Summary
在这里, 我们提出了一个评估口腔生物膜形成的方法在钛和氧化锆材料的牙科修复台, 包括分析细菌细胞的生存能力和形态学特征。在口腔生物膜分析中采用了一种与功能强大的显微技术相关联的原位模型。
Abstract
牙科植入物及其修复成分容易发生细菌定植和生物膜形成。使用提供低微生物黏附力的材料可以减少围植病的患病率和进展。鉴于口腔环境的复杂性和口腔生物膜的异质性, 需要显微技术来对牙齿和牙科材料的表面进行生物膜分析。本文介绍了用于比较人工牙基钛和陶瓷材料的口腔生物膜形成的一系列协议, 以及在形态学和细胞层面分析口腔生物膜的方法。用原位模型评价钛和氧化锆材料在牙科修复体上的口腔生物膜形成这项研究为 48 h 生物膜提供了令人满意的保护, 从而证明了方法上的充分性。光子显微镜允许分析在测试材料上形成的生物膜的区域代表。此外, 利用多光子显微镜对显影和图像进行处理, 可以对非常异构的微生物种群中的细菌生存能力进行分析。电子显微镜生物标本的制备促进了生物膜的结构保存, 图像分辨率好, 无工件。
Introduction
细菌生物膜是复杂的, 功能上和结构上有组织的微生物群落, 其特点是多种微生物物种, 合成胞外, 生物活性高分子基质1,2。细菌粘附到生物或非的表面之前, 形成的获得的薄膜, 主要包括唾液糖蛋白1,3,4。微生物与薄膜之间的物理化学相互作用初步建立, 其次是获得的薄膜的细菌 adhesins 和糖蛋白受体之间的相互作用更强。微生物多样性逐渐增加, 通过 coaggregation 的次级殖民者的受体已经附着的细菌, 形成一个多种群社区1,3,4, 5。
口腔微生物群的稳态及其与宿主的共生关系对维持口腔健康具有重要意义。口腔生物膜内的 dysbiosis 可能会增加龋病和牙周病2、5的发展风险。临床研究表明, 在牙齿或牙种植体上的生物膜积累与牙龈炎或周围种植体粘膜炎的形成有因果关系6,7。炎症过程的进展导致围 implantitis 和随后的损失种植体8。
牙科植入物及其修复成分容易发生细菌定植和生物膜形成9。使用具有化学成分和表面形貌的材料, 提供低微生物黏附力, 可减少9、10围植体疾病的患病率和进展。钛是用于制造植入物的假肢基台的最常用材料;然而, 陶瓷材料最近被介绍了并且越来越受欢迎作为替代钛由于他们的审美特性和生物相容性11,12。同样重要的是, 陶瓷材料已经与一个假想的减少可能坚持微生物, 主要是由于其表面粗糙度, 润湿性, 和表面自由能源10,13。
体外研究有助于了解微生物黏附力对修复桥台表面9、14、15、16、17的重要进展。然而, 口腔的动态环境, 其特点是其变化的温度和 pH 值和养分的可用性, 以及由存在的剪切力, 是不可再生的体外实验协议18, 19。为了克服这一问题, 另一种选择是使用原位模型的生物膜形成, 有利地保留其三维结构的前体分析10,20,21,22,23,24。
对口腔基质形成的生物膜复杂结构的分析需要使用能够显示光学致密物质25的显微技术。光子激光扫描显微镜是生物膜结构分析的现代选择26。它的特点是利用非线性光学光源接近红外波长, 脉冲到飞秒27。这一方法是为图像获取的荧光材料或显影标记的材料, 除了所产生的图像由非线性光学信号所衍生的现象称为第二次谐波产生。光子显微镜的优点之一是, 由于激发光强度的影响, 获得的最大图像深度为27。
对于非生物表面生物膜的生物活性分析, 用光子显微镜观察, 在细菌细胞中使用不同光谱特征和渗透能力的荧光核酸染料需要28。显影 SYTO9 (绿荧光) 和碘碘 (红荧光) 可用于视觉分化的活菌和死细菌28,29,30。碘碘化物只穿透受损膜的细菌, 而 SYTO9 进入细菌细胞, 并有完整且受损的膜。当两种染料都存在于细胞内时, 碘碘对核酸有更强的亲和力, 并取代 SYTO9, 标志着红色28,30。
鉴于口腔环境的复杂性和口腔生物膜的异质性, 需要显微技术来对牙齿和牙科材料表面进行生物膜分析。本文介绍了用于比较人工牙基钛和陶瓷材料的口腔生物膜形成的一系列协议, 以及在形态学和细胞层面分析口腔生物膜的方法。
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Protocol
这项研究获得了 Ribeirão 欧鲁普雷图牙科学院机构审查委员会的批准, 志愿者参加者签署了书面同意书 (程序 2011.1. 371.583)。
1.原位生物膜形成
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参加者的选择
