Summary
Здесь описан метод для изоляции микрососудов мозга крыс и для подготовки проб мембраны. Этот протокол имеет явное преимущество производства обогащенного microvessel образцы с приемлемым белка выход из отдельных животных. Образцы могут затем использоваться для анализа надежных белка на мозг микрососудистой эндотелия.
Abstract
Гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) является динамической барьер ткани, которая реагирует на различные раздражители, патофизиологические и фармакологические. Такие изменения, вытекающие из этих стимулов может значительно модулировать доставки лекарств в мозг и выдвижением, вызывают значительные трудности в лечении центральной нервной системы (ЦНС) заболеваний. Многие BBB изменения, которые влияют на фармакотерапии, включать белки, которые локализованы и выражены на уровне эндотелиальных клеток. Действительно такие знания о физиологии BBB в здоровье и болезни вызвал значительный интерес к изучению этих мембранных белков. С точки зрения исследований фундаментальной науки это подразумевает потребность в простой, но надежный и воспроизводимый метод для изоляции микрососудов из ткани мозга, добываемых из подопытных животных. Чтобы подготовить образцы мембраны из свежевыделенных микрососудов, важно, что препаратов примере быть обогащенный в эндотелиальных клетках, но ограничены в присутствии других типов клеток, нервно-сосудистого подразделения (т.е., астроциты, микроглии, нейронов, pericytes). Дополнительным преимуществом является возможность готовить образцы из отдельных животных с целью захвата истинной изменчивость белков в экспериментальной населения. В этой рукописи предоставляются подробности относительно метода, который используется для изоляции микрососудов мозга крыс и подготовки образцов мембраны. Microvessel обогащения, от образцов, полученных, достигается с помощью четырех шагов центрифугирования, где декстрана включен в буфере выборки. Этот протокол может быть легко адаптирована в других лабораториях для их собственных конкретных приложений. Было показано, что образцы, созданные из этого протокола дают надежные экспериментальные данные от белка анализа экспериментов, которые могут значительно облегчить понимание BBB ответы на физиологические, патофизиологические и фармакологические стимулы.
Introduction
Гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) существует на стыке центральной нервной системы (ЦНС) и кровообращения и играет важную роль в поддержании гомеостаза головного мозга. В частности BBB функций для точного управления вещества концентрации в внеклеточной жидкости мозга и чтобы эффективно поставки этих питательных веществ, которые необходимы ткани мозга выполнять значительные метаболические требования ЦНС1. Эти роли подразумевают, что BBB, который существует в первую очередь на уровне микрососудистой эндотелиальных клеток, должны обладать дискретных механизмов, которые позволяют некоторые вещества, чтобы получить доступ к паренхимы мозга, обеспечивая, что может потенциально опасные ксенобиотики накапливаются. Действительно микрососудистой эндотелиальные клетки мозга не перфорированную и выставку ограниченное Пиноцитоз, которая обеспечивает отсутствие неизбирательной проницаемости2. Кроме того эндотелиальные клетки мозга microvessel Экспресс туго junction и adherens перекрестка белки, которые действуют в форме физического «печать» между соседними эндотелиальных клеток и значительно ограничивают параклеточный диффузии веществ кровь в мозг паренхимы. Действительно селективный проницаемость эндогенных и экзогенных веществ требует функциональных выражение поглощения и измеряем транспортеры3. В целом, туго развязок, adherens развязок и транспортеры работают в концерте для поддержания уникальных барьерные свойства BBB.
BBB является динамической барьер, который реагирует на физиологические, патофизиологические и фармакологические раздражителей. Например было показано модулировать выражение критических туго Джанкшен белков (т.е., occludin, ресничный occluden-1 (ZO-1)), который связан с повышенной параклеточный проницаемости сосудистой маркеров таких гипоксии/реоксигенацию стресс как сахароза4,5,6. Аналогичные замечания были сделаны на уровне BBB в параметре черепно-мозговой травмы7 и периферические воспалительные боли8,9. Эти же заболевания также могут модулировать транспортных механизмов BBB10,11,12,,1314. Действительно, гипоксии/реоксигенацию травмы повышает функциональные выражения органических анионов, транспортировки 1a4 полипептид (Oatp1a4) на BBB, которые могут привести к значительным увеличением крови к мозгу перевозки конкретных Oatp транспорта субстратов такие как 13taurocholate и аторвастатина. BBB свойства также могут быть изменены по фармакотерапии, механизм, который может стать основой для обоих глубокие изменения в эффективности препарата в головном мозге и наркотиков лекарственных взаимодействий. Например ацетаминофен цели ядерных рецепторов сигнальных механизмов в микрососудистой эндотелиальных клеток головного мозга, увеличивает функциональные выражения критических измеряем транспортера Р-гликопротеина (P-gp) и изменяет время зависимых анальгезии предоставленных морфина, опиоидов болеутоляющие наркотиков и установленным P-gp транспорт субстрат15. Глубокое понимание BBB изменений, которые могут быть индуцированных заболеваний или наркотиков, также требует определения и характеристик конкретных механизмов регулирования, которые контролируют эти изменения. Действительно, было выявлено дискретных сигналов пути в мозг микрососудистой эндотелиальных клеток, которые контролируют молекулярных выражение туго съезда белки16,17 и транспортеры15, 18,19. Взятые вместе, эти наблюдения показывают, что сложные молекулярные пути участвуют в регуляции BBB плотные соединения и транспортеров в здоровье и болезни.
