Summary
Här beskrivs en metod för isolering av råtta hjärnan microvesselsna och beredning av membran prover. Detta protokoll har den klara fördelen att producera berikad microvessel prover med acceptabel protein avkastning från enskilda djur. Prover kan sedan användas för robust protein analyser på hjärnan mikrovaskulära endotelet.
Abstract
På blod - hjärnbarriären (BBB) är en dynamisk barriär vävnad som reagerar på olika patofysiologiska och farmakologiska stimuli. Sådana förändringar till följd av dessa stimuli kan modulera drogen leverans till hjärnan och, i förlängningen orsaka betydande utmaningar för behandling av centrala nervsystemet (CNS) sjukdomar. Många BBB ändringar som påverkar farmakoterapi, involverar proteiner som är lokaliserad och uttryckt på nivån av endotelceller. Ja, sådan kunskap på BBB fysiologi vid hälsa och sjukdom har väckt stort intresse i studien av dessa membranproteiner. Från grundläggande vetenskap forskning synpunkt innebär detta ett krav på en enkel men robust och reproducerbar metod för isolering av microvesselsna från hjärnvävnaden skördas från försöksdjur. För att förbereda membran prover från färska isolerade microvesselsna, är det viktigt att provet preparat vara berikad i endotelceller men begränsad i närvaro av andra celltyper neurovaskulära enheten (dvs, astrocyter, mikroglia, neuroner, pericyter). Ytterligare en fördel är möjligheten att förbereda prover från enskilda djur för att fånga sant variabilityen av proteinuttryck i en experimentell befolkning. I detta manuskript finns information om en metod som används för isolering av råtta hjärnan microvesselsna och beredning av membran prover. Microvessel berikning, från prover, uppnås genom att använda fyra centrifugering steg där dextran ingår i provet bufferten. Detta protokoll kan enkelt anpassas genom andra laboratorier för sina egna specifika tillämpningar. Prover som genereras från detta protokoll har visat sig ge robusta experimentella data från protein analys experiment som kan vara till stor hjälp förståelsen av BBB Svaren till fysiologiska, patofysiologiska och farmakologiska stimuli.
Introduction
På blod - hjärnbarriären (BBB) finns på gränssnittet mellan det centrala nervsystemet (CNS) och den systemiska cirkulationen och spelar en viktig roll i upprätthållandet av hjärnan homeostas. Specifikt, BBB funktioner för exakt kontroll koncentrationsgradient koncentrationer i hjärnan extracellulär vätska och att effektivt tillhandahålla de näringsämnen som krävs av hjärnvävnaden att uppfylla de stora metabola krav av CNS1. Dessa roller innebär att BBB, som finns främst på nivån på de mikrovaskulära endotelceller, måste ha diskreta mekanismer som gör att vissa ämnen för att komma åt hjärnparenkymet samtidigt att potentiellt skadliga xenobiotika kan inte ackumuleras. Faktiskt, hjärnan mikrovaskulära endotelceller är inte fenestrated och uppvisar begränsad pinocytosis, vilket garanterar en brist på icke-selektiva permeabilitet2. Dessutom express hjärnan microvessel endotelceller tight junction och adherens junction-proteiner som agerar att bilda en fysisk ”tätning” mellan intilliggande endotelceller och kraftigt begränsa paracellular spridning av blodburna ämnen in hjärnan parenkymet. Faktiskt, selektiv permeabilitet av endogena och exogena ämnen kräver funktionella uttryck för upptag och efflux transportörer3. Övergripande, tight junctions, adherens föreningspunkter och transportörer fungerar i samförstånd för att upprätthålla de unika barriäregenskaper BBB.
BBB är en dynamisk barriär som svarar på fysiologiska, patofysiologiska och farmakologiska stimuli. Till exempel har hypoxi/reoxygenation stress visat att modulera uttrycket av kritiska åtsittande föreningspunkt proteiner (dvs. occludin, zonulae occluden-1 (ZO-1)) som är associerad med ökad paracellular permeabilitet för vaskulär markörer sådana som sackaros4,5,6. Liknande observationer har gjorts på BBB i fastställandet av traumatisk hjärnan skada7 och perifer inflammatorisk smärta8,9. Dessa samma sjukdomar kan också modulera transportmekanismer på BBB10,11,12,13,14. Faktiskt, hypoxi/reoxygenation skada förbättrar funktionell uttryck för organisk anjontransporterande polypeptid 1a4 (Oatp1a4) på BBB, vilket kan leda till betydande ökningar i blod-till-hjärnan transport av särskilda Oatp transport substrat såsom cotransporting och atorvastatin13. BBB egenskaper kan också ändras av farmakoterapi själv, en mekanism som kan ligga till grund för både djupgående förändringar i drogen effektiviteten i hjärnan och för läkemedelsinteraktioner. Till exempel paracetamol mål nukleär receptor signalering mekanismer i hjärnan mikrovaskulära endotelceller, ökar funktionell uttryck för den kritiska transportproteinet P-glykoprotein (P-gp), och ändrar tidsberoende analgesi ges av morfin, transport en opioid smärtstillande läkemedel och etablerade P-gp substrat15. En grundlig förståelse av BBB förändringar, som kan induceras av sjukdomar eller av droger, kräver också identifiering och karakterisering av särskilda reglerande mekanismer som styr dessa ändringar. Faktiskt, diskreta signalvägar har identifierats i hjärnan mikrovaskulära endotelceller som styr molekylära uttrycket åtsittande föreningspunkt proteiner16,17 och transportörer15, 18,19. Sammantaget tyder dessa observationer på att komplexa molekylära vägar är inblandade i regleringen av BBB åtsittande föreningspunkter och transportörer i hälsa och sjukdom.
