Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Устные биопленки на различных материалах для стоматологических имплантатов

Published: June 24, 2018 doi: 10.3791/57756
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 1
1Department of Dental Materials and Prosthodontics, School of Dentistry of Ribeirão Preto, University of São Paulo, 2Department of Restorative Dentistry, School of Dentistry of Ribeirão Preto, University of São Paulo

Summary

Здесь мы представляем протокол для оценки устного биопленки на титана и циркония материалы для абатментов протезирование, включая анализ жизнеспособности клеток бактерий и морфологические характеристики. Модель на месте , связанная с мощными микроскопии методов используется для анализа устного биопленки.

Abstract

Зубные имплантаты и их компоненты протеза, склонны к бактериальной колонизации и биопленки. Использование материалов, что обеспечивает низкий адгезию микробов может уменьшить распространенность и прогрессирование заболеваний Пери имплантат. С учетом устных среды сложности и устных биопленки неоднородность, микроскопия, необходимой техники, которая может позволить биопленки анализ поверхностей зубов и стоматологические материалы. Эта статья описывает последовательность протоколов, для сравнения устные биопленки на титана и керамических материалов для опоры протезов, а также методы, участвующих в устной биоплёнки анализы на морфологических и клеточном уровнях. В situ модель для оценки устного биопленки на титана и циркония материалы для протеза опор, как описано в настоящем исследовании обеспечивает удовлетворительный сохранение 48 h биопленки, продемонстрировав тем самым методологических адекватности. Multiphoton микроскопии позволяет анализ зональный представитель биопленки, сформированные на тестовые материалы. Кроме того использование флуорофоров и обработки изображений, с помощью multiphoton микроскопии позволяет анализ бактериальной жизнеспособности в очень гетерогенной популяции микроорганизмов. Подготовка электронной микроскопии биологических образцов способствует структурной сохранению биопленки, изображения с хорошим разрешением и никаких артефактов.

Introduction

Бактериальные биопленки являются сложными, функционально и структурно организованы микробных сообществ, характеризуется разнообразием видов микроорганизмов, которые синтезировать внеклеточные, биологически активных полимеров матрица1,2. Бактериальной адгезии биотические или абиотические поверхностей предшествует формирование приобретенных пленкой, главным образом состоящая из слюнных гликопротеинов1,3,4. Слабая физико-химических взаимодействий между микроорганизмы и пленка изначально создаются и следуют сильнее взаимодействий между бактериальной адгезины и рецепторы гликопротеина приобретенных пленки. Микробного разнообразия постепенно увеличивает через coaggregation вторичного колонизаторами на рецепторы уже вложенных бактерий, образуя многовидовыми сообщества1,3,4, 5.

Гомеостаза устные микробиоту и симбиотические отношения с принимающей имеет важное значение в поддержании гигиены полости рта. Дисбактериоз в устной биоплёнки может увеличить риск развития кариеса и заболеваний пародонта2,5. Клинические исследования демонстрируют причинно следственные взаимосвязи между накоплением биопленки на зубы и имплантаты и развитие гингивита или Пери имплантат мукозита6,7. Прогрессирования воспалительного процесса приводит к периимплантита и последующей утрате имплантата8.

Зубные имплантаты и их компоненты протеза, склонны к бактериальной колонизации и биопленки формирования9. Использование материалов с химическим составом и топографии поверхности, что обеспечивает низкий адгезию микробов может уменьшить распространенность и прогрессирования заболевания Пери имплантат9,10. Титан является наиболее распространенным материалом для изготовления протезов абатментов для имплантатов; Однако керамические материалы были недавно введены и набирают популярность как альтернатива титана благодаря их эстетическим свойствам и биосовместимость11,12. Также важно, керамические материалы были связаны с якобы снижение потенциалом присоединиться к микроорганизмам, главным образом благодаря их шероховатости поверхности, смачиваемости и поверхности свободной энергии10,13.

В vitro исследования способствовали значительные успехи в понимании микробной адгезии для протезирования Абатмент поверхности9,14,,1516,17. Однако динамической среды полости рта, характеризуются различной температуры и рН и наличия питательных веществ, а также присутствие сил сдвига, не воспроизводится в пробирке экспериментально протоколы18, 19. Для преодоления этой проблемы, альтернативой является использование в situ моделей биопленки, который выгодно сохраняет свою трехмерную структуру для ex vivo анализа10,20, 21 , 22 , 23 , 24.