Значительные трудности в изучении BBB является абсолютным требованием простой и эффективный метод для изоляции микрососудов из ткани мозга, полученных экспериментальных животных и последующей подготовки образцов мембраны. Эти образцы должны быть готовы, так что они являются обогащенный микрососудистой эндотелиальных клеток мозга и ограничены в присутствии других типов клеток. За последние несколько лет в научной литературе13,20,,2122были зарегистрированы несколько методик для изоляции microvasculature от грызунов мозга. Эта статья описывает простой, надежный и воспроизводимый метод для изоляции микрососудов от мозга крысы и для подготовки эндотелиальной мембраны обогащенный образцов, которые могут использоваться для анализа выражения протеина. Преимуществом этого протокола изоляции microvessel является возможность получения образца препаратов высокого качества и с достаточно белка урожая от отдельных экспериментальных животных. Это дает возможность рассмотрения изменчивости между животных в выражении протеина. Такое продвижение в этом протоколе значительно улучшилась надежности ВВВ исследований потому, что теперь можно избежать чрезмерной оценки (или недооценки) истинного масштаба изменений белка на BBB. Кроме того включение нескольких шагов центрифугирования с декстрана позволяет улучшенная обогащения микрососудов в экспериментальных образцов при облегчении удаления нежелательных клеточных компонентов таких нейронов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все изложенные ниже процедуры были одобрены институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC) и соответствовать национальных институтов здравоохранения (НИЗ) и животных исследования: In Vivo экспериментов (прибытие) руководящих принципов представления докладов. Процедурные поток для протокола изображен на рисунке 1.
1. Установка для процедуры
- Подготовка мозга microvessel буфера (BMB). Начните с весом 54,66 g D-маннит, 1,90 g EGTA и базы 2-amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol (то есть, Tris) 1,46 g в чистый стакан. Добавление 1.0 Л деионизированной воды. Смешайте компоненты в BMB буфер с помощью магнитной мешалкой. После того, как решение было тщательно перемешивают, отрегулируйте рН 7,4, используя 1.0 М HCl.
- Готовят раствор 26% декстрана (75 000 МВт) (w/v) до обезболивающим животных. Приготовляют раствор декстрана, как описано в следующих шагах.
Примечание: Крайне важно подготовить это решение досрочно, потому что декстран может занять примерно 1,5-2 ч раствориться в водный буфера.- Весят из пудры декстрана (26 г на 100 мл буфера) в чистый стакан.
- Отмерьте соответствующий объем БМБ и обойтись в отдельный, чистый стакан.
- Медленно залейте BMB в стакан, содержащей пудры декстрана. Вручную смесь пудры декстрана во время разливки BMB, используя стекло перемешать стержня.
- Отрегулируйте пэ-аш до 7,4 с 1,0 М HCl непосредственно перед использовать.
Примечание: Типичный изоляции микрососудов мозга от 12 отдельных крысах Sprague-Dawley (мужчина или женщина; 3-месячного возраста; 200-250 g) требует 200 мл раствора декстрана (т.е., 52 g декстрана в 200 мл BMB).
2. Добыча ткани мозга от крысах Sprague-Dawley
- После желаемого экспериментальное лечение, анестезировать крысах Sprague-Dawley, с использованием кетамина (50 мг/кг; и.п. 2,5 мл/кг) и ксилазина (10 мг/мл; 2,5 мл/кг I, p.). Разбавьте кетамина и ксилазина в солевой раствор 0,9% для окончательного концентрации 20 мг/мл и 4,0 мг/мл соответственно. Усыпить животных путем обезглавливания, используя заостренный гильотинные IACUC руководящим принципам. Используйте ту же процедуру для мужчин и женщин Sprague-Dawley крыс.
- Иссечения кожи от крыс черепа, сделав один поперечного раскроя, используя Ножницы хирургические.
- С помощью rongeurs, тщательно удалить пластину черепа и подвергнуть мозг.
- Удаление мозга с помощью шпателя. Отсоединить головного мозга и изолированные мозговой ткани в конической Тюбик 50 мл, содержащие 5 мл BMB. Добавление 1.0 мкл ингибитора протеазы, коктейль 1.0 мл BMB буфера непосредственно перед использованием.
