Summary
Dieses Protokoll beschreibt Calorespirometry, die direkte und gleichzeitige Messung der Wärmeableitung und Atmung, sorgt für eine nicht-invasive Ansatz um den Energiestoffwechsel zu beurteilen. Diese Technik wird verwendet, um den Beitrag von aeroben und anaeroben Wege zur energetischen Nutzung durch die Überwachung des gesamten zellulären Energiefluss zu bewerten.
Abstract
Viele Zelllinien verwendet in der biologischen und biomedizinischen Grundlagenforschung pflegen energiehomöostase durch eine Kombination von aeroben und anaeroben Atmung. Allerdings ist der Umfang, den beide Wege zur Landschaft der zellulären Energieproduktion beitragen, konsequent übersehen. Transformierte Zellen kultiviert in Sättigung Niveaus der Glukose oft zeigen eine geringere Abhängigkeit auf Oxidative Phosphorylierung für ATP-Produktion, die durch eine Erhöhung der Substrat-Niveau Phosphorylierung ausgeglichen wird. Diese Verschiebung in der metabolischen Gleichgewicht ermöglicht Zellen, trotz der Anwesenheit der mitochondrialen Toxine vermehren. In veränderten Stoffwechsel Haltung der transformierten Zellen zu vernachlässigen, Ergebnisse von pharmazeutischen Prüfung können fehlinterpretiert werden, seit der potenziell Mitotoxic Effekte können nicht erkannt werden mit Modell Zelllinien kultiviert in Anwesenheit hoher Blutzucker Konzentrationen. Dieses Protokoll beschreibt die Paarung von zwei mächtigen Techniken, respirometrie und Kalorimetrie, die für die quantitative und nicht-invasive Beurteilung der aeroben und anaeroben Beiträge zur zellulären ATP-Produktion ermöglicht. Aerobe und anaerobe Atmungen erzeugen Wärme, die überwachten über Kalorimetrie sein kann. Unterdessen kann die Messrate der Sauerstoffverbrauch der aeroben Atmung, inwieweit. Wenn Wärmeableitung und Sauerstoffverbrauch gleichzeitig gemessen werden, kann das Verhältnis der Calorespirometric bestimmt werden. Die experimentell ermittelten Wert kann dann verglichen werden, um die theoretische Oxycaloric gleichwertig und das Ausmaß der anaeroben Atmung beurteilt werden kann. So bietet Calorespirometry eine einzigartige Methode, um eine Vielzahl von biologischen Fragen, einschließlich der Arzneimittelentwicklung, mikrobielles Wachstum und grundlegende Bioenergetik unter Inklusieve und hypoxischen Bedingungen zu analysieren.
Introduction
In biologischen Systemen, die Wärmeabgabe oder Enthalpie Änderung beim Stoffwechsel ist in der Regel entweder direkt überwacht (über direkte Kalorimetrie) oder indirekt über O2 Verbrauch und/oder CO-2 -Produktion (über respirometrie). Wenn diese Techniken isoliert verwendet werden, ist leider wichtige Informationen verloren gehen, wie der Beitrag von anaeroben Wege zur zellulären Stoffwechsel. Calorespirometry ist eine leistungsstarke Technik, die auf die gleichzeitige Messung der Wärmeableitung und die Atmung setzt. Calorespirometric Pionierarbeit den anaeroben Stoffwechsel im voll sauerstoffreiches Säugerzellen untersucht und demonstriert gleichzeitig Beiträge von aeroben und anaeroben Wege zur Energie-Homöostase trotz der transformierten Zellen in einer voll oxydierten Umgebung1. Calorespirometry wurde inzwischen zu einer Vielzahl von biologischen Fragestellungen angewandt. Beispiele hierfür sind die Untersuchung von tierischen Energetik bei niedrigen Sauerstoffgehalt, die Auswirkungen der Herbizid und Östrogen auf den Kiemen der Muscheln, der Stoffwechsel der terrestrischen Organismen und den mikrobiellen Abbau von organischen Böden Angelegenheit2, 3 , 4 , 5 , 6. Calorespirometry hat7Zellen offenbarte wie metabolische Vorkonditionierung vor dem Einfrieren der Kryokonservierung von Säugetieren verbessert. Jeder Ansatz, Kalorimetrie und respirometrie, hat selbständig erhöht unser Wissen über zelluläre und organismal Bioenergetik. Relativ unerforscht bleiben jedoch grundlegende biologische Fragestellungen, die durch den Einsatz von Calorespirometry beantwortet werden können.
Hesss Gesetz besagt, dass die totale Enthalpieänderung der Reaktion des Weges zwischen dem Anfangs- und Endwert Staaten unabhängig ist. Beispielsweise ist die gesamte Enthalpieänderung für einen biochemischen Weg die Summierung der Änderung der Enthalpien aller Reaktionen innerhalb der Weg. Kalorimetrie bietet einen Echtzeit-Ansatz zur Messung der zellulären Wärmeerzeugung, die wahllos aerobe und anaerobe Wege erkennt. Dies basiert auf der Grundlage, dass keine Energie in das System außer durch die Wände des experimentellen Ampulle8ausgetauscht werden. Eine Änderung der Wärmeableitung ist gleich der Änderung im Enthalpie befreit alle Stoffwechselreaktionen in der Ampulle. So korreliert eine negative Enthalpie zu einem Verlust von Wärme aus dem System. Umfassende Forschung in den letzten vier Jahrzehnten hat die thermodynamische Landschaft von Anabolismus und Katabolismus geprägt. Dies wird durch einen stetigen Anstieg der Fachartikel finden Sie unter den Suchbegriffen "biologisch" und "Kalorimetrie" wie durch die Vereinigten Staaten nationale Bibliothek von Medicine (NLM) an den National Institutes of Health (PubMed) indiziert dargestellt. Die Suche zeigt, dass vor 1970, insgesamt 27 Publikationen Referenz biologische Kalorimetrie; Unterdessen in 2016 allein verwendet 546 Publikationen die Technik.
