Summary
Det här protokollet beskriver calorespirometry, direkta och samtidig mätning av både värmeavledning och andning, som ger en icke-invasiv metod för att bedöma energimetabolism. Denna teknik används för utvärdering av bidraget av både aeroba och anaeroba vägar till energiutnyttjande genom att övervaka det totala cellular energiflödet.
Abstract
Många cellinjer som används i biologisk och biomedicinsk grundforskning upprätthålla energi homeostas genom en kombination av både aerob och anaerob respiration. Den utsträckning som båda vägar bidrar till landskap av cellulär energiproduktion är dock konsekvent förbisedd. Celler odlade i mättar glukosnivåerna ofta visar en minskad beroende på oxidativ fosforylering för ATP produktionen, vilket kompenseras av en ökning av substrat-nivå fosforylering. Detta skifte i metabola poise tillåter celler för att föröka trots närvaron av mitokondriell toxiner. I försumma den förändrade metaboliska balans av celler, resultat från en farmaceutisk screening kan misstolkas sedan den potentiellt mitotoxic effekter kan inte identifieras med hjälp av modell cellinjer odlade i närvaro av hög glukos koncentrationer. Det här protokollet beskriver hopkoppling av två kraftfulla tekniker, respiration och calorimetry, vilket möjliggör kvantitativa och icke-invasiv bedömning av både aeroba och anaeroba bidrag till cellulär ATP produktionen. Både aeroba och anaeroba respirations generera värme, vilket kan vara övervakade via kalorimetri. Samtidigt kan mäta graden av syreförbrukning bedöma omfattningen av aerob respiration. När både värmeavledning och syreförbrukning mäts samtidigt, kan calorespirometric förhållandet bestämmas. Experimentellt erhållna värdet kan sedan jämföras med de teoretiska oxycaloric motsvarande och omfattningen av den anaeroba andningen kan bedömas. Calorespirometry ger således en unik metod för att analysera en rad biologiska frågor, inklusive läkemedelsutveckling, mikrobiell tillväxt och grundläggande bioenergetik under både normoxic och hypoxisk villkor.
Introduction
I biologiska system, värme-release eller entalpi förändringen under metabolismen är vanligtvis övervakas antingen direkt (via direkt calorimetry) eller indirekt via O2 konsumtion eller CO2 produktion (via respiration). Tyvärr, när dessa tekniker används i isolering, kritisk information går förlorad, såsom bidrag till anaerob vägar till cellulär metabolism. Calorespirometry är en kraftfull teknik som bygger på samtidig mätning av både värmeavledning och andning. Banbrytande calorespirometric arbete undersökt anaerob metabolism i fullt syresatt däggdjursceller och visat samtidiga bidragen från både aeroba och anaeroba vägar till energi homeostas trots transformerade celler i en fullt syresatt miljö1. Calorespirometry har sedan dess kopplats till ett brett utbud av biologiska frågor. Några exempel är studiet av djurens Energetik på låga syrenivåer, effekterna av både herbicid och östrogen på gälarna musslor, metabolismen av landlevande organismer och mikrobiell nedbrytning av organiskt smuts fråga2, 3 , 4 , 5 , 6. calorespirometry har dessutom avslöjade hur metabola prekonditionering före frysning förbättrar Frysförvaring av däggdjurs-celler7. Varje strategi, både kalorimetri och respiration, självständigt har ökat vår kunskap om cellulära och organismers blockeringar. Grundläggande biologiska frågor som kan besvaras med hjälp av calorespirometry är dock fortfarande relativt outforskat.
Hess lag säger att den totala entalpi förändringen av en reaktion är oberoende av vägen mellan de inledande och avslutande staterna. Den totala entalpi förändringen för en biokemisk väg är exempelvis summeringen av förändringen i enthalpies av alla reaktioner inom vägen. Calorimetry erbjuder en realtid strategi för mätning av cellulära värmeproduktion, som urskillningslöst upptäcker både aeroba och anaeroba vägar. Detta är baserat på stiftelsen att ingen energi utbyts i systemet utom genom väggarna av experimentella ampull8. En förändring i värmeavledning är lika till förändring i entalpi släppt från alla metaboliska reaktioner i ampullen. Således korrelerar en negativ entalpi till en förlust av värme från systemet. Omfattande forskning under de senaste fyra decennierna har präglat det termodynamiska landskapet av både katabolism och anabolism. Detta representeras av en stadig ökning av forskningsartiklar som finns under de söktermer som ”biologiska” och ”kalorimetri” som indexeras av USA nationella bibliotek av Medicine (NLM) vid National Institutes of Health (PubMed). Sökningen visar att före 1970, sammanlagt 27 publikationer referens biologiska kalorimetri; under tiden i 2016 ensam utnyttjade 546 publikationer tekniken.