3. мозг обработка
- Передать ткани мозга от конической Тюбик 50 мл чистого Петри.
- Аккуратно с помощью щипцов, ролл мозг на 12,5 см диаметр фильтровальной бумаги для удаления внешних оболочек мозга, которые слабо соблюдаются коры головного мозга. Аккуратно нажмите ткани мозга против фильтровальная бумага и рулон ткани снова. Включите фильтр бумага часто во время этого шага.
- Сосудистое сплетение отделите от полушарий, используя пинцет.
Примечание: Сосудистое сплетение появляется как ясно мембранные ткани, локализованных на поверхности желудочков головного мозга. - Нежно придавить мозговой ткани и удалить оставшиеся мозговых оболочек и обонятельные луковицы, используя пинцет.
- Поместите ткани коры мозга в ступке охлажденный бокал. Добавьте 5,0 мл BMB содержащий ингибитор протеазы коктейль с раствором.
- С использованием гомогенизатора электропередачи, гомогенизировать ткани мозга с помощью 15 вверх и вниз штрихов при 3700 об/мин. Выполните усреднения с помощью мясорубки ткани ступку и пестик 10 мл. Между гомогенизации каждого индивидуального образца чистая пестик с помощью 70% этиловом спирте.
Примечание: Гомогенизации штрихи должны согласовываться в рамках ПАСЕ и величины. - Налейте помечены пробирок огневки.
4. центрифугирования шаги
- Добавьте 8.0 мл раствора 26% декстрана в каждой меткой центрифуги трубка, содержащая мозга огневки.
- Инвертировать трубки дважды и затем тщательно вихревой образца. Проводить vortexing каждого образца с использованием множественных углов для обеспечения тщательного перемешивания раствора огневки мозга с 26% декстрана раствором.
- Центрифуга образцы на 5000 x g 15 мин при 4 ° C.
Примечание: Для некоторых анализов, полезно сравнить микрососудов мозга с паренхимы мозга. Оценки выражения протеина в паренхиме мозга следует требуется, супернатант от этого шага центрифугирования (то есть, мозг Паренхиматозный фракция) могут быть собраны и температуре-80 ° C для использования в будущем. - Удалите с помощью вакуум отсос супернатант и стеклянной пипетки Пастера.
Примечание: Необходимо проявлять осторожность не беспокоить гранулы. В противном случае будет сокращено количество мозга микрососудов сбор, который значительно снизится урожайность белка от этой процедуры. - Ресуспензируйте гранулы в 5,0 мл BMB содержащий ингибитор протеазы коктейль (т.е., 1.0 мкл ингибитор протеазы коктейль 1.0 мл BMB буфера). Вихрь гранулы для обеспечения тщательного перемешивания.
- Добавьте 8.0 мл 26% декстрана в каждой пластиковых пробирок и вихрь, как описано в шагах 4.1-4.2 настоящего Протокола.
- Центрифуга образцы на 5000 x g 15 мин при 4 ° C.
- С помощью термос и стеклянной пипетки, аспирационная супернатант и убедитесь, что гранулы, содержащие microvessel мозга не нарушается.
Примечание: Избыток материала, которое присоединилось к стенкам трубки не содержат микрососудов и должны быть тщательно очищены и удалены. - Повторите шаги 4,5-4,8 на дополнительные два раза.
- После 4 декстрана центрифугирования шаги завершены, добавьте 5,0 мл BMB каждой лепешки и вихревой Ресуспензируйте образца.
Примечание: После завершения шага 4.10, весь микрососудов могут быть собраны для анализа белка локализации. Это может быть достигнуто, приняв 50 мкл аликвота вновь приостановлено microvessel гранул и размытие на стекло микроскопа. Микрососудов затем тепло исправлена на 95 ° C в течение 10 мин на Отопление блока после фиксации в ледяной этанола за дополнительные 10 минут слайды могут затем сохраняться в 4 ° C до тех пор, пока требуется для обработки изображений исследования.
5. Ultracentrifugation подготовить образцы всего мозга микрососудистой мембран
- Передача образцов в гомогенизатор охлажденный бокал.
- С использованием гомогенизатора электропередачи, гомогенизировать мозговой ткани, с помощью 8-10 вверх и вниз штрихов при 3000 об/мин. Гомогенизация осуществляется с использованием 10 мл ступку и пестик ткани точильщика. Чистая пестик, используя после гомогенизации каждого индивидуального образца на 70% спирте.
- Передача образцов для очистки ультрацентрифуга трубы. Количество и вес каждого индивидуального трубки. Баланс и пары труб перед погрузкой в ротор Ультрацентрифуги.
Примечание: Все весом и сопряжения ультрацентрифуга труб должны проводиться с шапки на обеспечить точное измерение веса трубки. - Центрифуга образцы на 150 000 x g за 1 час при 4 ° C.
