Summary
Этот протокол описывает calorespirometry, прямой и одновременное измерение тепловыделением и дыхания, который обеспечивает неинвазивная подход к оценке энергии метаболизма. Этот метод используется для оценки вклада аэробных и анаэробных пути использования энергии путем наблюдения за общей клеточной энергии потока.
Abstract
Многие клеточных линий, используемых в основных биологических и биомедицинских исследований поддержания энергетического гомеостаза через сочетание аэробных и анаэробных дыхание. Однако степень которой оба пути способствовала пейзаж клеточной энергии производства постоянно забывают. Преобразованные клетки культивировали в насыщения уровней глюкозы часто показывают снижение зависимости на Оксидативное фосфорилирование для производства АТФ, которое компенсируется увеличением в субстрат уровня фосфорилирования. Этот сдвиг в метаболические равновесием позволяет клетки размножаются несмотря на присутствие митохондриальной токсинов. В пренебрегая изменены метаболические равновесием трансформированных клеток, результаты от фармацевтической скрининга могут быть неправильно истолкованы с потенциально mitotoxic эффекты не могут быть обнаружены с помощью модели линии клетки культивировали в присутствии высоких глюкозы концентрации. Этот протокол описывает сопряжения двух мощных методов, калориметрия, который позволяет для оценки количественных и неинвазивной аэробных и анаэробных взносов сотовой производства АТФ и respirometry. Аэробных и анаэробных дыхание генерировать тепло, которое может быть контроль через калориметрии. Тем временем измерения скорость потребления кислорода может оценить степень аэробном дыхании. Когда одновременно измеряется как тепла, так и потребление кислорода, calorespirometric соотношения могут быть определены. Экспериментально полученное значение затем можно сравнить с теоретической oxycaloric эквивалент, и степень анаэробного дыхания можно судить. Таким образом calorespirometry обеспечивает уникальный метод для анализа широкий спектр биологических вопросов, включая разработки лекарств, микробного роста и основных Биоэнергетика под нормоксические и гипоксических условий.
Introduction
В биологических системах, тепло release или энтальпии в ходе метаболизма изменяется обычно контролируется либо непосредственно (через Прямая калориметрия) или косвенно через O2 потребления или производства CO2 (через respirometry). К сожалению когда эти методы используются в изоляции, критической информации теряется, как вклад анаэробных пути для клеточного метаболизма. Calorespirometry – это мощный метод, который опирается на одновременное измерение рассеивание тепла и дыхания. Новаторская работа calorespirometric расследование анаэробного метаболизма полностью кислородом клеток млекопитающих и продемонстрировал одновременный вклад аэробных и анаэробных пути энергетического гомеостаза несмотря на трансформированных клеток, находящихся в 1полностью кислородом среде. Calorespirometry с тех пор был применен к широкий спектр биологических вопросов. Некоторые примеры включают изучение животных энергетики на уровнях низким содержанием кислорода, воздействия гербицидов и эстрогена на жабрах двустворчатые моллюски, метаболизм земных организмов и микробного разложения органических почв вопрос2, 3 , 4 , 5 , 6. Кроме того, имеет calorespirometry показал как метаболические кондиционирования до замораживания улучшает криоконсервирования млекопитающих клетки7. Каждый подход, калориметрии и respirometry, самостоятельно увеличилась наши знания о клеточном и научные биоэнергетики. Однако основные биологические вопросы, которые можно ответить с помощью calorespirometry остаются сравнительно неизученными.
Закон Гесса утверждает, что изменение общей энтальпии реакции не зависит от пути между начальной и конечной государствами. Например изменение общей энтальпии на биохимические пути является суммирование с изменением энтальпии всех реакций в пути. Калориметрия предлагает в реальном времени подход для измерения производства ячеистого тепла, который неизбирательно обнаруживает аэробных и анаэробных пути. Это основано на фундаменте, что без энергии осуществляется в системе за исключением через стены экспериментальной ампулы8. Изменения в тепловыделение равен изменения энтальпии, освобождены от всех метаболических реакций в ампулы. Таким образом негативные энтальпии коррелирует к потере тепла от системы. Исчерпывающие исследования за последние четыре десятилетия характеризуется термодинамических ландшафт анаболизма и катаболизма. Это представлено устойчивый рост в научных статей, найденных под условия поиска «биологического» и «теплофизика» как индексированных по Соединенных Штатов национальной библиотеки из медицины (NLM) в национальном институте здоровья (PubMed). Поиск показывает, что до 1970 года, в общей сложности 27 публикаций ссылка биологических калориметрии; Тем временем в 2016 году в одиночку, 546 публикаций использовали технику.
