Summary
Her, er en metode til isolation af rotte hjernen microvessels og forberedelsen af membran prøver beskrevet. Denne protokol har den klare fordel at producere beriget microvessel prøver med acceptabel protein udbytte fra individuelle dyr. Prøver kan derefter bruges til robust protein analyser på hjernen mikrovaskulære endotelet.
Abstract
Blod - hjerne barrieren (BBB) er en dynamisk barriere væv, der reagerer på forskellige patofysiologiske og farmakologiske stimuli. Sådanne ændringer som følge af disse stimuli kan stærkt modulere medicinafgivelse til hjernen og dermed forårsage betydelige udfordringer i behandlingen af centralnervesystemet (CNS) sygdomme. Mange BBB ændringer, der påvirker Farmakoterapi, inddrage proteiner, der er lokaliseret og udtrykt på niveauet i endothelial celler. Faktisk, sådan viden på BBB fysiologi i sundhed og sygdom har udløst betydelig interesse for studiet af disse Membranproteiner. Fra et grundlæggende videnskab forskning synspunkt indebærer dette et krav om en simpel men robust og reproducerbar metode til isolation af microvessels fra hjernevæv høstet fra forsøgsdyr. For at forberede membran prøver fra frisk isoleret microvessels, er det nødvendigt at prøve præparater blive beriget i endothelial celler men begrænset i overværelse af andre celletyper neurovaskulære enhed (dvs., astrocytter, mikroglia, neuroner, pericytes). En ekstra fordel er evnen til at forberede prøverne fra enkelte dyr for at fange den sande variation af protein udtryk i en eksperimentel befolkning. I dette manuskript fremlægges oplysninger om en metode, der er udnyttet til isolation af rotte hjernen microvessels og forberedelse af membran prøver. Microvessel berigelse, fra prøverne stammer, er opnået ved hjælp af fire centrifugering trin hvor dextran er inkluderet i prøvebuffer. Denne protokol kan nemt tilpasses andre laboratorier for deres egne specifikke programmer. Prøver oprettes fra denne protokol har vist sig at give robust forsøgsdata fra protein analyse eksperimenter, der kan i høj grad støtte forståelsen af BBB svar til fysiologiske, patofysiologiske og farmakologiske stimuli.
Introduction
Blod - hjerne barrieren (BBB) findes på grænsefladen mellem det centrale nervesystem (CNS) og systemisk cirkulation og spiller en vigtig rolle i opretholdelsen af hjernen homøostase. Specifikt, BBB funktioner til netop kontrol opløste koncentrationer i hjernen ekstracellulærvæsken og effektivt levere de næringsstoffer, der kræves af hjernevæv til at opfylde de store metaboliske krav af CNS1. Disse roller indebærer, at BBB, som findes primært på samme niveau som den mikrovaskulære endotel celle, skal have diskrete mekanismer, der aktiverer nogle stoffer til at få adgang til hjernen parenkym samtidig med at potentielt skadeligt fremmedstoffer ikke kan ophobes. Ja, hjernen mikrovaskulære endotelceller er ikke fenestrated og udviser begrænset pinocytosis, der sikrer en mangel på non-selektive permeabilitet2. Derudover express hjernen microvessel endotelceller tight junction og adherens krydset proteiner der fungerer til at danne en fysisk "seal" mellem tilstødende endotelceller og stærkt begrænse paracellular diffusion af blodbårne stoffer i hjernen parenkym. Faktisk, selektiv permeabilitet af endogene og eksogene stoffer kræver funktionelle udtryk for optagelse og efflux transportvirksomheder3. Samlede, stramme vejkryds, adherens vejkryds og transportvirksomheder arbejder i fællesskab for at opretholde de unikke barriereegenskaber af BBB.
BBB er en dynamisk barriere, der reagerer på fysiologiske, patofysiologiske og farmakologiske stimuli. For eksempel, har hypoxi/reoxygenation stress vist sig at modulere udtryk for kritiske tight junction proteiner (dvs., occludin, zonulae occluden-1 (ZO-1)), som er forbundet med øget paracellular permeabilitet til vaskulær markører sådanne som saccharose4,5,6. Lignende observationer er gjort på BBB i fastsættelsen af traumatisk hjerne skade7 og perifere inflammatorisk smerte8,9. Disse samme sygdomme kan også modulere transportmekanismer på BBB10,11,12,13,14. Faktisk, hypoxi/reoxygenation skade forbedrer funktionelle udtryk for økologisk anion transporterer polypeptid 1a4 (Oatp1a4) på BBB, hvilket kan føre til betydelige stigninger i blod til hjernen transport af specifikke Oatp transport substrater såsom taurocholate og atorvastatin13. BBB egenskaber kan også ændres ved Farmakoterapi, selv, en mekanisme, der kan danne grundlag for både dybtgående ændringer i medicin effektivitet i hjernen og stof-drug interaktioner. For eksempel, acetaminophen mål nukleare receptor signaling mekanismer i hjernen mikrovaskulære endotelceller, øger funktionelle udtryk for kritiske efflux transporter P-glykoprotein (P-gp), og ændrer tidsafhængig analgesi tillagt morfin, transport en opioide smertestillende stof og etablerede P-gp substrat15. En grundig forståelse af BBB ændringer, der kan være fremkaldt af sygdomme eller af stoffer, kræver også identifikation og karakterisering af bestemte reguleringsmekanismer, der styrer disse ændringer. Faktisk, diskrete signaling veje er blevet identificeret i hjernen mikrovaskulære endotelceller, der styrer den molekylære udtryk for tight junction proteiner16,17 og transportvirksomheder,15, 18,19. Taget sammen, indikerer disse observationer, at komplekse molekylære veje er involveret i reguleringen af BBB stramme kryds og transportvirksomheder i både sundhed og sygdom.