Kalorimetrischer Methoden sind etabliert, Wärmeerzeugung zu bestimmen. Für die Lösung des respirometric Wert wird jedoch mehr Flexibilität gewährt. Die respirometric Messung kann von O2, CO2, oder O2 und CO2bestehen. Darüber hinaus kann die Messung der O2 oder CO2 durch verschiedene Techniken, einschließlich Optrodes, Clark-Art Elektroden und tunable Diode Laser Absorption Spektroskopie7,9,10 erfolgen ,11. Während CO2 -Produktion eine wertvolle Metrik in vielen respirometric Studien ist, nutzt das Medium für kultivierten Zellen oft ein Bicarbonic Puffersystem für pH Steuerung12,13. Zur Vermeidung von Komplikationen der CO2 -Messung in das Bicarbonat-System nutzt das folgende Protokoll für die Calorespirometry der Zellen in Kultur O2 als alleinige respirometric Parameter.
Gleichzeitig mit der Messung von Sauerstoff-Fluss, sind bestimmte Respirometers (siehe Tabelle der Materialien) für detaillierte Bewertungen der mitochondrialen Funktion ausgelegt. Substrat-Entkuppler-Inhibitor-Titrationen (Anzug) Protokolle sind etabliert und sind kompatibel mit Experimenten Membran potenzielle oder reaktiven Sauerstoff-Spezies (ROS) Bildung14messen soll. Die vorgestellte Protokoll für Calorespirometry der intakten Zellen ist kompatibel mit der Einführung der chemischen Entkuppler wie Carbonyl Zyanid-p-Trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) und F0F1-ATP-Synthase Oligomycin Hemmstoff. Durch die Zugabe von FCCP können Sauerstoffverbrauch abgekoppelt von der ATP-Produktion, zur Bewertung der Auswirkungen von potenziellen Therapeutika auf mitochondriale Leistung15nützlich ist. Darüber hinaus beleuchtet die Zugabe von Oligomycin das Ausmaß der Undichtigkeit Atmung. So sind die respirometric Messungen während Calorespirometry kompatibel mit umfangreiche Protokolle entwickelt, um weitere mitochondriale Physiologie aufzuklären.
Die gleichzeitige Messung der Wärmeableitung und Sauerstoff Flussmittel kann für die Berechnung des Calorespirometric (CR)-Verhältnisses. Dieses Verhältnis ist dann im Vergleich zu den Thornton Konstante oder die theoretische Oxycaloric entspricht, die zwischen-430-480 kJ Mol-1 je nach Zelllinie oder Gewebe von Interesse und ergänzten Kohlenstoff Substrate1, 16. so eine negativere CR Verhältnis zeigt erhöhte Beiträge von anaeroben Wege zu insgesamt Stoffwechselaktivität. Zum Beispiel reicht das CR-Verhältnis für die routinemäßige Muskel Gewebe Atmung ohne die aktive Durchführung von Arbeiten von-448-468 kJ Mol-1 im Bereich der theoretischen Oxycaloric entspricht17,18liegt. Unterdessen Säugetier-Krebszellen kultiviert im Medium, die reich an Glucose anzeigen erweiterte Milchsäuregärung nach Glykolyse und relativ niedrigen mitochondriale Engagement19. Dieser Phänotyp Ergebnisse in CR-Verhältnisse im Bereich der-490-800 kJ Mol-1, zeigen eine erhöhte Beteiligung der anaerobe Wege in den zellulären Stoffwechsel angedeutet durch mehr negative CR Verhältnisse1,7, 16,20.
Kommerzielle und gemeinnützige Zell- und Distributoren derzeit Angebot Zelllinien aus über 150 Arten mit fast 4.000 Zelllinien von Menschen abgeleitet. Immortalisierte Zelllinien sind praktische Werkzeuge für schnell Bewertung der Toxizität von potenziellen Therapeutika, von denen viele direkt oder indirekt mitochondriale Funktionen beeinträchtigen. Mit transformierten Zellen während Drogen-Screening kann der begrenzten Aussagekraft zum Teil wegen der Warburg-Effekt, ein Markenzeichen von vielen Krebsarten sein. Oft Krebs erzeugen ATP aus Substrat-Niveau Phosphorylierung und Redox-Gleichgewicht durch die Produktion von Laktat ohne Eingriff vollständig das Mitochondrium unter aeroben Bedingungen19. Pharmazeutische Entwicklung ist notorisch kostspielig und ineffizient, mit etwa 8 von 9 Verbindungen getestet in klinischen Studien am Menschen nicht Markt Genehmigung21erreicht. Während potenzielle Therapeutika erste Sichtung durch geringe Zytotoxizität in Zelllinien passieren kann, ist es möglich, dass einige dieser Verbindungen Mitotoxic sind. Ohne eine geeignete Methode, um zu erkennen, wie diese Toxine die Energiebilanz im Primärzellen beeinträchtigen können, die nicht der Warburg-Effekt angezeigt werden, ist oft wichtige Informationen über sah, therapeutische Entwicklung in frühen Stadien zu Engpässen.