- С помощью термос и стеклянной пипетки Пастера, аспирационная супернатант использовать осторожно, чтобы не нарушить Пелле Капиллярные мембраны.
- Основываясь на размер гранул, добавьте соответствующий объем буфера для хранения, который состоит из деионизированной воды и BMB в соотношении 1:1 (v/v). Как правило окатыши являются высокомобильна в 400-500 мкл буфера для хранения. Добавьте коктейль ингибитор протеазы в буфер хранения в соотношении 1,0 мкл на 1,0 мл буфера хранения.
- Вихревой образцов Ресуспензируйте Пелле в буфер хранения.
- С помощью стеклянной пипетки Пастера, капиллярные мембраны образцы передать пробки microcentrifuge меткой 1,5 мл.
- Перевал образца через иглу шприца 5 x для обеспечения образец тщательно перемешивают и что существуют без клеточных агрегатов.
- Хранить образцы на-80 ° C до тех пор, пока необходимые для анализа.
Примечание: Содержание белка каждого образца мембраны microvessel измеряется с помощью метода Брэдфорд.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Экспериментальный поток для изоляции микрососудов мозга крыс и для подготовки проб мембраны microvessel показан на рисунке 1. С помощью процедуры, представленные здесь, свидетельствует успешное изоляции нетронутыми микрососудов от мозга крысы (рис. 2A). Эти суда были получены после завершения центрифугирования с декстрана и сразу же до начала ultracentrifugation подготовить образцы мембраны (т.е. После завершения шага 4.10). На этом изображении microvessel окрашивается с помощью антитело против Oatp1a4, транспортер, что было показано, чтобы быть хорошо выражена на плазматической мембране мозга микрососудистой эндотелиальных клеток,2,11,,13, 18. Используя Западный анализ помаркой (рис. 2B), мембраны, которые были показаны препараты из микрососудов, добываемых из самок Sprague-Dawley быть обогащен тромбоцитов эндотелиальных клеток адгезии молекулы-1 (PECAM-1; также известен как CD31), маркер белка для мозг microvasculature. PECAM-1 является ингибирующее ко-рецептор участвующих в Т-клеток и B-клеточной сигнализации, сильно выраженный на плазматической мембране эндотелиальных клеток сосудистой. В процессе оптимизации этого протокола PECAM обогащения наблюдалась в мембраны образцы подготовлены с использованием двух и четырех шагов центрифугирования декстрана. Как показано на рисунке 2B, не было разницы в PECAM выражении между образцами, подготовлен с использованием этих различных центрифугирования шаги; Однако, четыре декстрана спинов привели в улучшение выражение эндотелиальной транспортных белков, который указывает улучшение microvessel обогащения в образцах. Кроме того использование четырех декстраны спинов Улучшено удаление нежелательных клеточных компонентов, как указано выражением снижение нейронов маркер белков, таких как synaptophysin18. Таким образом все последующие подготовка к microvessel мембран головного мозга были проведены с использованием четырех шагов центрифугирования декстрана. В наших экспериментах Западная помарка составляющих белка тубулина микротрубочек был использован как элемент управления загрузки. Как определяется assay протеина Брадфорд, мембраны препараты обычно дают концентрацию белка в диапазоне от 5,0 мг/мл и 10,0 мг/мл. Представитель белка количественной оценки результаты изображены в таблице 1. Эти ценности белков были определены на основе стандартной кривой, который был создан с помощью бычьим сывороточным альбумином (БСА; 2,0 мг/мл) в стандартной комплектации (рис. 3). Образцы протеина разводили в 10 раз в assay Брадфорд.
После количественного определения белка microvessel мембраны образцы могут быть использованы для биохимических методологий для анализа белка как Западный анализ помаркой, помарки точка или co иммунопреципитация. На рисунке 4A изображает представитель западную помарку для BBB транспортного белка глюкозы транспортер-1 (Glut-1) где были проанализированы образцы из таблицы 1 . Очистить одной полосы на соответствующие молекулярный вес (т.е., согласно прогнозу, 54 кДа) для этой весьма выразил BBB белка были обнаружены в каждом образце мембраны. Каждый индивидуальный Лейн в этом иммуноблоттинга представляет microvessel мембраны образец подготовлен единый экспериментальных животных. Равных белка в каждом Лейн был определен с помощью АТФазы натрия калия (т.е., Na+/k+ АТФаза; предсказал молекулярный вес = 113 кДа) как элемент управления загрузки. Как показано на рисунке 4В, выше выражение Glut-1 на уровне BBB было отмечено у самцов крыс по сравнению с их коллеги-женщины. Никакой разницы в выражении Na+/k+ АТФаза было отмечено между животными мужского и женского пола. Для этого денситометрических анализа полосы были предел, с использованием ImageJ программного обеспечения.