Kalorimetriska metoder är väletablerat att bestämma värmeproduktion. Dock beviljas mer flexibilitet för att lösa det respirometric värdet. Respirometric mätning kan bestå av O2, CO2, eller både O2 och CO2. Ytterligare, mätning av O2 eller CO2 kan ske genom olika tekniker, inklusive optrodes, Clark-typ elektroder och tunable diod laser absorption spektroskopi7,9,10 ,11. CO2 -produktion är en värdefull metriska i många respirometric studier, använder medium för odlade celler ofta en bicarbonic buffertsystem för pH kontroll12,13. För att undvika komplikationer av CO2 mätning i bikarbonat systemet, använder följande protokoll för calorespirometry av celler i kultur O2 som den enda respirometric parametern.
Samtidiga med att mäta syre flux, vissa respirometers (se Tabell för material) är utformade för detaljerade bedömningar av mitokondriell funktion. Substrat-uncoupler-hämmare-titreringar (kostym) protokoll är väl etablerade och är kompatibla med experiment som utformats för att mäta membran potentiella eller reaktiva syre arter (ROS) bildandet14. Presenterade protokollet för calorespirometry av intakta celler är kompatibel med införandet av kemiska uncouplers såsom karbonyl cyanid-p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) och F0F1-ATP-syntas hämmare oligomycin. Genom tillägg av FCCP, kan syreförbrukning vara okopplade från ATP produktionen, vilket är användbart för att bedöma effekten av potentiella therapeutics på mitokondriell 's diesel15. Dessutom belyser tillägg av oligomycin omfattningen av läcka respiration. Således är respirometric mätningarna utförs under calorespirometry kompatibel med omfattande protokoll utformat för att ytterligare belysa mitokondriell fysiologi.
Samtidig mätning av både värmeavledning och syre flux möjliggör beräkning av förhållandet calorespirometric (SP). Denna kvot jämförs sedan med den Thorntons konstant eller den teoretiska oxycaloric motsvarande, som sträcker sig mellan -430 till-480 kJ mol-1 beroende på cellinje eller vävnad av intresse och kompletterade kol substrat1, 16. således en mer negativ baserat på CR avslöjar ökade bidrag från anaerob spridningsvägar till övergripande metabolisk aktivitet. Exempelvis förhållandet CR för rutinmässig muskel vävnad respiration utan aktiva utförandet av arbete sträcker sig från -448-468 kJ mol-1 vilket är inom spänna av den teoretiska oxycaloric motsvarande17,18. Samtidigt däggdjur cancerceller odlade i medium som är hög i glukos visar förbättrad mjölksyra jäsning efter glykolys och låga relativt mitokondriell engagemang19. Denna fenotyp resulterar i CR nyckeltal i spänna av -490 till-800 kJ mol-1, visar en ökad medverkan av de anaeroba vägarna i den cellulära metabolismen som anges av mer negativ CR nyckeltal1,7, 16,20.
Både kommersiella och ideella cell- och distributörer för närvarande erbjudande cellinjer från över 150 arter, med nästan 4.000 cellinjer som härrör från människor. Förevigade cellinjer är praktiska verktyg för att snabbt utvärdera toxiciteten av potentiella therapeutics, varav många kan direkt eller indirekt påverka mitokondriell funktion. Med hjälp av celler under drogkontroll kan vara av begränsat värde delvis på grund av Warburg effekten, ett kännetecken för många cancerformer. Ofta cancer generera ATP från substrat-nivå fosforylering och upprätthålla redox balansen genom produktion av laktat utan fullt engagerande mitokondrien under aeroba förhållanden19. Läkemedelsutveckling är notoriskt kostsamma och ineffektiva, med cirka 8 av 9 föreningar testas i kliniska prövningar inte uppnår marknaden godkännande21. Även potentiella therapeutics kan passera inledande screening på grund av låg cytotoxicitet i cellinjer, är det möjligt att vissa av dessa föreningar är mitotoxic. Utan en lämplig metod för att upptäcka hur dessa toxiner kan försämra energibalansen i primära celler som inte visar effekten Warburg, är kritisk information ofta förbisedda, genomströmning terapeutisk utveckling i tidigt skede.