- 根据以下纳入标准选择患者: 一个健康的个体, 有完整的牙列, 没有口腔疾病的临床症状。
- 根据以下排除标准排除病人: 怀孕、哺乳期、龋齿、牙周疾病或抗生素治疗在过去3月里, 吸烟者, 或任何可能影响牙周状态的系统性疾病。
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口腔内设备的研制
- 用海藻酸盐的印象记录上颌弓。
- 将19毫升的水添加到100克石粉中, 制备 IV. 型石材。将石头倒入海藻酸盐霉菌中, 使其成为上颌拱的模型。
- 设计和制造一个丙烯酸口内设备, 以支持测试标本 (钛和陶瓷圆盘)。
- 用正畸钳制作 NiCr 线 (直径0.7 毫米) 的固定扣 #139 并将其放置在模型上。要在上前磨牙之间定位夹钳, 请弯曲每根导线的一端, 使其形成循环。
- 适应循环在牙缝的区域。在咬合中, 插入柔和的曲率, 以免干扰接触点和遮挡。在夹钳的末端做一个90°折叠, 以保持丙烯酸。
- 为了适合在上第二磨牙钳, 调整在颈部第三 (前庭) 线的曲率, 以轮廓的牙齿 (远端), 并作出一个90°折叠在钳位的一端保持在丙烯酸。
注: 为了提供足够的保留/稳定的口内设备, 固定扣被放置在上前磨牙和远端的第二磨牙两侧的牙弓。
- 根据制造商的指示操作自固化丙烯酸树脂, 在塑料阶段将丙烯酸树脂压在2玻璃板 (3 毫米厚的垫片中间), 使3毫米厚的板材。
- 在模型的腭区上放置丙烯酸片, 根据装置的设计, 在聚合前用雕刻机修剪多余的丙烯酸树脂。
- 用金属基体 (直径为10毫米, 厚度2毫米 (表面面积78.5 毫米2)) 制作蜡盘, 在基体中放置熔融蜡, 等待蜡凝固。手动将4个蜡盘嵌入丙烯酸树脂中, 其中2是前磨牙和第二磨牙旁边的2个。
- 让丙烯酸树脂在 20 psi 压缩空气的压力罐中聚合20分钟。
- 用电牙科实验室手机和切割机完成口腔内设备, 用磨料橡胶抛光。
- 使用上面描述的设备, 调整设备的适当配合。
- 用正畸钳制作 NiCr 线 (直径0.7 毫米) 的固定扣 #139 并将其放置在模型上。要在上前磨牙之间定位夹钳, 请弯曲每根导线的一端, 使其形成循环。
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钛及氧化锆试样的制备
注: 试样 (n = 14) 直径为10毫米, 厚度为2毫米, 表面面积为78.5 毫米2。- 用水冷 sandpapers 减少磨损 (600、1200和2000粒) 来抛光试样表面, 大约20分钟。
注: 对试样进行抛光, 以规范0.2 µm 表面粗糙度。 - 用液体洗涤剂和自来水清洁和消毒标本和口内设备, 然后使用异丙醇超声波浴15分钟. 用吸水纸巾擦干。
- 用0.1 毫升的无毒热熔胶 (图 1) 固定口腔内口服装置中的标本。
- 安装包含口腔标本的装置。
注: 含标本的口内装置应佩戴48小时。该设备被删除, 并储存在磷酸盐缓冲盐水 (PBS), 而病人正在吃和执行口腔清洁。
- 用水冷 sandpapers 减少磨损 (600、1200和2000粒) 来抛光试样表面, 大约20分钟。
2. 对细菌生存能力的评估
注: 样品大小n = 10。
- 通过添加3µL 的 SYTO9 (绿色荧光核酸染料) 和3µL 碘碘化 (红色荧光核酸染料) 到1毫升的无菌蒸馏水中制备染色溶液。
注意: 准备防光保护的解决方案。 - 将标本转移到24井板上, 用 PBS 彻底清洗, 去除任何非附着细胞。
- 添加适当的荧光染料溶液体积 (1 毫升), 以覆盖含生物膜的试样。非常小心地添加染料, 以免瓦解生物膜。
- 在室温下孵化标本 20-30 分钟, 免受光照。
- 用无菌蒸馏水轻轻冲洗生物膜样品, 除去多余的染料。
- 将试样放置在玻璃底碟中, 并执行微光子激光扫描显微镜进行生物膜分析。
注: 利用光子显微系统对细菌细胞生存能力进行分析。用 546/680 nm 和 477/600 nm 的激发/发射波长的过滤器检测了碘碘化物的荧光, SYTO9。获得的图像的大小为 5.16188 x 5.16188 毫米, 对应于每个标本 (78.5 毫米2) 或总面积33.94% 的总面积的26.64 毫米2 。这些图像是从样本的最中心部分制作的, 分辨率为 1024 x 1024 像素。用斐济软件31分别分析了红色通道和绿色通道图像。每个单元格都使用选择工具进行选择, 并通过像素的积分密度测量荧光的强度, 减去图像背景。
