Summary
פרוטוקול זה מתאר calorespirometry, מדידת סימולטני הישירים של פיזור חום וגם נשימה, אשר מספקת גישה לא פולשנית כדי להעריך את חילוף החומרים האנרגיה. טכניקה זו משמשת כדי להעריך את התרומה של מסלולים אירובית וגם אנאירובית כדי ניצול האנרגיה על-ידי ניטור את זרימת האנרגיה התאית הכוללת.
Abstract
שורות תאים רבים השתמשו במחקר ביולוגי וביו בסיסי לשמור על הומאוסטזיס אנרגיה באמצעות שילוב של נשימה אירובית וגם אנאירובית. אולם, במידה שבה שני מסלולים לתרום הנוף של ייצור האנרגיה התאית היא באופן עקבי תסולא בפז. תאים טרנספורמציה תרבותי ב קולח רמות הגלוקוז לעתים קרובות מציגים תלות ירד זרחון חמצוני לייצור ATP, אשר יפוצה על ידי עלייה ברמת סובסטרט זירחון. שינוי זה של פויז מטבולית מאפשר לתאים להתרבות למרות נוכחותם של רעלים מיטוכונדריאלי. בהזנחת שלווה מטבולי שונה של תאים טרנספורמציה, תוצאות של הקרנה התרופות עלול להתפרש מאז פוטנציאל ההשפעות mitotoxic ייתכן לא יזוהו באמצעות מודל שורות תאים בתרבית בנוכחות גלוקוז גבוהות ריכוזים. פרוטוקול זה מתאר הזיווג של שני טכניקות עוצמתיות, respirometry ו- calorimetry, המאפשר להערכת כמותית, לא פולשנית תרומות ייצור ATP תאית אירובית וגם אנאירובית. הנשימות אירובית וגם אנאירובית לייצר חום, אשר יכול להיות תחת פיקוח באמצעות calorimetry. בינתיים, מדידת קצב צריכת החמצן יכול להעריך את מידת נשימה אירובית. כאשר מחממים וגם צריכת החמצן נמדדים בו-זמנית, ניתן לקבוע את היחס calorespirometric. הערך השפעול שהושג לאחר מכן ניתן להשוות את שווי ערך תיאורטי oxycaloric, היקף נשימה אנאירובית יכולה להישפט. לפיכך, calorespirometry מספק שיטה ייחודית לנתח מגוון רחב של שאלות ביולוגיות, לרבות פיתוח תרופות, צמיחת חיידקים ביואנרגיה בסיסי תחת normoxic ותנאים ובשפתיים.
Introduction
במערכות ביולוגיות השינוי שחרור חום או אנתלפיה במהלך חילוף החומרים הוא בדרך כלל תחת פיקוח או ישירות (דרך ישירה calorimetry) או באופן עקיף באמצעות צריכת2 O ו/או ייצור CO2 (דרך respirometry). למרבה הצער, כאשר שיטות אלה משמשים בבידוד, מידע קריטי אובד, כגון התרומה של מסלולים אנאירובית כדי חילוף החומרים הסלולר. Calorespirometry היא טכניקה חזקה המסתמך על המידה בו-זמניות של פיזור חום וגם נשימה. Calorespirometric עבודה חלוצית חקר החומרים אנאירובית בתאי יונקים באופן מלא מחומצן והפגינו תרומות בו זמנית של מסלולים אירובית וגם אנאירובית כדי אנרגיה הומאוסטזה למרות התאים טרנספורמציה להיות הסביבה באופן מלא מחומצן1. Calorespirometry מאז הוחל למגוון רחב של שאלות ביולוגיות. להלן כמה דוגמאות המחקר של בעלי חיים energetics על רמות חמצן נמוכות, את ההשפעות של קוטל עשבים וגם אסטרוגן על הגג של צדפות, חילוף החומרים של האורגניזמים הארציים פירוק מיקרוביאלי של אדמה אורגני משנה2, 3 , 4 , 5 , 6. יתר על כן, יש calorespirometry preconditioning איך מטבולית חשף להקפאה משפר את הקפאה קריוגנית של מידע יונקים תאים7. כל אחד מתקרב, הן calorimetry והן respirometry, באופן עצמאי גדל הידע שלנו על הסלולר, organismal ביואנרגיה. עם זאת, שאלות הביולוגית הבסיסית יכולה לקבל מענה באמצעות calorespirometry נחקרו יחסית.
חוק הס קובע כי השינוי אנתלפיה הכולל של תגובה הוא עצמאי של הנתיב בין המדינות התחלתי וסופי. לדוגמה, השינוי אנתלפיה הכולל מסלול ביוכימי הוא הסיכום של שינוי enthalpies של כל תגובות בתוך מסלול. Calorimetry מציעה גישה בזמן אמת למדידת ייצור החום הסלולר, אשר מזהה ללא הבחנה מסלולים אירובית וגם אנאירובית. זה מבוסס על יסודות כי אין אנרגיה חילופי במערכת חוץ דרך הקירות של האמפולה ניסיוני8. שינוי פיזור חום שווה השינוי באנתלפיה שוחררו כל ריאקציות חילוף האמפולה. לפיכך, אנתלפיה שלילי המתייחס איבוד החום מן המערכת. מחקר מקיף בארבעת העשורים האחרונים יש מאופיין בנוף התרמודינמית של קטבוליזם והן אנאבוליזם. זה מיוצג על ידי עלייה קבועה מאמרי מחקר מצא תחת מילות החיפוש "ביולוגי" ו- "calorimetry" כפי באינדקס על-ידי ארצות הברית הלאומית ספריה של הרפואה (מיסיון)-מכוני הבריאות הלאומיים (PubMed). החיפוש חושף כי לפני 1970, סך של 27 פרסומים הפניה calorimetry ביולוגי; בינתיים, בשנת 2016 לבד, פרסומים 546 ניצלה את הטכניקה.