Рисунок 1: изложение процедур и протоколов для изоляции микрососудов мозга крысы и подготовить образцы мембраны. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: репрезентативных данных, показывая нетронутыми microvessel и проявление сосудистого эндотелия белков маркер. Ответ: Пятнать иммунофлюоресценции показал локализации Oatp1a4, транспортер, что было показано, чтобы быть хорошо выражена на BBB, в нетронутой мозга microvessel, изолированные, как описано в настоящем Протоколе. Локализация Oatp1a4 был обнаружен с помощью конкретных кролика polyclonal антитела против Oatp1a4 в разведении 1:10. Вторичное антитело было флуоресцентные конъюгированных анти кролик IgG, который был использован при разбавлении 1: 300. Шкалы бар = 7,5 мкм. B: Западный анализ помаркой продемонстрировал чистоты образцов microvessel, показывая обогащения конкретных эндотелиальных клеток маркер белка PECAM-1, который был обнаружен с помощью мыши моноклональные антитела в разведении 1: 100. Вторичное антитело было анти мыши IgG при разбавлении картографирования. BH = мозга огневки, MV = фракции сырой microvessel, МВМ = мозга microvessel мембраны. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: представитель калибровочной кривой для Assay протеина Брадфорд. Бычьим сывороточным альбумином (БСА) был использован в качестве стандарта и разбавляют до следующих концентраций: 0, 0,125, 0,25, 0,50, 0.75, 1.0, 1.5 и 2.0 мг/мл. Была измерена поглощения = 595 Нм. Каждая точка данных представляет в среднем три поглощения чтений на концентрацию BSA. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: представитель западной помарки, показаны половые различия в Glut-1 выражение в мембраны образцы подготовлены от изолированных микрососудов мозга крысы. A: Западный анализ помаркой показывает выражение Glut-1 в мембраны образцов, приготовленных из microvessel, изолированных от самцов и самок крыс Sprague-Dawley. Избыток-1 был обнаружен с помощью моноклональных антител кролика при разбавлении 1: 500. Вторичное антитело было моноклонального анти кролик IgG в 1:40,000 разрежения. Na=/k+ АТФаза, маркер плазматической мембраны и контроль погрузки, был обнаружен с использованием поликлональных IgG против кролика в разведениях 1: 40.000. B: Денситометрических анализ Glut-1 выражение в образцах мембраны, изолированный от самцов и самок крыс Sprague-Dawley. Результаты выражаются как означает SEM от 6 подопытных животных в группе лечения. Звездочки показывают точек данных, которые являются статистически значимыми из элемента управления. Считается, что значение p < 0,05 был статистически значимым. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Животное | Средняя Absorbance | Скорректированные Absorbance | Расчетные концентрации | Фактическая концентрация |
| (Λ = 595 Нм) | (мг/мл) | (мг/мл) | ||
| Мужчина 1 | биржевым курсом 0,7967 | 0.3859 | 0.768 | 7.68 |
| Кобель 2 | 0,7849 | 0.3741 | 0.7417 | 7.42 |
| Мужской 3 | 0.8187 | 0.4079 | 0.8173 | 8.17 |
| Мужской 4 | 0.7985 | 0.3877 | 0.7721 | 7.72 |
| Мужчины 5 | 0.7943 | 0.3835 | 0.7628 | 7.63 |
| Мужчины 6 | 0.7251 | 0.3143 | 0.6084 | 6.08 |
| Женские 1 | 0.7114 | 0.3006 | 0,578 | 5.78 |
| Женские 2 | 0,7993 | 0.3885 | 0.7738 | 7.74 |
| Женские 3 | 0.8201 | 0.4093 | 0.8203 | 8.2 |
| Женский 4 | 0.7526 | 0.3418 | 0.6698 | 6.7 |
| Девушки 5 | 0.8008 | 0.39 | 0.7773 | 7.77 |
| Женская 6 | 0,7975 | 0.3867 | 0,77 | 7.7 |
Таблица 1: концентрации белка представитель от мозга Microvessel препараты производным от мужского и женского пола Sprague-Dawley крысы. Скорректированные поглощения значения определяются вычитанием фона поглощения на l = 595 Нм от средней оптической плотности значений для каждого экспериментальных животных. В этот assay фон поглощения был определен 0.4108.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этой статье описан простой и эффективный метод подготовки образцы протеина мембраны из микрососудов, свежезаваренным изолированы от ткани мозга крысы. Несколько подходов для изоляции микрососудов мозга крыс и/или поколение мембранных препаратов от изолированных microvasculature поступили в литературе13,20,,2122 , 24. Хотя в принципе аналогично Протокол изоляции microvessel, описанные выше, этот подход был оптимизирован для подготовки образцов мембраны с отличным белка урожая от одного экспериментальных животных. Это заранее устранила необходимость в бассейн микрососудов от по крайней мере три крысах Sprague-Dawley для получения образцов удовлетворительное белка обогащения для использования в различных подходов для анализа белка. Такие подходы включают, но не ограничиваются, Западный анализ помаркой, точка помарки и co иммунопреципитация. Следует отметить, что практика объединения микрососудов из нескольких экспериментальных животных для создания одного образца значительно уменьшает межгрупповых изменчивости. В этой степени microvessel объединение может привести к данных с снижение распространения, которые не представляют истинное изменчивости в выражении протеина, наблюдается в популяции экспериментальных животных. Поскольку образцы могут быть получены из одного экспериментальных животных, захватывается истинный изменчивость исследования населения, который позволяет для экспериментальных данных получить это более представительным патофизиологические или фармакологических процесса под экзамен. Дополнительным преимуществом является, что образцы microvessel мембрана может быть подготовлен с использованием меньшего числа подопытных животных.