En stor utmaning i studien av BBB är det absoluta kravet på en enkel och effektiv metod för isolering av microvesselsna från hjärnvävnaden som härrör från försöksdjur och efterföljande beredning av membran prover. Dessa prover måste förberedas så att de är både berikad i hjärnan mikrovaskulära endotelceller och begränsad i närvaro av andra celltyper. Över flera år, har flera metoder för isolering av mikrocirkulation från gnagare hjärnan rapporterats i vetenskaplig litteratur13,20,21,22. Denna artikel beskriver en enkel, robust, och reproducerbar metod för isolering av microvesselsna från råtthjärna och för beredning av endothelial membran-berikad prover som kan användas för analys av proteiner. En fördel med detta microvessel isolering protokoll är förmågan att få provet preparat av hög kvalitet och med tillräckligt protein avkastning från ett enskilt experimentella djur. Detta gör övervägandet av variabilitet i proteinuttryck. Sådant förskott i detta protokoll har förbättrats avsevärt robustheten hos BBB studier eftersom övervärdering (eller underskattning) av sanna omfattningen av protein förändringar på BBB kan nu undvikas. Införandet av flera centrifugering steg med dextran kan dessutom förbättrad anrikningen av microvesselsna i experimentprover underlättar borttagning av oönskade cellulära beståndsdelar såsom nervceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla förfaranden som beskrivs nedan har godkänts av en institutionell djur vård och användning kommittén (IACUC) och överensstämmer med National Institutes of Health (NIH) och djur forskning: In Vivo experiment (ankomst) riktlinjerna för rapportering. Det processuella flödet för protokoll avbildas i figur 1.
1. set-up för förfarandet
- Förbereda hjärnan microvessel bufferten (BMB). Börja genom att väga 54.66 g D-mannitol, 1,90 g EGTA och 1.46 g 2-amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol (dvs, Tris) base till en ren bägare. Lägg till 1,0 L avjoniserat vatten. Blanda komponenterna i BMB bufferten med en magnetomrörare. När lösningen har blandats ordentligt, justera pH till 7,4 använder 1,0 M HCl.
- Förbereda 26% dextran (75 000 MW) lösning (volymvikt) före anesthetizing djur. Förbereda dextran lösningen som beskrivs i följande steg.
Obs: Det är kritiskt viktigt att förbereda denna lösning före tid eftersom dextran kan ta ungefär 1,5-2 h att upplösa i vattenlösning buffert.- Väg ut på pulveriserad dextran (26 g per 100 mL buffert) till en ren bägare.
- Mäta ut lämplig volym av BMB och fördela i en separat, ren bägare.
- Häll sakta BMB i bägaren som innehåller pulveriserade dextran. Blanda manuellt den pulveriserade dextran under hälla av BMB med hjälp av en glasstav uppståndelse.
- Justera pH till 7,4 med 1,0 M HCl omedelbart före att använda.
Obs: En typisk isolering av hjärnan microvesselsna från 12 individuella Sprague-Dawley-råttor (manlig eller kvinnlig; varje 3 månader ålder, 200-250 g) kräver 200 mL dextran lösning (dvs 52 g dextran i 200 mL BMB).
2. utvinning av hjärnvävnad från Sprague-Dawley-råttor
- Efter önskad experimentell behandling, söva Sprague-Dawley-råttor som använder ketamin (50 mg/kg, 2,5 mL/kg i.p.) och xylazin (10 mg/mL, 2,5 mL/kg I, p.). Späd ketamin och xylazin i 0,9% koksaltlösning till slutliga koncentrationer på 20 mg/mL och 4,0 mg/mL respektive. Avliva djur genom halshuggning med hjälp av en vass giljotin enligt IACUC riktlinjer. Använd samma procedur för både manliga och kvinnliga Sprague-Dawley-råttor.
- Resect huden från råtta skallen genom att göra ett enda tvärgående snitt med kirurgisk sax.
- Använder rongeurs, försiktigt bort skallen plattan och exponera hjärnan.