Анализ сложной структуры биопленки, сформированные на устные субстратов требует использования методов микроскопии, способного отображать оптически плотного вопрос25. Multiphoton лазерная сканирующая микроскопия является современным вариантом для биопленки структурный анализ26. Он характеризуется использованием нелинейной оптики с источником освещения рядом инфракрасные волны, пульсирующий до фемтосекунд27. Этот метод показан для захвата изображений аутофлюоресценция материалов или материалов, отмечен флуорофоров, помимо изображений, генерируемых нелинейных оптических сигналов, полученных от явления, известного как второе поколение гармонических. Среди преимуществ multiphoton микроскопии является глубина большие изображения, полученные с минимальным клеток, причиненный интенсивность света возбуждения27.

Для анализа жизнеспособности биопленки на абиотические поверхностей multiphoton микроскопии использование флуоресцентных нуклеиновой кислоты красители с различные спектральные характеристики и мощность проникновения в бактериальных клетках требуется28. Флуорофоров SYTO9 (зеленый люминесцентные) и пропидий йодидом (красный люминесцентные) может использоваться для визуального разграничения между живые и Мертвые бактерии28,29,30. Пропидий йодидом проникает только бактерии с поврежденной мембраны, в то время как SYTO9 входит бактериальной клетки с нетронутыми и нарушенной мембраны. Когда оба красители присутствуют внутри клетки, пропидий йодидом имеет большее сродство нуклеиновых кислот и вытесняет SYTO9, пометив его красный28,30.

С учетом устных среды сложности и устных биопленки неоднородность, микроскопия, необходимой техники, которая может позволить биопленки анализ поверхностей зубов и стоматологические материалы. Эта статья описывает последовательность протоколов, для сравнения устные биопленки на титана и керамических материалов для опоры протезов, а также методы, участвующих в устной биоплёнки анализы на морфологических и клеточном уровнях.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Это исследование был одобрен Советом по рассмотрению институциональных Школа стоматологии в Рибейран-Прету, и добровольцев участник подписал письменное согласие (процесс 2011.1.371.583).

1. биопленки в Situ

  1. Отбор участников
    1. Выберите пациентов, основанные на следующих критериях: здоровый человек с полным зубочелюстной системы и никаких клинических признаков заболевания полости рта.
    2. Исключить пациентов, основанные на следующих критериях исключения: беременности, лактации, кариес, заболевания пародонта или лечения антибиотиками в последние 3 месяца, курильщик или любые системные заболевания, которые могут повлиять на состояние пародонта.
  2. Подготовка интраоральные устройства
    1. Запись верхнечелюстной арка посредством альгината впечатление.
    2. Подготовьте тип IV камень, добавив 19 мл воды 100 г каменного порошка. Залейте камень в альгинатные прессформы сделать модель верхнечелюстной арки.
    3. Дизайн и изготовить акриловые интраоральные устройства для поддержки испытательных образцов (титана и керамические диски).
      1. Изготовить цепкой застежки из NiCr проволоки (0.7 мм в диаметре) с помощью ортодонтические плоскогубцы #139 и разместите их на модели. Чтобы разместить зажим между верхних премоляров, согните один конец каждого провода так, что они образуют цикл.
        1. Адаптировать цикла в регионе межзубных сосочков. Вставьте в окклюзии, Нежный кривизны, чтобы не вмешиваться с точки соприкосновения и окклюзии. Сделайте 90° складывать в конце зажим для крепления в акрил.
        2. Чтобы соответствовать зажим в верхней второй моляра, адаптировать кривизны провода в шейки матки третьей (вестибулярные) для контура зуба (дистальной части) и сделать 90° складывать в конце зажим для крепления в акрил.
          Примечание: В целях обеспечения надлежащего удержания/стабильность интраоральные устройство, цепкой застежки были размещены между верхних премоляров и дистальной аспект второй молярной по обе стороны зубной дуги.
      2. Управлять самостоятельно полимеризации акриловой смолы в соответствии с инструкциями производителя и нажмите акриловой смолы между 2 стекла (с 3 мм толщиной spacer вставил) во время этапа пластиковые, чтобы сделать лист толщиной 3 мм.
      3. Заложить акриловый лист на небной региона модели, по словам дизайн устройства и обрезать излишки акриловой смолы с Карвер, до полимеризации.
      4. Изготовить воск дисков с помощью металлической матрицы [10 мм в диаметре, 2 мм в толщину (площадь поверхности 78,5 мм2)], поместив расплавленный воск в матрице и ждет воск затвердеть. Вручную вставьте 4 дисков воск в акриловой смолы, из них 2 между премоляров и другие 2 рядом со вторых моляров.
      5. Пусть акриловой смолы полимеризоваться в горшочке давление сжатого воздуха за 20 мин до 20 psi.
      6. Закончить интраоральные устройства с электрическим стоматологической лаборатории наконечника и резец и отполировать абразивной резиной.
      7. Настройте устройство для надлежащего нужным в рот с использованием оборудования, описанных выше.
  3. Подготовка образцов для титана и циркония
    Примечание: Образцы (n = 14) являются 10 мм в диаметре и 2 мм в толщину и имеют площадь поверхности 78,5 мм2.
    1. Польский поверхности образцов с water-cooled шкурки уменьшения абразивности (600, 1200 и 2000 Грит), примерно 20 мин.
      Примечание: Полировка образцов была проведена стандартизировать шероховатости поверхности на 0,2 мкм.
    2. Очистки и дезинфекции образцов и интраоральные устройства с жидкого моющего средства и воды и затем использовать изопропиловый спирт ультразвуковой ванне для 15 мин высушить с бумажные полотенца.
    3. Исправьте образцы в интраоральные устных устройства с около 0,1 мл нетоксичные горячего расплава клея (рис. 1).
    4. Установка устройства, содержащие образцы в ротовой полости.
      Примечание: Интраоральные устройства, содержащие образцы должны носить в течение 48 часов. Устройство было удалено и хранятся в-фосфатный буфер (PBS) в то время как пациент ел и выполняющих устные очистки.

