Summary
Her, er en metode for isolering av rotte hjernen microvessels og for utarbeidelse av membran prøver beskrevet. Denne protokollen har klare fordelen av å produsere beriket microvessel prøver med akseptabel protein gi fra enkelte dyr. Eksempler kan deretter brukes for robust protein analyser på hjernen mikrovaskulær endotelet.
Abstract
Blod - hjerne barrieren (BBB) er en dynamisk barrier vev som svarer til ulike patofysiologiske og farmakologiske stimuli. Slike endringer som følge av disse stimuli kan sterkt modulerer narkotika-leveranser til hjernen og dermed forårsake betydelige utfordringer i behandlingen av sentralnervesystemet (CNS) sykdommer. Mange BBB endringer som påvirker farmakoterapi, innebære proteiner som er lokalisert og uttrykt på nivået av endotelceller. Slik kunnskap på BBB fysiologi i helse og sykdom har faktisk skapt betydelig interesse i studiet av disse membran proteiner. Fra et grunnleggende vitenskap forskning ståsted innebærer dette et behov for en enkel men robust og reproduserbar metode for isolering av microvessels fra hjernevev høstet fra forsøksdyr. For å forberede membran prøver fra ferske isolert microvessels, er det viktig at prøven forberedelser være beriket i endotelceller, men begrenset i nærvær av andre celletyper av nevrovaskulære (dvs. astrocyttene, microglia, neurons, pericytes). En ekstra fordel er muligheten til å forberede prøver fra enkelte dyr for å fange den sanne variasjonen av protein uttrykk i en eksperimentell befolkning. I dette manuskriptet tilbys detaljer om en metode som benyttes for isolering av rotte hjernen microvessels og forberedelse av membran prøver. Microvessel berikelse, fra prøver avledet, oppnås ved hjelp av fire sentrifugering trinn der dekstran er inkludert i prøven bufferen. Denne protokollen kan lett tilpasses av andre laboratorier for sine egne spesifikke applikasjoner. Prøver fra denne protokollen har vist å gi robust prøvedata fra protein analyse eksperimenter som kan betydelig hjelpe forståelsen av BBB svar på fysiologiske patofysiologiske og farmakologiske stimuli.
Introduction
Blod - hjerne barrieren (BBB) finnes på grensesnittet mellom sentralnervesystemet (CNS) og systemisk sirkulasjonen og spiller en viktig rolle i vedlikehold av hjernen homeostase. Spesielt BBB funksjonene til nøyaktig kontroll stoff konsentrasjoner i hjernen ekstracellulære væske og effektivt levere disse næringsstoffer som kreves av hjernevev for å oppfylle betydelig metabolic kravene av CNS1. Disse rollene innebærer at BBB, som finnes hovedsakelig i nivået av mikrovaskulær endothelial celle, må ha separate mekanismer som gjør at noen stoffer til hjernen parenchyma samtidig at potensielt skadelige xenobiotics ikke samle. Faktisk hjernen mikrovaskulær endotelceller er ikke fenestrated og viser begrenset pinocytosis, som sikrer mangel på ikke-selektive permeabilitet2. I tillegg express hjernen microvessel endotelceller stramt junction og adherens krysset proteiner som fungerer til en fysisk "forsegle" mellom tilstøtende endotelceller og sterkt begrense paracellular spredning av blodbårne stoffer i hjernen parenchyma. Faktisk krever selektiv permeabilitet av endogene og eksogene stoffer funksjonelle uttrykk for opptak og middelklasseinnbyggere transportører3. Samlet, stramt veikryss, adherens veikryss og transportører jobber sammen å opprettholde de unike barriereegenskaper av BBB.
BBB er en dynamisk barriere som svarer til fysiologiske patofysiologiske og farmakologiske stimuli. For eksempel har hypoksi/reoxygenation stress blitt vist å modulere uttrykk for kritiske tett krysset proteiner (dvs. occludin, zonulae occluden-1 (ZO-1)), som er forbundet med økt paracellular permeabilitet til vaskulær markører slik som sukrose4,5,6. Lignende observasjoner gjort i BBB i innstillingen for traumatisk brain skader7 og eksterne inflammatorisk smerte8,9. Disse samme sykdommer kan også modulerer transportmekanismer BBB10,11,12,13,14. Faktisk, hypoksi/reoxygenation skade forbedrer funksjonelle uttrykk for organisk anion transport polypeptid 1a4 (Oatp1a4) på BBB, som kan føre til betydelige økninger i blod-til-hjerne transport av bestemte Oatp transport underlag slik taurocholate og atorvastatin13. BBB egenskaper kan også endres ved farmakoterapi, en mekanisme som kan danne grunnlag for både dyptgripende endringer i stoffet effektiviteten i hjernen og for narkotika-interaksjoner. For eksempel Paracetamol mål kjernefysiske reseptor signalnettverk mekanismer i hjernen mikrovaskulær endotelceller, øker funksjonelle uttrykk for den kritiske middelklasseinnbyggere transporter P-glykoprotein (P-gp) og endrer tidsavhengige analgesi gitt av morfin, transportere en opioid smertestillende medikament og etablerte P-gp substrat15. En grundig forståelse av BBB endringer, som kan være forårsaket av sykdommer eller narkotika, krever også identifikasjon og karakterisering av spesifikke regulatoriske mekanismene som styrer disse endringene. Faktisk diskret signalveier er blitt identifisert i hjernen mikrovaskulær endotelceller som kontrollerer molekylær uttrykk for tett krysset proteiner16,17 og transportører15, 18,19. Sammen indikerer disse observasjonene at komplekse molekylær veier er involvert i regulering av BBB stramt veikryss og transportører i både helse og sykdom.