- Ta bort hjärnan med hjälp av en spatel. Lossa storhjärnan och placera isolerade hjärnvävnaden i en 50 mL konisk tub innehållande 5 mL BMB. Tillsätt 1,0 μL av proteashämmare cocktail per 1,0 mL av BMB buffert omedelbart före användning.
3. hjärnan bearbetning
- Överföra hjärnvävnad från 50 mL koniska röret till en ren petriskål.
- Med pincett, rulla försiktigt hjärnan på 12,5 cm diameter filterpapper ta bort yttre hjärnhinnorna, som följs löst till hjärnbarken. Försiktigt tryck på hjärnvävnaden mot filterpapper och rulla vävnaden igen. Aktivera pappersfiltret ofta under detta steg.
- Separata plexus koroidea från hjärnhalvorna med hjälp av tången.
Obs: Plexus koroidea visas som en tydlig membranös vävnad lokaliserad till ytan av cerebral ventriklar. - Försiktigt platta hjärnvävnaden och ta bort återstående hjärnhinnorna och luktsinnet lökar med pincett.
- Placera den kortikala hjärnvävnaden i ett kylt glas murbruk. Lägga till 5,0 mL av BMB innehållande proteashämmare cocktail i mortel.
- Med hjälp av en overhead power Homogenisatorer, homogenisera hjärnvävnaden använder 15 upp och ner stroke vid 3 700 rpm. Utföra homogenisering med en 10 mL mortel vävnad kvarn. Mellan homogenisering av varje enskilt prov, ren mortelstöten med 70% etanol.
Obs: Homogenisering stroke bör överensstämma i takt och omfattning. - Häll blandningen i märkta centrifugrör.
4. centrifugering steg
- Lägga till 8,0 mL 26% dextran lösning till varje märkt centrifugrör som innehåller hjärnan Homogenatet.
- Vänd röret två gånger och sedan grundligt vortex provet. Genomföra vortexa av varje prov med flera vinklar för att säkerställa en noggrann blandning av hjärnan Homogenatet lösning med 26% dextran lösning.
- Centrifugera proverna på 5 000 x g under 15 minuter vid 4 ° C.
Obs: För vissa analyser är det användbart att jämföra hjärnan microvesselsna med hjärnparenkymet. Bör bedömningen av proteinuttryck i hjärnparenkymet kan krävs, supernatanten från denna centrifugeringssteget (dvs hjärnan parenkymal fraktion) samlas och lagras vid-80 ° C för framtida bruk. - Ta bort supernatanten med hjälp av ett vakuum insugningsventil och glas Pasteur-pipett.
Obs: Måste vara försiktig att inte störa pelleten. Annars minskas mängd i hjärnan microvesselsna insamlade, vilket kommer att signifikant sänka protein avkastningen från detta förfarande. - Återsuspendera pelleten i 5,0 mL av BMB innehållande proteashämmare cocktail (dvs 1,0 μL proteashämmare cocktail per 1,0 mL av BMB buffert). Vortex pelleten att säkerställa omsorgsfull blandning.
- Lägga till 8,0 mL av 26% dextran varje centrifugrör och vortex enligt beskrivningen i steg 4.1-4.2 i detta protokoll.
- Centrifugera proverna på 5 000 x g under 15 minuter vid 4 ° C.
- Med Termoskanna och glas pipett ska Aspirera supernatanten och säkerställa att pellets som innehåller hjärnan microvessel inte störs.
Obs: Överskott material som har anslutit sig till rörväggen innehåller inte microvesselsna och bör noggrant rengöras och tas bort. - Upprepa steg 4,5 till 4.8 en ytterligare två gånger.
- En gång 4 dextran centrifugering steg har slutförts, lägga till 5,0 mL av BMB varje pellet och vortex att resuspendera provet.
Obs: Efter slutförandet av steg 4.10, hela microvesselsna kan samlas in för analys av protein lokalisering. Detta kan åstadkommas genom att ta en 50 μL alikvotens åter svävande microvessel pellet och smetar på ett glas objektglas. Microvesselsna är sedan värme-fast vid 95 ° C under 10 minuter på en värmeblocket följt av fixering i iskall etanol för en ytterligare 10 min. bilder kan sedan lagras vid 4 ° C tills krävs för studier avbildning.
5. ultracentrifugering att förbereda prover av totala hjärnans mikrovaskulära membran
- Överföra prover till kylda glas Homogenisatorer.
- Med hjälp av en overhead power Homogenisatorer, homogenisera hjärnvävnad med 8-10 upp och ner stroke vid 3000 rpm. Homogenisering utförs med en 10 mL mortel vävnad kvarn. Rengöra mortelstöten med 70% etanol efter homogenisering av varje enskilt prov.
- Överföra prover för att rengöra ultracentrifugen rör. Nummer och väger varje enskild rör. Balans och koppla ihop rören före lastning i ultracentrifugen rotorn.