שיטות calorimetric הן וותיקה כדי לקבוע את ייצור החום. עם זאת, גמישות רבה יותר ניתנת לפתרון הערך respirometric. המדידה respirometric יכולה להיות מורכבת O2, CO2, או O2 והן CO2. עוד יותר, ניתן לבצע את המדידה של O2 או CO2 באמצעות טכניקות שונות, כולל optrodes, אלקטרודות קלארק-סוג של tunable דיודת לייזר לקליטת ספקטרוסקופיה7,9,10 ,11. בעוד הייצור2 CO הוא מדד חשוב במחקרים רבים respirometric, האמצעי עבור תאים בתרבית מנצל לעתים קרובות מערכת מאגר bicarbonic עבור ה-pH שליטה12,13. כדי להימנע מסיבוכים המדידה2 CO למערכת ביקרבונט, פרוטוקול הבאים עבור calorespirometry של תאים בתרבות מנצל O2 כפרמטר respirometric הבלעדית.
בו זמנית עם מדידת שטף חמצן, respirometers מסוימים (ראה טבלה של חומרים) מיועדים הערכות מפורט של פונקציה מיטוכונדריאלי. המצע-uncoupler-מעכב-titrations (סידרה) פרוטוקולים גם הקימה, תואמים ניסויים שנועדו למדוד ממברנה חמצן פוטנציאליים או תגובתי היווצרות מינים (ROS)14. פרוטוקול הציג עבור calorespirometry של תאים שלמים הוא תואם עם כניסתה של uncouplers כימיים כגון קרבוניל ציאניד-p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) ו- F0F1-ATP סינתאז oligomycin מעכב. באמצעות התוספת של FCCP, צריכת חמצן יכול להיות חשיפות מייצור ATP, אשר שימושית להעריך את ההשפעה של פוטנציאל הרפוי peformance מיטוכונדריאלי15. יתר על כן, התוספת של oligomycin מאירה את היקף הדליפה נשימה. לפיכך, המידות respirometric שבוצעה במהלך calorespirometry תואמים פרוטוקולים מקיפה שנועדה בהמשך להסבר מיטוכונדריאלי פיזיולוגיה.
המדד בו זמנית של פיזור חום וגם חמצן השטף מאפשר חישוב היחס calorespirometric (CR). יחס זה מושווה ואז תורנתון קבוע או את עיוני oxycaloric מקביל, שנעה בין-430 כ-480 kJ מול-1 בהתאם שורת תאים או רקמות עניין סובסטרטים שהושלם פחמן1, 16. לפיכך, יחס CR שליליים יותר מגלה תרומות מוגברת של מסלולים אנאירובית לפעילות מטבולית בסך הכל. לדוגמה, יחס CR נשימה רקמת שריר שגרתית ללא הביצועים פעילים של העבודה נע בין-448-468 kJ מול-1 אשר נמצא בטווח עיוני oxycaloric מקביל17,18. בינתיים, תאים סרטניים בתרבית של תרבותי בינוני גבוה גלוקוזה להציג תסיסה הומולקטית משופרת בעקבות גליקוליזה, נמוכה יחסית האירוסין מיטוכונדריאלי19. התוצאה פנוטיפ CR יחסי בטווח של-490 כ-800 kJ מול-1, הממחיש את מעורבות מוגברת של המסלולים אנאירובית בחילוף החומרים הסלולר כמצוין שליליים יותר CR יחסי1,7, 16,20.
מסחרי והן ללא כוונת רווח תאים ורקמות מפיצים כרגע ההצעה שורות תאים מעל 150 מינים, עם קרוב ל-4,000 שורות תאים נגזר מן בני אדם. שורות תאים מונצחים הם כלים נוחים להערכת הרעילות של הרפוי פוטנציאליים, רבים מהם עלולים במישרין או בעקיפין להפריע פונקציות מיטוכונדריאלי במהירות. באמצעות תאים טרנספורמציה במהלך ההקרנה סמים עלולה להיגרם של ערך ניבוי מוגבל בחלק ורבורג, סימן היכר של סרטן רבים. לעתים קרובות, סרטן לייצר ATP מ זרחון ברמת סובסטרט ולתחזק שיווי משקל של חמצון-חיזור דרך הייצור של לקטט בלי מלא מרתקים של מיטוכונדריון תחת תנאים אירוביים19. פיתוח פרמצבטי הוא לשמצה יקר, לא יעיל, עם 8 מתוך 9 תרכובות נבדק בניסויים קליניים האנושי הצליח להשיג אישור השוק21. בעוד הרפוי פוטנציאליות רשאי לעבור ההקרנה הראשונית עקב נמוך cytotoxicity בשורות תאים, זה אפשרי כי כמה תרכובות אלה הן mitotoxic. ללא שיטה מתאימה כדי לזהות כמה רעלים אלו עלול לפגום את מאזן האנרגיה בתאים הראשי אינם מציגים ורבורג, מידע קריטי לעתים קרובות נראה יתר על המידה, bottlenecking טיפולית פיתוח בשלבים מוקדמים.