En viktig utfordring i studiet av BBB er den absolutte kravet til en enkel og effektiv metode for isolering av microvessels fra hjernevev forsøksdyr og påfølgende forberedelse av membran prøver. Disse prøvene må være forberedt slik at de er både beriket i hjernen mikrovaskulær endotelceller og begrenset i nærvær av andre celletyper. Over de siste årene, har flere metoder for isolering av microvasculature fra gnager hjernen rapportert i vitenskapelig litteratur13,20,21,22. Denne artikkelen beskriver en enkel, robust, og reproduserbar metode for isolering av microvessels fra rotte hjerne og utarbeidelse av endothelial membran-beriket prøver som kan brukes til analyse av protein uttrykk. En fordel med denne microvessel isolasjon protokollen er muligheten til å få prøve forberedelser av høy kvalitet og med tilstrekkelig protein avkastning fra en individuell eksperimentelle dyr. Dette gjør at hensynet til Inter dyr variasjon i protein uttrykk. Slike forskudd i denne protokollen har mye bedre robusthet av BBB studier fordi over estimering, eller under estimering sanne omfanget av protein endringer på BBB nå kan unngås. I tillegg gir inkludering av flere sentrifugering trinn med dekstran forbedret anriking av microvessels i eksperimentelle prøver samtidig fremme fjerning av uønskede mobilnettet bestanddeler som neurons.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrer skissert nedenfor er godkjent av en institusjonell Animal Care og bruk Committee (IACUC) og i samsvar med National Institutes of Health (NIH) og dyr forskning: I Vivo eksperimenter (ANKOMME) retningslinjer. Fremgangsmåter for flyten for protokollen er avbildet i figur 1.
1. oppsett for prosedyren
- Forberede hjernen microvessel bufferen (BMB). Start ved veiing 54.66 g D-mannitol, 1,90 g EGTA og 1.46 g 2-amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol (dvs. Tris) base i et rent beger. Legge til 1,0 L deionisert vann. Blande komponenter i BMB bufferen med en magnetisk rørestang. Når løsningen har vært grundig blandet, justere pH 7,4 bruker 1,0 M HCl.
- Forberede 26% dekstran (MW 75.000) løsning (w/v) før anesthetizing dyr. Forbered den dekstran løsningen som beskrevet i fremgangsmåten nedenfor.
Merk: Det er kritisk viktig å forberede denne løsningen forhånd fordi dekstran kan ta ca 1,5-2 timer å oppløse i vandig buffer.- Vei ut av pulverisert dekstran (26 g per 100 mL buffer) i et rent beger.
- Måle ut riktig antall BMB og dispensere til et eget, rent beger.
- Sakte hell BMB i begeret som inneholder pulverisert dekstran. Manuelt bland i pulverisert dekstran under pouring BMB bruker glass rør stang.
- Justere pH 7,4 med 1,0 M HCl umiddelbart før du bruker.
Merk: En typisk isolering av hjernen microvessels fra 12 personlige Sprague-Dawley rotter (mann eller kvinne; 3 måneder av alderen; 200-250 g hver) krever 200 mL dekstran løsning (dvs. 52 g dekstran i 200 mL BMB).
2. utvinning av hjernevevet fra Sprague-Dawley rotter
- Etter ønsket eksperimentell behandling, bedøve Sprague-Dawley rotter ketamin (50 mg/kg, 2,5 mL/kg IP) og xylazine (10 mg/mL, 2,5 mL/kg jeg, p.). Fortynne ketamin og xylazine i 0,9% saltvann til siste konsentrasjoner av 20 mg/mL og 4.0 mg/mL henholdsvis. Avlive dyrene ved halshogging bruker en skjerpet giljotinen IACUC retningslinjer. Bruk samme fremgangsmåte for både mannlige og kvinnelige Sprague-Dawley rotter.
- Resect huden fra rotte skallen ved å lage et enkelt tverrgående kutt med kirurgisk saks.
- Bruker rongeurs, nøye fjerne skallen platen og utsette hjernen.