3. 用能量色散谱法分析试样的化学成分 (EDS)
注: 样品大小n = 3。
- 选择每种无生物膜试验材料的3个标本, 并使用扫描电子显微镜与色散能量光谱仪相耦合, 评估每个试样2个不同区域的化学成分, 电子束电压为10伏32。
4. 细菌生物膜的扫描电镜形态学分析
注: 样品大小n = 1。
- 将生物膜浸泡在2.5% 戊二醛稀释0.1 米常使用钠缓冲液中, pH 7.0-7.3, 为 24 h。
- 在 PBS 缓冲器中清洗样品 (pH 值 = 7.6)。
- 用1% 锇毒气对生物膜进行1小时的后缀。
- 在 PBS 缓冲器中清洗样品 (pH 值 = 7.6)。
- 仔细脱水生物膜样品, 使它们浸入乙醇溶液浓度的增加 (50%、70%、90%、95% 和 100%)。
注: 在100% 浓度下进行3的乙醇交换。总脱水步骤大约需要2小时。 - 将试样转移到临界点干燥机上, 用二氧化碳 (CO2) 进行多次置换, 直到试样干燥。
- 从仪器中取出干标本, 将其装入扫描电子显微镜支架上。
- 溅射涂层20纳米的黄金层到标本的表面为120s。
- 在扫描电镜室插入镀金圆盘。从每个标本的5个不同区域获得图像, 在可变压力下 20-30 伏, 在650X 放大12。
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Representative Results
本研究以 48 h 的原位生长后生物膜的定植密度为依据, 用光子显微镜观察了钛和氧化锆圆盘上的占地面积与试样总扫描面积的比例 (26.64 毫米2)。图 2表示3测试材料表面的细菌定植密度。在铸件表面和在机械加工的钛盘 (分别为0.0292 µm2和0.0213 µm2) 上观察到的生物膜密度高于氧化锆圆盘 (0.0099 µm2;p < 0.05;克鲁斯卡尔-沃利斯的测试, 其次是邓恩的测试)。
图 3显示了氧化锆表面的细菌细胞 (图 3A、 3A和3A)、机械加工的钛 (图 3B、 3B和3B), 铸造钛 (图 3C, 3C)和3C ") 磁盘。在这个协议中, 核酸染料碘碘化物只渗透到细菌与受损的膜, 因此, 发出一个红色荧光信号, 与死细胞有关。SYTO9 渗透细菌细胞与完整或受损的膜, 并发出绿色荧光信号的活微生物。细胞细菌的生存能力在测试材料之间是相似的, 在所有小组中占主导地位的活微生物 (图 4)。活/死细胞比例为 2.10, 氧化锆, 1.95 的机械加工钛, 1.63 铸造钛。
在抛光和/或加工过程中, 观察到所有材料表面产生的裂纹、沟槽或磨损缺陷, 在机械加工和铸造钛盘中更清晰。在氧化锆圆盘中, 观察到较大的区域缺乏微生物;还观察到主要由球菌、杆菌和丝状菌组成的小多态微生物聚集物 (图 5A和5A)。有球菌和杆菌的存在散布在机械加工的钛盘表面上 (图 5B和5B)。铸造钛标本提出了微生物的菌落在表面生物膜状外观 (图 5C和5C ') 的基质。与机械加工的钛和铸钛盘相比, 氧化锆圆盘表面观察到的基体材料较少。
EDS 分析发现70.83% 的氧化锆, 22.84% 的氧气, 4.52% 的钇, 和1.57% 的铪在氧化锆圆盘;95.16% 的钛, 3.99% 的氧气, 和0.85% 的碳在铸钛盘;和89.86% 的钛, 7.53% 的氧气, 2.61% 的碳在机械加工钛盘 (图 6)。
图 1: 口腔内设备为就地研究.固定扣用锻丝制造, 钛和氧化锆试验盘 (直径10毫米, 2 毫米厚) 随机放置在前磨牙和磨牙区, 部分嵌入自固化丙烯酸树脂中。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: 细菌细胞密度的荧光图像.这些是细菌细胞密度的荧光图像 (A) 氧化锆, (B) 机械加工钛和 (C) 铸造钛盘在 48 h 以后原位。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3: 细菌的细胞活力附着在表面上.这些面板显示了细菌在氧化锆 (a) 上的死和活细菌细胞的表面上的生存能力, (B) 机械加工钛上的死和活细菌细胞, (C) 铸钛上的死和活细菌细胞由荧光成像描述的磁盘。死细菌细胞被碘碘化物 (A ', B '和C ': 红色荧光信号) 染色。活细菌染色的 SYTO9 (A ", B", 和C ": 绿色荧光信号)。面板A、 B和C显示颜色合并图像。请单击此处查看此图的较大版本.