Calorespirometry är en praktisk, icke-invasiv metod att analysera metabolisk aktivitet i en mängd olika biologiska prover, inklusive celler och vävnader. Kärnan i protokollet presenteras är kompatibel med en rad applikationer. En komplikation, dock har identifierats. Förevigade celler odlas ofta i ett glukos-fri medium kompletteras med galaktos att öka bidraget från oxidativ fosforylering (OXPHOS) för energiproduktion, för att medvetandegöra celler till potentiella mitotoxins22, 23. Denna metaboliska omprogrammering verkar skymma analys när prover placeras i de rostfria ampuller som används av de kalorimeter15. Celler odlade i glukos medium fortsätter att engagera sig i höga metaboliska aktiviteten i flera timmar. Samtidigt minska celler odlade i galaktos medium värmeproduktion inom 30 min av deras placering i ampullen, att göra mätningar begränsas till tidig experimentell tidpunkter. Detta beteende, hindrar tyvärr möjlighet att bedöma deras cellulära spridning. Trots denna särskilda begränsning, de flesta program är kompatibla med calorespirometric analys och detaljerad metabola information kan erhållas genom detta tillvägagångssätt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. cell kultur
- Upprätthålla mänskliga hepatocellulärt karcinom (HepG2) celler i Dulbeccos modifierade örnens medium (DMEM) innehållande 10% fetalt bovint serum (FBS) och ytterligare substrat (10 mM glukos, 2 mM glutamin och 1 mM pyruvat) vid 37 ° C i en cell kultur inkubator (5% CO2 , 95% luft, 100% luftfuktighet).
Obs: Använd ovanstående DMEM formuleringen när DMEM refereras i senare steg för respiration och kalorimetri. - Platta celler på 1 x 106 celler per 100 mm kultur platta och subkultur dem varje 7 dagar eller innan den når 90% konfluens och förnya medium varje 3-4 dagar.
- Utföra experimenten när cellerna är 60-80% konfluenta.
2. förberedelse av Respirometer och kalorimeter
- Pipettera 2.2 mL DMEM in i respirometer kammaren, sätt i proppen, och justera den med verktyget propp spacer som möjliggör optimal syre diffusion från luften till medium.
- Rör kontinuerligt vid 37 ° C tills syrehalten (blå trace) och syre flux (röda spår) är stabila. Säkerställa den respirometer programvaran är programmerad att redovisa syre lösligheten hos det medium som används i experimentet.
Obs: Olika medier har olika syre löslighet koefficienter (t.ex., DMEM = 0,92). - Efter stabilisering av syrekoncentrationen i DMEM kammaren är öppen, markera en stabil del av syre koncentration tracen och kalibrera den för 100% luft mättnad.
- Kalibrera för 0% syre att välja en stabil del av syre koncentration spårningen när inget syre är närvarande i kammaren. Utför det här steget om du efter 20 µL titrering av 230 mM natrium Ditionit eller efter allt syre förbrukas av det biologiska provet i slutet av ett experiment.
- Efter 100% luft kalibrering av respirometer, stänga proppen och säkerställa att inga bubblor är närvarande i kammaren.
Obs: en liten ökning i syre flux kommer att identifieras i den slutna kammaren som polarographic syresensorn (POS) förbrukar syre för att mäta partialtrycket syrgas. - Efter ~ 10 min av proppen stängs, bekräfta att respirometer är redo för HepG2 celler genom att observera en stabil syre flux.
Obs: Den kalorimeter som används här som använder rostfria ampuller och kräver en ampull ska användas som referens. - Tillsätt 2,5 mL H2O (dH2O) [lika volym som proverna (steg 4)] till referens ampull av kalorimetern och dra åt den gemensamma jordbrukspolitiken, med tång om det behövs. Rengör den förseglade ampullen med luftflöde och sakta sänka ampullen position 1 i kanalen hänvisning av kalorimetern. Tills på position 1 biologiska prov är beredd.
3. förberedelse av HepG2 celler för respiration och kalorimetri
- Bekräfta att respirometer och kalorimetern är beredd och kalibrerad. Varm DMEM och trypsin till 37 ° C i ett vattenbad.
- Lägga till DMEM en fräsch 100 mm platta och plats i inkubatorn som möjliggör Jämviktstiden av medium för både CO2 och temperatur.
Obs: Detta medium används för kalorimetri experimentet, så lämplig volym beror på antalet ampuller som ska användas. - Bekräfta med ett inverterat ljusmikroskop att cellerna är på 60-80% konfluenta, sedan tvätta den 100 mm platta 2 x med 10 mL av rumstemperatur fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
- Tillsätt 3 mL av den 37-° C trypsin till 100 mm plattan av celler och inkubera dem i 7-10 min vid 37 ° C i cell kultur inkubatorn. Neutralisera trypsin med 3 mL 37-° C DMEM och stänga av försiktigt pipettering det ~ 20 gånger med en 5 mL Pipettera.
- Över 6 mL återsuspenderade celler DMEM och trypsin till ett sterilt 15 mL koniska rör och centrifugera det för 5 min vid 175 x g. ta bort vätskan utan att störa cellpelleten.
- Återsuspendera cellpelleten i ~ 5 mL DMEM och Pipettera noggrant för att säkerställa cellerna är tillräckligt separerade från varandra.
- Ta bort ~ 100 µL av välblandade provet och utföra en grundlig celltal utnyttja alla 8 fält på en hemocytometer att avgöra det totala antalet celler. Sedan beräkna volymen för resuspension av cellerna för att generera ~ 2 x 106 celler per 50 µL.