- Fjerne hjernen ved hjelp av en slikkepott. Koble cerebrum og plasser isolert hjernevev i en 50 mL konisk rør som inneholder 5 mL av BMB. Tilsett 1,0 μL av protease hemmer cocktail per 1,0 mL av BMB buffer umiddelbart før bruk.
3. hjernen behandling
- Overføre hjernevevet fra 50 mL konisk røret til en ren Petriskål.
- Ved hjelp av pinsett, forsiktig roll hjernen på 12,5 cm diameter filter papir fjerne ytre meninges, som følges løst hjernebarken. Forsiktig trykker hjernevev mot filter papir og rulle vevet igjen. Slå filter papir ofte i dette trinnet.
- Skille choroid plexus fra cerebrale hemisfærer ved hjelp av pinsett.
Merk: Den choroid plexus vises som en klar membranous vev lokalisert til overflaten av cerebral ventriklene. - Forsiktig flat hjernevevet og fjern resterende meninges og olfactory pærer ved hjelp av pinsett.
- Plass kortikale hjernevev i en kjølt glass morter. Legge til 5.0 mL av BMB som inneholder protease hemmer cocktail mørtelen.
- Bruker en overhead power homogenizer, homogenize hjernevev med 15 opp og ned slag på 3700 rpm. Utføre homogenisering bruker en 10 mL morter vev jeksel. Mellom homogenisering av hver enkelt prøve, rengjør pistil med 70% etanol.
Merk: Homogenisering slag skal være konsekvent i form av fart og omfang. - Hell homogenate i merket sentrifuge rør.
4. sentrifugering trinn
- Legge til 8.0 mL 26% dekstran løsning i hver merket sentrifuge rør som inneholder hjernen homogenate.
- Invertere røret to ganger og deretter grundig vortex prøven. Utføre vortexing av hvert utvalg bruker flere vinkler for å sikre en grundig blanding av hjernen homogenate løsning med 26% dekstran løsning.
- Sentrifuger eksempler på 5000 x g i 15 min på 4 ° C.
Merk: For noen analyser er det nyttig å sammenligne hjernen microvessels med hjernen parenchyma. Skal vurdering av protein uttrykk i hjernen parenchyma kan nødvendig nedbryting fra denne sentrifugering trinn (dvs. hjernen parenchymal brøkdel) samles og lagres ved-80 ° C for fremtidig bruk. - Fjern nedbryting bruker et vakuum aspirator og glass Pasteur pipette.
Merk: Forsiktighet må utvises ikke forstyrre pellet. Ellers reduseres antall hjernen microvessels samlet, som vil vesentlig redusere protein avkastningen av denne prosedyren. - Resuspend pellet i 5.0 mL av BMB som inneholder protease hemmer cocktail (dvs. 1.0 μL protease hemmer cocktail per 1,0 mL av BMB buffer). Vortex pellet å sikre grundig blande.
- Legge 8.0 mL 26% dekstran til hver sentrifuge rør og vortex som beskrevet i trinnene 4.1-4.2 i denne protokollen.
- Sentrifuger eksempler på 5000 x g i 15 min på 4 ° C.
- Bruke et vakuum kolbe og glass pipette, Sug opp nedbryting og sikre at pellet inneholder hjernen microvessel ikke forstyrres.
Merk: Overflødig materiale som har levd opp til røret veggen inneholder ikke microvessels og bør nøye rengjøres og fjernet. - Gjenta trinn 4.5 til 4,8 en ytterligere to ganger.
- Når 4 dekstran sentrifugering trinn er fullført, legge 5.0 mL BMB til hver pellets og vortex å resuspend prøven.
Merk: Etter at trinn 4.10, hele microvessels kan samles for analyse av protein lokalisering. Dette kan oppnås ved å ta en 50 μL aliquot av nytt suspendert microvessel pellets og smøre på en barometer microscope skyve. Microvessels er da varme-fast ved 95 ° C i 10 min på oppvarming blokk etterfulgt av fixation i iskalde etanol for en ekstra 10 min. lysbilder kan deretter lagres på 4 ° C til nødvendig for imaging studier.
5. Ultracentrifugation å forberede prøver av hjernen mikrovaskulær membraner
- Overføre prøver til kjølt glass homogenizer.
- Bruker en overhead power homogenizer, homogenize hjernevev bruke 8-10 opp og ned slag på 3000 rpm. Homogenisering er utført med en 10 mL morter vev jeksel. Rengjør pistil med 70% etanol etter homogenisering av hver enkelt prøve.
- Overføre prøver å rengjøre ultracentrifuge rør. Nummeret og veie hver individuelle rør. Balanse og koble rørene før lasting i ultracentrifuge rotoren.
Merk: Alle veier og sammenkobling av ultracentrifuge rør må være gjennomført med caps på å sikre nøyaktig måling av rør vekter. - Sentrifuger eksempler på 150 000 x g 1t på 4 ° C.
- Bruke vakuum kolbe og glass Pasteur pipette, Sug opp nedbryting bruker forsiktighet for ikke å forstyrre kapillært membran-pellets.