Возможно наиболее важным рассмотрение в осуществлении настоящего протокола включает в себя шаги центрифугирования. Действительно центрифуги могут отличаться между лабораториями из-за их возраста, производитель, и/или общего состояния и целостности. Это может привести к значительные различия в уровне уровень фактической g (или об/мин) от спина спина. Роль этой вариации в целостности образца могут быть минимизированы центрифугированием всех образцов в одном сравнительный анализ вместе в том же ротор в то же время. Например если ротор имеет только двенадцать разъемов для образца трубки, то изоляции и подготовки образцов microvessel в индивидуальный эксперимент будет ограничено до двенадцати. Это гарантирует, что подготовлены образцы имеют сопоставимое качество и что любые изменчивости в выражении означает белка между экспериментальных групп может быть назначен для лечения состояние самой.
Дополнительное рассмотрение предполагает подготовку решения 26% декстрана, который необходим для разделения мозга микрососудов и Паренхиматозный ткани мозга через дифференциального центрифугирования. Декстран-полимер глюкозы с преобладанием α-1,6-связаны единиц и обычно обладает линейной структуры25. Он также вмещает высокая вода привязки. Например 1 g декстрана 75 (то есть, декстран со средней молекулярной массой 75 000 да как используется в настоящем протоколе) сохраняет примерно 20-25 мл воды. Это свойство декстрана может привести к глубокой проблемы в растворении порошка в водный буфер. Водный растворимости может быть улучшена путем нагревать решение декстрана максимальная температура 40 ° C. При нагревании, полимер взаимодействует с молекулами воды, тем самым вызывая декстрана принять менее расширенный конформацию (т.е., более низкую степень удержания воды) в растворе. Отопление для более высоких температур вызовет декстрана полимер сломать и, таким образом, это будет неэффективно как разделительные реагента. Кроме того важно, что рН раствора декстрана скорректирована до 7,4 непосредственно перед использованием. Решения 26% декстрана могут испытывать значительные рН сдвиги, даже более чем 1-2 часа после приготовления. Из этих соображений 26% декстрана раствор должен быть готов в день эксперимента, но с достаточно времени до изоляции ткани головного мозга позволяют для растворения и соответствующую корректировку рН.
Ограничение этого протокола предполагает наличие других типов клеток, нервно-сосудистого единицы (NVU) в microvessel препаратов. В дополнение к эндотелиальных клеток NVU состоит из различных клеточных компонентов, включая глиальные клетки (то есть, астроциты, микроглии), pericytes и нейронов 3,,2627. Изоляция микрососудов от грызунов мозга обычно показывает обогащения с сосудистой эндотелиальных клеток; Однако наблюдается также выражение нейрональных маркер белков, а также выражение глиальных фибриллово кислой белка (СВМС), маркер установленным экзоцитоз. Кроме того pericytes присутствуют в подготовке образца из-за их интимной связи с эндотелия. В настоящее время это практически невозможно изолировать мозга микрососудов из подопытных животных и ликвидировать все pericytes, нейроны и астроциты. Однако этот протокол было выдвинуто через несколько шагов центрифугирования, так что образцы обогащаются в эндотелиальных клетках (т.е., как указано выражением улучшение после каждого шага центрифуги PECAM-1) с ограниченным присутствием других (типы клеток т.е. как указано снижение выражение нейрональных маркер белка synaptophysin-1 после каждого шага центрифугирования).