Калориметрических методов хорошо известны, чтобы определить производства тепла. Однако для разрешения использованием респирометрической значение предоставляется больше гибкости. Использованием респирометрической измерения может состоять из O2, CO2, или O2 и CO2. Кроме того измерение O2 или CO2 может быть достигнуто путем различных методов, включая optrodes, Кларк тип электродов и перестраиваемые Диод лазера поглощения спектроскопии7,9,10 ,11. В то время как CO2 производства является ценным метрики во многих исследованиях использованием респирометрической, средство для культивируемых клеток часто использует bicarbonic буферную систему для контроля рН12,13. Чтобы избежать осложнений CO2 измерения в системе бикарбонат, следующий протокол для calorespirometry клеток в культуре использует O2 в качестве единственного параметра использованием респирометрической.
Одновременно с измерением потока кислорода, некоторые respirometers (см. Таблицу материалы) предназначены для детальной оценки функции митохондрий. Субстрат uncoupler ингибитор титрования (костюм) протоколы хорошо разработаны и совместимы с эксперименты, предназначенные для измерения мембраны потенциальных или реактивного кислорода (АФК) формирование14. Представленные протокол для calorespirometry нетронутым клеток совместим с введением химических uncouplers карбонильные цианид p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) и oligomycin ингибитора синтазы F0F1-АТФ. Путем добавления FCCP потребление кислорода может быть центровку от производства АТФ, который является полезным для оценки воздействия потенциальных терапевтических средств на митохондриальной peformance15. Кроме того добавление oligomycin освещает масштабы утечки дыхания. Таким образом использованием респирометрической измерений во время calorespirometry совместимы с обширной протоколы, разработанные для дальнейшего прояснения митохондриальной физиологии.
Одновременное измерение рассеивание тепла и кислорода потока позволяет расчет коэффициента calorespirometric (CR). Это соотношение затем сравнивается с константой Торнтон или теоретический эквивалент, oxycaloric, которая колеблется между-430--480 кДж моль-1 в зависимости от линии клетки или ткани интереса и дополнено углеродных подложках1, 16. Таким образом, более негативное отношение CR показывает увеличение взносов от анаэробных пути к общей метаболической активности. Например коэффициент CR для рутинной мышц тканевого дыхания без активного выполнения работы варьируется от-448 до-468 кДж моль-1, который находится в пределах диапазона теоретических oxycaloric эквивалентную17,18. Тем временем млекопитающих раковые клетки культивировали в среде, что является высоким содержанием глюкозы отображения расширенной молочнокислое брожение после гликолиза и относительно низкой митохондриальной участие19. Этот фенотип результаты в соотношениях CR в диапазоне-490--800 кДж моль-1, демонстрируя повышенное участие анаэробных путей в клеточный метаболизм, как указано на, более негативные CR соотношения1,7 16,20.
Коммерческие и некоммерческие клеток и тканей дистрибьюторов в настоящее время предложение клеточных линий более 150 видов, с почти 4000 клеточных линий, полученных от людей. Удобные инструменты для быстрого оценки токсичности потенциальных терапевтических средств, многие из которых могут прямо или косвенно вмешиваться в митохондриальной функции увековечен клеточных линий. С помощью трансформированных клеток во время наркотиков скрининг может быть ограниченной прогностическая ценность отчасти из-за эффекта Варбург, отличительной чертой многих раковых заболеваний. Часто рака генерировать СПС от субстрата уровня фосфорилирования и поддерживать окислительно-восстановительного баланса путем производства молочной кислоты без полного вовлечения митохондрий в аэробных условиях19. Фармразработка крайне дорого и неэффективно, с примерно 8 из 9 соединений, протестированы в клинические испытания на человеке не достигают рынок утверждения21. В то время как потенциальные терапии может пройти первоначальный отбор из-за низкой цитотоксичность в клеточных линий, вполне возможно, что некоторые из этих соединений являются mitotoxic. Без подходящий метод для обнаружения, как эти токсины могут ухудшить энергетический баланс в клетках первичной, которые не отображают эффект Варбург критической информации часто чрезмерно посмотрел, обнаружены терапевтические развития на ранних стадиях.