En betydelig udfordring i studiet af BBB er det absolutte krav om en enkel og effektiv metode til isolation af microvessels fra hjernevæv afledt af forsøgsdyr og efterfølgende udarbejdelse af membran prøver. Disse prøver skal være forberedt, så de er både beriget i hjernen mikrovaskulære endotelceller og begrænset i tilstedeværelse af andre celletyper. Over de sidste mange år, har flere metoder til isolering af microvasculature fra gnaver hjerne blevet rapporteret i den videnskabelige litteratur13,20,21,22. Denne artikel beskriver en enkel, robust, og reproducerbar metode til dyrkning af microvessels fra rotte hjernen og forberedelse i endothelial membran-beriget prøver, der kan bruges til analyse af protein udtryk. En fordel ved denne microvessel isolation protokol er evnen til at opnå prøve præparater af høj kvalitet og med tilstrækkelig protein udbytte fra individuelle eksperimentelle dyr. Dette giver mulighed for hensyntagen til indbyrdes animalske variabilitet i protein udtryk. Sådan et forskud i denne protokol har væsentligt forbedret robustheden af BBB undersøgelser, fordi overvurdering (eller lav ansættelse) af den sande dumpingmargenens protein ændringer på BBB kan nu undgås. Derudover muliggør optagelse af flere centrifugering trin med dextran forbedret berigelse af microvessels i eksperimentelle prøver samtidig letter fjernelse af uønskede cellebestanddele som neuroner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedurer skitseret nedenfor er blevet godkendt af en institutionel Animal Care og brug udvalg (IACUC) og i overensstemmelse med National Institutes of Health (NIH) og dyr forskning: rapportering In Vivo forsøg (kommer) retningslinjer. De proceduremæssige flow-protokollen er afbildet i figur 1.
1. set-up for proceduren
- Forberede hjernen microvessel buffer (BMB). Start ved vejning 54.66 g D-mannitol, 1.90 g EGTA og 1,46 g 2-amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol (dvs. Tris) base i en ren bægerglas. Tilføje 1,0 L deioniseret vand. Bland dele BMB buffer med en magnetomrører. Når løsningen er blevet grundigt blandet, justere pH til 7.4 ved hjælp af 1,0 M HCl.
- Forberede 26% dextran (MW 75.000) opløsning (w/v) før bedøve dyr. Forberede dextran løsning, som beskrevet i følgende fremgangsmåde.
Bemærk: Det er kritisk vigtigt at forberede denne løsning før tid, fordi dextran kan tage ca. 1,5-2 h til at opløse i vandig buffer.- Der afvejes de pulveriserede dextran (26 g per 100 mL buffer) i en ren bægerglas.
- Afmåle den passende mængde BMB og dispensere i en separat, ren bægerglas.
- Langsomt hæld BMB i bægerglasset, der indeholder pulveriserede dextran. Manuelt blande pulveriseret dextran under hælde af BMB ved hjælp af en glasstang rør.
- PH indstilles til 7.4 med 1,0 M HCl umiddelbart forudgående at bruge.
NOTE: Et typisk isolation af hjernen microvessels fra 12 individuelle Sprague-Dawley rotter (mandlig eller kvindelig; 3 måneder i alder, 200-250 g hver) kræver 200 mL af dextran løsning (dvs. 52 g dextran i 200 mL af BMB).
2. udvinding af hjernevæv fra Sprague-Dawley rotter
- Efter den ønskede eksperimentel behandling, bedøver Sprague-Dawley rotter ved hjælp af ketamin (50 mg/kg, 2,5 mL/kg i.p.) og xylazin (10 mg/mL, 2,5 mL/kg I, p.). Fortynd ketamin og xylazin i 0,9% saltvand for endelige koncentrationer af 20 mg/mL og 4,0 mg/mL henholdsvis. Aflive dyr ved halshugning ved hjælp af en skærpet guillotinen i overensstemmelse med IACUC retningslinjer. Brug samme fremgangsmåde for både mandlige og kvindelige Sprague-Dawley rotter.
- Resect hud fra rotte kraniet ved at gøre en enkelt tværgående snit ved hjælp af kirurgiske saks.
- Bruger rongeurs, forsigtigt fjerne kraniet plade og udsætte hjernen.