Obs: Alla vägning och hopkoppling av ultracentrifugen rören måste bedrivas med locken på att åstadkomma en korrekt mätning av tube vikter. - Centrifugera proverna vid 150 000 x g för 1 h vid 4 ° C.
- Med en termos och glas Pasteur-pipett, Aspirera supernatanten med hand inte att störa kapillär membran pelleten.
- Baserat på pelleten storleken, lägga till en lämplig volym av lagring buffert, som består av avjoniserat vatten och BMB i förhållandet 1:1 (v/v). Normalt är pellets resuspended i 400-500 μL av lagring buffert. Lägga till proteas hämmare cocktail lagring bufferten i ett förhållande av 1,0 μl per 1,0 mL av lagring buffert.
- Vortex prover till återsuspendera pelleten i lagring buffert.
- Använda ett glas Pasteur-pipett, överföra kapillär membran prover till ett märkt 1,5 mL mikrocentrifug rör.
- Passera provet genom en nål spruta 5 x att säkerställa provet blandas då grundligt och att ingen cellulära aggregat finns.
- Lagra prover vid-80 ° C tills krävs för analys.
Obs: Proteinhalten i varje microvessel membran prov mäts med hjälp av Bradford metoden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Experimentell flödet för isolering av råtta hjärnan microvesselsna och beredning av microvessel membran prover visas i figur 1. Använda proceduren presenteras här, framgångsrika isolering av intakt microvesselsna från råtthjärna påvisas (figur 2A). Dessa fartyg erhölls efter slutförandet av centrifugering med dextran och omedelbart innan ultracentrifugering att förbereda membran prover (dvs. efter avslutad steg 4.10). I denna bild, är microvessel målat med en antikropp mot Oatp1a4, en transportör som har visat sig vara väl uttryckt på plasmamembranet av hjärnan mikrovaskulära endotelceller2,11,13, 18. Med western blot analys (figur 2B), membran preparat från microvesselsna skördas från kvinnliga Sprague-Dawley-råttor visades berikad vara i trombocytantal endothelial celladhesionsmolekyl-1 (PECAM-1; kallas även CD31), ett protein som markör för hjärnan mikrocirkulation. PECAM-1 är en hämmande samtidig receptor involverad i T-celler och B-cell signalering som uttrycks mycket på plasmamembranet av vaskulära endotelceller. Under optimering av detta protokoll observerades PECAM anrikning i membran prover tillagas med två och fyra dextran centrifugering steg. Som visas i figur 2B, fanns det ingen skillnad i PECAM uttryck mellan prover beredd med dessa olika centrifugering steg; dock fyra dextran spins resulterade i förbättrad uttryck av endothelial transportproteiner, som indikerar förbättrad microvessel anrikning i proverna. Dessutom, snurrar användning av fyra dextrans förbättrad borttagning av oönskade cellulära beståndsdelar som anges av minskat uttryck av neuronala markör proteiner såsom synaptophysin18. Därför utfördes alla efterföljande förberedelser för hjärnan microvessel membran med fyra dextran centrifugering steg. I vår western blot experiment användes det mikrotubulära konstituerande proteinet tubulinet som lastning kontroll. Enligt Bradford protein analysen, ge membran preparat normalt protein koncentrationer mellan 5,0 mg/mL och 10,0 mg/mL. Representativa protein kvantifiering resultaten återges i tabell 1. Dessa protein värden bestämdes baserat på en standardkurva som genereras med hjälp av bovint serumalbumin (BSA; 2,0 mg/mL) som standard (figur 3). Protein prover späddes 10-faldigt i Bradford-analysen.
Efter protein kvantifiering, microvessel membran prover kan utnyttjas för biokemiska metoder för proteinanalys såsom western blot analys, dot blotting eller co-immunoprecipitation. Figur 4A skildrar en representativ western blot för BBB transport protein glukos transporter-1 (Glut-1 och andra) där prover från tabell 1 analyserades. Rensa enstaka band på lämpliga molekylvikt (dvs förutspås vara 54 kDa) för detta mycket-uttryckta BBB protein upptäcktes i varje membran prov. Varje enskild lane i detta western blot representerar microvessel membran prov beredd från en enda experimentella djur. Lika protein i varje lane bestämdes med hjälp av natrium-kalium ATPas (dvs Na+k+ ATPas; förutspådda molekylvikt = 113 kDa) som lastning kontroll. Som visas i figur 4B, observerades högre uttryck Glut-1 med BBB hos hanråttor jämfört med sina kvinnliga motsvarigheter. Ingen skillnad i uttryck av Na+k+ ATPas observerades mellan manliga och kvinnliga djur. För denna Densitometrisk analys var band quantitated med ImageJ programvara.