Calorespirometry является Неинвазивная подход для анализа метаболической активности в различных биологических проб, в том числе клеток и тканей. Основные представленные протокол совместим с широкого спектра приложений. Одно осложнение, однако, была обнаружена. Увековечен клетки часто выращиваются в среде свободной глюкозы, дополнена галактозы для увеличения вклада окислительного фосфорилирования (OXPHOS) для производства энергии, с целью информирования клетки потенциальные mitotoxins22, 23. Этот метаболических перепрограммирования, как представляется, закрывают анализа, когда образцы помещаются в ампулах из нержавеющей стали, используемые в калориметре15. Клетки культивировали в среде глюкозы по-прежнему участвовать в высокой метаболической активности в течение нескольких часов. Тем временем клетки культивировали в галактозы средних уменьшение производства тепла в течение 30 минут их размещения в ампулы, делая ограничивается заблаговременно экспериментальных точек измерения. Это поведение, к сожалению, препятствует возможность оценить их пролиферации. Несмотря на это конкретные ограничения большинство приложений совместимы с calorespirometric анализом и метаболические подробную информацию можно получить через этот подход.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. клеточная культура
- Поддерживать человека гепатоцеллюлярной карциномы (HepG2) клеток в Дульбекко изменение орла среде (DMEM), содержащей 10% плода бычьим сывороточным (ФБС) и дополнительные субстратов (глюкоза 10 мм, 2 мм глутамина и пирувата 1 мм) при 37 ° C в инкубатор культуры клеток (5% CO2 , воздуха 95%, 100% влажность).
Примечание: Используйте выше формулировка DMEM когда DMEM упоминается в последующих шагах для respirometry и калориметрии. - Пластина клетки на 1 x 10-6 клеток на 100 мм пластины культуры и субкультуры их каждые 7 дней или до достижения 90% confluency и возобновить носитель каждые 3-4 дня.
- Выполните эксперименты, когда клетки являются 60-80% притока.
2. Подготовка респирометра и калориметрические
- Накапайте 2,2 мл DMEM в камере респирометра, полностью вставьте пробку и настроить его с помощью инструмента распорку пробку для диффузии оптимальной кислорода из воздуха до среднего.
- Постоянно помешивая при 37 ° C, до тех пор, пока концентрация кислорода (синий след) и поток кислорода (красный след) являются стабильными. Убедитесь, что респирометра программного обеспечения запрограммирован для учета растворимости кислорода, используемых в эксперименте.
Примечание: Различные средства массовой информации имеют различные кислорода растворимость коэффициентов (например, DMEM = 0,92). - После стабилизации концентрации кислорода в среде DMEM с открытой камеры выберите стабильной частью трассировки концентрация кислорода и калибровки для воздуха 100% насыщения.
- Калибровка для 0% кислорода, выбор стабильной частью трассировки концентрации кислорода, когда нет кислорода присутствует в зале. Выполните этот шаг после 20 мкл титрования Дитионит натрия 230 мм, или после того, как все кислород расходуется в биологическом образце в конце эксперимента.
- После калибровки воздуха 100% Респирометр закройте пробку и убедитесь, что не пузыри присутствуют в камере.
Примечание: небольшое увеличение потока кислорода будет быть обнаружен в закрытой камере как полярографический кислородного датчика (POS) потребляет кислорода для измерения парциального давления кислорода. - После ~ 10 минут закрываться пробкой подтверждают, что респирометра готова к HepG2 клеток, наблюдая стабильной кислорода поток.
Примечание: Калориметра, используемый здесь использует ампулы из нержавеющей стали и требует одной ампулы для использования в качестве ссылки. - Добавление ссылки ампулы калориметра 2,5 мл H2O (dH2O) [равный объем как образцы (шаг 4)] и затяните крышку, используя плоскогубцы, если необходимо. Очистить запечатанном ампулы с потоком воздуха и медленно опустите ампулы в положение 1 в опорного канала калориметра. Остаются в позиции 1, до тех пор, пока готовится биологических образцов.
3. Подготовка HepG2 клеток Respirometry и калориметрия
- Убедитесь, что респирометра и калориметра подготовлен и откалиброван. Теплой среде DMEM и трипсина до 37 ° C на водяной бане.
- Добавьте DMEM свежие 100-мм пластины и место в инкубаторе для уравновешивания среды для CO2 и температуры.
Примечание: Эта среда будет использоваться для эксперимента, калориметрия, поэтому соответствующий объем зависит от количества ампул, которые будут использоваться. - Подтвердите с инвертированным микроскопом света, что клетки находятся в 60-80% притока, затем промыть 100-мм листа 2 x 10 мл физиологического раствора фосфатного буфера комнатной температуры (PBS).
- Добавить 3 мл трипсина 37-° C 100-мм пластины клеток и инкубировать их в 7-10 мин при 37 ° C в инкубатор культуры клеток. Нейтрализовать трипсина с 3 мл DMEM 37 ° C и приостановить, нежно закупорить ~ 20 раз с 5 мл пипетки.
- Передача по 6 мл ресуспензированы клеток в среде DMEM и трипсина в стерильных 15-мл конические и центрифуги, за 5 минут при 175 x g. удаления жидкости без затрагивания Пелле ячейки.
- Ресуспензируйте Пелле клеток в ~ 5 мл DMEM и пипетки, он тщательно обеспечить клетки достаточно отделить друг от друга.