- Fjerne hjernen ved hjælp af en spatel. Fjern cerebrum og placere den isolerede hjernevæv i en 50 mL konisk slange der indeholder 5 mL af BMB. Tilsæt 1,0 μL af protease hæmmer cocktail pr. 1,0 mL af BMB buffer umiddelbart før brug.
3. hjernens behandling
- Overføre hjernevæv fra 50 mL konisk rør til en ren petriskål.
- Hjernen bruger pincet, forsigtigt rulle på 12,5 cm diameter filtrerpapir fjerne ydre meninges, som overholdes løst hjernebarken. Forsigtigt Tryk på hjernevævet mod filtrerpapir og roll vævet igen. Drej filtrerpapir ofte under dette trin.
- Adskille plexus chorioideus fra hjernehalvdele med pincet.
Bemærk: Plexus chorioideus vises som en klar hindeagtige væv lokaliseret til overfladen af cerebral hjertekamrene. - Forsigtigt flade hjernevæv og fjerne resterende meninges og olfaktoriske pærer med pincet.
- Placere den kortikale hjernevæv i et kølede glas mørtel. Tilføje 5,0 mL af BMB indeholdende protease hæmmer cocktail til mørtel.
- Ved hjælp af en luftledninger homogeniseringsapparat homogeniseres hjernevæv ved hjælp af 15 op og ned slagtilfælde på 3.700 rpm. Udføre homogenisering ved hjælp af en 10 mL morter og støder væv grinder. Mellem homogenisering af hver enkelt prøve, rense pistil med 70% ethanol.
Bemærk: Homogenisering slagtilfælde bør være konsekvent i tempo og omfang. - Hæld homogenatet i mærket centrifugeglas.
4. centrifugering trin
- Tilføje 8,0 mL af 26% dextran løsning til hver mærket centrifugeglasset indeholdende hjernen homogenatet.
- Vend røret to gange og derefter grundigt vortex prøven. Foretage vortexing af hver prøve ved hjælp af flere vinkler til at sikre en grundig blanding af hjernen homogenatet løsning med 26% dextran løsning.
- Centrifuge prøver på 5.000 x g i 15 min. ved 4 ° C.
Bemærk: For visse analyser, det er nyttigt at sammenligne hjernen microvessels med hjernen parenkym. Skal vurderingen af protein udtryk i hjernen parenkym kan kræves, supernatanten fra denne centrifugering trin (dvs., hjernen parenkymalt brøkdel) indsamles og opbevares ved-80 ° C til fremtidig brug. - Fjern supernatanten ved hjælp af et vakuum indsugningsventil og glas Pasteur pipette.
Bemærk: Der skal udvises forsigtighed ikke forstyrre pelleten. Ellers vil blive reduceret mængden af hjernen microvessels indsamlet, som formindskes betydeligt protein udbyttet af denne procedure. - Resuspenderes i 5,0 mL af BMB indeholdende protease hæmmer cocktail (dvs. 1.0 μL protease hæmmer cocktail pr. 1,0 mL af BMB buffer). Vortex pellet at sikre grundig blanding.
- Tilføje 8,0 mL af 26% dextran til hver centrifugeglas og vortex som beskrevet i trin 4.1-4.2 af denne protokol.
- Centrifuge prøver på 5.000 x g i 15 min. ved 4 ° C.
- Brug en sugekolbe og glas pipette, Aspirér supernatanten og sørge for at pille indeholdende hjernen microvessel ikke forstyrres.
Bemærk: Overskydende materiale, der har levet op til rørvæggen indeholder ikke microvessels og skal omhyggeligt rengøres og fjernet. - Gentag trin 4,5 til 4,8 en yderligere to gange.
- En gang 4 dextran centrifugering trin er afsluttet, tilføje 5,0 mL af BMB til hver pellet og vortex til resuspend prøven.
Bemærk: Efter afslutningen af trin 4.10, hele microvessels kan indsamles til analyse af protein lokalisering. Dette kan opnås ved at tage en 50 μL alikvot re suspenderede microvessel pellet og udtværing på et glas objektglas. Microvessels er derefter varme-fast ved 95 ° C i 10 min på en varme blok efterfulgt af fiksering i iskold ethanol til en yderligere 10 min. dias kan derefter opbevares ved 4 ° C indtil kræves for billeddiagnostiske undersøgelser.
5. ultracentrifugering at forberede prøverne af samlede hjerne mikrovaskulære membraner
- Overføre prøver til kølede glas homogeniseringsapparat.
- Ved hjælp af en luftledninger homogeniseringsapparat homogeniseres hjernevæv ved hjælp af 8-10 op og ned slagtilfælde ved 3000 rpm. Homogenisering er foretaget ved hjælp af en 10 mL morter og støder væv grinder. Ren pistil med 70% ethanol efter homogenisering af hver enkelt prøve.
- Overføre prøver at rense ultracentrifuge rør. Nummer og vejer hver enkelte rør. Balance og parre rør før pålæsningen i ultracentrifuge rotor.