Calorespirometry היא גישה מעשית, לא פולשנית לנתח פעילות חילוף החומרים במגוון של דגימות ביולוגיות, כולל תאים ורקמות. הליבה של פרוטוקול הציג הוא תואם עם מגוון רחב של יישומים. בעיה אחת, עם זאת, זוהתה. תאים מונצח לעיתים קרובות מתורבתים במדיום נטול גלוקוז בתוספת גלקטוז להגדיל את התרומה של זרחון חמצוני (OXPHOS) לייצור אנרגיה, על מנת לרגש לתאים mitotoxins פוטנציאליים22, 23. הזו מטבולי התכנות מופיע המעורפלים ניתוח כאשר דגימות ממוקמות על ampules פלדת אל-חלד בשימוש על ידי ה קלורימטר15. תאים תרבותי במדיום גלוקוז ממשיכים לעסוק פעילות מטבולית גבוהה למשך מספר שעות. בינתיים, תאים תרבותי במדיום גלקטוז להקטין את ייצור החום בתוך 30 דקות של שלהם השמה האמפולה, ביצוע מדידות מוגבל לנקודות זמן בתחילת הניסוי. התנהגות זו, למרבה הצער, מעכבת את ההזדמנות כדי להעריך את התפשטות הסלולר שלהם. למרות מגבלה ספציפית זו, מרבית היישומים עולים בקנה אחד עם ניתוח calorespirometric, ניתן לקבל מידע מפורט מטבולית באמצעות גישה זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. תרבית תאים
- לשמור על hepatocellular האנושי קרצינומה (HepG2) בתאים בינוני ששינה הנשר של Dulbecco (DMEM) המכיל 10% סרום שור עוברית (FBS) ותערובות נוספים (גלוקוז 10 מ"מ, 2 מ מ גלוטמין ו פירובט 1 מ מ)-37 מעלות צלזיוס ב חממה התרבות תאים (5% CO2 , 95% אוויר, 100% לחות).
הערה: השתמש ניסוח DMEM לעיל כאשר DMEM יש הפניה בשלבים מאוחר יותר עבור respirometry ו- calorimetry. - צלחת התאים-עונה 1 פרק 106 תאים לכל 100 מ מ תרבות צלחת תת-תרבות אותם כל 7 ימים או לפני שהגיע confluency 90%, לחדש את המדיום כל 3-4 ימים.
- לבצע את הניסויים כאשר תאים הם 60-80% confluent.
2. הכנת Respirometer, קלורימטר
- Pipet 2.2 מ של DMEM אל החדר respirometer, הכנס את הפקק במלואו ולאחר להתאים אותו בעזרת הכלי מרווח בסימפטומים ולא במחלה עצמה כדי לאפשר דיפוזיה חמצן אופטימלית מהאוויר כבינונית.
- ומערבבים ברציפות ב 37 ° C עד ריכוז חמצן (trace כחול), שטף חמצן (trace אדום) הם יציבים. ודא תוכנה של respirometer מתוכנת להביא בחשבון מסיסות החמצן של המדיום המשמשים את הניסוי.
הערה: מדיה שונים יש מקדמי מסיסות החמצן שונים (למשל, DMEM = 0.92). - לאחר ייצוב של ריכוז החמצן DMEM עם פתח קאמרית, בחר בחלק האיתור ריכוז חמצן יציב, לכייל אותו עבור 100% אוויר רוויה.
- כיול עבור 0% חמצן בחירת חלק יציב של המעקב ריכוז החמצן כאשר אין חמצן קיים בבית הבליעה. לבצע שלב זה לאחר 20 טיטור µL של 230 מילימטר נתרן dithionite או אחרי כל החמצן נצרך על ידי המדגם הביולוגי בסוף הניסוי.
- לאחר כיול 100% אוויר של respirometer, לסגור את הפקק, להבטיח כי אין בועות נוכחים בבית הבליעה.
הערה: עלייה קלה חמצן זורמים יזוהו בחדר סגור כמו חיישן חמצן polarographic (POS) צורכת חמצן על מנת למדוד את לחץ חלקי של חמצן. - לאחר ~ 10 דקות של בסימפטומים ולא במחלה עצמה בסכנת סגירה, לאשר respirometer הוא מוכן HepG2 תאים על ידי התבוננות זרימה יציבה חמצן.
הערה: קלורימטר המשמש כאן מנצל ampules פלדת אל-חלד ודורש אחד האמפולה שישמש כהפניה. - להוסיף 2.5 מ ל H2O (dH2O) [שווה נפח כמו הדגימות (שלב 4)] האמפולה הפניה של קלורימטר והדק את הכובע, באמצעות צבת במידת הצורך. לנקות את האמפולה אטום עם זרימת אוויר, הורידו לאט את האמפולה לעמדה 1 בערוץ הפניה של קלורימטר. יישארו במיקום 1 עד מכינים דגימה ביולוגית.
3. הכנה של תאים HepG2 Respirometry, Calorimetry
- לאשר respirometer ואת קלורימטר הם מוכנים מכויל. DMEM חם, טריפסין עד 37 מעלות צלזיוס בתוך אמבט מים.
- להוסיף DMEM צלחת 100-מ מ טרי והמקום בחממה כדי לאפשר equilibration של המדיום CO2 וגם הטמפרטורה.
הערה: בינוני ישמש עבור הניסוי calorimetry, אז האחסון המתאימה תלויה במספר של ampules ייעשה שימוש. - אשר עם מיקרוסקופ אור הפוך, כי התאים נמצאים ב 60-80% confluent, ואז תשטוף 100-מ מ לוח 2 x 10 מ ל תמיסת בטמפרטורת החדר באגירה פוספט (PBS).
- להוסיף 3 מיליליטר טריפסין C 37 ° לצלחת 100 מ מ של תאים, דגירה אותם למשך 7-10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס בחממה התרבות תאים. לנטרל את טריפסין עם 3 מ ל 37-° C DMEM, השעיה על-ידי בעדינות pipetting זה ~ 20 פעמים עם pipet מ.