В целом этот подход для изоляции микрососудов мозга крыс и для подготовки проб мембраны может быть адаптирована в любой лаборатории с интересом в изучении BBB белки патофизиологические или фармакологических условиях. Например этот протокол обеспечивает microvessel образцы, которые могут быть использованы для изучения наркотиков транспортных белков, которые выражаются эндогенно BBB2,18. Обоснованность такого подхода позволило наблюдения дискретные изменения в Oatp1a4 в ответ на раздражители фармакологических, экспериментальных данных, который сообщил дизайн строгих исследований для оценки функции транспортер и регулирование на уровне BBB. Протокол, описанные выше может также применяться к анализы белка туго Джанкшен белков и adherens перекрестка белков в усилии понять BBB в физиологических условиях и изучить изменения в целостности BBB в ответ на патофизиологические и фармакологической стресс. Очевидно этот протокол может быть адаптирована для нескольких приложений в поле BBB и, таким образом, представляет собой простые, но надежные и воспроизводимый метод, который могут быть включены в исследования BBB, требующих анализа белка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грантов от национальных институтов здравоохранения (R01-NS084941) и биомедицинских исследований Комиссии Аризона (ADHS16-162406) PTR. WA получил прошлом поддержки от предварительного докторских назначение национальных институтов здравоохранения обучения Грант (T32-HL007249).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | #P8340 | Component of brain microvessel buffer |
| D-mannitol | Sigma-Aldrich | #M4125 | Component of brain microvessel buffer |
| EGTA | Sigma-Aldrich | #E3889 | Component of brain microvessel buffer |
| Trizma Base | Sigma-Aldrich | #T1503 | Component of brain microvessel buffer |
| Dextran (MW 75,000) | Spectrum Chemical Mftg Corp | #DE125 | Dextran used in centrifugation steps to separate microvessels from brain parenchyma |
| Zetamine | MWI Animal Health | #501072 | General anesthetic |
| Xylazine | Western Medical Supply | #5530 | General anesthetic |
| 0.9% saline solution | Western Medical Supply | N/A | General anesthetic diluent |
| Filter Paper (12.5 cm diameter) | VWR | #28320-100 | Used for removal of meninges from brain tissue |
| Centrifuge Tubes | Sarstedt | #60.540.386 | Disposable tubes used for dextran centrifugation steps |
| Pierce™ Coomassie Plus (Bradford) Assay | ThermoFisher Scientific | #23236 | Measurement of protein concentration in membrane preparations |
| Wheaton Overhead Power Homogenizer | DWK Life Sciences | #903475 | Required for homogenization of samples |
| 10.0ml glass mortar and pestle tissue grinder | DWK Life Sciences | #358039 | Required for homogenization of samples |
| Hydrochloric Acid | Sigma-Aldrich | #H1758 | Required for pH adjustment of buffers |
| Bovine Serum Albumin | ThermoFisher Scientific | #23210 | Protein standard for Bradford Assay |
| Standard Forceps | Fine Science Tools | #91100-12 | Used for dissection of brain tissue |
| Friedman-Pearson Rongeurs | Fine Science Tools | #16020-14 | Used for opening skull to isolate brain |
| 50 ml conical centrifuge tubes | ThermoFisher Scientific | #352070 | Used for collection of brain tissue following isolation |
| Glass Pasteur Pipets | ThermoFisher Scientific | #13-678-20C | Used for aspiration of cellular debris following dextran spins |
| Ethanol, anhydrous | Sigma-Aldrich | #459836 | Used for cleaning tissue grinder; diluted to 70% with distilled water |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman-Coulter | #41121703 | Used for ultracentrifugation of samples |
References
- Rolfe, D. F., Brown, G. C. Cellular energy utilization and molecular origin of standard metabolic rate in mammals. Physiol Rev. 77 (3), 731-758 (1997).
- Brzica, H., Abdullahi, W., Ibbotson, K., Ronaldson, P. T. Role of Transporters in Central Nervous System Drug Delivery and Blood-Brain Barrier Protection: Relevance to Treatment of Stroke. J Cent Nerv Syst Dis. 9, 1179573517693802 (2017).
- Ronaldson, P. T., Davis, T. P. Targeting transporters: promoting blood-brain barrier repair in response to oxidative stress injury. Brain Res. 1623, 39-52 (2015).
- Witt, K. A., Mark, K. S., Hom, S., Davis, T. P. Effects of hypoxia-reoxygenation on rat blood-brain barrier permeability and tight junctional protein expression. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 285 (6), H2820-H2831 (2003).
- McCaffrey, G., et al. Occludin oligomeric assemblies at tight junctions of the blood-brain barrier are altered by hypoxia and reoxygenation stress. J Neurochem. 110 (1), 58-71 (2009).
- Lochhead, J. J., et al. Oxidative stress increases blood-brain barrier permeability and induces alterations in occludin during hypoxia-reoxygenation. J Cereb Blood Flow Metab. 30 (9), 1625-1636 (2010).
- Lucke-Wold, B. P., et al. Bryostatin-1 Restores Blood Brain Barrier Integrity following Blast-Induced Traumatic Brain Injury. Mol Neurobiol. 52 (3), 1119-1134 (2015).
- Campos, C. R., Ocheltree, S. M., Hom, S., Egleton, R. D., Davis, T. P. Nociceptive inhibition prevents inflammatory pain induced changes in the blood-brain barrier. Brain Res. , 6-13 (2008).