Calorespirometry ist eine praktische, nicht-invasive Ansatz zur Stoffwechselaktivität in einer Vielzahl von biologischen Proben, einschließlich der Zellen und Geweben zu analysieren. Der Kern des vorliegenden Protokolls ist mit einer Vielzahl von Anwendungen kompatibel. Jedoch wurde eine Komplikation festgestellt. Immortalisierte Zellen sind oft in einem Glukose-freies Medium ergänzt mit Galaktose, den Beitrag der Oxidative Phosphorylierung (OXPHOS) für die Energieerzeugung zu erhöhen, um die Zellen, die potenzielle Mitotoxins22sensibilisieren kultiviert, 23. Diese metabolischen Umprogrammierung erscheint Analyse zu verdecken, wenn Proben in der Edelstahl-Ampullen verwendet durch die Kalorimeter15platziert werden. Zellen in einem Glukose-Medium kultiviert weiterhin in hoher Stoffwechselaktivität für mehrere Stunden zu engagieren. Unterdessen verringern Zellen in Galaktose Medium kultiviert die Wärmeproduktion innerhalb von 30 min von ihrer Platzierung in der Ampulle, Messungen auf frühen experimentellen Zeitpunkte beschränkt. Dieses Verhalten verhindert leider die Möglichkeit, ihre Zellproliferation zu bewerten. Trotz dieser besonderen Einschränkung die meisten Anwendungen sind kompatibel mit Calorespirometric Analyse und metabolische Detailinformationen erhalten Sie durch diesen Ansatz.
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Protocol
(1) Zellkultur
- Halten menschliche hepatozellulären Karzinom (HepG2) Zellen in Dulbeccos geändert Eagle Medium (DMEM) mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS) und zusätzliche Substrate (Pyruvat 1 mM, 10 mM Glukose und 2 mM Glutamin) bei 37 ° C in einer Zelle Kultur Inkubator (5 % CO2 , 95 % Luft, 100 % Luftfeuchtigkeit).
Hinweis: Verwenden der oben genannten DMEM Formulierung, wenn DMEM in späteren Schritten für respirometrie und Kalorimetrie verwiesen wird. - Platte der Zellen bei 1 x 106 Zellen pro 100 mm Kultur und Subkultur sie alle 7 Tage oder vor erreichen 90 % Konfluenz und erneuern das Medium alle 3-4 Tage.
- Durchführen Sie die Experimente, wenn Zellen 60-80 % Zusammenfluss sind.
2. Vorbereitung des Respirometer und Kalorimeter
- Pipettieren 2,2 mL DMEM in die Kammer Respirometer, legen Sie den Stopper voll und passen Sie es mit dem Stopper Spacer Werkzeug, um optimale Sauerstoffdiffusion aus Luft auf Medium zu ermöglichen.
- Rühren Sie ständig bei 37 ° C, bis der Sauerstoff-Konzentration (blaue Spur) und Sauerstoff-Fluss (rote Spur) stabil sind. Sicherstellen Sie, dass die Respirometer Software programmiert ist, entfallen die Sauerstoff-Löslichkeit des Mediums in das Experiment verwendet.
Hinweis: Unterschiedliche Medien haben unterschiedliche Sauerstoff Löslichkeit Koeffizienten (z. B.DMEM = 0,92). - Wählen Sie nach der Stabilisierung der Sauerstoffkonzentration in DMEM mit der Kammer öffnen einen stabilen Teil der Sauerstoff-Konzentration-Ablaufverfolgung und für 100 % Luft Sättigung zu kalibrieren.
- Kalibrierung für 0 % Sauerstoff Sie einen stabile Teil der Sauerstoff-Konzentration-Ablaufverfolgung auswählen, wenn kein Sauerstoff im Plenarsaal anwesend ist. Führen Sie diesen Schritt nach 20 µL Titration von 230 mM Natrium Dithionite oder nach allen Sauerstoff von der biologischen Probe am Ende eines Experiments verbraucht wird.
- Schließen Sie nach der 100 % Luft Kalibrierung der Respirometer den Stopper und sicherzustellen Sie, dass keine Luftblasen im Plenarsaal anwesend sind.
Hinweis: ein leichter Anstieg im Sauerstoff-Fluss wird in der geschlossenen Kammer als der polarographischen Lambdasonde erkannt (POS) Sauerstoff verbraucht, um den Sauerstoff-Partialdruck zu messen. - Bestätigen Sie nach ~ 10 min von der Verschluss geschlossen wird, dass die Respirometer bereit für HepG2-Zellen durch einen stabilen Sauerstoff-Fluss zu beobachten.