2. Оценка бактериальной жизнеспособности

Примечание: Размер выборки n = 10.

  1. Приготовляют раствор крашения, добавив 3 мкл SYTO9 (зеленая краска люминесцентные нуклеиновой кислоты) и 3 мкл пропидий йодидом (красный флуоресцентные нуклеиновой кислоты краской) по 1 мл стерильной дистиллированной воды.
    Примечание: Подготовьте решения защищены от света.
  2. Передача образцов к пластине 24-Ну и вымыть их с PBS для удаления любой non сторонник клеток.
  3. Добавьте соответствующий объем (1 мл) раствора Флюоресцентная краска для покрытия биопленки содержащих образца. Добавьте краситель очень осторожно чтобы не дезорганизовать биопленки.
  4. Проинкубируйте образцы для 20-30 минут при комнатной температуре, в защищенном от света.
  5. Осторожно промойте биопленки образца с стерильной дистиллированной водой, чтобы удалить любые излишки красителя.
  6. Поместите образец в блюдо дно стекла и выполнять multiphoton лазерной сканирующей микроскопии для анализа биопленки.
    Примечание: Жизнеспособности клеток бактерий был проведен анализ с использованием системы multiphoton микроскопии. Флуоресценции пропидий йодидом был обнаружен с помощью фильтра с длиной волны возбуждения/выбросов 546/680 нм и 477/600 Нм для SYTO9. Размер изображений, полученных был 5.16188 x 5.16188 мм, что соответствует 26,64 мм2 общей площади каждого образца (78,5 мм2) или 33.94% от общей площади. Изображения были сделаны из центральной части образца, с разрешением 1024 x 1024 пикселей. Красный канал и зеленый канал изображения были проанализированы отдельно с помощью программного обеспечения Фиджи31. Каждая ячейка был выбран с помощью инструмента выделения и интенсивность флуоресценции была измерена путем комплексного плотность пикселей, вычитание фона изображения.

3. анализ химического состава образцов по энергии дисперсионных спектроскопии (ЭЦП)

Примечание: Размер выборки n = 3.

  1. Выберите 3 образцов каждого материала биопленки бесплатный тест и оценить химический состав в 2 разных районах каждого образца с помощью сканирующего электронного микроскопа, в сочетании с дисперсионные энергии спектрометр с электронно пучка напряжением 10 кв32.

4. морфологический анализ бактериальные биопленки, сканирующая электронная микроскопия

Примечание: Размер выборки n = 1.

  1. Исправьте биопленки, погружая образцы в низкотемпературном растворе глютаральдегида 2,5%, разбавленных в 0,1 М натрия cacodylate буфера, рН 7,0-7.3, за 24 часа.
  2. Мыть образца в PBS буфере (рН = 7.6).
  3. Постфиксная биопленки с 1% осмия тетраоксид за 1 час.
  4. Мыть образца в PBS буфере (рН = 7.6).
  5. Обезвоживает биопленки образцы тщательно, сохраняя их погружен в повышении концентрации растворов этанола (50%, 70%, 90%, 95% и 100%).
    Примечание: Выполните 3 обмены этанола в концентрации 100%. Общее обезвоживание шаг занимает около 2 часов.
  6. Передача образцов сушилка критической точки и сделать несколько замен с углекислым газом (CO2) до тех пор, пока образцы являются сухими.
  7. Удаление сухих образцов из аппарата и смонтировать их на Держатели сканирующий электронный микроскоп.
  8. Распыления пальто 20 Нм слой золота на поверхности образца для 120 s.
  9. Вставляйте диски с покрытием золотом в зале сканирующий электронный микроскоп. Получение изображений из 5 различных областей каждого образца, в 20-30 кв под переменным давлением и увеличение 650 X12.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