Obs: Detta kommer att säkerställa att 2 x 106 celler läggs till varje kammare av respirometer med minimal medium deplacement. - Centrifugera cellerna för 5 min vid 175 x g. återsuspendera pelleten i den beräknade volymen DMEM från steg 3,7.
- Utföra en celltal för att fastställa den mängd som krävs för att injicera 2 x 106 celler per kammare i den respirometer (detta bör vara ~ 50 µL). Lagra cellerna för respirometric mätning på is tills.
- Medan koncentrerad cell provet är på is, bestämma den utspädning som krävs för att producera en koncentration av 1 x 105 celler/mL för kalorimetri.
- Blanda provet väl och förbereda ~ 3 mL av celler vid 1 x 105 celler/mL i DMEM Varje ampull.
Obs: Den DMEM som används för provspädning bör det skakade medium som bereddes i steg 3.3.
4. kalorimetri
- Säkerställa att kalorimetern är ansluten till datorn och kalorimetriska signalen i µW är observerbara och stabil.
- Tillsätt 2,5 mL cellerna på 1 x 105 celler/mL (~2.5 x 105 celler) till varje ampull, att säkerställa tillräckligt med luft mellan locket på ampullen och mediet som möjliggör gasdiffusion.
- Omedelbart dra av locket, med tång om det behövs. Rengör den förseglade ampull, använda luftflödet att ta bort eventuella externa skräp, och sakta sänka ampullen position 1 av kalorimetern. Registrera den tid som ampullen sänks position 1.
- Tillåta ampullen att sitta vid läge 1 för 15 min.
Obs: Under 15 min celler är att injiceras i respirometer (steg 5). Detta säkerställer att det samma tidsintervallet används både värmeproduktion och syreförbrukning när CR förhållandet bestäms. - Efter 15 min på position 1, sakta sänka både referens- och provet ampuller till läge 2. Registrera tid i ampuller sänktes och åtgärd i minst 30 min.
5. respiration
- Under de 15 minuters mellanrum där ampullen är högst 1 i kalorimetern, börja de respirometric studierna.
- Grundligt blanda cell provet genom pipettering för att säkerställa en homogen lösning och injicera < 50 µL av det cell provet i varje kammare av respirometer för en slutlig koncentration av ~ 2 x 106 celler/kammare. Registrera den tid som cellerna injiceras i respirometer.
- Efter injektionen är HepG2 cellerna kontinuerligt rörs vid 37 ° C. Vänta minst 20-30 min för båda en stabilisering av den syre fluxen och en stadig minskning av syrekoncentrationen.
- Välj fliken O2 flux per V till höger på skärmen och markera en stabil del av syre flux. Välj märken, sedan statistik och rekord för O2 flux per V. Denna inspelning kommer att användas i beräkningen av förhållandet CR.
Obs: Steg 5.5 och 5.6 är valfria. Läcka respiration och maximal uncoupled respiration kommer att avslöjas av titreringar av oligomycin och FCCP. - Injicera 1 µL av 4mg/mL oligomycin i varje kammare och tillåta ~ 10 min för syre flux stabilisering. Spela in stabil läcka respiration klassar genom att följa steg utförs i 5.4 genom att belysa en stabil del av syre flux spårningen efter oligomycin tillägg.
- Titrera 2-µL injektioner av 0,2 mM FCCP i varje kammare, vilket möjliggör syre flux stabilisering efter varje injektion. Fortsätta titreringarna tills maximal flux nås, som indikeras av en liten nedgång i efterföljande FCCP titrering. Registrera den stabila respiration klassar under maximal flux.
6. beräkning av Calorespirometric förhållandet
- Utföra en sista cell sammanräkning av proverna beredd på ~ 1 x 105 celler/mL utnyttja alla 8 fält av en hemocytometer att avgöra det totala antalet celler som tillsätts ampullen (2,5 mL).
- Bestämma en tid att spela in mätningar från både kalorimetern och respirometer som stabila signaler är närvarande vid identiska tider. Hänvisning till den inspelade tiden då ampullen sänktes till position 2 och tiden för injektion av celler i respirometer.
- Spela in värmeproduktion genom att placera markören över spårningen visar värmeeffekt för respekterade ampullen fastställts i steget och express som µW/miljoner celler. Samla in syre förbrukningsdata och säkerställa att det uttrycks som pmol O2 x s-1 x miljoner celler.
- För att beräkna förhållandet CR, först konvertera µW till kJ/s, och sedan dividera kJ/s över mol av O2/s att erhålla CR kvoten uttryckt i kJ/mol O2. Obs: CR förhållandet presenteras i kJ/mol O2.