Hinweis: Die hier verwendete Kalorimeter nutzt Edelstahl Ampullen und erfordert eine Ampulle als Referenz verwendet werden. - Die Referenz-Ampulle von der Kalorimeter 2,5 mL H2O (dH2O) [gleiches Volumen wie die Proben (Schritt 4)] hinzu und ziehen Sie die Kappe mit einer Zange, wenn nötig. Reinigen Sie den versiegelten Ampulle mit Luftstrom und senken Sie langsam die Ampulle auf position 1 in den Referenzkanal das Kalorimeter. Bleiben Sie an Position 1 bis zur biologischen Probe vorbereitet ist.
3. Vorbereitung der HepG2-Zellen für Respirometrie und Kalorimetrie
- Bestätigen Sie, dass die Respirometer und Kalorimeter vorbereitet und kalibriert werden. Warm DMEM und Trypsin auf 37 ° C in einem Wasserbad.
- DMEM Hinzufügen einer frisch 100-mm-Platte und in den Inkubator, um das Gleichgewicht des Mediums für CO2 und Temperatur zu ermöglichen.
Hinweis: Dieses Medium wird für das Experiment Kalorimetrie verwendet werden, so dass das entsprechende Volumen hängt die Anzahl der Ampullen, die verwendet werden. - Bestätigen Sie mit einer invertierten Lichtmikroskop, dass die Zellen am Zusammenfluss von 60-80 %, dann waschen die 100-mm-Platte 2 X mit 10 mL der Raumtemperatur Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS).
- Die 100-mm-Platte von Zellen 3 mL von 37 ° C Trypsin hinzu und inkubieren sie ca. 7-10 min bei 37 ° C in der Zelle-Kultur-Inkubator. Neutralisieren die Trypsin mit 3 mL 37 ° C DMEM und aussetzen von sanft pipettieren sie ~ 20 Mal mit einer 5 mL pipettieren.
- Überführen Sie die 6 mL resuspendierte Zellen in DMEM und Trypsin in ein steriles 15 mL konische Röhrchen und Zentrifugieren Sie, für 5 min bei 175 X g. Flüssigkeit entfernen, ohne die Zelle Pellet zu stören.
- Aufschwemmen der Zelle Pellet in ~ 5 mL DMEM und pipettieren gründlich um sicherzustellen, dass die Zellen ausreichend voneinander getrennt sind.
- Entfernen Sie ~ 100 µL der gut gemischten Probe zu und führen Sie eine gründliche Zellzahl nutzen alle 8 Felder auf eine Hemocytometer, die Gesamtzahl der Zellen zu bestimmen. Dann berechnen Sie das Volumen für Wiederfreisetzung der Zellen um ~ 2 x 106 Zellen pro 50 µL zu generieren.
Hinweis: Dadurch wird sichergestellt, dass jede Kammer der Respirometer mit minimalen mittleren Hubraum 2 x 106 Zellen hinzugefügt werden. - Zentrifugieren Sie den Zellen für 5 min bei 175 X g. Aufschwemmen das Pellet in das berechnete Volumen der DMEM aus Schritt 3.7.
- Führen Sie eine Zellzahl bestimmen die Lautstärke, 2 x 106 Zellen pro Kammer in der Respirometer zu injizieren (Dies sollte ~ 50 µL) erforderlich. Speichern Sie die Zellen für die respirometric Messung auf Eis, bis bereit.
- Während die konzentrierte Zellprobe auf dem Eis ist, bestimmen Sie die Verdünnung erforderlich, um eine Konzentration von 1 x 105 Zellen/mL für die Kalorimetrie zu produzieren.
- Die Probe gut mischen und jede TRINKAMPULLE ~ 3 mL der Zellen bei 1 x 105 Zellen/mL in DMEM vorbereiten.
Hinweis: Die DMEM verwendet für die Probenverdünnung sollte das äquilibriert Medium in Schritt 3.3 vorbereitet sein.
4. Kalorimetrie
- Sicherstellen Sie, dass Kalorimeter an den Computer angeschlossen ist und das kalorimetrisch Signal in µW beobachtbaren und stabil.
- Jede Ampulle 2,5 mL der Zellen bei 1 x 105 Zellen/mL (~2.5 X 105 Zellen) hinzu, ausreichend Luft ist zwischen den Deckel von der Ampulle und das Medium, um Gasdiffusion zu ermöglichen.
- Sofort ziehen Sie die Kappe mit einer Zange, wenn nötig. Reinigen Sie den versiegelten Ampulle mit Luftstrom um jeglichen externen Schmutz zu entfernen und senken Sie langsam die Ampulle auf position 1 der Kalorimeter. Notieren Sie die Zeit, die die Ampulle auf position 1 abgesenkt wird.
- Lassen Sie die Ampulle an Position 1 für 15 min sitzen.
Hinweis: In diesem Zeitraum 15 min sind Zellen in der Respirometer (Schritt 5) injiziert werden. Dies sorgt dafür, dass die gleichen Zeitintervall für die Produktion von Wärme und Sauerstoff-Verbrauch verwendet wird, wenn das CR-Verhältnis bestimmt wird. - Senken Sie nach 15 min auf Position 1 langsam die Referenz und Sample Ampullen auf Position 2. Zeichnen Sie die Zeit, die die Ampullen gesenkt wurden und Maßnahme mindestens 30 min lang.
5. respirometrie
- Während der 15-min-Intervall, in dem die Ampulle auf Position 1 in das Kalorimeter ist, beginnen Sie die respirometric Studien.