图 4: Boxplots 在不同的试验材料上代表生物膜的细胞生存能力.请单击此处查看此图的较大版本.
图 5: 扫描电镜.这些面板显示了扫描电子显微镜的 (a, a ') 氧化锆, (b, b ') 机械加工钛, (c, c ') 铸造钛圆盘与生物膜, 在全景和关闭的看法, 在 48 h原位之后.请单击此处查看此图的较大版本.
图 6: 用能量色散谱 (EDS) 进行元素分析.这些面板显示 (A) 氧化锆圆盘 (锆 = 氧化锆, Y = 钇, C = 碳, O = 氧, Hf = 铪);(B) 机械加工钛, (c) 铸钛圆盘 (Ti = 钛, O = 氧, 和 c = 碳)。请单击此处查看此图的较大版本.
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Discussion
本文所述的协议是为了评价人工牙基钛和氧化锆材料的生物膜形成, 包括细菌细胞活力和形态学特征的分析。为了达到这一目的, 设计了一种生物膜形成的原位模型, 由口内装置组成, 能够容纳试验材料样品, 并使其暴露在动态口腔环境中48小时。该设备被认为是舒适和容易插入, 删除和清洁的志愿者。然而, 它对语音学和美学的影响甚少, 制作简单、成本低廉, 并使标本易于回收, 不破坏生物膜结构。此外, 该方法还可以保存细菌细胞和细胞外基质的完整性。实验中, 舌与试样的接触和圆盘的意外损耗是该模型的局限性。为了最大限度地减少该方法的局限性, 在口内装置中的圆盘定位是随机分布的;此外, 这些圆盘是用无毒的热熔胶固定的, 并没有样品损失报告。
由于口腔环境中细菌种类的高异质性, 需要强大的显微技术来分析生物膜对其坚硬表面的殖民化。多光子显微镜提供了比常规或共焦显微分析的几个优势, 如固有的三维分辨率, 近红外激发, 以优异的光学穿透, 减少漂白和光损伤当成像活细胞, 并提供定量信息33,34的能力。这些优势来源于双光子吸收过程的高度局部激发和光散射在试样中的减弱效应。因此, 多光子显微镜能使深部组织成像, 最小细胞损伤, 并启动良好的局部化光化学34。随机抽样和有代表性的字段数将被选出, 以准确分析35,36。光子激光扫描显微镜允许分析 5161.88 x 5161.88 µm 的面积, 相当于总标本面积的33.94%。共焦显微术没有使用, 因为需要大量的领域的代表性分析和长时间的评价标本。此外, 聚焦的背景信号限制了荧光显微镜的使用。尽管多光子显微镜的优点, 在微生物领域只有少数应用报告37,38,39。其中之一是它作为操纵工具的使用;例如, 为了实现局部消融, 凋亡/坏死, 漂白, 或 photoactivation 的一个明确定义的体积的生物膜细胞26。该方法的另一种应用是评价抗菌剂对多种生物膜组分25、40、41的功效。
本研究用荧光核酸染料对粘附细菌细胞的生存能力进行评价, 并将细胞作为其膜完整性28的功能。SYTO9 显影和碘碘化物用于活体和死菌的视觉鉴别。文献报道了 SYTO9 和碘碘化物使用的一些局限性, 如 SYTO9 难以用完整的膜染色革兰阴性菌, 因为它必须穿过结构30中存在的两个细胞膜, 42。因此, 活细胞可以被低估的联合染色。另外, 当 SYTO9 不是完全地被碘碘化物替换, 黄色荧光可能被观察而不是红色在细菌细胞30,42。另一个限制是随着时间的推移, SYTO9 信号的减少。建议在接触染料29、30后30分钟内进行显微分析。有必要考虑背景荧光来计算信号强度, 因为基底的荧光和未绑定染料的存在可能会干扰结果30。然而, 由于这些限制是很好的报告, 有可能在指定的时间内处理样本, 并在斐济软件的帮助下仔细选择和减去图像的背景。
在扫描电子显微镜下的高真空和电子辐照表示含有生物材料的样品的不利条件。除非导电性外, 生物膜在其自然状态下是水合的, 干扰了电子生成和检测系统, 形成了工件43。因此, 必须准备含有生物材料的标本, 以确保保存其电子43,44的结构和导电。研制了具有导电材料的试样的固定、脱水、干燥、涂装等工艺过程, 特别注意稀释和时间。生物材料的固定用醛在常使用缓冲和毒气后固定, 以保持粘附生物膜43,45,46的结构。脱水是随着乙醇浓度的升高而达到的, 水逐渐被有机溶剂44所取代。干燥以极小的变形生物膜建筑学通过关键点执行连续替换液体 CO2为乙醇去除, 然后转换 CO2到气相, 去除液体/气体界面, 并消除表面张力的标本43,44,45,46。为了确保电子的电导率, 防止或减少损害, 并图像的文物, 标本被涂上了 10-20 纳米层的金或金/钯。另外, 用一层薄薄的金属涂层试样可以减少试样内的电荷积聚, 提高对比度, 提高图像分辨率46。