- להעביר את 6 מ של תאים resuspended DMEM, טריפסין לתוך צינור חרוטי סטרילי 15-mL, centrifuge זה עבור 5 דקות ב 175 ג' x להסיר את הנוזל מבלי להפריע בגדר התא.
- Resuspend בגדר תא ב ~ 5 מ של DMEM ו- pipet זה ביסודיות כדי להבטיח את התאים הם מספיק לזהויות אחד לשני.
- להסיר µL ~ 100 המדגם מעורבב היטב ולבצע ספירת תאים יסודית ניצול כל השדות 8-hemocytometer כדי לקבוע את המספר הכולל של תאים. ואז לחשב את עוצמת הקול עבור resuspension של התאים על מנת ליצור ~ 2 x 106 תאים לכל 50 µL.
הערה: פעולה זו תבטיח כי 2 x 106 תאים יתווספו כל לשכת respirometer עם הזחה בינונית מזערי. - Centrifuge התאים עבור 5 דקות ב x 175 ג' Resuspend בגדר מחושב בנפח DMEM מ שלב 3.7.
- לבצע ספירת תאים כדי לקבוע את העוצמה הדרושה כדי להזריק 2 x 106 תאים לכל תא respirometer (זה צריך להיות µL ~ 50). לאחסן את התאים. עבור המידה respirometric על הקרח עד מוכן.
- בעוד המדגם תא מרוכז על קרח, לקבוע דילול הדרושה להפקת ריכוז עונה 1 פרק 105 תאים למ"ל עבור calorimetry.
- מערבבים היטב את הדגימה ולהתכונן ~ 3 מ"ל של תאי-עונה 1 פרק 105 תאים/מ ל DMEM כל האמפולה.
הערה: DMEM המשמש דילול המדגם צריך להיות המדיום equilibrated מוכן בשלב 3.3.
4. calorimetry
- ודא קלורימטר מחובר למחשב האות calorimetric ב µW הוא הנצפה ויציב.
- להוסיף 2.5 מ של התאים-תאים5 עונה 1 פרק 10/mL (~2.5 x 105 תאים) כל האמפולה, ולהבטיח מספיק אוויר הוא בין המכסה של האמפולה המדיום כדי לאפשר דיפוזיה גז.
- מיד להדק את הכובע, באמצעות צבת במידת הצורך. לנקות את האמפולה אטום, באמצעות זרימת אוויר כדי להסיר את כל פסולת חיצוני, ולא הורידו לאט את האמפולה לעמדה 1 של קלורימטר. רשום את הזמן שהאמפולה הוא הוריד את עמדה 1.
- לאפשר את האמפולה לשבת במיקום 1 למשך 15 דקות.
הערה: במהלך תקופה זו 15 דקות, תאים הם יש. להזריק respirometer (שלב 5). פעולה זו מבטיחה כי המרווח באותו הזמן משמש עבור ייצור החום וצריכת החמצן כאשר נקבע היחס CR. - לאחר 15 דקות במיקום 1, הורידו לאט ampules התייחסות והן דוגמה למצב 2. להקליט את הזמן שהשפיל את ampules ואת מדד למשך 30 דקות לפחות.
5. respirometry
- במהלך 15-מין מרווח שבו האמפולה נמצא במיקום 1 ב קלורימטר, להתחיל את הלימודים respirometric.
- לערבב ביסודיות את דגימת תאים על ידי pipetting כדי להבטיח פתרון הומוגני ולהזריק < µL 50 המדגם תא לתוך כל לשכת respirometer עבור ריכוז סופי של ~ 2 x 106 תאים/קאמרית. רשום את הזמן שהתאים מוזרקים לתוך respirometer.
- אחרי הזריקה, התאים HepG2 ברציפות מנוער ב 37 º C. המתן לפחות 20-30 דקות לייצוב שני של שטף חמצן, ירידה מתמדת ירידה בריכוז החמצן.
- בחר את הכרטיסיה השטף2 O לכל V בצד ימין של המסך, לסמן חלק יציב חמצן השטף. בחר מרקס, ואז סטטיסטיקות ונתונים הרשומה עבור שטף2 O לכל V. הקלטה זו תשמש בחישוב של היחס CR.
הערה: השלבים 5.5 ו- 5.6 הם אופציונליים. דליפת נשימה ומערכת הנשימה חשיפות מקסימלי יתגלה על ידי titrations של oligomycin ושל FCCP. - מזריקים µL 1 של 4 מ"ג/מ"ל oligomycin לתוך כל תא ולאפשר ~ 10 דקות לייצוב השטף חמצן. קצב נשימה הדליפה יציב הרשומה על-ידי ביצוע שלבים הופיעה 5.4 על-ידי סימון חלק יציב של חמצן השטף המעקב לאחר תוספת oligomycin.
- Titrate 2-µL זריקות של 0.2 מ מ FCCP לתוך כל תא, מתן חמצן מייצב השטף אחרי כל זריקה. להמשיך את titrations עד שטף מקסימלי, כמצוין על-ידי ירידה קלה טיטרציה FCCP הבאים. להקליט את קצב נשימה יציבה במהלך שטף מקסימלי.
6. חישוב יחס Calorespirometric
- לבצע ספירה תא הסופי של הדגימות מוכן במלון ~ עונה 1 פרק 105 תאים למ"ל ניצול 8 תחומי hemocytometer כדי לקבוע את המספר הכולל של תאים הוסיף את האמפולה (2.5 מ ל).
- לקבוע זמן למדידות הרשומה קלורימטר והן respirometer בו אותות יציב נוכחים במועדים זהים. התייחסות של הזמן כאשר האמפולה הונמך כדי למקם 2 ובזמן ההזרקה של תאים לתוך respirometer.