Figur 1: Skissera av förfaranden och protokoll att isolera råtta hjärnan microvesselsna och förbereda membran prover. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: representativa uppgifter visar intakt microvessel och uttryck av en vaskulära endotelceller markör proteinet. A: Immunofluorescens färgning visade lokalisering av Oatp1a4, en transportör som har visat sig vara väl uttryckt på BBB, i en intakt hjärnan microvessel isolerade som beskrivs i detta protokoll. Oatp1a4 lokalisering upptäcktes med hjälp av en specifik kanin polyklonala antikroppar mot Oatp1a4 vid en spädningsgrad av 1:10. Den sekundära antikroppen var en fluorescerande konjugerade anti-kanin IgG som användes vid en spädning på 1:300. Skalstapeln = 7,5 μm. B: Western blot analys visat renheten av microvessel prover visar berikning av specifika endotelceller markör protein PECAM-1, som upptäcktes med hjälp av en mus monoklonal antikropp i en spädning 1: 100. Den sekundära antikroppen var en antimus IgG vid en spädning på 1: 50000. BH = hjärnan Homogenatet, MV = rå microvessel bråkdel, MVM = hjärnan microvessel membran. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: en representativ standardkurva för Bradford Protein analysen. Bovint serumalbumin (BSA) användes som en standard och var utspädd till följande koncentrationer: 0, 0,125, 0,25, 0,50, 0,75, 1.0, 1.5 och 2.0 mg/mL. Absorbansen mättes på = 595 nm. Varje datapunkt representerar ett genomsnitt av tre absorbansen avläsningar per BSA koncentration. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: representativa western blot visar könsskillnader i Glut-1 uttryck i membran prover beredd från isolerade råtta hjärnan microvesselsna. A: Western blot analys visar uttryck av Glut-1 i membran prover beredd från microvessel isolerade från manliga och kvinnliga Sprague-Dawley-råttor. Glut-1 upptäcktes med hjälp av en monoklonal antikropp som kanin vid en spädningsgrad av 1: 500. Den sekundära antikroppen var en monoklonal anti-kanin IgG vid en 1:40,000 spädning. Na=k+ ATPas, plasmamembranet markör och lastning kontroll, upptäcktes med hjälp av en polyklonala anti-kanin IgG på en 1: 40.000 utspädningar. B: Densitometrisk analys av Glut-1 uttryck i membran prover isolerade från manliga och kvinnliga Sprague-Dawley-råttor. Resultaten uttrycks som menar SEM från 6 experimentella djur per behandlingsgrupp. Asteriskerna visar datapunkter som är statistiskt signifikant från kontroll. Ett värde av p < 0.05 ansågs vara statistiskt signifikant. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Djur | Genomsnittlig absorbans | Justerade absorbans | Beräknade koncentrationen | Faktiska koncentration |
| (Λ = 595 nm) | (mg/ml) | (mg/ml) | ||
| Hane 1 | 0.7967 | 0.3859 | 0.768 | 7,68 |
| Hane 2 | 0.7849 | 0.3741 | 0.7417 | 7,42 |
| Hane 3 | 0.8187 | 0.4079 | 0.8173 | 8.17 |
| Manliga 4 | 0.7985 | 0.3877 | 0.7721 | 7,72 |
| Manliga 5 | 0.7943 | 0.3835 | 0.7628 | 7,63 |
| Manliga 6 | 0.7251 | 0.3143 | 0.6084 | 6,08 |
| Kvinna 1 | 0.7114 | 0.3006 | 0.578 | 5,78 |
| Kvinnliga 2 | 0.7993 | 0.3885 | 0.7738 | 7,74 |
| Kvinnliga 3 | 0.8201 | 0.4093 | 0.8203 | 8,2 |
| Kvinnliga 4 | 0.7526 | 0.3418 | 0.6698 | 6,7 |
| Kvinnliga 5 | 0.8008 | 0,39 | 0.7773 | 7,77 |
| Kvinnliga 6 | 0.7975 | 0.3867 | 0,77 | 7,7 |
Tabell 1: representant Protein koncentrationer från hjärnan Microvessel preparat härrör från manliga och kvinnliga Sprague-Dawley-råttor. Justerade absorptionsvärden bestäms genom att subtrahera bakgrundsabsorbansen vid l = 595 nm från genomsnittlig absorbans värden för varje experimentella djur. I denna analys fastställdes bakgrundsabsorbansen vara 0.4108.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I den här artikeln beskrivs en enkel och effektiv metod för att förbereda membran protein prover från microvesselsna nyligen isolerade från råtta hjärnvävnad. Flera metoder för isolering av råtta hjärnan microvesselsna och/eller produktion av membran preparat från isolerade mikrocirkulation har rapporterats i litteraturen13,20,21,22 , 24. även om protokollet microvessel isolering ovan är liknande i princip, detta tillvägagångssätt har optimerats för att möjliggöra beredning av membran prover med utmärkt protein avkastning från en enda experimentella djur. Detta förskott har eliminerat behovet att pool microvesselsna från minst tre Sprague-Dawley-råttor för att erhålla prover med tillfredsställande protein anrikning för användning i olika metoder för proteinanalys. Dessa metoder inkluderar, men är inte begränsade till, western blot analys, dot blotting och co-immunoprecipitation. Det bör noteras att öva av sammanslagning microvesselsna från flera försöksdjur att generera ett enda prov kraftigt minskar mellan grupperna variabilitet. I denna utsträckning, kan microvessel pooling resultera i data med minskad spridning som inte representerar sant variabilitet i proteinuttryck som observerats i en population av försöksdjur. Eftersom proverna kan framställas från enda försöksdjur, fångas sanna variabilityen av en studiepopulation, vilket ger experimentella data inhämtas som är mer representativ för den patofysiologiska eller farmakologiska processen under undersökning. En ytterligare fördel är att microvessel membran prover kan förberedas genom ett minskat antal försöksdjur.