- Basert på pellet, legge til en riktig mengde lagring buffer, som består av deionisert vann og BMB i forholdet 1:1 (v/v). Vanligvis er pellets resuspended i 400-500 μL lagring buffer. Legge til protease hemmer cocktail lagring bufferen i forholdet 1.0 μL per 1,0 mL av lagring buffer.
- Vortex prøver å resuspend pellets lagring buffer.
- Bruker et glass Pasteur pipette, overføre kapillært membran prøver til et merket 1,5 mL microcentrifuge rør.
- Bestått prøven gjennom en nål sprøyte 5 x å sikre prøven er grundig blandet og at ingen mobilnettet oppsamlinger finnes.
- Lagre prøver-80 ° c til nødvendig for analyse.
Merk: Proteininnholdet i hver microvessel membran prøve måles med metoden Bradford.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Eksperimentell flyten for isolering av rotte hjernen microvessels og forberedelse av microvessel membran prøver er vist i figur 1. Ved hjelp av prosedyren som presenteres her, vellykket isolering av intakt microvessels fra rotte hjernen demonstreres (figur 2A). Disse fartøyene ble innhentet etter sentrifugering med dekstran og umiddelbart før begynner ultracentrifugation å forberede membran prøver (dvs. etter at trinn 4.10). I dette bildet, er microvessel farget med et antistoff mot Oatp1a4, en transportør som har vist seg å være godt uttrykt i plasma membranen hjernen mikrovaskulær endotelceller2,11,13, 18. Western blot analyse (figur 2B), membran preparater fra microvessels høstet fra hunnrotter Sprague-Dawley ble vist beriket å være i blodplater endothelial celle vedheft molekyl-1 (PECAM-1, også kjent som CD31), en markør protein for hjernen microvasculature. PECAM-1 er en hemmende co reseptor involvert i T-celler og B-celle signalisering som er svært uttrykt i plasma membranen av vaskulær endotelceller. Under optimalisering av denne protokollen, ble PECAM berikelse observert i membranen prøver tilberedt med to og fire dekstran sentrifugering trinnene. Som vist i figur 2B, var det ingen forskjell i PECAM uttrykk mellom prøvene tilberedt med følgende forskjellige sentrifugering; men fire dekstran spinner resulterte i økt uttrykk av endothelial transport proteiner som angir forbedret microvessel berikelse i prøvene. I tillegg, spinner bruk av fire dextrans forbedret fjerning av uønskede mobilnettet bestanddeler som indikert av redusert uttrykk for neuronal markør proteiner som synaptophysin18. Derfor ble alle etterfølgende forberedelser til hjernen microvessel membraner utført med fire dekstran sentrifugering trinn. I vår western blot eksperimenter, ble microtubule konstituerende protein tubulin brukt som en lasting. Som bestemmes av Bradford protein analysen, gi membran forberedelser vanligvis protein konsentrasjonene varierer mellom 5,0 mg/mL og 10,0 mg/mL. Representant protein kvantifisering resultater er vist i tabell 1. Disse protein verdiene ble fastsatt basert på en standard kurve som ble generert ved hjelp av bovin serum albumin (BSA, 2,0 mg/mL) som standard (Figur 3). Protein prøver ble utvannet 10-fold i Bradford analysen.
Etter protein kvantifisering, microvessel membran prøver kan utnyttes for biokjemiske metoder for protein analyse som western blot analyse, punkt blots eller co-immunoprecipitation. Figur 4A viser en representant western blot for BBB transport protein glukose transporter-1 (Glut-1) hvor prøver fra tabell 1 ble analysert. Fjerner enkelt band på den aktuelle Molekylvekten (dvs. spådd for å bli 54 kDa) for denne svært uttrykt BBB protein ble oppdaget i hvert membran-utvalg. Hver enkelt fil i denne western blot representerer microvessel membran utvalg forberedt fra en enkelt eksperimentelle dyr. Lik protein i hver bane var bestemmes ved hjelp av natrium-kalium ATPase (dvs. Na+/K+ ATPase, spådde molekylvekt = 113 kDa) som en lasting. Som vist i figur 4B, ble høyere uttrykk for Glut-1 i BBB observert i mannlig rotter i forhold til sine kvinnelige kolleger. Ingen forskjell i uttrykk for Na+/K+ ATPase ble observert mellom mannlige og kvinnelige dyr. For denne densitometric analysen, var band quantitated bruker ImageJ programvare.