Bemærk: Alle vejer og binding af ultracentrifuge rør skal gennemføres med hætter på at sikre nøjagtig måling af tube vægte. - Centrifuge prøver på 150.000 x g i 1 time ved 4 ° C.
- Ved hjælp af en sugekolbe og glas Pasteur pipette, Aspirér supernatanten benytter sig ikke at forstyrre kapillær membran pellet.
- Baseret på pellet størrelse, tilsættes en passende mængde storage buffer, som består af deioniseret vand og BMB i forholdet 1:1 (v/v). Typisk, pellets er genopslemmes i 400-500 μL opbevaring buffer. Tilføje protease hæmmer cocktail til opbevaring buffer i et forhold på 1,0 μL per 1,0 mL af opbevaring buffer.
- Vortex prøver at resuspend pellet i opbevaring buffer.
- Bruger et glas Pasteur pipette, overføre kapillær membran prøver til en mærket 1,5 mL microcentrifuge tube.
- Bestået prøven gennem en nål sprøjten 5 x til at sikre, at prøven blandes grundigt, og at ingen cellulære aggregater findes.
- Gemme prøver på-80 ° C indtil kræves til analyse.
Bemærk: Proteinindholdet af hver microvessel membran prøve måles ved hjælp af metoden Bradford.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den eksperimentelle flow til isolation af rotte hjernen microvessels og forberedelsen af microvessel membran prøver er vist i figur 1. Ved hjælp af den procedure, der præsenteres her, vellykket isolation af intakte microvessels fra rotte hjernen er vist (figur 2A). Disse fartøjer stammer efter afslutningen af centrifugering med dextran og umiddelbart før påbegyndelse ultracentrifugering at forberede membran prøver (dvs. efter gennemførelsen af trin 4.10). I dette billede, er at microvessel farvet ved hjælp af en antistof mod Oatp1a4, en transportvirksomhed, der har vist sig at være godt udtrykt i plasma membranen af hjernen mikrovaskulære endotelceller2,11,13, 18. Ved hjælp af western blot analyse (figur 2B), membran præparater fra microvessels høstet fra hunrotter Sprague-Dawley blev vist beriget at være med trombocyt endotel celle vedhæftning molekyle-1 (PECAM-1, også kendt som CD31), en markør protein for hjernen microvasculature. PECAM-1 er en hæmmende Co receptor involveret i T-celle- og B-celle signalering, der er stærkt udtrykt på plasma membran af vascular endothelial celler. Under optimering af denne protokol, blev PECAM berigelse observeret i membranen prøver udarbejdet ved hjælp af to og fire dextran centrifugering trin. Som vist i figur 2B, var der ingen forskel i PECAM udtryk mellem prøver udarbejdet ved hjælp af disse forskellige centrifugering trin; men fire dextran spins resulterede i forbedret udtryk i endothelial transport proteiner, som angiver forbedret microvessel berigelse i prøverne. Desuden spins brug af fire dextrans forbedret fjernelse af uønskede cellebestanddele som angivet ved nedsat ekspression af neuronal markør proteiner som synaptophysin18. Derfor, alle efterfølgende forberedelserne til hjernen microvessel membraner blev udført ved hjælp af fire dextran centrifugering trin. I vores vestlige skamplet eksperimenter, blev mikrotubulus konstituerende protein tubulin brugt som en loading kontrol. Som fastlagt af Bradford protein assay, udbytte membran præparater typisk protein koncentrationer spænder mellem 5,0-10,0 mg/mL. Repræsentative protein kvantificering resultaterne er afbildet i tabel 1. Disse protein værdier blev bestemt udfra en standardkurve, der er genereret ved hjælp af bovint serumalbumin (BSA; 2,0 mg/mL) som standard (figur 3). Protein prøver blev fortyndet 10-fold i Bradford assay.
Efter protein kvantificering, microvessel membran prøver kan udnyttes til biokemiske metoder til proteinanalyse som western blot analyse, dot blotting eller co-immunoprecipitation. Figur 4A skildrer en repræsentativ vestlige skamplet for BBB transport protein glukose transporter-1 (Glut-1) hvor prøver fra tabel 1 blev analyseret. Klart, enkelt bands på den passende molekylvægt (dvs., forudsagt til at være 54 kDa) for denne yderst udtrykt BBB protein blev opdaget i hver prøve, membran. Hver individuel lane i denne vestlige skamplet repræsenterer microvessel membran prøve forberedt fra en enkelt eksperimentelle dyr. Lig protein i hver lane var bestemmes ved hjælp af natrium-kalium ATPase (dvs Na+/K+ ATPase; forudsagte molekylvægt = 113 kDa) indlæsning kontrol. Som vist i figur 4B, blev højere udtryk af Glut-1 på BBB observeret i mandlige rotter i forhold til deres kvindelige modstykker. Ingen forskel i udtryk for Na+/K+ ATPase blev observeret mellem mandlige og kvindelige dyr. For denne densitometric analyse, var bands quantitated bruger ImageJ software.