Kanske innebär den mest kritiska beaktas i genomförandet av detta protokoll centrifugering steg. Faktiskt, centrifuger kan skilja sig mellan laboratorier på grund av sin ålder, tillverkare, och/eller övergripande villkor och integritet. Detta kan leda till betydande variationer i den faktiska g nivå (eller rpm) från spin att snurra. Rollen av denna variation i provet integriteten kan minimeras genom centrifugering av alla prover i en enda jämförande analys tillsammans i samma rotorn samtidigt. Exempelvis om en rotor har bara tolv platser för provrör, kommer att sedan isolering och beredning av microvessel prover i ett enskilt experiment begränsas till tolv. Detta övervägande garanterar att förberedda prover av jämförbar kvalitet och att eventuella variationer i genomsnittlig proteinuttryck mellan experimentella grupper kan tilldelas villkoret behandling själv.
En ytterligare faktor innebär utarbetandet av 26% dextran lösningen, som krävs för separation av hjärnan microvesselsna och hjärnan parenkymal vävnad via differentiell centrifugering. Dextran är en glukos polymer med en prevalens av α-1,6-länkade enheter och vanligen äger en linjär struktur25. Det har också en hög vatten-bindande kapacitet. Till exempel behåller 1 g dextran 75 (dvs dextran med en genomsnittlig molekylvikt av 75,000 Da som används i detta protokoll) ca 20-25 mL vatten. Denna egenskap hos dextran kan leda till djupgående utmaningar i upplösning av pulvret in i vattenlösning bufferten. Vattenlöslighet kan förbättras genom upphettning dextran lösningen till en maximal temperatur av 40 ° C. Vid uppvärmning interagerar polymeren mindre med vattenmolekyler, därigenom orsakar dextran att anta en mindre utökade konformation (dvs. lägre grad av vätskeansamling) i lösning. Uppvärmning till högre temperatur kommer att orsaka dextran polymeren att bryta ner och det kommer därför vara ineffektiva som en separerande reagens. Dessutom är det viktigt att den dextran lösningen pH justeras till 7,4 omedelbart före användning. Lösningar av 26% dextran kan uppleva betydande pH Skift, även över 1-2 timmar efter beredning. På grund av dessa överväganden, måste 26% dextran lösningen vara beredd på dagen av experimentet men med tillräckligt med tid före isolering av hjärnvävnaden att möjliggöra upplösning och lämplig justering av pH.
En begränsning av detta protokoll innebär förekomsten av andra typer av neurovaskulära enhet (NVU) i microvessel preparat. Utöver endotelceller består NVU av olika cellulära komponenter inklusive gliaceller (dvs, astrocyter, mikroglia), pericyter och nervceller 3,26,27. Isolering av microvesselsna från gnagare hjärnan visar vanligtvis berikning med vaskulära endotelceller; dock har uttrycket av neuronala markör proteiner samt uttryck av glial fibrillary sura protein (Fredsgenomförande), en markör för etablerade Astrocyten också observerats. Dessutom är pericyter närvarande i provet preparat på grund av deras intima förening med den vaskulära endotelet. För närvarande är det nästan omöjligt att isolera hjärnan microvesselsna från försöksdjur och eliminera alla pericyter, nervceller och astrocyter. Emellertid har detta protokoll varit avancerade via flera centrifugering steg så att proverna är berikad med endotelceller (dvs. som anges av förbättrad uttryck av PECAM-1 efter varje centrifugeringssteget) med begränsad närvaro av andra cell typer ( dvs, indikerat av minskat uttryck av neuronala markör protein synaptophysin-1 efter varje centrifugeringssteget).