Figur 1: omrisset av prosedyrer og protokoller å isolere rotte hjernen microvessels og forberede membran prøver. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: representant data som viser intakt microvessel og uttrykk for et vaskulær endotelial celle markør protein. A: Immunofluorescence flekker viste lokalisering av Oatp1a4, en transportør som har vist seg å være godt uttrykt på BBB, i en intakt hjernen microvessel isolert som beskrevet i denne protokollen. Oatp1a4 lokalisering ble oppdaget ved hjelp av en bestemt kanin polyklonale antistoff mot Oatp1a4 på en fortynning av 1:10. Sekundær antistoffer var en fluorescerende konjugert anti-kanin IgG som ble brukt på en fortynning av 1:300. Skala bar = 7,5 μm. B: Western blot analyse demonstrert renheten av microvessel prøver av viser berikelse av bestemte endothelial celle markør protein PECAM-1, som ble oppdaget ved hjelp av en mus monoklonalt antistoff på en 1: 100 fortynning. Sekundær antistoffer var en anti-mus IgG på en 1: 50,000 fortynning. BH = hjernen homogenate, MV = rå microvessel brøk, MVM = hjernen microvessel membraner. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: en representant standardkurven for Bradford Protein analysen. Storfe serum albumin (BSA) ble brukt som standard og ble utvannet til følgende konsentrasjonen: 0, 0.125, 0,25, 0,50, 0,75, 1.0, 1.5 og 2.0 mg/mL. Absorbansen ble målt ved = 595 nm. Hvert datapunkt representerer et gjennomsnitt på tre absorbansen opplesninger per BSA konsentrasjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: representant western blot viser Kjønnsforskjeller i Glut-1 uttrykk i membranen prøver forberedt fra isolert rotte hjernen Microvessels. A: Western blot analyse viser uttrykk for Glut-1 i membranen prøver forberedt fra microvessel isolert fra mannlige og kvinnelige Sprague-Dawley rotter. Glut-1 ble oppdaget ved hjelp av en kanin monoklonalt antistoff på en 1:500 fortynning. Sekundær antistoffer var et monoklonalt anti-kanin IgG på en 1:40,000 fortynning. Na=/K+ ATPase, en plasma membran markør og lasting kontrollen, ble oppdaget ved hjelp av en polyklonale anti-kanin IgG på en 1: 40.000 fortynninger. B: Densitometric analyse av Glut-1 uttrykk i membranen prøver isolert fra mannlige og kvinnelige Sprague-Dawley rotter. Resultatene uttrykkes som mener SEM fra 6 forsøksdyr per behandlingsgruppe. Stjernene angir datapunkter som er statistisk signifikant fra kontrollen. Verdien p < 0,05 ble ansett å være statistisk signifikant. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Dyr | Gjennomsnittlig Absorbance | Justert Absorbance | Fallende utregnet blodkonsentrasjon | Faktiske konsentrasjon |
| (Λ = 595 nm) | (mg/ml) | (mg/ml) | ||
| Mannlige 1 | 0.7967 | 0.3859 | 0.768 | 7.68 |
| Mannlige 2 | 0.7849 | 0.3741 | 0.7417 | 7.42 |
| Mannlige 3 | 0.8187 | 0.4079 | 0.8173 | 8.17 |
| Mann 4 | 0.7985 | 0.3877 | 0.7721 | 7,72 |
| Mannlige 5 | 0.7943 | 0.3835 | 0.7628 | levert kamret for 7,63 |
| Mannlige 6 | 0.7251 | 0.3143 | 0.6084 | 6,08 |
| Kvinnelige 1 | 0.7114 | 0.3006 | 0.578 | 5,78 |
| Kvinnelige 2 | 0.7993 | 0.3885 | 0.7738 | 7,74 |
| Kvinnelige 3 | 0.8201 | 0.4093 | 0.8203 | 8.2 |
| Kvinnelige 4 | 0.7526 | 0.3418 | 0.6698 | 6.7 |
| Kvinnelige 5 | 0.8008 | 0,39 | 0.7773 | 7.77 |
| Kvinnelige 6 | 0.7975 | 0.3867 | 0.77 | 7.7 |
Tabell 1: representant Protein konsentrasjoner fra hjernen Microvessel forberedelser avledet fra mannlige og kvinnelige Sprague-Dawley rotter. Justert absorbansen verdiene avgjøres ved å trekke bakgrunn absorbans ved l = 595 nm fra gjennomsnittlig absorbansen verdier for hvert eksperimentelle dyr. I denne analysen, ble bakgrunn absorbansen identifisert som 0.4108.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En enkel og effektiv metode for å forberede membran protein prøver fra microvessels fersk isolert fra rotte hjernevev er beskrevet i denne artikkelen. Flere tilnærminger for isolering av rotte hjernen microvessels og/eller generering av membran preparater fra isolert microvasculature er rapportert i litteraturen13,20,21,22 , 24. selv om microvessel isolasjon protokollen beskrevet ovenfor er lignende i prinsippet, denne tilnærmingen er optimalisert for å aktivere forberedelse av membran prøver med utmerket protein avkastning fra en enkelt eksperimentelle dyr. Dette forhånd har eliminert behovet til bassenget microvessels fra minst tre Sprague-Dawley rotter for å få prøver med tilfredsstillende protein berikelse for bruk i ulike tilnærminger til protein analyse. Disse inkluderer, men er ikke begrenset til, western blot analyse, punkt blots og co-immunoprecipitation. Det bør bemerkes at praksisen med å samle microvessels fra flere forsøksdyr generere en enkelt prøve sterkt reduserer Inter gruppe variasjon. Til dette omfang, kan microvessel pooling resultere i data med redusert spredning som ikke representerer sant variasjon i protein uttrykk i en befolkning på forsøksdyr. Siden prøver kan tilberedes fra enkelt forsøksdyr, er den sanne variasjonen i en studien befolkningen fanget, som gjør at eksperimentelle data innhentes som er mer representativt for patofysiologiske eller farmakologiske prosessen undersøkelse. En ekstra fordel er at microvessel membran eksempler kan være forberedt med et redusert antall forsøksdyr.