- Ronaldson, P. T., Demarco, K. M., Sanchez-Covarrubias, L., Solinsky, C. M., Davis, T. P. Transforming growth factor-beta signaling alters substrate permeability and tight junction protein expression at the blood-brain barrier during inflammatory pain. J Cereb Blood Flow Metab. 29 (6), 1084-1098 (2009).
- Seelbach, M. J., Brooks, T. A., Egleton, R. D., Davis, T. P. Peripheral inflammatory hyperalgesia modulates morphine delivery to the brain: a role for P-glycoprotein. J Neurochem. 102 (5), 1677-1690 (2007).
- Ronaldson, P. T., Finch, J. D., Demarco, K. M., Quigley, C. E., Davis, T. P. Inflammatory pain signals an increase in functional expression of organic anion transporting polypeptide 1a4 at the blood-brain barrier. J Pharmacol Exp Ther. 336 (3), 827-839 (2011).
- Pop, V., et al. Early brain injury alters the blood-brain barrier phenotype in parallel with beta-amyloid and cognitive changes in adulthood. J Cereb Blood Flow Metab. 33 (2), 205-214 (2013).
- Thompson, B. J., et al. Hypoxia/reoxygenation stress signals an increase in organic anion transporting polypeptide 1a4 (Oatp1a4) at the blood-brain barrier: relevance to CNS drug delivery. J Cereb Blood Flow Metab. 34 (4), 699-707 (2014).
- Tome, M. E., et al. P-glycoprotein traffics from the nucleus to the plasma membrane in rat brain endothelium during inflammatory pain. J Cereb Blood Flow Metab. 36 (11), 1913-1928 (2016).
- Slosky, L. M., et al. Acetaminophen modulates P-glycoprotein functional expression at the blood-brain barrier by a constitutive androstane receptor-dependent mechanism. Mol Pharmacol. 84 (5), 774-786 (2013).
- Artus, C., et al. The Wnt/planar cell polarity signaling pathway contributes to the integrity of tight junctions in brain endothelial cells. J Cereb Blood Flow Metab. 34 (3), 433-440 (2014).
- Yu, H., et al. Long-term exposure to ethanol downregulates tight junction proteins through the protein kinase Calpha signaling pathway in human cerebral microvascular endothelial cells. Exp Ther Med. 14 (5), 4789-4796 (2017).
- Abdullahi, W., Brzica, H., Ibbotson, K., Davis, T. P., Ronaldson, P. T. Bone morphogenetic protein-9 increases the functional expression of organic anion transporting polypeptide 1a4 at the blood-brain barrier via the activin receptor-like kinase-1 receptor. J Cereb Blood Flow Metab. 37 (7), 2340-2345 (2017).
- Mesev, E. V., Miller, D. S., Cannon, R. E. Ceramide 1-Phosphate Increases P-Glycoprotein Transport Activity at the Blood-Brain Barrier via Prostaglandin E2 Signaling. Mol Pharmacol. 91 (4), 373-382 (2017).
- Betz, A. L., Csejtey, J., Goldstein, G. W. Hexose transport and phosphorylation by capillaries isolated from rat brain. Am J Physiol. 236 (1), C96-C102 (1979).
- Yousif, S., Marie-Claire, C., Roux, F., Scherrmann, J. M., Decleves, X. Expression of drug transporters at the blood-brain barrier using an optimized isolated rat brain microvessel strategy. Brain Res. 1134 (1), 1-11 (2007).
- McCaffrey, G., et al. Tight junctions contain oligomeric protein assembly critical for maintaining blood-brain barrier integrity in vivo. J Neurochem. 103 (6), 2540-2555 (2007).
- Brzica, H., et al. The liver and kidney expression of sulfate anion transporter sat-1 in rats exhibits male-dominant gender differences. Pflugers Arch. 457 (6), 1381-1392 (2009).
- Ronaldson, P. T., Bendayan, R. HIV-1 viral envelope glycoprotein gp120 produces oxidative stress and regulates the functional expression of multidrug resistance protein-1 (Mrp1) in glial cells. J Neurochem. 106 (3), 1298-1313 (2008).
- Pustylnikov, S., Sagar, D., Jain, P., Khan, Z. K. Targeting the C-type lectins-mediated host-pathogen interactions with dextran. J Pharm Pharm Sci. 17 (3), 371-392 (2014).
- Obermeier, B., Daneman, R., Ransohoff, R. M. Development, maintenance and disruption of the blood-brain barrier. Nat Med. 19 (12), 1584-1596 (2013).
- Abdullahi, W., Davis, T. P., Ronaldson, P. T. Functional Expression of P-glycoprotein and Organic Anion Transporting Polypeptides at the Blood-Brain Barrier: Understanding Transport Mechanisms for Improved CNS Drug Delivery? AAPS J. 19 (4), 931-939 (2017).