Figur 1: oversigt over procedurer og protokoller at isolere rotte hjernen microvessels og forberede membran prøver. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: repræsentative data viser intakt microvessel og udtryk for en vaskulær endotel celle markør protein. A: Immunfluorescens farvning viste lokalisering af Oatp1a4, en transportvirksomhed, der har vist sig at være godt udtrykt på BBB, i en intakt hjernen microvessel isoleres som beskrevet i denne protokol. Oatp1a4 lokalisering blev fundet ved hjælp af en specifik kanin polyklonale antistof mod Oatp1a4 ved en fortynding på 1:10. Sekundær antistof var en fluorescerende konjugerede anti-kanin IgG, der blev brugt ved en fortynding på 1: 300. Skalalinjen = 7,5 μm. B: Western blot analyse demonstreret renheden af microvessel prøver ved at vise berigelse af specifikke endotel celle markør protein PECAM-1, som blev fundet ved hjælp af et monoklonalt muse-antistof ved 1: 100. Sekundær antistof var en anti-mus IgG i en 1: 50.000 fortynding. BH = hjerne homogenatet, MV = rå microvessel fraktion, MVM = hjerne microvessel membraner. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: en repræsentativ standardkurve for Bradford Protein Assay. Bovint serumalbumin (BSA) blev brugt som en standard og blev fortyndet til følgende koncentrationer: 0, 0,125, 0,25, 0,50, 0,75, 1,0, 1,5 og 2,0 mg/mL. Absorbansen blev målt på = 595 nm. Hvert datamærke repræsenterer et gennemsnit af tre absorbans behandlinger pr. BSA koncentration. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: repræsentative vestlige skamplet viser Sex forskelle i overflod-1 udtryk i membranen prøver forberedt fra isolerede Rat Brain Microvessels. A: Western blot analyse viser udtryk af Glut-1 i membranen prøver fremstillet af microvessel isoleret fra mandlige og kvindelige Sprague-Dawley rotter. Glut-1 blev fundet ved hjælp af en kanin monoklonale antistof ved 1: 500. Sekundær antistof var et monoklonalt anti-kanin IgG ved 1:40,000. Na=k+ ATPase, et plasma membran markør og kontrolelementet lastning blev fundet ved hjælp af en polyklonale anti-kanin IgG på en 1: 40.000 fortyndinger. B: Densitometric analyse af Glut-1 udtryk i membranen prøver isoleret fra mandlige og kvindelige Sprague-Dawley rotter. Resultaterne udtrykkes som mener SEM fra 6 forsøgsdyr pr. behandling gruppe. Stjerner angiver datapunkter, der er statistisk signifikant fra kontrol. En værdi af p < 0,05 blev anset for at være statistisk signifikant. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Dyr | Gennemsnitlige absorbans | Justerede absorbans | Beregnede koncentration | Faktiske koncentration |
| (Λ = 595 nm) | (mg/ml) | (mg/ml) | ||
| Mandlige 1 | 0.7967 | 0.3859 | 0.768 | 7.68 |
| Mandlige 2 | 0.7849 | 0.3741 | 0.7417 | 7,42 |
| Mandlige 3 | 0.8187 | 0.4079 | 0.8173 | 8.17 |
| Mandlige 4 | 0.7985 | 0.3877 | 0.7721 | 7,72 |
| Mandlige 5 | 0.7943 | 0.3835 | 0.7628 | 7.63 |
| Mandlige 6 | 0.7251 | 0.3143 | 0.6084 | 6.08 |
| Kvindelige 1 | 0.7114 | 0.3006 | 0.578 | 5,78 |
| Kvindelige 2 | 0.7993 | 0.3885 | 0.7738 | 7,74 |
| Kvindelige 3 | 0.8201 | 0.4093 | 0.8203 | 8.2 |
| Kvindelig 4 | 0.7526 | 0.3418 | 0.6698 | 6.7 |
| Kvindelige 5 | 0.8008 | 0,39 | 0.7773 | 7.77 |
| Kvindelige 6 | 0.7975 | 0.3867 | 0,77 | 7.7 |
Tabel 1: repræsentant Protein koncentrationer fra hjernen Microvessel præparater fremstillet af mandlige og kvindelige Sprague-Dawley rotter. Justerede absorbans værdier bestemmes ved at fratrække baggrundsabsorbansen på l = 595 nm fra gennemsnitlige absorbans værdier for hvert eksperimentelle dyr. I denne analyse, baggrundsabsorbansen var fast besluttet på at være 0.4108.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne artikel beskrives en simpel og effektiv metode til membran protein prøver fra microvessels frisk isoleret fra rotte hjernevæv. Flere metoder til isolering af rotte hjernen microvessels og/eller generations membranen præparater fra isolerede microvasculature er blevet rapporteret i litteraturen13,20,21,22 , 24. selv om den microvessel isolation protokollen beskrevet ovenfor er lignende i princippet, denne tilgang er blevet optimeret for at aktivere forberedelse af membran prøver med fremragende protein udbytte fra en enkelt eksperimentelle dyr. Dette forskud har elimineret behovet for pool microvessels fra mindst tre Sprague-Dawley rotter for at få prøver med tilfredsstillende protein berigelse til brug i forskellige tilgange til proteinanalyse. Sådanne strategier omfatter, men er ikke begrænset til, western blot analyse, dot blotting og co-immunoprecipitation. Det skal bemærkes, at praksis med at samle microvessels fra flere forsøgsdyr til at generere en enkelt prøve kraftigt reducerer mellem grupperne variabilitet. For så vidt kan microvessel samle resultere i data med reduceret spredning, der ikke repræsenterer sande variation i protein udtryk observeret i indbyggere af forsøgsdyr. Da prøver kan tilberedes fra enkelt forsøgsdyr, er den sande variation af en undersøgelse befolkning fanget, hvilket giver mulighed for eksperimentelle data fremstilles er mere repræsentativ for den patofysiologiske eller farmakologiske proces under undersøgelse. En ekstra fordel er, at microvessel membranen prøver kan forberedes ved hjælp af en reduceret antallet af forsøgsdyr.