(se kompletterande fil 1)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Reproducerbarheten av calorespirometric mätningar är beroende av en korrekt och konsekvent provberedning. Prover beredd från cellkultur bör inte användas om plattorna är övervuxna, eftersom blodkroppar kan bli felaktiga på grund av klumpar. Vidare, reducerad värme flöden på grund av begränsad substrat diffusion i klampade cellerna kan uppstå. Därför, när du använder vidhäftande celler, är det kritiskt att Välj en tallrik med konfluens mellan 60-80% och ändra medium 24 h före försöket.
Ordentlig instrumental kalibrering och underhåll är också kritisk för informativ och reproducerbara calorespirometric mätningar. Genom att följa tillverkarens etablerade rengöring protokoll för respirometer, omfattande tvättar med etanol genomförs för att säkerställa att kvarvarande hydrofoba uncouplers och -hämmare tas bort och inte äventyrar mätningarna av delvis hämmande eller uncoupling mitokondrier. När respirometer kammaren är i drift före provet mätning, bör både syrekoncentrationen och syre flux spår vara stabila som visas i figur 1. Om POS är i behov av sensorn tjänst, kommer syre flux inte stabilisera som kan ses i figur 2. Mätningar skall inte utföras när POS inte är ordentligt servad. Dessutom bör de ampuller som utnyttjas i kalorimetern rengöras, steriliserad, och torkas före användning, som biologiska föroreningar kan störa värmeproduktion av provet.
Cellprover tillagas efter ordentlig kalibrering och beredning av både respirometer och kalorimetern. Först proppen i respirometer är stängd och kammaren inspekteras för att säkerställa att inga luftbubblor är närvarande. Sedan är HepG2 celler koncentrerad till ~ 2 x 106/50 µL för respiration och omedelbart placeras på is. För calorimetry späds HepG2 celler från koncentrerad provet i skakad DMEM på ~ 1 x 105 celler/mL. När cellerna blandas grundligt genom pipettering, läggs 2,5 mL av suspensionen till en steril ampull. Ampullen är tättslutande och eventuella externa skräp tas bort genom att blåsa ampullen med en luftström från en luftpump. Ampullen är sedan sakta sänkte position 1, där det återstår för 15 min. Efter 15 min har gått, både referens- och provet ampuller sänks sedan långsamt till läge 2 och mätningar kan börja registreras när den värmeeffekt är stabil (figur 3).
En sista celltal utförs när cellerna läggs till både kalorimetern och respirometer att avgöra det exakta antalet celler som förs in i kalorimetern. Värmeproduktion uttrycks sedan per miljon celler. Om de HepG2 cellerna odlas i avsaknad av glukos och galaktos kompletteras för att öka mitokondriell engagemang, cellerna föröka inte inuti kalorimetern, men istället minska deras metaboliska aktiviteten efter ca 30 min i ampullen. Detta begränsar CR beräkningen till den tidigaste tidpunkten vid vilken värmaskingrandet mättes (figur 4).
Det är viktigt att registrera den tid som cellerna tillsätts ampullen så att mätningarna av värmeförbrukningen produktion och syre samlas vid samma tidpunkter. Om denna försiktighetsåtgärd inte tas, viktigt experimentella fel kan införas vid fastställandet av förhållandet CR. Under perioden 15-min ampullen är högst 1 i kalorimetern, cellerna är tillräckligt blandat av pipettering dem medan 2 x 106 celler injiceras i den respirometer via en Hamilton spruta. Syre flux stabiliseras efter ca 15 min och syre koncentration stadigt minskar (figur 5). Återigen är det avgörande att tidpunkten för prov injektion registreras för dataanalys. Stabiliserat oxygen flödet av cellerna fungerar som surrogat för syreförbrukning vid beräkningen av förhållandet CR. Ytterligare titreringar utförs för att bedöma den läcka respirationen (1 µL oligomycin) indikeras av en droppe till en lägre syre flux och maximal uncoupled respirationen (3-5 titreringar av 2 µL FCCP) indikeras av misslyckandet med att öka andningen efter successiva FCCP titreringar. Kanske inte en ofullständig uncoupling eller en hämning av respiration observerats om FCCP beståndet har löpt ut (figur 6).