Kanskje omfatter den viktigste hensynet i gjennomføringen av denne protokollen sentrifugering trinn. Faktisk kan sentrifuger variere mellom laboratorier på grunn av deres alder, produsent / generelle tilstand og integritet. Dette kan føre til betydelige variasjoner i den faktiske g nivå (eller rpm nivå) fra spin å spinne. Rollen til denne variasjonen i prøven integritet kan reduseres ved sentrifugering alle prøvene per komparativ analyse sammen i samme rotoren samtidig. For eksempel hvis en rotor har bare tolv spor for eksempel rør, begrenses deretter isolasjon og forberedelse av microvessel prøver i et enkelt eksperiment til tolv. Denne vurderingen sikrer at forberedt prøver er av tilsvarende kvalitet og at noen variasjon i mener protein uttrykk mellom eksperimentelle grupper kan tilordnes til behandlingen tilstanden selv.
Tas innebærer tilberedning av 26% dekstran, som kreves for separasjon av hjernen microvessels og parenchymal hjernevevet via differensial sentrifugering. Dekstran er en glukose polymer med prevalens α-1,6-tilknyttede enheter og vanligvis har en lineær struktur25. Det har også en høy vann-innbindingen behandlingskapasitet. For eksempel beholder 1 g dekstran 75 (dvs. dekstran med en gjennomsnittlig molekylvekt av 75 000 Da som brukes i denne protokollen) ca 20-25 mL vann. Egenskapen for dekstran kan føre til dyp utfordringer i løse opp pulveret inn i vandig buffer. Vandig løselighet kan forbedres ved oppvarming dekstran løsningen maksimum temperatur på 40 ° C. Ved oppvarming samhandler polymer mindre med vannmolekyler, og dermed forårsaker dekstran å vedta en mindre utvidet konformasjon (dvs. lavere grad av vann oppbevaring) i løsningen. Oppvarming til temperaturer vil føre dekstran polymer å bryte ned og derfor vil det være ineffektivt som en skiller reagens. I tillegg er det viktig at pH av løsningen dekstran justeres 7,4 umiddelbart før bruk. Løsninger for 26% dekstran kan oppleve betydelige pH SKIFT, med over 1-2 timer etter forberedelse. På grunn av disse vurderingene, må 26% dekstran løsningen være forberedt dagen av eksperimentet, men med tilstrekkelig tid før isolering av hjernevevet for oppløsning og riktig justering av pH.
En begrensning av denne protokollen innebærer tilstedeværelsen av andre celletyper i nevrovaskulære enheten (NVU) i microvessel forberedelser. I tillegg til endotelceller består NVU av ulike cellulære komponenter inkludert gliacellene (dvs. astrocyttene, microglia), pericytes og neurons 3,26,27. Isolasjonen av microvessels fra gnager hjernen viser vanligvis berikelse med vaskulær endotelial celler. Imidlertid er uttrykk for neuronal markør proteiner og uttrykk for glial fibrillary Sure protein (GFAP), en etablert astrocytter markør, også observert. I tillegg finnes pericytes i prøven forberedelser på grunn av tilknytningen intime vaskulære endotelet. I dag er det praktisk talt umulig å isolere hjernen microvessels fra experimental dyr og eliminere alle pericytes, nerveceller og astrocyttene. Men har denne protokollen vært avanserte via flere sentrifugering trinn slik at prøvene er beriket i endotelceller (dvs. som angitt av økt uttrykk for PECAM-1 etter hvert sentrifugering trinn) med begrenset tilstedeværelsen av andre cellen typer ( dvs., som indikert av redusert uttrykk for neuronal merke protein synaptophysin-1 etter hver sentrifugering trinn).
