécula HDFS hace un fuerte enlace covalente con los grupos hidroxilo en la superficie de la AAO introducida por el Piraña tratamiento26. Por lo tanto, como se muestra en la figura 1 complementaria una monocapa uno mismo-montado sólida puede ser formada cuando un gran número de grupos hidroxilo presente en la superficie del sustrato. Para una calidad óptima con un monocapa uno mismo-montado HDFS, sugerimos llevar a cabo la reacción en un ambiente deshumidificado. Cuando HDFS es expuesto a la humedad, una reacción de lado con agua forma dímeros, trimers y oligómeros incluso de moléculas de silano y disminuye la calidad general de la monocapa auto ensamblada.

Al usar el molde de la AAO con un gradiente de tamaño en nanoimprinting térmica, placas de la célula con un gradiente de nanopillars obtuvieron figura 2 y figura 3. El método de nanoimprinting termal tiene una ventaja que puede producir una gran cantidad de placas de iguales nanopattern utilizando un molde principal de la AAO. Complementaria la figura 2 muestra que no hay diferencia en la calidad de lo nanopattern producido, incluso después de quince procesos de impresión, en comparación con el nanopattern producido por el nuevo molde AAO. La razón de poliestireno como material para la transferencia de un nanopattern es que el poliestireno tiene una temperatura de transición de cristal apropiado (100 ° C) para la impresión térmica, y es ampliamente utilizado en platos de cultivo celular comercial debido a su propiedades transparentes y no tóxicos.

Fabricación de nanoestructuras con alta proporción de nanoimprinting térmica método es difícil. Porque, cuando condiciones de proceso, tales como aumento de la presión y el tiempo, el molde se convierte en profundamente enraizado en el sustrato de polímero, lo que es difícil separar el molde del substrato. Por lo tanto, es muy difícil conseguir tener una relación de aspecto de 1:3 o más usando nuestra técnica de nanoimprinting nanopatrones. Sin embargo, de acuerdo a imágenes TEM observamos la figura 5, hemos encontrado un interesante hecho de que la membrana de las células de nanopatrones no estuvo en contacto con la parte inferior de la nanopattern. En otras palabras, todos los estímulos físicos que pueden manipular una respuesta de las células se originaron de la parte superior de la nanopattern. Por lo tanto, en este estudio, no tenemos que considerar la relación de aspecto en el estudio de las respuestas de la célula a la nanopattern. Como se muestra en el suplementario figura 3, solución al 0.1% proteína capa no influyó en el accesorio de hECFCs en las superficies de nanopillar. Además, estos estímulos nanoscaled de las placas nanopattern gradiente disminuyeron el área celular y perímetro de hECFCs y filopodial mayor consecuencia figura 5.

En Resumen, hemos establecido nanopattern gradiente placas manipulando una respuesta de hECFCs en vitro. Para saber exactamente qué tamaño de nanoestructuras las células son afectadas grandemente, un trabajo futuro es necesario diseñar una célula específica tamaño nanopillar mediante el ajuste de la pendiente de la diámetro de gradiente y mínima-máxima de la nanopillars. Esperamos que este gradiente nanopattern a ser una herramienta fascinante para la interacción entre las células y nanoestructuras de la pantalla, así como proporcionar nichos de células avanzado que nanoestructuras pueden ajustarse libremente en tamaño.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Este trabajo fue financiado por el programa de investigación de ciencia básica a través de la nacional investigación Fundación de Corea (NRF) financiado por el Ministerio de educación, ciencia y tecnología (MEST) [NRF-2015R1D1A1A01060397] y Bio y desarrollo de tecnología médica Programa de la NRF financiado por el Ministerio de ciencia, TIC y planeación de futuro [NRF-2017M3A9C6029563].

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Perchloric acid 60% Daejung Chemicals & Metals 6512-4100
Ethyl alcohol, absolute 99.9% Daejung Chemicals & Metals 4118-4100
Phosphoric acid 85% Daejung Chemicals & Metals 6532-4400
Methyl alcohol 99.5% Daejung Chemicals & Metals 5558-4400
Chromium(VI) oxide Daejung Chemicals & Metals 2558-4400
Sulfuric acid 95% Daejung Chemicals & Metals 7781-4100
Hydrogen peroxide 30% Daejung Chemicals & Metals 4104-4400
n-hexane 95% Daejung Chemicals & Metals 4081-4400
Toluene 99.5% Daejung Chemicals & Metals 8541-4400
(heptadecafluoro-1,1,2,2,-tetrahydrodecyl)dimethylchlorosilane Gelest SIH5840.4 Moisture sensitive
Methoxynonafluorobutane 99% Sigma aldrich 464309
Collagen solution Stemcell #4902
Gelatin Sigma aldrich G1890 Protein coating solution
Ficoll-Paque GE Heathcare 17-1440-03 Hydrophilic polysaccharide solution
EGM-2MV Lonza CC-3202 Endothelial cell expansion medium
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140-122
Phosphate buffered saline Gibco 10010031
Fetal bovine serum Gibco 12483-020
Paraformaldehyde Sigma aldrich P6148
Glutaraldehyde Sigma aldrich G5882-100ML
Osmium tetroxide Sigma aldrich 201030-1G
Hexamethyldisilazane Sigma aldrich 440191
Triton X-100 Sigma aldrich X100-100ML Octylphenol ethoxylate 
Goat serum Gibco 26050-088
anti-human vinculin primary antibody  Sigma aldrich V9131
F-actin probe Molecular Probes A12379 Fluorescence-conjugated phalloidin
Alexa Fluor 488-conjugated anti-mouse IgG antibody Molecular Probes A11001 Fluorescence-conjugated secondary antibody 
4',6-diamidino-2-phenylindole  Sigma aldrich D9542
Mounting medium DAKO S3023
Anti-human vWF primary antibody  DAKO A0082
Anti-human CD144 primary antibody  BD Biosciences #555661
Eponate 12™ Embedding Kit, with BDMA Ted Pella 18012 Epoxy resin
Uranyl Acetate, 25g Ted Pella 19481
Lead Citrate, Trihydrate, 10g Ted Pella 19312
Ultra pure aluminum plate Goodfellow 26050-088
Polystyrene sheet Goodfellow ST313120
8.0" silicon wafer Siltron 29-01024-03 Single side polished, 725 µm thick
Vacuum desiccator, 4.4 L Kartell KA.230
Vacuum pump Vacuumer V3.VOP100
Power supply Unicorntech UDP-3003
Magnetic stirrer Daihan scientific SL.SMS03022
Overhead stirrer Daihan scientific HT120DX
Circulator Daihan scientific WCR-P12
Linear moving stage Zaber A-LSQ300A-E01-KT07
Angle bracket, 90 degrees Zaber AB90M Accessory of the linear moving stage
PMP forcep, 145 mm Vitlab 67995 Nonmetallic tweezer
PTFE beaker, 250 mL Cowie CW007.25
Ultrasonic cleaner Branson B2510MTH
PCB cutter Hozan Tool Industrial K-110
Nanoimprint device Nanonex NX-2000
Oxygen plasma generator Femto Science CUTE
Low temperature sterilizer Lowtem Crystal 50
CO2 Incubator Panasonic MCO-18AC
Confoal laser scanning microscope Carl Zeiss LSM700
Scanning electron microscope JEOL JSM6701
Transmission electron microscope Hitachi H-7500

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References

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Fabricación de Nanopattern gradiente térmico Nanoimprinting técnica y proyección de la respuesta de células formadoras de colonias endoteliales humanas
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