Figur 1:100 % luft kalibrering av respirometer och status för polarographic syresensor (POS). Signalerna för syrekoncentrationen (blå linje) och syre flux (röda linjen) både stabilisera före 100% luft kalibreringen. De stabila linjerna visar att respirometer är redo för kalibrering. Kalibrering ska utföras i DMEM och inte i H2O. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 2: POS i behov av service. Efter stabiliseringen av syrekoncentrationen (blå trace) misslyckas syre flux (röda trace) att stabilisera. Producentorganisationerna bör inte användas för experiment och service bör tillämpas som beskrivs av tillverkaren. En ökad instabilitet av syre flux korrelerar med en ökad efterfrågan på POS service. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: 2,5 x 105 HepG2 celler odlade i glukos medium visar tecken på spridning i kalorimetern. Laddar ~2.5 x 105 HepG2 celler odlade i närvaro av glukos per ampull genererar en konstant värmeproduktion av -20 till-28 µW med inställningen 30-µW på instrumentet och en ökad värmeproduktion över tid korrelerar med cellulär proliferation inuti ampullen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: 2,5 x 105 HepG2 celler odlade i galaktos medium inte föröka och värma produktionen minskar med tiden. Laddar ~2.5 x 105 HepG2 celler odlade i galaktos per ampull resultat i en omedelbar värmeproduktion av ~-20 µW. Dock värmeproduktion minskar med tiden och begränsar CR-baserat på mätningar till tidig punkter av experimentet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: rutin, uncoupled, och läcka respiration HepG2 celler. När celler injicerades i respirometer, minskade syrekoncentrationen stadigt (blå trace). Efter stabiliseringen av syre flux (röda trace) under den rutinmässiga respirationen av intakta celler lades oligomycin hämma den F0F1-ATP-syntas. Detta indikeras av stabiliseringen av syre flux efter oligomycin tillägg, som avslöjar läckage respiration. Cirka 3-5 titreringar av FCCP bör utföras att avskilja andning från ATP-syntes och att avslöja elektrontransport system (ETS) kapacitet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: misslyckade uncoupling av HepG2 cellandningen. Efter tillägg av celler flux syre stabiliserad (röda trace) under rutinmässiga andning och syre koncentration stadigt minskade (blå linje). Titrering av FCCP resulterade i en ofullständig uncoupling och eventuell hämning, förhindra maximal ETS kapacitet från nåtts. FCCP var sannolikt smittade eller degraderas från långsiktig lagring. Om observerade, måste en färsk FCCP lager förberedas. Också bekräfta att oligomycin inte hämmar ETS kapacitet under uncoupling. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Syftet med calorespirometry är att kvantitativt bedöma bidragen av aerob och anaerob vägar till metabolisk aktivitet och få en sammansatt bild av cellulär energi flux. Detta sker genom samtidig mätning av värmeavledning och syre flux följt av en jämförelse mellan beräknade CR förhållandet med den teoretiska oxycaloric motsvarande. Flera kritiska steg måste övervägas för reproducerbara och tillförlitliga uppgifter. Underhåll av en steril, frisk cellkultur är kritisk. Kontamination av bakterier eller svampar kan resultera i förskingrade produktion eller syre värmeförbrukningen, rendering CR förhållandet meningslös. Ytterligare, felaktig blodkroppar, dålig prov blandning, eller sammanklibbade celler kan också resultera i en felaktig CR. Ett viktigt steg när det gäller respirometer är korrekt provberedning så att injektionen understiger 50 µL i volym. Denna volym säkerställer en minimal mängd av medium är fördrivna från kammaren och syreförbrukningen tillskrivs korrekt 2 x 106 celler. När rutinmässig respiration observeras, är föreslagna protokollet kompatibel med två ytterligare titreringar (oligomycin och FCCP), som belyser läcka respiration och ETS kapacitet av mitokondrierna. För denna tillämpning, kan Överdriven tillsats av FCCP hämma andningen och förhindra maximal flux; minst 3-5 titreringar bör därför utföras innan att nå maximal uncoupled respirationen.
Underhåll och korrekt kalibrering av både respirometer och kalorimetern är avgörande för calorespirometry. Titrering protokollet för bakgrunden syreförbrukning rekommenderas starkt och utförs med stegvis titreringar av Ditionit att nå minskad syrehalt i kammaren. Detta är en väsentlig åtgärd att bekräfta tätslutande chambers och korrigera för syre tillbaka diffusion in i kamrarna, särskilt om mätningar utförs på en låg syrehalt spänning. Dessutom utför en omrörare test före tillsats av celler kan ge information om lyhördheten för POS. Om lyhördhet är dålig eller syre flödet är inte stabil (figur 2), service till POS krävs. Felaktig rengöring av respirometer avdelningar kan lämna rester av hämmare eller uncouplers, som kan påverka efterföljande experiment. Luftbubblor i den slutna kammaren klarar också av att störa mätningarna och kan införas under stängning av kammaren eller under prov injektion om det finns luftbubblor i sprutan. Den kalorimeter protokollet är mer direkt, men det är också mottagliga för experimentella fel. Till exempel kommer att felaktig tätning av ampullen tillåta avdunstning ske som ändrar massivt värmeflöde.