- Удалить ~ 100 мкл перемешанных образца и выполнить тщательный клеток игр, используя все 8 поля на Горяева определить общее количество клеток. Затем рассчитайте объем для ресуспендирования ячеек с целью генерировать ~ 2 x 106 клеток / 50 мкл.
Примечание: Это будет гарантировать, что 2 x 106 клеток добавляются к каждой камере респирометра с минимальным средний перемещения. - Центрифуга клетки для 5 минут при 175 x g. Ресуспензируйте Пелле в рассчитанном объеме DMEM из шага 3.7.
- Выполните подсчет клеток для определения объема необходимых для вставки 2 х 106 клеток в камере респирометра (это должно быть ~ 50 мкл). Храните клетки для использованием респирометрической измерения на льду до готовности.
- В то время как образец концентрации клеток на льду, определите разрежения, необходимые для производства в концентрации 1 х 105 клеток/мл для калориметрии.
- Хорошо перемешайте образец и подготовить ~ 3 мл клеток в 1 х 105 клеток/мл в среде DMEM для каждого ампулы.
Примечание: DMEM, используется для разбавления образца должна быть уравновешенной среднего, подготовленную на этапе 3.3.
4. калориметрия
- Обеспечить, чтобы калориметра подключен к компьютеру и калориметрических сигнал в мкВт наблюдаемых и стабильной.
- Добавление каждая ампула 2,5 мл клеток в 1 х 105 клеток/мл (~2.5 x 105 клеток), обеспечение достаточного количества воздуха между крышкой ампулы и среднего для газовой диффузии.
- Сразу же затяните крышку, используя плоскогубцы, если необходимо. Очистить запечатанный ампулы, используя поток воздуха для удаления любого внешнего мусора и медленно опустите ампулы в положение 1 калориметра. Запишите время ампулы опускается в положение 1.
- Разрешить ампулы сидеть в позиции 1, 15 мин.
Примечание: В этот период 15 мин, клетки должны быть введены в респирометра (шаг 5). Это гарантирует, что тот же интервал времени используется для производства тепла и потребление кислорода, когда коэффициент CR определяется. - После 15 минут в позиции 1 медленно опустите как ссылка, так и образец ампулы в положение 2. Запись времени, которые были снижены ампулы и меру для по крайней мере 30 минут.
5. respirometry
- Во время 15-мин интервал, в котором ампулы находится в позиции 1 в калориметре начинают использованием респирометрической исследований.
- Тщательно перемешайте образец клеток, закупорить обеспечить однородный раствор и привнести < 50 мкл образец клеток в каждой камере респирометра для конечной концентрации ~ 2 x 106 клеток/камеры. Запишите время клетки вводят в респирометра.
- После инъекции HepG2 клетки постоянно перемешивают при 37 ° C. Подождите, по крайней мере 20-30 минут для обоих стабилизации потока кислорода и неуклонное снижение концентрации кислорода.
- Выберите вкладку O2 потока в V в правой части экрана и выделить стабильной часть потока кислорода. Выберите метки, затем статистики и записи данных для потока2 O за V. Эта запись будет использоваться в расчет коэффициента CR.
Примечание: Шаги 5.5 и 5.6 являются необязательными. Максимальная центровку дыхания и дыхания, утечке будет раскрыта путем титрования oligomycin и FCCP. - Придать каждой камеры 1 мкл 4 мг/мл oligomycin и позволяют ~ 10 минут для стабилизации потока кислорода. Частота дыхания в записи стабильной утечки на следующие шаги, выполняемые в 5.4, выделив стабильной частью трассировки потока кислорода после добавления oligomycin.
- Титруйте 2 мкл инъекции 0,2 мм FCCP в каждой камере, позволяя для стабилизации потока кислорода после каждой инъекции. Продолжайте титрование до достижения максимального потока, как указано на некоторое снижение в последующих FCCP титрования. Рекорд частоты стабильной дыхания во время максимального потока.
6. Расчет коэффициента Calorespirometric
- Выполните окончательный клеток, количество образцов, подготовленный на ~ 1 х 105 кл/мл, используя все 8 поля Горяева определить общее количество ячеек добавляется ампулы (2,5 мл).
- Определите время для записи измерений калориметр и Респирометр, на котором стабильные сигналы присутствуют на идентичные раз. Ссылаться на то время, когда ампулы был снижен до позиции 2 и время инъекции клеток в респирометра.
- Запись производства тепла, поместив курсор над трассировки, вывода тепла для уважаемых ампулы в то время определяется на этапе и выразить как мкВт/миллионов клеток. Сбор данных по потреблению кислорода и убедитесь, что он выражается как пмоль O2 x s-1 миллион клеток.
- Чтобы вычислить коэффициент CR, сначала преобразовать мкВт кДж/s, а затем разделить кДж/s над mol O/s2получить соотношение CR, выраженный в виде кДж/моль O2. Примечание: CR соотношение представлена в кДж/моль O2.