Sammantaget kan denna metod för isolering av råtta hjärnan microvesselsna och beredning av membran prover anpassas i ett laboratorium med ett intresse i att studera BBB proteiner patofysiologiska eller farmakologiska villkor. Detta protokoll innehåller exempelvis microvessel prover som kan utnyttjas för att studera drug transportproteiner som uttrycks endogenously på BBB2,18. Robustheten av detta tillvägagångssätt har aktiverat observationen av diskreta förändringar i Oatp1a4 som svar på farmakologisk stimuli, experimentella data som har informerat utformningen av rigorösa studier för att bedöma transportör funktion och reglering på BBB. Det protokoll som beskrivs ovan kan också tillämpas på protein analyser av åtsittande föreningspunkt proteiner och adherens junction proteiner i ett försök att förstå BBB under fysiologiska betingelser och att studera förändringar i BBB integritet svar på patofysiologiska och farmakologiska stressfaktorer. Klart, detta protokoll kan anpassas för flera program i fältet BBB och, därför, representerar en enkel men robust och reproducerbar metod som kan införlivas i BBB studier som kräver proteinanalys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av anslag från National Institutes of Health (R01-NS084941) och Arizona biomedicinsk forskning kommissionen (ADHS16-162406) till PTR. WA har fått förbi stöd från en pre forskarnivå utnämning till ett nationellt institut för hälsa utbildning bidrag (T32-HL007249).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | #P8340 | Component of brain microvessel buffer |
| D-mannitol | Sigma-Aldrich | #M4125 | Component of brain microvessel buffer |
| EGTA | Sigma-Aldrich | #E3889 | Component of brain microvessel buffer |
| Trizma Base | Sigma-Aldrich | #T1503 | Component of brain microvessel buffer |
| Dextran (MW 75,000) | Spectrum Chemical Mftg Corp | #DE125 | Dextran used in centrifugation steps to separate microvessels from brain parenchyma |
| Zetamine | MWI Animal Health | #501072 | General anesthetic |
| Xylazine | Western Medical Supply | #5530 | General anesthetic |
| 0.9% saline solution | Western Medical Supply | N/A | General anesthetic diluent |
| Filter Paper (12.5 cm diameter) | VWR | #28320-100 | Used for removal of meninges from brain tissue |
| Centrifuge Tubes | Sarstedt | #60.540.386 | Disposable tubes used for dextran centrifugation steps |
| Pierce™ Coomassie Plus (Bradford) Assay | ThermoFisher Scientific | #23236 | Measurement of protein concentration in membrane preparations |
| Wheaton Overhead Power Homogenizer | DWK Life Sciences | #903475 | Required for homogenization of samples |
| 10.0ml glass mortar and pestle tissue grinder | DWK Life Sciences | #358039 | Required for homogenization of samples |
| Hydrochloric Acid | Sigma-Aldrich | #H1758 | Required for pH adjustment of buffers |
| Bovine Serum Albumin | ThermoFisher Scientific | #23210 | Protein standard for Bradford Assay |
| Standard Forceps | Fine Science Tools | #91100-12 | Used for dissection of brain tissue |
| Friedman-Pearson Rongeurs | Fine Science Tools | #16020-14 | Used for opening skull to isolate brain |
| 50 ml conical centrifuge tubes | ThermoFisher Scientific | #352070 | Used for collection of brain tissue following isolation |
| Glass Pasteur Pipets | ThermoFisher Scientific | #13-678-20C | Used for aspiration of cellular debris following dextran spins |
| Ethanol, anhydrous | Sigma-Aldrich | #459836 | Used for cleaning tissue grinder; diluted to 70% with distilled water |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman-Coulter | #41121703 | Used for ultracentrifugation of samples |
References
- Rolfe, D. F., Brown, G. C. Cellular energy utilization and molecular origin of standard metabolic rate in mammals. Physiol Rev. 77 (3), 731-758 (1997).
- Brzica, H., Abdullahi, W., Ibbotson, K., Ronaldson, P. T. Role of Transporters in Central Nervous System Drug Delivery and Blood-Brain Barrier Protection: Relevance to Treatment of Stroke. J Cent Nerv Syst Dis. 9, 1179573517693802 (2017).
- Ronaldson, P. T., Davis, T. P. Targeting transporters: promoting blood-brain barrier repair in response to oxidative stress injury. Brain Res. 1623, 39-52 (2015).
- Witt, K. A., Mark, K. S., Hom, S., Davis, T. P. Effects of hypoxia-reoxygenation on rat blood-brain barrier permeability and tight junctional protein expression. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 285 (6), H2820-H2831 (2003).
- McCaffrey, G., et al. Occludin oligomeric assemblies at tight junctions of the blood-brain barrier are altered by hypoxia and reoxygenation stress. J Neurochem. 110 (1), 58-71 (2009).
- Lochhead, J. J., et al. Oxidative stress increases blood-brain barrier permeability and induces alterations in occludin during hypoxia-reoxygenation. J Cereb Blood Flow Metab. 30 (9), 1625-1636 (2010).
- Lucke-Wold, B. P., et al. Bryostatin-1 Restores Blood Brain Barrier Integrity following Blast-Induced Traumatic Brain Injury. Mol Neurobiol. 52 (3), 1119-1134 (2015).
- Campos, C. R., Ocheltree, S. M., Hom, S., Egleton, R. D., Davis, T. P. Nociceptive inhibition prevents inflammatory pain induced changes in the blood-brain barrier. Brain Res. , 6-13 (2008).