- Mischen Sie die Zellprobe durch pipettieren gewährleisten eine homogene Lösung zu injizieren < 50 µL die Zellprobe in jeder Kammer des Respirometer für eine Endkonzentration von ~ 2 x 106 Zellen/Kammer. Notieren Sie die Zeit, die die Zellen in den Respirometer injiziert werden.
- Nach der Injektion werden die HepG2-Zellen kontinuierlich bei 37 ° c gerührt. Warten Sie mindestens 20-30 min für beide eine Stabilisierung der Sauerstoff-Fluss und eine stetige Abnahme der Sauerstoffkonzentration.
- Wählen Sie die Registerkarte " O2 Flux pro V " auf der rechten Seite des Bildschirms und markieren Sie eine stabile Portion Sauerstoff Flussmittel zu. Wählen Sie Markierungen, dann Statistiken und Daten für O2 Flux pro V. Diese Aufnahme wird bei Berechnung des CR-Verhältnisses verwendet werden.
Hinweis: Die Schritte 5.5 und 5.6 sind optional. Leck-Atmung und maximale abgekoppelt Atmung werden durch Titrationen von Oligomycin und FCCP enthüllt werden. - In jeder Kammer 1 µL 4mg/mL Oligomycin injizieren und erlauben ~ 10 min für Sauerstoff Flussmittel Stabilisierung. Rekord stabile Atmung Leckrate von Schritten durch die Hervorhebung einer stabilen Portion Sauerstoff-Fluss-Spur nach Oligomycin Zugabe in 5.4 durchgeführt.
- Titel 2-µL-Injektionen von 0,2 mM FCCP in jeder Kammer, so dass für Sauerstoff Flussmittel Stabilisierung nach jeder Injektion. Die Titrationen weiter bis der maximale Fluss erreicht ist, wie durch einen leichten Rückgang der nachfolgenden FCCP Titration. Notieren Sie die stabile Atemfrequenz während der maximale Fluss.
6. Berechnung der Calorespirometric Verhältnis
- Führen Sie eine endgültige Zellzahl der Proben vorbereitet auf ~ 1 x 105 Zellen/mL nutzen alle 8 Felder von einer Hemocytometer zu bestimmen, die Gesamtzahl der Zellen hinzugefügt, um die Ampulle (2,5 mL).
- Bestimmen Sie eine Zeit zur Aufzeichnung von Messungen von Kalorimeter und Respirometer bei der stabile Signale zu gleichen Zeiten anwesend sind. Die Referenzzeit aufgezeichnet, wenn die Ampulle gesenkt wurde, um 2 und dem Zeitpunkt der Injektion von Zellen in der Respirometer zu positionieren.
- Notieren Sie die Wärmeproduktion, indem man den Cursor über die Ablaufverfolgung anzeigen Heizleistung für die angesehene Ampulle zum Zeitpunkt bestimmt, im Schritt und ausdrücklich als µW/Millionen Zellen. Sauerstoff-Verbrauch-Daten zu sammeln und stellen Sie sicher, dass es als Pmol O2 x s-1 x Millionen Zellen exprimiert wird.
- Um das CR-Verhältnis berechnen, zuerst konvertieren Sie µW in kJ/s, und verteilen Sie kJ/s über Mol/s O2, ausgedrückte als kJ/Mol O2CR-Verhältnis zu erhalten. Hinweis: Der CR-Verhältnis wird in kJ/Mol O2vorgestellt.
(siehe ergänzende Datei 1)
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Representative Results
Die Reproduzierbarkeit der Messungen der Calorespirometric hängt eine richtige und konsequente Probenvorbereitung. Proben aus Zellkultur sollte nicht verwendet werden, wenn die Platten bewachsen sind, wie zellenzahlen aufgrund Verklumpung ungenau werden können. Darüber hinaus reduzierte Wärmeströme durch begrenzte Substrat Diffusion in den aufgehäuften Zellen auftreten. Adhärente Zellen verwenden, ist es daher, eine Platte mit der Konfluenz zwischen 60-80 % wählen und ändern Sie das Medium 24 h vor dem Experiment von entscheidender Bedeutung.
Korrekte instrumental Kalibrierung und Wartung sind auch entscheidend für informative und reproduzierbare Calorespirometric Messungen. Anhand der Hersteller niedergelassen Reinigung Protokoll für die Respirometer, umfangreiche Waschungen mit Ethanol werden implementiert, um sicherzustellen, dass passives hydrophobe Entkuppler und Inhibitoren entfernt werden und nicht die Messungen von teilweise beeinträchtigen hemmende oder abkoppeln Mitochondrien. Wenn die Respirometer Kammer vor der Probenmessung betrieben wird, sollte die Sauerstoffkonzentration und die Sauerstoff-Fluss-Spuren stabil, wie in Abbildung 1dargestellt. Ist die POS Sensor Service benötigen, wird der Sauerstoff-Fluss nicht stabilisieren, wie in Abbildung 2dargestellt. Messungen sollten nicht durchgeführt werden, wenn die POS nicht ordnungsgemäß gewartet wird. Darüber hinaus sollte die Ampullen in der Kalorimeter verwendet werden gereinigt, sterilisiert und getrocknet vor dem Gebrauch als biologische Kontamination die Wärmeproduktion der Probe stören kann.