(см. дополнительный файл 1)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Воспроизводимость результатов измерений calorespirometric зависит от надлежащего и последовательного пробоподготовки. Образцов, приготовленных из клеточной культуры следует не использоваться если заросло пластины, как клеток может стать неточными из-за слипания. Кроме того, может произойти снижение тепловых потоков из-за ограниченной субстрата диффузии в скомканным клетки. Таким образом при использовании адэрентных клеток, крайне важно, чтобы выбрать пластину с confluency между 60-80% и изменить среднего за 24 часа до эксперимента.
Правильной инструментальной калибровки и обслуживания также являются критическими для информативных и воспроизводимые calorespirometric измерений. Следуя производителя создана очистки протокол для Респирометр, обширные автомойки с этанолом реализованы обеспечить остаточного гидрофобных uncouplers и ингибиторы удаляются и не подрывать измерения, частично ингибирования или расцепления митохондрий. Когда респирометра работает перед измерением образца, концентрация кислорода и следы потока кислорода должно быть стабильным, как показано на рисунке 1. Если POS нуждается службы датчика, поток кислорода не стабилизируется, как показано на рисунке 2. Измерения не должны проводиться, когда POS не обслуживаются должным образом. Кроме того ампулы, используемых в калориметре следует очистить, стерилизации и сушат до использования, как биологическое загрязнение может мешать производства тепла образца.
После правильной калибровки и подготовка респирометра и калориметра готовятся образцы клетки. Во-первых закрыт пробкой в респирометра и камеры проверяется, чтобы убедиться, что нет пузырьков воздуха присутствуют. Затем HepG2 клетки сосредоточены в ~ 2 x 10 мкл6/50 для respirometry и сразу же размещены на льду. Для калориметрия HepG2 клетки из концентрированного образца разводят в уравновешенной DMEM на ~ 1 х 105 клеток/мл. После того, как клетки тщательно перемешивается закупорить, 2,5 мл суспензии добавляется в стерильные ампулы. Ампулы плотно закрытыми, и любые внешние мусора удаляется путем дуть ампулы с потоком воздуха от воздушного насоса. Ампулы, затем, медленно опустил в положение 1, где она остается 15 минут. После того, как прошло 15 минут, как ссылка, так и образец ампулы затем медленно опустил в положение 2 и измерения может начать быть записаны как только тепло выход стабильной (рис. 3).
Счетчик окончательный клеток производится после ячейки добавляются в калориметр и респирометра определить точное количество клеток в калориметре. Производство тепла затем выражается в миллион клеток. Если HepG2 клетки культивировали в отсутствии глюкозы и галактозы дополняется увеличить митохондриальной участия, клетки не размножаться внутри калориметра, но вместо этого уменьшается их метаболической активности после около 30 мин в ампулы. Это ограничивает CR расчета ранних время точку, на котором измерялось рассеивание тепла (рис. 4).
Очень важно записывать время клетки добавляются к ампулы, чтобы собирать в одинаковое время точках измерения потребления тепла производства и кислорода. Если эта предосторожность не берется, важные экспериментальной ошибки могут быть введены в определении соотношения CR. В период 15-мин в то время как ампулы находится в позиции 1 в калориметре, клетки достаточно смешиваются закупорить их, и 2 х 106 клеток вводят в респирометра через шприц Гамильтон. Потока кислорода стабилизируется после примерно 15 мин и кислорода концентрация неуклонно снижается (рис. 5). Опять же важно, что время инъекции образца записывается для анализа данных. Стабилизированный кислород потока клетки служит суррогат для потребления кислорода при расчете коэффициента CR. Дополнительные титрования выполняются для оценки утечки дыхания (1 мкл oligomycin) обозначается падение ниже потока кислорода и максимальной центровку дыхания (3-5 титрования 2 мкл FCCP) обозначается неспособность увеличить дыхание после последовательных FCCP титрование. Неполные расцеплять или ингибитирование дыхания не может быть отмечено, если акции FCCP истек (рис. 6).