Måske omfatter den mest kritiske overvejelser i forbindelse med gennemførelsen af denne protokol centrifugering trin. Faktisk, centrifuger kan variere mellem laboratorier på grund af deres alder, producent, og/eller generelle tilstand og integritet. Dette kan føre til betydelige udsving i de faktiske g niveau (eller rpm niveau) fra spin på spin. Denne variation i stikprøven integritet rolle kan minimeres ved centrifugering af alle prøver i en enkelt sammenlignende analyse sammen i den samme rotor på samme tid. For eksempel, hvis en rotor har kun tolv tilgængelige slots for prøveglassene, vil derefter isolation og forberedelse af microvessel prøver i et enkelt eksperiment være begrænset til tolv. Denne behandling sikrer at rede prøver er af sammenlignelig kvalitet og at enhver variation i gennemsnitlig protein udtryk mellem eksperimentelle grupper kan tildeles betingelsen behandling, selv.
En ekstra overvejelse indebærer udarbejdelse af 26% dextran løsning, hvilket er nødvendigt for adskillelsen af hjernen microvessels og hjerne parenkymalt væv via differentieret centrifugering. Dextran er en glucose polymer med en forekomst af α-1,6-forbundne enheder og typisk besidder en lineær struktur25. Det har også en høj vand-bindende kapacitet. For eksempel, bevarer 1 g af dextran 75 (dvs., dextran med en gennemsnitlig molekylevægt på 75.000 Da som bruges i denne protokol) ca 20-25 mL vand. Denne egenskab af dextran kan føre til dybtgående udfordringer opløse pulveret i vandig bufferen. Vandig opløselighed kan forbedres ved at opvarme dextran løsning til en maksimal temperatur på 40 ° C. Ved opvarmning interagerer polymeren mindre med vandmolekyler, hvorved dextran at vedtage en mindre udvidet kropsbygning (dvs. lavere grad af væskeophobning) i løsning. Opvarmning til højere temperaturer vil forårsage dextran polymer til at bryde, og det vil derfor være ineffektiv som et adskillende reagens. Derudover er det vigtigt, at pH i opløsningen dextran justeres til 7.4 umiddelbart før brug. Løsninger af 26% dextran kan opleve betydelige pH skiftehold, selv over 1-2 timer efter forberedelse. På grund af disse overvejelser, skal 26% dextran løsning være forberedt på dagen af forsøget men med tilstrækkelig tid forud for dyrkning af hjernevæv til at tillade opløsning og passende justering af pH.
En begrænsning af denne protokol involverer tilstedeværelsen af andre celletyper neurovaskulære enhed (NVU) i microvessel præparater. Ud over endotelceller består NVU af forskellige cellulære komponenter herunder glial celler (dvs, astrocytter, mikroglia), pericytes og neuroner 3,26,27. Isolering af microvessels fra gnaver hjernen viser typisk berigelse med vaskulære endotel celler; dog er udtryk for neuronal markør proteiner samt udtryk for glial fibrillære sure protein (GFAP), en etableret astrocyte markør, også observeret. Derudover er pericytes til stede i prøven præparater på grund af deres intime forening med den vaskulære endotel. På nuværende tidspunkt er det næsten umuligt at isolere hjernen microvessels fra forsøgsdyr og fjerne alle pericytes, neuroner og astrocytter. Men denne protokol har været avanceret via flere centrifugering trin således at prøverne er beriget i endothelial celler (dvs. som det fremgår af forbedret udtryk af PECAM-1 efter hver centrifugering trin) med begrænset tilstedeværelsen af andre celler typer ( dvs. som det fremgår af reduceret udtryk af neuronal markør protein synaptophysin-1 efter hver centrifugering trin).