Zellproben bereiten wir nach der richtigen Kalibrierung und Vorbereitung der Respirometer und das Kalorimeter. Erstens der Anschlag in der Respirometer ist geschlossen und die Kammer wird überprüft, um sicherzustellen, dass keine Luftblasen vorhanden sind. HepG2-Zellen sind dann konzentrierte sich auf ~ 2 x 10650 µL für respirometrie und sofort auf Eis gelegt. Für Kalorimetrie sind HepG2-Zellen aus der konzentrierte Probe in äquilibriert DMEM bei ~ 1 x 105 Zellen/mL verdünnt. Nachdem Zellen von pipettieren gründlich gemischt werden, wird eine sterile Ampulle 2,5 mL der Suspension hinzugefügt. Die Ampulle ist dicht, und jeglichen externen Schmutz wird entfernt, indem der Ampulle mit einem Luftstrom von einer Luftpumpe bläst. Die Ampulle wird dann langsam abgesenkt, Position 1, wo bleibt es für 15 Minuten. Nach 15 min vergangen, die Referenz und Sample Ampullen dann langsam auf Position 2 sinken und Messungen können aufgezeichnet werden, wenn die Heizleistung ist stabil (Abbildung 3) beginnen.
Eine endgültige Zellenzahl wird ausgeführt, nachdem das Kalorimeter und Respirometer zu bestimmen, die genaue Anzahl der Zellen in das Kalorimeter eingeführt die Zellen hinzugefügt werden. Die Wärmeerzeugung wird dann pro million Zellen ausgedrückt. Wenn die HepG2-Zellen in der Abwesenheit von Glukose kultiviert und Galaktose ergänzt wird um mitochondriale Beteiligung zu erhöhen, die Zellen nicht innerhalb der Kalorimeter zu vermehren, aber stattdessen verringern ihre metabolische Aktivität nach ca. 30 min in der Ampulle. Dies schränkt die CR-Berechnung zu den frühesten Zeitpunkt an dem die Wärmeabfuhr gemessen wurde (Abbildung 4).
Es ist wichtig, die Zeit aufzuzeichnen, die die Zellen der Ampulle hinzugefügt werden, so dass die Messungen des Wärmeverbrauchs Produktions- und Sauerstoff zu gleichen Zeitpunkten erhoben werden. Wenn diese Vorsichtsmaßnahme nicht genommen wird, können wichtige experimentelle Fehler bei der Bestimmung des Verhältnisses CR eingeführt werden. Während der 15-Minuten-Periode während der Ampulle auf Position 1 in das Kalorimeter ist, die Zellen sind ausreichend durch pipettieren sie gemischt, und 2 x 106 Zellen sind in der Respirometer über eine Hamilton-Spritze injiziert. Sauerstoff-Fluss stabilisiert sich nach ca. 15 min und Sauerstoff Konzentration stetig (Abbildung 5 abnimmt). Wiederum ist es wichtig, dass die Zeit der probeninjektion für die Datenanalyse aufgezeichnet ist. Der stabilisierten Sauerstoff-Fluss der Zellen dient als Ersatz für Sauerstoff-Verbrauch bei der Berechnung der CR-Verhältnisses. Zusätzliche Titrationen werden durchgeführt, um die Leck-Atmung (1 µL Oligomycin) gekennzeichnet durch einen Tropfen auf einen niedrigeren Sauerstoff-Fluss und die maximale abgekoppelt Atmung (3-5 Titrationen von 2 µL FCCP) gekennzeichnet durch den Ausfall die Atmung nach erhöhen bewerten aufeinanderfolgenden FCCP Titrationen. Eine unvollständige Entkopplung oder eine Hemmung der Atmung möglicherweise nicht eingehalten, wenn die FCCP Lager (Abbildung 6) abgelaufen ist.