- להקליט את ייצור החום על ידי הצבת הסמן על המעקב אחר של הצגת פלט חום עבור האמפולה מכובד במועד שיקבע בשלב ואת אקספרס כתאי µW/מיליון. לאסוף נתוני צריכת חמצן ולהבטיח כי זה מבוטאת pmol O2 x s-1 מיליון תאים.
- כדי לחשב את יחס CR, ראשית להמיר µW kJ/s, ולאחר מכן לחלק kJ/s מעל מול של O2/s כדי לקבל את היחס CR המבוטא kJ/mol O2. הערה: היחס CR מוצג ב- kJ/mol O2.
(ראה 1 קובץ משלים)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הפארמצבטית של מדידות calorespirometric תלוי הכנה נכונה ועקבית הדגימה. דוגמאות מקריסטלים של תרבית תאים אין להשתמש אם הלוחות הם מגודלים, כמו ספירת יכול להיות לא מדויק בשל clumping. עוד יותר, זורם חום מופחתת בשל דיפוזיה המצע מוגבל בתאים גושית עלולה להתרחש. לכן, כאשר באמצעות תאים חסיד, זה קריטי כדי לבחור צלחת עם confluency בין 60-80% וכדי לשנות את המדיום 24 שעות לפני הניסוי.
כיול פלייבק נכונה ותחזוקה הינם קריטיים עבור מדידות calorespirometric לשחזור אינפורמטיבי. על ידי ביצוע של היצרן הקימה פרוטוקול ניקוי עבור respirometer, שוטף נרחב עם אתנול מיושמים על מנת להבטיח uncouplers הידרופוביות שיורית, מעכבי יוסרו לא מתפשרים חלקית את המידות על-ידי המיטוכונדריה מעכבות או uncoupling. כאשר תא respirometer פועל לפני המדידה הדגימה, ריכוז חמצן והן את עקבות השטף חמצן צריך להיות יציב, כפי שמוצג באיור1. אם המכירה (pos) הוא זקוק חיישן שירות, שטף חמצן לא יבסס כפי שניתן לראות באיור2. מדידות לא לבצע בעת המכירה (pos) לא ניתן להגיע כראוי. בנוסף, ampules מנוצל קלורימטר צריכה להיות ניקה, עיקור, יבש לפני השימוש, כמו זיהום ביולוגי יכול להפריע ייצור החום של המדגם.
תא דוגמאות מוכנות לאחר כיול נכון של הכנת גם את respirometer וגם את קלורימטר. ראשית, סגור את הפקק ב respirometer, התא נבדק כדי לוודא שאין בועות אוויר קיימים. לאחר מכן, תאים HepG2 מרוכז ~ 2 x 106/50 µL על respirometry, מיד להניח על קרח. עבור calorimetry, HepG2 תאים מן המדגם מרוכז מעורבבת עם equilibrated DMEM-~ 1 x 105 תאים למ"ל. לאחר התאים מעורבבים באופן יסודי על-ידי pipetting, 2.5 מ של ההשעיה נוסף על האמפולה סטרילי. האמפולה בחוזקה חתום, נפולת החיצוני יוסר על ידי פיצוץ את האמפולה עם זרם אוויר של משאבת אוויר. האמפולה הוא הוריד ואז לאט לאט כדי למקם 1, איפה זה נשאר למשך 15 דקות. לאחר 15 דקות חלף, הפניה והן מדגם ampules ואז הוריד באיטיות למצב 2 מדידות להתחיל להקליט ברגע החום פלט יציבה (איור 3).
ספירת תאים הסופי מתבצע לאחר הוספת התאים את קלורימטר והן את respirometer כדי לקבוע את המספר המדויק של תאים מוחדרים קלורימטר. ייצור חום מבוטא ואז לכל מיליון תאים. אם התאים HepG2 מתורבתים בהיעדר גלוקוז, גלקטוז הוא בתוספת להגברת המעורבות מיטוכונדריאלי, התאים לא להתרבות בתוך קלורימטר, אך במקום זאת להקטין את הפעילות המטבולית שלהם לאחר כ- 30 דקות ב- האמפולה. זה מגביל את החישוב CR לנקודת הזמן המוקדם ביותר שבו נמדדה על פיזור חום (איור 4).
זה חיוני כדי לתעד את הזמן שהתאים מתווספים את האמפולה כך המידות של ייצור החום וצריכת החמצן נאספים בנקודות זמן זהה. אם אמצעי זהירות זה לא נלקח, שגיאות חשובות ניסיוני יכול להיות הציג קביעת היחס CR. במהלך תקופת 15-מין, ואילו האמפולה נמצאת בעמדה קלורימטר 1, התאים מעורבבים מספיק על-ידי pipetting אותם, 2 x 106 תאים מוזרקים לתוך respirometer באמצעות מזרק המילטון. חמצן השטף מייצבת לאחר כ 15 דקות וחמצן ריכוז מסרב בהתמדה (איור 5). שוב, זה קריטי כי הזמן של הזריקה מדגם נרשם לניתוח נתונים. שטף חמצן מיוצב של התאים משמש הפונדקאית עבור צריכת חמצן בעת חישוב היחס CR. Titrations נוספים יש לבצע כדי להעריך את הנשימה דליפה (1 µL oligomycin) שצוין על-ידי ירידה זרם חמצן נמוך יותר, נשימה חשיפות מקסימלי (3-5 titrations של 2 µL FCCP) המצוין על-ידי הכשל כדי להגדיל את הנשימה לאחר רצופים FCCP titrations. Uncoupling לא שלם או על עיכוב של נשימה ייתכן לא ציין אם המניה FCCP פג (איור 6).