En av begränsningarna med denna metod är att inte alla celler kan vara odlade i suspension och många cellinjer är anhängare till den cell kultur plattan eller substrat. För att utföra experiment, måste bifogade celler rubbas enzymatiskt från plattan med hjälp av dissociation medel såsom trypsin. Celler i detta tillstånd kanske inte i logaritmisk tillväxtfasen och deras fysiologi kan ändras. Således, efterföljande analys via som kalorimetern och respirometer nyligen trypsinized celler kan bedöma störs cellulära aktiviteter. Vidare, är en begränsning i protokollet presenterade kalorimetriska sedimentation av celler i de slutna ampuller, vilket kan leda till lokal hypoxi runt celler på grund av långsam syre diffusion i vattenlösningar. Vi har fastställt att ~ 3 x 105 celler är den övre gränsen som är kompatibel med de ampuller som används i detta protokoll. Öka antalet celler som kan generera en hypoxisk miljö från sedimentation av cellerna, att äventyra resultatet. Optimering är således kritiska om en annan cellinje utreds och alternativa metoder bör anses såsom att öka torrtillverkade minska på celler24sedimentation. Ampuller finns det tillstånd som under omrörning; Det är dock viktigt att säkerställa en minimal signal-brus-förhållande är närvarande under omrörningen. Dessutom kalorimetrar förutom en anställd i detta protokoll är kompatibla med calorespirometry och deras funktioner kan vara bortom vad vi har lagt fram. En annan begränsning av calorespirometric analys via en två-kammare respirometer är oförmågan för en hög genomströmning analys, som skulle vara mest relevanta för läkemedelsutveckling. Denna begränsning, uppvägs dock av kapaciteten för en högupplöst karakterisering av föreningens inflytande på andningsorganen kedja och mitokondrie fysiologi.
Kapacitet för både högupplösta och samtidig mätning av utdata och syre värmeflödet från samma prov är en betydande styrka av denna metod. En potentiell guldmyntfot när du använder vidhäftande celler skulle vara till både kultur och analysera celler som odlas på microcarrier pärlor i suspension. Denna metod skulle undvika de negativa effekterna av dissociation från cellytan kultur och möjliggöra analys av cellulära funktioner i olika faser av tillväxtkurvan (logaritmiska fas vs. kontakt-hämmade fas7). Tyvärr kan det vara problematiskt på grund av den höga omrörning hastigheten som krävs i respirometer och potentialen för slipning av pärlor tillsammans med celler under den uppståndelse bar med microcarrier pärlor. Trots dessa begränsningar förblir ett brett spektrum av applikationer kompatibel med calorespirometry. Denna metod är särskilt redo för att underlätta bättre farmaceutisk utveckling genom att snabbt identifiera mitotoxic föreningar i odlade celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete var delvis finansierad av National Science Foundation bidraget CHE-160944 Mary E. Konkle och Michael A. Menze.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HepG2 Cells | American Type Culture Collection | HB-8065 | Cells used for calorespirometry |
| O2k-Respirometer | Oroboros Instruments | 10022-02 | Respirometer |
| LKB 2277 thermal activity monitor (TAM) | Thermometric AB | Thermometric was purchased by TA Instruments | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | Thermofisher Scientific | 11360070 | 100x solution added to DMEM medium |
| Fetal Bovine Serum - Premiuim Select | Atlanta Biologicals | S11550 | Added to 10% in DMEM medium |
| Trypsn-EDTA (0.25%) | Thermofisher Scientific | 25200072 | Cell dissociation reagent |
| Oligomycin from Streptomyces diastatochromogenes | Sigma Aldrich | O4876 | Mitochondrial Inhibitor |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone | Sigma Aldrich | C2920 | Mitochondrial Uncoupler |
| Corning 100 mm TC-Treated Culture Dish | Corning Corporation | 430167 | Tissue culture dish |
| Glucose, powder | Thermofisher Scientific | 15023021 | Glucose for DMEM medium |
| Galactose, powder | Fischer Scientific | BP656500 | Galactose for DMEM medium |
| L-Glutamine (200 mM) | Thermofisher Scientific | 25030081 | Glutamine for DMEM medium |
| DMEM, no glucose | Thermofisher Scientific | 11966025 | Cell culture medium |
References
- Gnaiger, E., Kemp, R. B. Anaerobic metabolism in aerobic mammalian cells: information from the ratio of calorimetric heat flux and respirometric oxygen flux. Biochimica et Biophysica Acta. 1016, 328-332 (1990).
- Barros, N., Gallego, M., Feijoo, S. Calculation of the specific rate of catabolic activity (Ac) from the heat flow rate of soil microbial reactions measured by calorimetry: significance and applications. Chemistry & Biodiversity. 1, 1560-1568 (2004).
- Cheney, M. A., Fiorillo, R., Criddle, R. S. Herbicide and estrogen effects on the metabolic activity of Elliptio complanata measured by calorespirometry. Comparative Biochemistry and Physiology - Part C: Pharmacology, Toxicology and Endocrinology. 118, 159-164 (1997).