Bild 1:100 % Luft Kalibrierung von Respirometer und Status der polarographischen Sauerstoff-Sensor (POS). Die Signale für die Sauerstoffkonzentration (blaue Linie) und der Sauerstoff-Fluss (rote Linie) sowohl vor der Luft 100 % Kalibrierung zu stabilisieren. Die stabile Linien zeigen, dass die Respirometer kalibriert ist. Die Kalibrierung sollte durchgeführt werden, in DMEM und nicht in H2O. Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: POS Service benötigen. Nach der Stabilisierung der Sauerstoffkonzentration (blaue Spur) nicht der Sauerstoff-Fluss (rote Spur) zu stabilisieren. Der POS sollte nicht verwendet werden, für Experimente und Dienst sollte angewendet werden, wie vom Hersteller beschrieben. Eine erhöhte Instabilität des Flussmittels Sauerstoff korreliert mit einer steigenden Nachfrage für POS-Service. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Ca. 2,5 x 105 HepG2-Zellen kultiviert in Glukose Medium zeigen Anzeichen von Verbreitung in das Kalorimeter. ~2.5 X 105 HepG2 Ladezellen kultiviert in Anwesenheit von Glukose pro Ampulle erzeugt eine Konstante Wärmeproduktion von-20 bis-28 µW mit dem 30 µW-Einstellung am Gerät und im Laufe der Zeit eine erhöhte Wärmeproduktion korreliert mit Zellproliferation im Inneren der Ampulle. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4: Ca. 2,5 x 105 HepG2-Zellen kultiviert in Galaktose Medium nicht vermehren und Produktion sinkt im Laufe der Zeit zu heizen. ~2.5 X 105 HepG2 Ladezellen kultiviert in Galaktose pro Ampulle ergibt eine sofortige Wärme-Erzeugung von ~-20 µW. Jedoch die Wärmeproduktion im Laufe der Zeit abnimmt und schränkt die CR-Verhältnis Messungen zu den frühen Zeitpunkten des Experiments. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5: Routine, losgelöst, und Leck Atmung der Zellen HepG2. Sobald die Respirometer Zellen injiziert wurden, verringerte Sauerstoffkonzentration kontinuierlich (blaue Spur). Nach der Stabilisierung der Sauerstoff-Fluss (rote Spur) während der routinemäßigen Atmung der intakte Zellen wurde Oligomycin hinzugefügt, um die F0F1-ATP-Synthase hemmen. Dies wird durch die Stabilisierung der Sauerstoff-Fluss nach Oligomycin Zugabe, das Leck Atmung enthüllt. Ca. 3-5 Titrationen FCCP sollte zu Atmung von ATP-Synthese zu entkoppeln und offenbaren Elektronentransport Systemkapazität (ETS) durchgeführt werden. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 6: erfolglose Entkopplung der Zellatmung HepG2. Nach Zugabe von Zellen Sauerstoff flux stabilisierte (rote Spur) während der routinemäßigen Atmung und Sauerstoff Konzentration stetig abgenommen (blaue Linie). Titration von FCCP führte eine unvollständige abkoppeln und eventuelle Hemmung, verhindern, dass die maximale Kapazität der ETS erreicht wird. FCCP war wahrscheinlich verunreinigt oder nach längerer Lagerung abgebaut. Wenn beobachtet, muss ein frischer FCCP Vorrat vorbereitet werden. Außerdem bestätigen Sie, dass das Oligomycin hemmt nicht ETS Kapazität beim Entkuppeln. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Das Ziel des Calorespirometry ist quantitativ bewerten die Beiträge der aeroben und anaeroben Wege zur Stoffwechselaktivität und erhalten eine zusammengesetzte Ansicht der Zellenergie Flussmittel. Dies geschieht durch eine gleichzeitige Messung der Wärmeableitung und Sauerstoff-Fluss, gefolgt durch einen Vergleich der berechneten CR-Verhältnis mit der theoretischen Oxycaloric entspricht. Mehrere wichtige Schritte müssen für reproduzierbare und zuverlässige Daten berücksichtigt werden. Die Aufrechterhaltung einer sterilen, gesunde Zelle Kultur ist von entscheidender Bedeutung. Kontamination durch Bakterien oder Pilze führen veruntreuter Produktion oder Sauerstoff Wärmeverbrauch, Rendern das CR-Verhältnis bedeutungslos. Weitere, unsachgemäße Zelle zählt, schlechte Probe mischen, oder aufgehäuften Zellen können auch in einem ungenauen CR-Verhältnis führen. Ein wichtiger Schritt im Hinblick auf die Respirometer ist ordnungsgemäße Probenvorbereitung, so dass die Injektion unter 50 µL Volumen. Dieses Volumen sorgt für eine minimale Menge des Mediums wird aus der Kammer verdrängt und der Sauerstoffverbrauch ist richtig, 2 x 106 Zellen zugeschrieben. Sobald regelmäßige Atmung beobachtet wird, ist das vorgeschlagene Protokoll kompatibel mit zwei zusätzlichen Titrationen (Oligomycin und FCCP), die Leck Atmung und ETS Kapazität der Mitochondrien zu beleuchten. Für diese Anwendung kann übermäßiger Zugabe von FCCP Atmung hemmen und maximale Flussmittel verhindern; Daher sollte mindestens 3-5 Titrationen vor dem Erreichen der maximalen abgekoppelt Atmung durchgeführt werden.
Wartung und korrekte Kalibrierung des Respirometer und Kalorimeter ist entscheidend für Calorespirometry. Die Titration Protokoll für Hintergrund-Sauerstoff-Verbrauch wird dringend empfohlen und erfolgt mit schrittweisen Titrationen Dithionite, verminderte Sauerstoff-Niveaus innerhalb der Kammer zu erreichen. Dies ist eine wesentliche Maßnahme zur Bestätigung dicht verschlossenen Kammern und für hinten Sauerstoffdiffusion in den Kammern zu korrigieren, vor allem, wenn Messungen an einer niedrigen Sauerstoff-Spannung durchgeführt werden. Auch kann ein Rührer Test vor Zugabe der Zellen über die Reaktionsfähigkeit des POS informieren. Wenn die Reaktionsfähigkeit ist schlecht oder der Sauerstoff-Flux ist nicht stabil (Abbildung 2), Service am POS ist erforderlich. Unsachgemäße Reinigung der Respirometer Kammern kann Restmengen von Inhibitoren oder Entkuppler, die spätere Experimente auswirken lassen. Luftblasen in der verschlossenen Kammer sind auch in der Lage ist, die Messungen stören und können eingeführt werden beim Schließen der Kammer oder während der probeninjektion wenn Luftblasen in der Spritze vorhanden sind. Die Kalorimeters Protokoll ist direkter, aber es ist auch anfällig für experimentellen Fehler. Beispielsweise ermöglicht die fehlerhafte Abdichtung der Ampulle Verdampfung auftreten, wodurch massiv Wärmestrom geändert.