Samlet kan denne tilnærmingen for isolering av rotte hjernen microvessels og utarbeidelse av membran prøver tilpasses i et laboratorium med en interesse i å studere BBB proteiner under patofysiologiske eller farmakologiske forhold. For eksempel gir denne protokollen microvessel prøver som kan benyttes for studier av narkotika transport proteiner som uttrykkes endogenously BBB2,18. Robust denne tilnærmingen har aktivert observasjon av diskrete endringer i Oatp1a4 i respons til farmakologisk stimuli, eksperimentelle data som har informert utformingen av strenge studier å vurdere transporter funksjon og regulering på BBB. Protokollen beskrevet ovenfor kan også brukes på protein analyser av tett krysset proteiner og adherens krysset proteiner i et forsøk på å forstå BBB under fysiologiske forhold og å studere endringer i BBB integritet svar patofysiologiske og farmakologiske stressors. Tydelig, denne protokollen kan tilpasses for flere applikasjoner innen BBB, og representerer derfor en enkel men robust og reproduserbar metode som kan innlemmes i BBB studier krever protein analysen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra National Institutes of Health (R01-NS084941) og Arizona biomedisinsk forskning Commission (ADHS16-162406) til PTR. WA fått forbi støtte fra en pre avtale til nasjonale institutter for helse opplæring stipend (T32-HL007249).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | #P8340 | Component of brain microvessel buffer |
| D-mannitol | Sigma-Aldrich | #M4125 | Component of brain microvessel buffer |
| EGTA | Sigma-Aldrich | #E3889 | Component of brain microvessel buffer |
| Trizma Base | Sigma-Aldrich | #T1503 | Component of brain microvessel buffer |
| Dextran (MW 75,000) | Spectrum Chemical Mftg Corp | #DE125 | Dextran used in centrifugation steps to separate microvessels from brain parenchyma |
| Zetamine | MWI Animal Health | #501072 | General anesthetic |
| Xylazine | Western Medical Supply | #5530 | General anesthetic |
| 0.9% saline solution | Western Medical Supply | N/A | General anesthetic diluent |
| Filter Paper (12.5 cm diameter) | VWR | #28320-100 | Used for removal of meninges from brain tissue |
| Centrifuge Tubes | Sarstedt | #60.540.386 | Disposable tubes used for dextran centrifugation steps |
| Pierce™ Coomassie Plus (Bradford) Assay | ThermoFisher Scientific | #23236 | Measurement of protein concentration in membrane preparations |
| Wheaton Overhead Power Homogenizer | DWK Life Sciences | #903475 | Required for homogenization of samples |
| 10.0ml glass mortar and pestle tissue grinder | DWK Life Sciences | #358039 | Required for homogenization of samples |
| Hydrochloric Acid | Sigma-Aldrich | #H1758 | Required for pH adjustment of buffers |
| Bovine Serum Albumin | ThermoFisher Scientific | #23210 | Protein standard for Bradford Assay |
| Standard Forceps | Fine Science Tools | #91100-12 | Used for dissection of brain tissue |
| Friedman-Pearson Rongeurs | Fine Science Tools | #16020-14 | Used for opening skull to isolate brain |
| 50 ml conical centrifuge tubes | ThermoFisher Scientific | #352070 | Used for collection of brain tissue following isolation |
| Glass Pasteur Pipets | ThermoFisher Scientific | #13-678-20C | Used for aspiration of cellular debris following dextran spins |
| Ethanol, anhydrous | Sigma-Aldrich | #459836 | Used for cleaning tissue grinder; diluted to 70% with distilled water |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman-Coulter | #41121703 | Used for ultracentrifugation of samples |
References
- Rolfe, D. F., Brown, G. C. Cellular energy utilization and molecular origin of standard metabolic rate in mammals. Physiol Rev. 77 (3), 731-758 (1997).
- Brzica, H., Abdullahi, W., Ibbotson, K., Ronaldson, P. T. Role of Transporters in Central Nervous System Drug Delivery and Blood-Brain Barrier Protection: Relevance to Treatment of Stroke. J Cent Nerv Syst Dis. 9, 1179573517693802 (2017).
- Ronaldson, P. T., Davis, T. P. Targeting transporters: promoting blood-brain barrier repair in response to oxidative stress injury. Brain Res. 1623, 39-52 (2015).
- Witt, K. A., Mark, K. S., Hom, S., Davis, T. P. Effects of hypoxia-reoxygenation on rat blood-brain barrier permeability and tight junctional protein expression. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 285 (6), H2820-H2831 (2003).
- McCaffrey, G., et al. Occludin oligomeric assemblies at tight junctions of the blood-brain barrier are altered by hypoxia and reoxygenation stress. J Neurochem. 110 (1), 58-71 (2009).
- Lochhead, J. J., et al. Oxidative stress increases blood-brain barrier permeability and induces alterations in occludin during hypoxia-reoxygenation. J Cereb Blood Flow Metab. 30 (9), 1625-1636 (2010).
- Lucke-Wold, B. P., et al. Bryostatin-1 Restores Blood Brain Barrier Integrity following Blast-Induced Traumatic Brain Injury. Mol Neurobiol. 52 (3), 1119-1134 (2015).
- Campos, C. R., Ocheltree, S. M., Hom, S., Egleton, R. D., Davis, T. P. Nociceptive inhibition prevents inflammatory pain induced changes in the blood-brain barrier. Brain Res. , 6-13 (2008).