Samlet set kan denne tilgang til isolation af rotte hjernen microvessels og forberedelsen af membran prøver tilpasses i et laboratorium, der har interesse i at studere BBB proteiner patofysiologiske eller farmakologiske betingelser. For eksempel, giver denne protokol microvessel prøver, der kan udnyttes til undersøgelse af drug transport proteiner, der udtrykkes endogent på BBB2,18. Robustheden af denne tilgang har aktiveret observation af diskrete ændringer i Oatp1a4 svar på farmakologiske stimuli, eksperimentelle data, som har meddelt design af strenge undersøgelser at vurdere transporter funktion og regulering på BBB. Protokollen beskrevet ovenfor kan også anvendes til protein analyser af stram vejkryds proteiner og adherens krydset proteiner i et forsøg på at forstå BBB fysiologiske betingelser og studere ændringer i BBB integritet i svar til patofysiologiske og farmakologiske stressfaktorer. Klart, denne protokol kan tilpasses til flere programmer i feltet BBB, og derfor udgør en enkel endnu robust og reproducerbar metode, der kan indarbejdes i BBB undersøgelser kræver proteinanalyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Institutes of Health (R01-NS084941) og Arizona biomedicinsk forskning Kommissionen (ADHS16-162406) til PTR. WA har modtaget tidligere støtte fra en PhD udnævnelse til nationale institutter for sundhed uddannelse tilskud (T32-HL007249).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | #P8340 | Component of brain microvessel buffer |
| D-mannitol | Sigma-Aldrich | #M4125 | Component of brain microvessel buffer |
| EGTA | Sigma-Aldrich | #E3889 | Component of brain microvessel buffer |
| Trizma Base | Sigma-Aldrich | #T1503 | Component of brain microvessel buffer |
| Dextran (MW 75,000) | Spectrum Chemical Mftg Corp | #DE125 | Dextran used in centrifugation steps to separate microvessels from brain parenchyma |
| Zetamine | MWI Animal Health | #501072 | General anesthetic |
| Xylazine | Western Medical Supply | #5530 | General anesthetic |
| 0.9% saline solution | Western Medical Supply | N/A | General anesthetic diluent |
| Filter Paper (12.5 cm diameter) | VWR | #28320-100 | Used for removal of meninges from brain tissue |
| Centrifuge Tubes | Sarstedt | #60.540.386 | Disposable tubes used for dextran centrifugation steps |
| Pierce™ Coomassie Plus (Bradford) Assay | ThermoFisher Scientific | #23236 | Measurement of protein concentration in membrane preparations |
| Wheaton Overhead Power Homogenizer | DWK Life Sciences | #903475 | Required for homogenization of samples |
| 10.0ml glass mortar and pestle tissue grinder | DWK Life Sciences | #358039 | Required for homogenization of samples |
| Hydrochloric Acid | Sigma-Aldrich | #H1758 | Required for pH adjustment of buffers |
| Bovine Serum Albumin | ThermoFisher Scientific | #23210 | Protein standard for Bradford Assay |
| Standard Forceps | Fine Science Tools | #91100-12 | Used for dissection of brain tissue |
| Friedman-Pearson Rongeurs | Fine Science Tools | #16020-14 | Used for opening skull to isolate brain |
| 50 ml conical centrifuge tubes | ThermoFisher Scientific | #352070 | Used for collection of brain tissue following isolation |
| Glass Pasteur Pipets | ThermoFisher Scientific | #13-678-20C | Used for aspiration of cellular debris following dextran spins |
| Ethanol, anhydrous | Sigma-Aldrich | #459836 | Used for cleaning tissue grinder; diluted to 70% with distilled water |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman-Coulter | #41121703 | Used for ultracentrifugation of samples |
References
- Rolfe, D. F., Brown, G. C. Cellular energy utilization and molecular origin of standard metabolic rate in mammals. Physiol Rev. 77 (3), 731-758 (1997).
- Brzica, H., Abdullahi, W., Ibbotson, K., Ronaldson, P. T. Role of Transporters in Central Nervous System Drug Delivery and Blood-Brain Barrier Protection: Relevance to Treatment of Stroke. J Cent Nerv Syst Dis. 9, 1179573517693802 (2017).
- Ronaldson, P. T., Davis, T. P. Targeting transporters: promoting blood-brain barrier repair in response to oxidative stress injury. Brain Res. 1623, 39-52 (2015).
- Witt, K. A., Mark, K. S., Hom, S., Davis, T. P. Effects of hypoxia-reoxygenation on rat blood-brain barrier permeability and tight junctional protein expression. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 285 (6), H2820-H2831 (2003).
- McCaffrey, G., et al. Occludin oligomeric assemblies at tight junctions of the blood-brain barrier are altered by hypoxia and reoxygenation stress. J Neurochem. 110 (1), 58-71 (2009).
- Lochhead, J. J., et al. Oxidative stress increases blood-brain barrier permeability and induces alterations in occludin during hypoxia-reoxygenation. J Cereb Blood Flow Metab. 30 (9), 1625-1636 (2010).
- Lucke-Wold, B. P., et al. Bryostatin-1 Restores Blood Brain Barrier Integrity following Blast-Induced Traumatic Brain Injury. Mol Neurobiol. 52 (3), 1119-1134 (2015).