Eine Einschränkung dieser Methode ist, dass nicht alle Zellen in der Suspension gezüchtet werden können und viele Zelllinien sind Anhänger der Zellplatte Kultur oder Substrat. Um Experimente durchzuführen, müssen die angeschlossene Zellen enzymatisch aus der Platte durch den Einsatz von Dissoziation Mittel wie Trypsin verdrängt werden. Zellen in diesem Zustand möglicherweise nicht in der logarithmischen Wachstumsphase und ihrer Physiologie kann geändert werden. Damit nachfolgende Analyse über , die das Kalorimeter und Respirometer vor kurzem trypsiniert Zellen beurteilen können gestört ZELLAKTIVITÄTEN. Darüber hinaus ist eine Einschränkung in der vorgestellten kalorimetrisch Protokoll der Sedimentation der Zellen in der beiliegenden Ampullen, lokale Hypoxie rund um die Zellen aufgrund der langsamen Sauerstoffdiffusion in wässrigen Lösungen führen. Wir haben festgestellt, dass ~ 3 x 105 Zellen die Obergrenze mit den Ampullen, die in diesem Protokoll verwendeten kompatibel ist. Erhöhung der Anzahl der Zellen kann eine hypoxische Umgebung aus der Sedimentation der Zellen, beeinträchtigen die Ergebnisse erzeugen. Optimierung ist so kritisch, wenn eine andere Zelllinie untersucht und alternative Ansätze berücksichtigt werden wie die Erhöhung der mittleren Dichte, die Sedimentation der Zellen24zu reduzieren. Ampullen gibt es diese Erlaubnis rühren; Allerdings ist es wichtig, sicherzustellen, dass eine minimale Signal-Rausch-Verhältnis während der Aufregung vorhanden ist. Darüber hinaus Kalorimeter neben dem beschäftigt in diesem Protokoll sind kompatibel mit Calorespirometry und ihre Fähigkeiten möglicherweise darüber hinaus, was wir vorgestellt haben. Eine weitere Einschränkung der Calorespirometric Analyse über ein zwei-Kammer-Respirometer ist die Unfähigkeit eine Hochdurchsatz-Analyse, die wichtigsten pharmazeutischen Entwicklung wäre. Diese Einschränkung wird jedoch durch die Kapazität für eine hochauflösende Charakterisierung der Verbindung Einfluss auf die Atmungskette und mitochondriale Physiologie ausgeglichen.
Die Kapazität für hochauflösende und gleichzeitige Messung des Wärmestroms Ausgabe und Sauerstoff aus der gleichen Probe ist eine wesentliche Stärke dieser Methode. Ein möglicher Goldstandard bei adhärenten Zellen würde sein, sowohl Kultur und Zellen gezüchtet auf Microcarrier Perlen in der Schwebe zu analysieren. Diese Methode würde die negative Auswirkungen für die Dissoziation von der Zelloberfläche Kultur vermeiden und ermöglichen die Analyse der zellulären Funktionen in verschiedenen Phasen der Wachstumskurve (logarithmische Phase vs. Kontakt gehemmt Phase7). Leider kann mit Microcarrier Perlen problematisch wegen der hohe Rührgeschwindigkeit in der Respirometer und das Potenzial für das Schleifen der Perlen zusammen mit Zellen unterhalb der Stir Bar erforderlich sein. Trotz dieser Einschränkungen bleibt ein breites Anwendungsspektrum mit Calorespirometry kompatibel. Insbesondere ist diese Methode bereit, um besser pharmazeutische Entwicklung durch schnelle Identifizierung Mitotoxic Verbindungen in kultivierten Zellen zu erleichtern.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde zum Teil finanziert von der National Science Foundation Grant CHE 160944, Mary E. Konkle und Michael A. Menze.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HepG2 Cells | American Type Culture Collection | HB-8065 | Cells used for calorespirometry |
| O2k-Respirometer | Oroboros Instruments | 10022-02 | Respirometer |
| LKB 2277 thermal activity monitor (TAM) | Thermometric AB | Thermometric was purchased by TA Instruments | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | Thermofisher Scientific | 11360070 | 100x solution added to DMEM medium |
| Fetal Bovine Serum - Premiuim Select | Atlanta Biologicals | S11550 | Added to 10% in DMEM medium |
| Trypsn-EDTA (0.25%) | Thermofisher Scientific | 25200072 | Cell dissociation reagent |
| Oligomycin from Streptomyces diastatochromogenes | Sigma Aldrich | O4876 | Mitochondrial Inhibitor |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone | Sigma Aldrich | C2920 | Mitochondrial Uncoupler |
| Corning 100 mm TC-Treated Culture Dish | Corning Corporation | 430167 | Tissue culture dish |
| Glucose, powder | Thermofisher Scientific | 15023021 | Glucose for DMEM medium |
| Galactose, powder | Fischer Scientific | BP656500 | Galactose for DMEM medium |
| L-Glutamine (200 mM) | Thermofisher Scientific | 25030081 | Glutamine for DMEM medium |
| DMEM, no glucose | Thermofisher Scientific | 11966025 | Cell culture medium |
References
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