איור 1:100 % אוויר כיול של respirometer ואת המצב של חיישן חמצן polarographic (POS). האותות עבור ריכוז חמצן (קו כחול), השטף את החמצן (הקו האדום) שניהם ייצוב לפני הכיול 100% אוויר. הקווים יציב מציינים כי respirometer הוא מוכן לצורך כיול. יש לבצע את הכיול DMEM, ולא H2O. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: POS זקוק שירות. לאחר ייצוב ריכוז חמצן (trace כחול), שטף חמצן (אדום trace) נכשל לייצב. המכירה (pos) לא צריכים לשמש לניסויים, השירות צריך להיות מיושם כפי שתואר על ידי היצרן. חוסר שטף חמצן יציבות מוגברת בקורלציה עם הביקוש שירות POS. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: כ 2.5 x 10 תאים5 HepG2 תרבותי במדיום גלוקוז מראים סימנים של התפשטות ב קלורימטר. טעינת ~2.5 x 105 HepG2 תאים תרבותי בנוכחות גלוקוז לכל האמפולה יוצר חום קבוע הפקה של-20 עד µW-28 באמצעות הגדרת 30-µW על הכלי, ייצור חום מוגבר לאורך זמן בקורלציה עם התפשטות הסלולר בפנים האמפולה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: כ 2.5 x 10 תאים5 HepG2 תרבותי גלקטוז בינוני לא להתרבות וחום ייצור יורדת עם הזמן. טעינת ~2.5 x 105 HepG2 תאים תרבותי בגלקטוז לכל תוצאות האמפולה ייצור החום מיידית של ~-20 µW. עם זאת, ייצור החום יורד במשך הזמן ומגביל את מדידות CR-יחס אל נקודות זמן בתחילת הניסוי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5: שגרה, חשיפות, ו דליפה נשימה של תאים HepG2. ברגע תאים היו מוזרק את respirometer, ריכוז החמצן ירד בהתמדה (trace כחול). לאחר הייצוב של שטף חמצן (אדום trace) במהלך הנשימה שגרתית של תאים שלמים, oligomycin נוספה כדי לעכב את סינתאז -ATP10F F. זה מסומן על ידי ייצוב חמצן נוזלי לאחר תוספת oligomycin, אשר חושף את הדליפה נשימה. כ 3-5 titrations של FCCP צריכה להתבצע כדי לנתק את הנשימה של סינתזת ATP וכדי לחשוף את התחבורה אלקטרון קיבולת מערכת (ETS). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 6: uncoupling לא מוצלח של הנשימה תא HepG2. לאחר תוספת של תאים, שטף חמצן מיוצב (trace אדום) לריכוז שגרתית הנשימה והחמצן ירד בהתמדה (קו כחול). טיטור של FCCP הביאה uncoupling לא שלם וניגוד בסופו של דבר, מניעת היכולת ETS מקסימלי להיות הגיעו. FCCP היה ככל הנראה מזוהמים או מושפל מתוך אחסון לטווח ארוך. אם נצפתה, מניה FCCP טרי צריך להיות מוכן. כמו כן, לאשר שאת oligomycin לא לעכב את קיבולת ETS במהלך uncoupling. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
המטרה של calorespirometry היא באופן כמותי להעריך את תרומתם של מסלולים ואנאירוביים לפעילות מטבולית ולקבל תצוגה ללא הפרדות צבע של שטף האנרגיה התאית. זו מושגת על ידי מידת פיזור חום, שטף חמצן ואחריו השוואה של היחס CR מחושב עם oxycaloric תיאורטי מקביל בו זמנית. יש לקחת בחשבון מספר שלבים קריטיים עבור נתונים אמינים הדירים. שמירה על תרבות תא סטרילי, בריא הוא קריטי. זיהום על ידי חיידקים או פטריות עלול לגרום חום שימוש לא חוקי ייצור או חמצן הצריכה, עיבוד היחס CR חסר משמעות. נוסף, פסולים תא נחשב, דוגמת המסכן ערבוב, או תאים גושית יכולה להיגרם גם כתוצאה יחס CR לא מדויק. שלב קריטי לגבי respirometer הוא הכנת הדוגמא הנכונה כך ההזרקה היא מתחת µL 50 בכרך. אמצעי אחסון זה מבטיח כמות מזערית של המדיום הוא שנעקרו מן החדר צריכת החמצן כראוי מיוחסת 2 x 106 תאים. ברגע נשימה שגרתית נצפית, פרוטוקול המוצע הוא תואם עם שני titrations נוספים (oligomycin ו- FCCP), אשר להאיר הדליפה נשימה וקיבולת ETS של המיטוכונדריה. עבור יישום זה, תוספת מוגזמת של FCCP יכול לעכב נשימה ולמנוע שטף מקסימלי; לכן, לפחות 3-5 titrations צריכה להתבצע לפני שהגיע את הנשימה חשיפות מקסימלי.