Рисунок 1:100 % воздуха калибровка респирометра и статус полярографический кислородного датчика (POS). Сигналы для концентрации кислорода (синяя линия) и поток кислорода (красная линия), оба стабилизации до 100% воздуха калибровки. Стабильные линии указывают, что респирометра готова для калибровки. Калибровка должна выполняться в среде DMEM, а не в H2O. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: POS нуждающихся сервис. После стабилизации концентрации кислорода (синий след) поток кислорода (красный след) удастся стабилизировать. POS не должны использоваться для проведения экспериментов и обслуживания должны применяться изложенные изготовителем. Усилением нестабильности потока кислорода коррелирует с увеличение спроса на услуги POS. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: Примерно 2,5 x 105 HepG2 клетки культивировали в среде глюкозы признаки распространения в калориметре. Загрузка ~2.5 x 105 HepG2 клетки культивировали в присутствии глюкозы в ампулы создает постоянный тепла от -20 до-28 мкВт с помощью параметра 30-мкВт на инструменте и увеличение тепла со временем коррелирует с пролиферации внутри ампулы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: Примерно 2,5 x 105 HepG2 клетки культивировали в среде галактозы не размножаться и тепла производства уменьшается со временем. Загрузка ~2.5 x 105 HepG2 клетки культивировали в галактозу за результаты ампулы в производстве немедленное тепла ~-20 мкВт. Однако производство тепла уменьшается со временем и ограничивает CR-соотношение измерения в начале времени точки эксперимента. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5: обычной, расцеплено и утечки дыхания клеток HepG2. После того, как клетки вводили в Респирометр, концентрация кислорода неуклонно сокращалось (синий след). После стабилизации потока кислорода (красный след) во время рутинной дыхания нетронутым клеток oligomycin был добавлен для ингибирования F0F1-АТФ-синтазы. Это обозначается стабилизации потока кислорода после того oligomycin, который показывает утечки дыхания. Приблизительно 3-5 титрования FCCP должна выполняться чтобы расцепить дыхания от синтез АТФ и раскрыть потенциал системы (ЕТС) переноса электронов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 6: неудачной расцеплять дыхания клеток HepG2. После добавления клеток кислорода поток стабилизированный (красный след) во время рутинной дыхания кислорода концентрация и неуклонно сокращалось (синяя линия). Титрование FCCP привели к неполной расцеплять и возможного ингибирование, предотвращая достигаются максимальные возможности ETS. FCCP вероятно был загрязненной или деградировали от длительного хранения. Если отмечено, свежий запас FCCP должны быть готовы. Кроме того убедитесь, что oligomycin не сдерживать ETS потенциала во время отсоединения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Цель calorespirometry заключается в том, чтобы количественно оценить вклад аэробных и анаэробных пути к метаболической активности и получить составное представление потока клеточной энергии. Это достигается путем одновременного измерения тепла и поток кислорода, следуют сравнение расчетный коэффициент CR с теоретический эквивалент oxycaloric. Несколько важных шагов должны рассматриваться для воспроизводимых и достоверных данных. Поддержание стерильные, здоровой клеточной культуры является критическим. Загрязнение бактерий или грибов может привести к ненадлежащим производства или кислорода теплопотребления, выхолащивания CR соотношение. Кроме того, неправильное клетки подсчитывает, плохой пример смешения, или скомканным клетки могут также привести к неточной соотношение CR. Важнейшим шагом отношении респирометра является подготовка надлежащего образца так, что инъекции ниже 50 мкл в объеме. Этот объем обеспечивает минимальное количество средних вытесняется из камеры и потребление кислорода приписывается правильно 2 х 106 клеток. Когда наблюдается регулярное дыхание, предлагаемый протокол совместим с двух дополнительных титрования (oligomycin и FCCP), которые освещают утечки дыхания и ETS потенциал митохондрий. Для этого приложения чрезмерным добавлением FCCP может тормозить дыханием и предотвратить максимального потока; Поэтому по крайней мере 3-5 титрования должны выполняться до достижения максимальной центровку дыхания.
Техническое обслуживание и правильной калибровки респирометра и калориметра имеет решающее значение для calorespirometry. Титрование протокол для потребления кислорода фон настоятельно рекомендуется и выполняется с поэтапный титрования дитионит достичь снижения кислорода в камере. Это является важной мерой для подтверждения плотно закрытой камеры и исправить для обратной диффузии кислорода в камеры, особенно если измерения проводятся на напряжения низкой кислорода. Кроме того выполнение перемешивания теста перед добавлением клеток может предоставить информацию о реакции POS. Если реагирование бедных или потока кислорода не является стабильным (рис. 2), службу для POS не требуется. Неправильная очистка камеры респирометра может оставить остаточные количества ингибиторы или uncouplers, которые могут повлиять на последующие эксперименты. Пузырьков воздуха в герметичной камере также способны вмешиваться с измерениями и могут быть введены во время закрытия камеры или образец инъекции, если воздушные пузыри присутствуют в шприц. Калориметр протокол более прямой, но это также восприимчивы к экспериментальной ошибки. Например неправильное закрытие ампулы позволит испарение происходит, которая массово изменяет тепловой поток.