- Ronaldson, P. T., Demarco, K. M., Sanchez-Covarrubias, L., Solinsky, C. M., Davis, T. P. Transforming growth factor-beta signaling alters substrate permeability and tight junction protein expression at the blood-brain barrier during inflammatory pain. J Cereb Blood Flow Metab. 29 (6), 1084-1098 (2009).
- Seelbach, M. J., Brooks, T. A., Egleton, R. D., Davis, T. P. Peripheral inflammatory hyperalgesia modulates morphine delivery to the brain: a role for P-glycoprotein. J Neurochem. 102 (5), 1677-1690 (2007).
- Ronaldson, P. T., Finch, J. D., Demarco, K. M., Quigley, C. E., Davis, T. P. Inflammatory pain signals an increase in functional expression of organic anion transporting polypeptide 1a4 at the blood-brain barrier. J Pharmacol Exp Ther. 336 (3), 827-839 (2011).
- Pop, V., et al. Early brain injury alters the blood-brain barrier phenotype in parallel with beta-amyloid and cognitive changes in adulthood. J Cereb Blood Flow Metab. 33 (2), 205-214 (2013).
- Thompson, B. J., et al. Hypoxia/reoxygenation stress signals an increase in organic anion transporting polypeptide 1a4 (Oatp1a4) at the blood-brain barrier: relevance to CNS drug delivery. J Cereb Blood Flow Metab. 34 (4), 699-707 (2014).
- Tome, M. E., et al. P-glycoprotein traffics from the nucleus to the plasma membrane in rat brain endothelium during inflammatory pain. J Cereb Blood Flow Metab. 36 (11), 1913-1928 (2016).
- Slosky, L. M., et al. Acetaminophen modulates P-glycoprotein functional expression at the blood-brain barrier by a constitutive androstane receptor-dependent mechanism. Mol Pharmacol. 84 (5), 774-786 (2013).
- Artus, C., et al. The Wnt/planar cell polarity signaling pathway contributes to the integrity of tight junctions in brain endothelial cells. J Cereb Blood Flow Metab. 34 (3), 433-440 (2014).
- Yu, H., et al. Long-term exposure to ethanol downregulates tight junction proteins through the protein kinase Calpha signaling pathway in human cerebral microvascular endothelial cells. Exp Ther Med. 14 (5), 4789-4796 (2017).
- Abdullahi, W., Brzica, H., Ibbotson, K., Davis, T. P., Ronaldson, P. T. Bone morphogenetic protein-9 increases the functional expression of organic anion transporting polypeptide 1a4 at the blood-brain barrier via the activin receptor-like kinase-1 receptor. J Cereb Blood Flow Metab. 37 (7), 2340-2345 (2017).
- Mesev, E. V., Miller, D. S., Cannon, R. E. Ceramide 1-Phosphate Increases P-Glycoprotein Transport Activity at the Blood-Brain Barrier via Prostaglandin E2 Signaling. Mol Pharmacol. 91 (4), 373-382 (2017).
- Betz, A. L., Csejtey, J., Goldstein, G. W. Hexose transport and phosphorylation by capillaries isolated from rat brain. Am J Physiol. 236 (1), C96-C102 (1979).
- Yousif, S., Marie-Claire, C., Roux, F., Scherrmann, J. M., Decleves, X. Expression of drug transporters at the blood-brain barrier using an optimized isolated rat brain microvessel strategy. Brain Res. 1134 (1), 1-11 (2007).
- McCaffrey, G., et al. Tight junctions contain oligomeric protein assembly critical for maintaining blood-brain barrier integrity in vivo. J Neurochem. 103 (6), 2540-2555 (2007).
- Brzica, H., et al. The liver and kidney expression of sulfate anion transporter sat-1 in rats exhibits male-dominant gender differences. Pflugers Arch. 457 (6), 1381-1392 (2009).
- Ronaldson, P. T., Bendayan, R. HIV-1 viral envelope glycoprotein gp120 produces oxidative stress and regulates the functional expression of multidrug resistance protein-1 (Mrp1) in glial cells. J Neurochem. 106 (3), 1298-1313 (2008).
- Pustylnikov, S., Sagar, D., Jain, P., Khan, Z. K. Targeting the C-type lectins-mediated host-pathogen interactions with dextran. J Pharm Pharm Sci. 17 (3), 371-392 (2014).
- Obermeier, B., Daneman, R., Ransohoff, R. M. Development, maintenance and disruption of the blood-brain barrier. Nat Med. 19 (12), 1584-1596 (2013).
- Abdullahi, W., Davis, T. P., Ronaldson, P. T. Functional Expression of P-glycoprotein and Organic Anion Transporting Polypeptides at the Blood-Brain Barrier: Understanding Transport Mechanisms for Improved CNS Drug Delivery? AAPS J. 19 (4), 931-939 (2017).