תחזוקה וכיול נכונה של respirometer והן קלורימטר הוא קריטי עבור calorespirometry. פרוטוקול טיטור עבור צריכת חמצן רקע מומלץ בחום, מתבצע באמצעות צעד חכם titrations של dithionite להגיע לרמות החמצן ירד בתוך החדר. זה הוא אמצעי חיוני לאשר בחוזקה אטומים בתאי ולתקן עבור דיפוזיה חמצן בחזרה לתוך התאים, במיוחד אם מדידות מבוצעות במתח נמוך חמצן. כמו כן, ביצוע מבחן בחישה לפני חיבור של תאים יכול לספק מידע על התגובה של המכירה (pos). אם התגובה הוא עני או שטף חמצן אינו יציב (איור 2), שירות המכירה נדרש. ניקוי נאות של התאים respirometer יכול להשאיר מאחורי בכמויות משקעיו של מעכבי או uncouplers, אשר עשוי להשפיע על הניסויים הבאים. בועות אוויר בתא אטום גם הם מסוגלים המפריעים המידות והציג יכולה להיות במהלך סגירת החדר או במהלך דוגמת הזרקת בועות אוויר הנמצאות בתוך המזרק. הפרוטוקול של קלורימטר היא ישירה יותר, אך הוא גם רגיש לשגיאות ניסיוני. לדוגמה, אטימה לא תקין של האמפולה יאפשר אידוי להתרחש אילו שינויים בנפט זרימת חום.
אחת המגבלות של שיטה זו הוא כי לא כל התאים יכולים להיות תרבותי ההשעיה, שורות תאים רבים הן חסיד תא תרבות צלחת או המצע. על מנת לבצע ניסויים, תאים המצורף צריך להיות רופף enzymatically מהצלחת באמצעות סוכנים דיסוציאציה כמו טריפסין. תאים במצב זה ייתכן בשלב הצמיחה לוגריתמי, את הפיזיולוגיה שלהם עשויים להשתנות. לפיכך, לאחר מכן ניתוח דרך שקלורימטר ואת respirometer של תאים trypsinized לאחרונה עשויים להעריך משובשות פעילות הסלולר. בהמשך, מגבלה בפרוטוקול calorimetric הציג נמצא שיקוע של תאים ב- ampules סגורים, דבר שעלול להוביל היפוקסיה מקומיות מסביב לתאים בשל דיפוזיה חמצן איטי בפתרונות מימית. אנחנו קבעו כי ~ 3 x 105 תאים הוא הגבול העליון תואם ampules בשימוש בפרוטוקול זה. הגדלת מספר התאים יכולים ליצור סביבה ובשפתיים מ שיקוע של התאים, להתפשר על התוצאות. לפיכך, אופטימיזציה היא קריטית אם קו תא שונות זה נחקר ויש גישות אלטרנטיביות להתייחס כגון הגדלת צפיפות בינונית כדי להפחית את שקיעת תאי24. Ampules זמינים כי אישור זע; עם זאת, חיוני כדי להבטיח שיחס אות לרעש מינימלי יהיה נוכח בזמן ערבוב. בנוסף, מדי קלוריות חוץ האחד המועסקים פרוטוקול זה תואמים ל- calorespirometry, היכולות שלהם וייתכן שהוא מעבר מה הוצגו. הגבלה נוספת של calorespirometric ניתוח ויה respirometer דו תאיים הוא חוסר עבור ניתוח תפוקה גבוהה, אשר יהיה רלוונטי ביותר עבור פיתוח פרמצבטי. מגבלה זו, אולם, קוזז על ידי יכולת אפיון ברזולוציה גבוהה של המתחם ההשפעה על שרשרת הנשימה ופיזיולוגיה מיטוכונדריאלי.
יכולת מדידה ברזולוציה גבוהה והן סימולטני של חום שטף וכניסת חמצן מדגם זהה הוא כוח משמעותי של שיטה זו. תקן הזהב הפוטנציאליים בעת שימוש תאים חסיד להיות לתרבות בשני ולנתח תאים גדל על microcarrier חרוזים ההשעיה. בשיטה זו למנוע את ההשפעה השלילית של דיסוציאציה מהמשטח התרבות התא ומאפשרים לניתוח של פונקציות הסלולר בשלבים שונים של עקומת גדילה (שלב לוגריתמי לעומת קשר-עכבות שלב7). למרבה הצער, שימוש microcarrier חרוזים יכול להיות בעייתי עקב קצב מלהיב גבוהה נחוץ את respirometer ואת הפוטנציאל שחיקה של החרוזים יחד עם תאים מתחת לפס מערבבים. למרות מגבלות אלו, מגוון רחב של יישומים עדיין תואם calorespirometry. בפרט, שיטה זו מאיימת על שמטרתה לעודד פיתוח פרמצבטי באיתור במהירות, תרכובות mitotoxic בתאים בתרבית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו מומן בחלקו על ידי המענק הלאומית למדע צ'ה-160944 מרי דגלס Konkle, מייקל א Menze.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HepG2 Cells | American Type Culture Collection | HB-8065 | Cells used for calorespirometry |
| O2k-Respirometer | Oroboros Instruments | 10022-02 | Respirometer |
| LKB 2277 thermal activity monitor (TAM) | Thermometric AB | Thermometric was purchased by TA Instruments | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | Thermofisher Scientific | 11360070 | 100x solution added to DMEM medium |
| Fetal Bovine Serum - Premiuim Select | Atlanta Biologicals | S11550 | Added to 10% in DMEM medium |
| Trypsn-EDTA (0.25%) | Thermofisher Scientific | 25200072 | Cell dissociation reagent |
| Oligomycin from Streptomyces diastatochromogenes | Sigma Aldrich | O4876 | Mitochondrial Inhibitor |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone | Sigma Aldrich | C2920 | Mitochondrial Uncoupler |
| Corning 100 mm TC-Treated Culture Dish | Corning Corporation | 430167 | Tissue culture dish |
| Glucose, powder | Thermofisher Scientific | 15023021 | Glucose for DMEM medium |
| Galactose, powder | Fischer Scientific | BP656500 | Galactose for DMEM medium |
| L-Glutamine (200 mM) | Thermofisher Scientific | 25030081 | Glutamine for DMEM medium |
| DMEM, no glucose | Thermofisher Scientific | 11966025 | Cell culture medium |
References
- Gnaiger, E., Kemp, R. B. Anaerobic metabolism in aerobic mammalian cells: information from the ratio of calorimetric heat flux and respirometric oxygen flux. Biochimica et Biophysica Acta. 1016, 328-332 (1990).