Один из недостатков этого метода является, что не все клетки могут быть культивировали в подвеска и многих клеточных линий адэрентных клеток культуры пластины или субстрат. Для выполнения экспериментов, прилагаемый клетки должны быть ферментативно выбили из пластины с помощью диссоциации агентов, таких как трипсина. Клетки в этом состоянии не может быть в фазе логарифмического роста и их физиологии могут быть изменены. Таким образом последующего анализа через которую калориметра и респирометра недавно trypsinized клетки могут оценить деятельность была нарушена сотовых. Кроме того в протоколе представленных калориметрический ограничены седиментации клеток в закрытых ампулы, которые могут привести к локальной гипоксии вокруг клетки за счет диффузии медленно кислорода в водных растворах. Мы определили, что ~ 3 x 105 клеток является верхний предел, совместимые с ампулы, используемые в настоящем Протоколе. Увеличение количества клеток можно создавать гипоксических условий седиментации клеток, ставя под угрозу результаты. Таким образом оптимизация имеет решающее значение, если расследование различных клеток линии и альтернативные подходы должны рассматриваться как увеличение средней плотности уменьшить осаждение клетки24. Ампулы доступны что разрешения перемешивания; Однако важно, чтобы убедиться, что минимальное соотношение сигнал шум присутствует во время перемешивания. Кроме того приборы для калориметрических измерений, кроме одного, используемые в настоящем Протоколе, совместимы с calorespirometry и их возможностей может выходить за рамки того, что мы представили. Еще одним ограничением calorespirometric анализа через 2 камеры респирометра является невозможность для высокой пропускной способности анализа, который будет наиболее актуальными для фармацевтических разработок. Это ограничение, однако, компенсируется потенциала для высокого разрешения характеристику соединения влияния на митохондриальной физиологии и дыхательной цепи.
Для высокого разрешения и одновременного измерения теплового потока вывода и кислорода из того же образца рассчитан на значительную прочность этого метода. Потенциальным золотой стандарт при использовании адэрентных клеток будет обе культуры и анализа выросли на microcarrier бусины в виде суспензии клеток. Этот метод будет избежать негативного влияния диссоциации от поверхности культуры клеток и позволяют анализ клеточных функций в различных фазах роста кривой (логарифмический фаза против контакт тормозится фаза7). К сожалению использование microcarrier бисер может быть проблематичным из-за высокой скорости перемешивания в респирометра и потенциал для измельчения из бисера наряду с клетки под бар stir. Несмотря на эти ограничения широкий спектр приложений по-прежнему совместим с calorespirometry. В частности этот метод является poised для того чтобы лучше содействовать фармацевтических разработок, быстро определив mitotoxic соединений в культивируемых клеток.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Эта работа частично финансируется Национальный научный фонд Грант ЧЕ-160944 Мэри э. Konkle и Майкл а. Мензе.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HepG2 Cells | American Type Culture Collection | HB-8065 | Cells used for calorespirometry |
| O2k-Respirometer | Oroboros Instruments | 10022-02 | Respirometer |
| LKB 2277 thermal activity monitor (TAM) | Thermometric AB | Thermometric was purchased by TA Instruments | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | Thermofisher Scientific | 11360070 | 100x solution added to DMEM medium |
| Fetal Bovine Serum - Premiuim Select | Atlanta Biologicals | S11550 | Added to 10% in DMEM medium |
| Trypsn-EDTA (0.25%) | Thermofisher Scientific | 25200072 | Cell dissociation reagent |
| Oligomycin from Streptomyces diastatochromogenes | Sigma Aldrich | O4876 | Mitochondrial Inhibitor |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone | Sigma Aldrich | C2920 | Mitochondrial Uncoupler |
| Corning 100 mm TC-Treated Culture Dish | Corning Corporation | 430167 | Tissue culture dish |
| Glucose, powder | Thermofisher Scientific | 15023021 | Glucose for DMEM medium |
| Galactose, powder | Fischer Scientific | BP656500 | Galactose for DMEM medium |
| L-Glutamine (200 mM) | Thermofisher Scientific | 25030081 | Glutamine for DMEM medium |
| DMEM, no glucose | Thermofisher Scientific | 11966025 | Cell culture medium |
References
- Gnaiger, E., Kemp, R. B. Anaerobic metabolism in aerobic mammalian cells: information from the ratio of calorimetric heat flux and respirometric oxygen flux. Biochimica et Biophysica Acta. 1016, 328-332 (1990).
- Barros, N., Gallego, M., Feijoo, S. Calculation of the specific rate of catabolic activity (Ac) from the heat flow rate of soil microbial reactions measured by calorimetry: significance and applications. Chemistry & Biodiversity. 1, 1560-1568 (2004).
- Cheney, M. A., Fiorillo, R., Criddle, R. S. Herbicide and estrogen effects on the metabolic activity of Elliptio complanata measured by calorespirometry. Comparative Biochemistry and Physiology - Part C: Pharmacology, Toxicology and Endocrinology. 118, 159-164 (1997).