- Campos, C. R., Ocheltree, S. M., Hom, S., Egleton, R. D., Davis, T. P. Nociceptive inhibition prevents inflammatory pain induced changes in the blood-brain barrier. Brain Res. , 6-13 (2008).
- Ronaldson, P. T., Demarco, K. M., Sanchez-Covarrubias, L., Solinsky, C. M., Davis, T. P. Transforming growth factor-beta signaling alters substrate permeability and tight junction protein expression at the blood-brain barrier during inflammatory pain. J Cereb Blood Flow Metab. 29 (6), 1084-1098 (2009).
- Seelbach, M. J., Brooks, T. A., Egleton, R. D., Davis, T. P. Peripheral inflammatory hyperalgesia modulates morphine delivery to the brain: a role for P-glycoprotein. J Neurochem. 102 (5), 1677-1690 (2007).
- Ronaldson, P. T., Finch, J. D., Demarco, K. M., Quigley, C. E., Davis, T. P. Inflammatory pain signals an increase in functional expression of organic anion transporting polypeptide 1a4 at the blood-brain barrier. J Pharmacol Exp Ther. 336 (3), 827-839 (2011).
- Pop, V., et al. Early brain injury alters the blood-brain barrier phenotype in parallel with beta-amyloid and cognitive changes in adulthood. J Cereb Blood Flow Metab. 33 (2), 205-214 (2013).
- Thompson, B. J., et al. Hypoxia/reoxygenation stress signals an increase in organic anion transporting polypeptide 1a4 (Oatp1a4) at the blood-brain barrier: relevance to CNS drug delivery. J Cereb Blood Flow Metab. 34 (4), 699-707 (2014).
- Tome, M. E., et al. P-glycoprotein traffics from the nucleus to the plasma membrane in rat brain endothelium during inflammatory pain. J Cereb Blood Flow Metab. 36 (11), 1913-1928 (2016).
- Slosky, L. M., et al. Acetaminophen modulates P-glycoprotein functional expression at the blood-brain barrier by a constitutive androstane receptor-dependent mechanism. Mol Pharmacol. 84 (5), 774-786 (2013).
- Artus, C., et al. The Wnt/planar cell polarity signaling pathway contributes to the integrity of tight junctions in brain endothelial cells. J Cereb Blood Flow Metab. 34 (3), 433-440 (2014).
- Yu, H., et al. Long-term exposure to ethanol downregulates tight junction proteins through the protein kinase Calpha signaling pathway in human cerebral microvascular endothelial cells. Exp Ther Med. 14 (5), 4789-4796 (2017).
- Abdullahi, W., Brzica, H., Ibbotson, K., Davis, T. P., Ronaldson, P. T. Bone morphogenetic protein-9 increases the functional expression of organic anion transporting polypeptide 1a4 at the blood-brain barrier via the activin receptor-like kinase-1 receptor. J Cereb Blood Flow Metab. 37 (7), 2340-2345 (2017).
- Mesev, E. V., Miller, D. S., Cannon, R. E. Ceramide 1-Phosphate Increases P-Glycoprotein Transport Activity at the Blood-Brain Barrier via Prostaglandin E2 Signaling. Mol Pharmacol. 91 (4), 373-382 (2017).
- Betz, A. L., Csejtey, J., Goldstein, G. W. Hexose transport and phosphorylation by capillaries isolated from rat brain. Am J Physiol. 236 (1), C96-C102 (1979).
- Yousif, S., Marie-Claire, C., Roux, F., Scherrmann, J. M., Decleves, X. Expression of drug transporters at the blood-brain barrier using an optimized isolated rat brain microvessel strategy. Brain Res. 1134 (1), 1-11 (2007).
- McCaffrey, G., et al. Tight junctions contain oligomeric protein assembly critical for maintaining blood-brain barrier integrity in vivo. J Neurochem. 103 (6), 2540-2555 (2007).
- Brzica, H., et al. The liver and kidney expression of sulfate anion transporter sat-1 in rats exhibits male-dominant gender differences. Pflugers Arch. 457 (6), 1381-1392 (2009).
- Ronaldson, P. T., Bendayan, R. HIV-1 viral envelope glycoprotein gp120 produces oxidative stress and regulates the functional expression of multidrug resistance protein-1 (Mrp1) in glial cells. J Neurochem. 106 (3), 1298-1313 (2008).
- Pustylnikov, S., Sagar, D., Jain, P., Khan, Z. K. Targeting the C-type lectins-mediated host-pathogen interactions with dextran. J Pharm Pharm Sci. 17 (3), 371-392 (2014).
- Obermeier, B., Daneman, R., Ransohoff, R. M. Development, maintenance and disruption of the blood-brain barrier. Nat Med. 19 (12), 1584-1596 (2013).
- Abdullahi, W., Davis, T. P., Ronaldson, P. T. Functional Expression of P-glycoprotein and Organic Anion Transporting Polypeptides at the Blood-Brain Barrier: Understanding Transport Mechanisms for Improved CNS Drug Delivery? AAPS J. 19 (4), 931-939 (2017).