- Barros, N., Gallego, M., Feijoo, S. Calculation of the specific rate of catabolic activity (Ac) from the heat flow rate of soil microbial reactions measured by calorimetry: significance and applications. Chemistry & Biodiversity. 1, 1560-1568 (2004).
- Cheney, M. A., Fiorillo, R., Criddle, R. S. Herbicide and estrogen effects on the metabolic activity of Elliptio complanata measured by calorespirometry. Comparative Biochemistry and Physiology - Part C: Pharmacology, Toxicology and Endocrinology. 118, 159-164 (1997).
- Wadso, L., Hansen, L. D. Calorespirometry of terrestrial organisms and ecosystems. Methods. 76, 11-19 (2015).
- Gnaiger, E. Animal energetics at very low oxygen: information from calorimetry and respirometry. Strategies for Gas Exchange and Metabolism. Woakes, A. J., Grieshaber, M. K., Bridges, C. R. , Cambridge University Press. London. 149-171 (1991).
- Barros, N., Hansen, L. D., Pineiro, V., Perez-Cruzado, C., Villanueva, M., Proupin, J., Rodriguez-Anon, J. A. Factors influencing the calorespirometric ratios of soil microbial metabolism. Soil Biology and Biochemistry. 92, 221-229 (2016).
- Menze, M. A., Chakraborty, N., Clavenna, M., Banerjee, M., Liu, X. H., Toner, M., Hand, S. C. Metabolic preconditioning of cells with AICAR-riboside: improved cryopreservation and cell-type specific impacts on energetics and proliferation. Cryobiology. 61, 79-88 (2010).
- Webb, P. Human Calorimetry. , ABC-CLIO, LCC. Santa Barbara, CA. In Volume 7 of Endocrinology and Metabolism Series (1985).
- Neven, L. G., Lehrman, N. J., Hansen, L. D. Effects of temperature and modified atmospheres on diapausing 5th instar codling moth metabolism. Journal of Thermal Biology. 42, 9-14 (2014).
- Brueckner, D., Solokhina, A., Krahenbuhl, S., Braissant, O. A combined application of tunable diode laser absorption spectroscopy and isothermal micro-calorimetry for calorespirometric analysis. Journal of Microbiological Methods. 139, 210-214 (2017).
- Hasan, S. M. K., Manzocco, L., Morozova, K., Nicoli, M. C., Scampicchio, M. Effects of ascorbic acid and light on reactions in fresh-cut apples by microcalorimetry. Thermochimica Acta. 649, 63-68 (2017).
- Criddle, R. S., Fontana, A. J., Rank, D. R., Paige, D., Hansen, L. D., Breidenbach, R. W. Simultaneous measurement of metabolic heat rate, CO2 production, and O2 consumption by microcalorimetry. Analytical Biochemistry. 194, 413-417 (1991).
- Criddle, R. S., Breidenbach, R. W., Rank, D. R., Hopkin, M. S., Hansen, L. D. Simultaneous calorimetric and respirometric measurements on plant-tissues. Thermochimica Acta. 172, 213-221 (1990).
- Pesta, D., Gnaiger, E. High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle. Methods in Molecular Biology. 810, 25-58 (2012).
- Grimm, D., Altamirano, L., Paudel, S., Welker, L., Konkle, M. E., Chakraborty, N., Menze, M. A. Modulation of cellular energetics by galactose and pioglitazone. Cell and Tissue Research. , (2017).
- Hansen, L. D., Macfarlane, C., McKinnon, N., Smith, B. N., Criddle, R. S. Use of calorespirometric ratios, heat per CO2 and heat per O2, to quantify metabolic paths and energetics of growing cells. Thermochimica Acta. 422, 55-61 (2004).
- Chinet, A., Clausen, T., Girardier, L. Microcalorimetric determination of energy expenditure due to active sodium-potassium transport in the soleus muscle and brown adipose tissue of the rat. The Journal of Physiology. 265, 43-61 (1977).
- Paul, R. J. Physical and biochemical energy balance during an isometric tetanus and steady state recovery in frog sartorius at 0 degree C. Journal of General Physiology. 81, 337-354 (1983).
- Warburg, O. On the origin of cancer cells. Science. 123, 309-314 (1956).
- Kemp, R. B. Importance of the calorimetric-respirometric ratio in studying intermediary metabolism of cultured mammalian cells. Thermochimica Acta. 172, 61-73 (1990).
- Kola, I., Landis, J. Can the pharmaceutical industry reduce attrition rates? Nature Reviews Drug Discovery. 3, 711-715 (2004).
- Kamalian, L., Chadwick, A. E., Bayliss, M., French, N. S., Monshouwer, M., Snoeys, J., Park, B. K. The utility of HepG2 cells to identify direct mitochondrial dysfunction in the absence of cell death. Toxicology in Vitro. 29, 732-740 (2015).
- Rossignol, R., Gilkerson, R., Aggeler, R., Yamagata, K., Remington, S. J., Capaldi, R. A. Energy substrate modulates mitochondrial structure and oxidative capacity in cancer cells. Cancer Research. 64, 985-993 (2004).
- Fontana, A. J., Hansen, L. D., Breidenbach, R. W., Criddle, R. S. Microcalorimetric measurement of aerobic cell-metabolism in unstirred cell-cultures. Thermochimica Acta. 172, 105-113 (1990).