- Ronaldson, P. T., Demarco, K. M., Sanchez-Covarrubias, L., Solinsky, C. M., Davis, T. P. Transforming growth factor-beta signaling alters substrate permeability and tight junction protein expression at the blood-brain barrier during inflammatory pain. J Cereb Blood Flow Metab. 29 (6), 1084-1098 (2009).
- Seelbach, M. J., Brooks, T. A., Egleton, R. D., Davis, T. P. Peripheral inflammatory hyperalgesia modulates morphine delivery to the brain: a role for P-glycoprotein. J Neurochem. 102 (5), 1677-1690 (2007).
- Ronaldson, P. T., Finch, J. D., Demarco, K. M., Quigley, C. E., Davis, T. P. Inflammatory pain signals an increase in functional expression of organic anion transporting polypeptide 1a4 at the blood-brain barrier. J Pharmacol Exp Ther. 336 (3), 827-839 (2011).
- Pop, V., et al. Early brain injury alters the blood-brain barrier phenotype in parallel with beta-amyloid and cognitive changes in adulthood. J Cereb Blood Flow Metab. 33 (2), 205-214 (2013).
- Thompson, B. J., et al. Hypoxia/reoxygenation stress signals an increase in organic anion transporting polypeptide 1a4 (Oatp1a4) at the blood-brain barrier: relevance to CNS drug delivery. J Cereb Blood Flow Metab. 34 (4), 699-707 (2014).
- Tome, M. E., et al. P-glycoprotein traffics from the nucleus to the plasma membrane in rat brain endothelium during inflammatory pain. J Cereb Blood Flow Metab. 36 (11), 1913-1928 (2016).
- Slosky, L. M., et al. Acetaminophen modulates P-glycoprotein functional expression at the blood-brain barrier by a constitutive androstane receptor-dependent mechanism. Mol Pharmacol. 84 (5), 774-786 (2013).
- Artus, C., et al. The Wnt/planar cell polarity signaling pathway contributes to the integrity of tight junctions in brain endothelial cells. J Cereb Blood Flow Metab. 34 (3), 433-440 (2014).
- Yu, H., et al. Long-term exposure to ethanol downregulates tight junction proteins through the protein kinase Calpha signaling pathway in human cerebral microvascular endothelial cells. Exp Ther Med. 14 (5), 4789-4796 (2017).
- Abdullahi, W., Brzica, H., Ibbotson, K., Davis, T. P., Ronaldson, P. T. Bone morphogenetic protein-9 increases the functional expression of organic anion transporting polypeptide 1a4 at the blood-brain barrier via the activin receptor-like kinase-1 receptor. J Cereb Blood Flow Metab. 37 (7), 2340-2345 (2017).
- Mesev, E. V., Miller, D. S., Cannon, R. E. Ceramide 1-Phosphate Increases P-Glycoprotein Transport Activity at the Blood-Brain Barrier via Prostaglandin E2 Signaling. Mol Pharmacol. 91 (4), 373-382 (2017).
- Betz, A. L., Csejtey, J., Goldstein, G. W. Hexose transport and phosphorylation by capillaries isolated from rat brain. Am J Physiol. 236 (1), C96-C102 (1979).
- Yousif, S., Marie-Claire, C., Roux, F., Scherrmann, J. M., Decleves, X. Expression of drug transporters at the blood-brain barrier using an optimized isolated rat brain microvessel strategy. Brain Res. 1134 (1), 1-11 (2007).
- McCaffrey, G., et al. Tight junctions contain oligomeric protein assembly critical for maintaining blood-brain barrier integrity in vivo. J Neurochem. 103 (6), 2540-2555 (2007).
- Brzica, H., et al. The liver and kidney expression of sulfate anion transporter sat-1 in rats exhibits male-dominant gender differences. Pflugers Arch. 457 (6), 1381-1392 (2009).
- Ronaldson, P. T., Bendayan, R. HIV-1 viral envelope glycoprotein gp120 produces oxidative stress and regulates the functional expression of multidrug resistance protein-1 (Mrp1) in glial cells. J Neurochem. 106 (3), 1298-1313 (2008).
- Pustylnikov, S., Sagar, D., Jain, P., Khan, Z. K. Targeting the C-type lectins-mediated host-pathogen interactions with dextran. J Pharm Pharm Sci. 17 (3), 371-392 (2014).
- Obermeier, B., Daneman, R., Ransohoff, R. M. Development, maintenance and disruption of the blood-brain barrier. Nat Med. 19 (12), 1584-1596 (2013).
- Abdullahi, W., Davis, T. P., Ronaldson, P. T. Functional Expression of P-glycoprotein and Organic Anion Transporting Polypeptides at the Blood-Brain Barrier: Understanding Transport Mechanisms for Improved CNS Drug Delivery? AAPS J. 19 (4), 931-939 (2017).