- Wadso, L., Hansen, L. D. Calorespirometry of terrestrial organisms and ecosystems. Methods. 76, 11-19 (2015).
- Gnaiger, E. Animal energetics at very low oxygen: information from calorimetry and respirometry. Strategies for Gas Exchange and Metabolism. Woakes, A. J., Grieshaber, M. K., Bridges, C. R. , Cambridge University Press. London. 149-171 (1991).
- Barros, N., Hansen, L. D., Pineiro, V., Perez-Cruzado, C., Villanueva, M., Proupin, J., Rodriguez-Anon, J. A. Factors influencing the calorespirometric ratios of soil microbial metabolism. Soil Biology and Biochemistry. 92, 221-229 (2016).
- Menze, M. A., Chakraborty, N., Clavenna, M., Banerjee, M., Liu, X. H., Toner, M., Hand, S. C. Metabolic preconditioning of cells with AICAR-riboside: improved cryopreservation and cell-type specific impacts on energetics and proliferation. Cryobiology. 61, 79-88 (2010).
- Webb, P. Human Calorimetry. , ABC-CLIO, LCC. Santa Barbara, CA. In Volume 7 of Endocrinology and Metabolism Series (1985).
- Neven, L. G., Lehrman, N. J., Hansen, L. D. Effects of temperature and modified atmospheres on diapausing 5th instar codling moth metabolism. Journal of Thermal Biology. 42, 9-14 (2014).
- Brueckner, D., Solokhina, A., Krahenbuhl, S., Braissant, O. A combined application of tunable diode laser absorption spectroscopy and isothermal micro-calorimetry for calorespirometric analysis. Journal of Microbiological Methods. 139, 210-214 (2017).
- Hasan, S. M. K., Manzocco, L., Morozova, K., Nicoli, M. C., Scampicchio, M. Effects of ascorbic acid and light on reactions in fresh-cut apples by microcalorimetry. Thermochimica Acta. 649, 63-68 (2017).
- Criddle, R. S., Fontana, A. J., Rank, D. R., Paige, D., Hansen, L. D., Breidenbach, R. W. Simultaneous measurement of metabolic heat rate, CO2 production, and O2 consumption by microcalorimetry. Analytical Biochemistry. 194, 413-417 (1991).
- Criddle, R. S., Breidenbach, R. W., Rank, D. R., Hopkin, M. S., Hansen, L. D. Simultaneous calorimetric and respirometric measurements on plant-tissues. Thermochimica Acta. 172, 213-221 (1990).
- Pesta, D., Gnaiger, E. High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle. Methods in Molecular Biology. 810, 25-58 (2012).
- Grimm, D., Altamirano, L., Paudel, S., Welker, L., Konkle, M. E., Chakraborty, N., Menze, M. A. Modulation of cellular energetics by galactose and pioglitazone. Cell and Tissue Research. , (2017).
- Hansen, L. D., Macfarlane, C., McKinnon, N., Smith, B. N., Criddle, R. S. Use of calorespirometric ratios, heat per CO2 and heat per O2, to quantify metabolic paths and energetics of growing cells. Thermochimica Acta. 422, 55-61 (2004).
- Chinet, A., Clausen, T., Girardier, L. Microcalorimetric determination of energy expenditure due to active sodium-potassium transport in the soleus muscle and brown adipose tissue of the rat. The Journal of Physiology. 265, 43-61 (1977).
- Paul, R. J. Physical and biochemical energy balance during an isometric tetanus and steady state recovery in frog sartorius at 0 degree C. Journal of General Physiology. 81, 337-354 (1983).
- Warburg, O. On the origin of cancer cells. Science. 123, 309-314 (1956).
- Kemp, R. B. Importance of the calorimetric-respirometric ratio in studying intermediary metabolism of cultured mammalian cells. Thermochimica Acta. 172, 61-73 (1990).
- Kola, I., Landis, J. Can the pharmaceutical industry reduce attrition rates? Nature Reviews Drug Discovery. 3, 711-715 (2004).
- Kamalian, L., Chadwick, A. E., Bayliss, M., French, N. S., Monshouwer, M., Snoeys, J., Park, B. K. The utility of HepG2 cells to identify direct mitochondrial dysfunction in the absence of cell death. Toxicology in Vitro. 29, 732-740 (2015).
- Rossignol, R., Gilkerson, R., Aggeler, R., Yamagata, K., Remington, S. J., Capaldi, R. A. Energy substrate modulates mitochondrial structure and oxidative capacity in cancer cells. Cancer Research. 64, 985-993 (2004).
- Fontana, A. J., Hansen, L. D., Breidenbach, R. W., Criddle, R. S. Microcalorimetric measurement of aerobic cell-metabolism in unstirred cell-cultures. Thermochimica Acta. 172, 105-113 (1990).