尽管存在一些局限性, 本研究中所描述的原位模型对钛和氧化锆材料的口腔生物膜形成有足够的评价, 保留了 48 h 生物膜。利用多光子显微镜与影像学相结合的显影, 可以分析在非常异构的微生物种群中细菌细胞的生存能力, 从而使试验材料成为殖民地。生物样品的制备技术促进了生物膜的结构保存, 允许获得高质量的图像, 用于对殖民微生物的可视化和形态学表征。.
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者感谢 Maulin 从显微镜多用户实验室 (Ribeirão 欧鲁普雷图医学院) 的慷慨协助与 EDS 和 SEM 分析和老兄特谢拉马查多为他在视频版的慷慨技术援助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hydrogum 5 | Zhermack Dental | C302070 | |
| Durone IV | Dentsply | 17130500002 | |
| NiCr wire | Morelli | 55.01.070 | |
| JET auto polymerizing acrylic | Clássico | ||
| Dental wax | Clássico | ||
| Pressure pot | Essencedental | ||
| Sandpapers 600 grit | NORTON | T216 | |
| Sandpapers 1200 grit | NORTON | T401 | |
| Sandpapers 2000 grit | NORTON | T402 | |
| Metallographic Polishing Machine | Arotec | ||
| Isopropyl alcohol | SIGMA-ALDRICH | W292907 | |
| Hot melt adhesive | TECSIL | PAH M20017 | |
| Filmtracer LIVE/DEAD Biofilm Viability Kit | Invitrogen | L10316 | |
| Pipette Tips, 10 µL | KASVI | K8-10 | |
| Pipette Tips, 1,000 µL | KASVI | K8-1000B | |
| 24-well plate | KASVI | K12-024 | |
| Glass Bottom Dish | Thermo Scientific | 150680 | |
| AxioObserver inverted microscope | ZEISS | ||
| Chameleon vision ii laser | Coherent | ||
| Objective EC Plan-Neofluar 40x/1.30 Oil DIC | ZEISS | 440452-9903-000 | |
| SDD sensors - X-Max 20mm² | Oxford Instruments | ||
| Glutaraldehyde solution | SIGMA-ALDRICH | G5882 | |
| Sodium cacodylate Buffer | SIGMA-ALDRICH | 97068 | |
| Osmium tetroxide | SIGMA-ALDRICH | 201030 | |
| Na2HPO4 | SIGMA-ALDRICH | S9638 | Used for preparation of phosphate buffered saline |
| KH2PO4 | SIGMA-ALDRICH | P9791 | |
| NaCl | MERK | 1.06404 | |
| Kcl | SIGMA-ALDRICH | P9333 | |
| Ethanol absolute for analysis EMSURE | MERK | 1.00983 | |
| CPD 030 Critical Point Dryer | BAL-TEC | ||
| JSM-6610 Series Scanning Electron Microscope | JEOL | ||
| SCD 050 Sputter Coater | BAL-TEC |
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