- Wadso, L., Hansen, L. D. Calorespirometry of terrestrial organisms and ecosystems. Methods. 76, 11-19 (2015).
- Gnaiger, E. Animal energetics at very low oxygen: information from calorimetry and respirometry. Strategies for Gas Exchange and Metabolism. Woakes, A. J., Grieshaber, M. K., Bridges, C. R. , Cambridge University Press. London. 149-171 (1991).
- Barros, N., Hansen, L. D., Pineiro, V., Perez-Cruzado, C., Villanueva, M., Proupin, J., Rodriguez-Anon, J. A. Factors influencing the calorespirometric ratios of soil microbial metabolism. Soil Biology and Biochemistry. 92, 221-229 (2016).
- Menze, M. A., Chakraborty, N., Clavenna, M., Banerjee, M., Liu, X. H., Toner, M., Hand, S. C. Metabolic preconditioning of cells with AICAR-riboside: improved cryopreservation and cell-type specific impacts on energetics and proliferation. Cryobiology. 61, 79-88 (2010).
- Webb, P. Human Calorimetry. , ABC-CLIO, LCC. Santa Barbara, CA. In Volume 7 of Endocrinology and Metabolism Series (1985).
- Neven, L. G., Lehrman, N. J., Hansen, L. D. Effects of temperature and modified atmospheres on diapausing 5th instar codling moth metabolism. Journal of Thermal Biology. 42, 9-14 (2014).
- Brueckner, D., Solokhina, A., Krahenbuhl, S., Braissant, O. A combined application of tunable diode laser absorption spectroscopy and isothermal micro-calorimetry for calorespirometric analysis. Journal of Microbiological Methods. 139, 210-214 (2017).
- Hasan, S. M. K., Manzocco, L., Morozova, K., Nicoli, M. C., Scampicchio, M. Effects of ascorbic acid and light on reactions in fresh-cut apples by microcalorimetry. Thermochimica Acta. 649, 63-68 (2017).
- Criddle, R. S., Fontana, A. J., Rank, D. R., Paige, D., Hansen, L. D., Breidenbach, R. W. Simultaneous measurement of metabolic heat rate, CO2 production, and O2 consumption by microcalorimetry. Analytical Biochemistry. 194, 413-417 (1991).
- Criddle, R. S., Breidenbach, R. W., Rank, D. R., Hopkin, M. S., Hansen, L. D. Simultaneous calorimetric and respirometric measurements on plant-tissues. Thermochimica Acta. 172, 213-221 (1990).
- Pesta, D., Gnaiger, E. High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle. Methods in Molecular Biology. 810, 25-58 (2012).
- Grimm, D., Altamirano, L., Paudel, S., Welker, L., Konkle, M. E., Chakraborty, N., Menze, M. A. Modulation of cellular energetics by galactose and pioglitazone. Cell and Tissue Research. , (2017).
- Hansen, L. D., Macfarlane, C., McKinnon, N., Smith, B. N., Criddle, R. S. Use of calorespirometric ratios, heat per CO2 and heat per O2, to quantify metabolic paths and energetics of growing cells. Thermochimica Acta. 422, 55-61 (2004).
- Chinet, A., Clausen, T., Girardier, L. Microcalorimetric determination of energy expenditure due to active sodium-potassium transport in the soleus muscle and brown adipose tissue of the rat. The Journal of Physiology. 265, 43-61 (1977).
- Paul, R. J. Physical and biochemical energy balance during an isometric tetanus and steady state recovery in frog sartorius at 0 degree C. Journal of General Physiology. 81, 337-354 (1983).
- Warburg, O. On the origin of cancer cells. Science. 123, 309-314 (1956).
- Kemp, R. B. Importance of the calorimetric-respirometric ratio in studying intermediary metabolism of cultured mammalian cells. Thermochimica Acta. 172, 61-73 (1990).
- Kola, I., Landis, J. Can the pharmaceutical industry reduce attrition rates? Nature Reviews Drug Discovery. 3, 711-715 (2004).
- Kamalian, L., Chadwick, A. E., Bayliss, M., French, N. S., Monshouwer, M., Snoeys, J., Park, B. K. The utility of HepG2 cells to identify direct mitochondrial dysfunction in the absence of cell death. Toxicology in Vitro. 29, 732-740 (2015).
- Rossignol, R., Gilkerson, R., Aggeler, R., Yamagata, K., Remington, S. J., Capaldi, R. A. Energy substrate modulates mitochondrial structure and oxidative capacity in cancer cells. Cancer Research. 64, 985-993 (2004).
- Fontana, A. J., Hansen, L. D., Breidenbach, R. W., Criddle, R. S. Microcalorimetric measurement of aerobic cell-metabolism in unstirred cell-cultures. Thermochimica Acta. 172, 105-113 (1990).