В этом исследовании колонизации плотность биопленки после 48 ч в situ роста была представлена доля области колонизированным на дисках титана и циркония по отношению к отсканированные площадь образца с помощью multiphoton микроскопии ( 26,64 мм2). Рисунок 2 представляет плотность бактериальной колонизации на поверхности 3 проверенных материалов. Выше плотность биопленки было отмечено на поверхностях актеров и на обработанной титановые диски (0.0292 мкм2 и 0.0213 µm2, соответственно) чем в дисках циркония (0.0099 мкм2; p < 0,05; Kruskal-Wallis тест, а затем Данн тест).

Рисунок 3 показывает жизнеспособность клеток бактерий на поверхности циркония (рис. 3A, 3А ', и 3A»), механической обработке титана (рисунок 3B, 3B', и 3B») и литые титановые (рис. 3 c, 3 C' , и 3 C «) диски. В настоящем Протоколе нуклеиновые кислоты краситель пропидий йодидом проникает только в бактерии с поврежденной мембраны и, таким образом, испускает красный люминесцентные сигнал, что связано с мертвых клеток. SYTO9 проникает бактериальные клетки с нетронутыми или скомпрометированные мембраны и Зеленый флуоресцентный сигнал от живых микроорганизмов. Клеточных бактериальных жизнеспособности был похож между испытания материалов, с преобладанием живых микроорганизмов во всех группах (рис. 4). 2.10 для циркония, 1.95 для механической титана и 1.63 для литых титановых пропорции жить/мертвые клетки.

Трещины, канавки или истирания дефекты на поверхности все материалы, полученные в процессе полировки и/или обработки были замечены, более четко в станке и литые титановые диски. В цирконий диски большие районы были замечены с отсутствием микроорганизмов; также наблюдались небольшие полиморфных микробной агрегатов, состоящие в основном из кокки, бациллы и нитчатые бактерии (Рисунок 5A и 5А '). Присутствие кокки и бациллами был рассеян на поверхности обработанной титановые диски (Рисунок 5B и 5B'). Литой титана образцов представлены колоний микроорганизмов, которые участвуют в матрицу биопленки как появление на поверхности (рис. 5 c и 5 C'). На поверхности дисков циркония, по сравнению с механической Титан и титановые диски литые было отмечено меньше материала матрицы.

EDS анализ показал 70.83% циркония, 22,84% кислорода, 4.52% иттрия и 1,57% гафния в цирконий диски; 95.16% титана, 3,99% кислорода и 0,85% углерода в литых дисков титана; и 89,86% титана, 7,53% кислорода и 2,61% углерода в смоделированной титановые диски (рис. 6).

Figure 1
Рисунок 1 : Интраоральные устройство для на месте исследования. Цепкой застежки были сфабрикованы с кованой проволоки, и титана и циркония тест дисков (10 мм в диаметре, толщиной 2 мм) случайно были расположены в регионах премоляров и моляров, частично внедрены в самотвердеющие акриловой смолы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2 : Изображения флуоресценции плотности бактериальных клеток. Эти изображения флуоресценции бактериальной клетке плотности на циркония (A), (B) механической обработке титана, и (C) литые титановые диски после 48 ч в situ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. 

Figure 3
Рисунок 3 : Жизнеспособность клеток бактерий присоединились к поверхности. Эти панели показывают, что жизнеспособность клеток бактерий присоединились к поверхности (A) мертвых и живой бактериальной клетки на циркония, мертвых (B) и живой бактериальной клетки на обработанной титана и (C) мертвых и живой бактериальной клетки на литые титановые диски, изображены флуоресценции изображений. Мертвые бактериальной клетки окрашивали пропидий йодидом (A', B', и C': красный люминесцентные сигнал). Живых бактерий окрашенных с SYTO9 (A», B», и C «: Зеленая Флуоресценция сигнал). Панели, A, Bи C показывают объединены цвета изображения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4 : Boxplots, представляющий биопленки ячейки жизнеспособность на различных тестовых материалов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 5
Рисунок 5 : Растровая электронная микроскопия. Эти панели показывают растровая электронная микроскопия из (A A') циркония, (B, B') механической обработке титана, и (C, C') литые титановые диски с биопленки, панорамным и крупным планом вид, после 48 ч на месте . Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 6
Рисунок 6 : Элементарный анализ энергии дисперсионных спектроскопии (ЭЦП). Эти панели показывают диски циркония (A) (Zr = циркония, Y = иттрия, C = углерода, O = кислорода и Hf = гафния); (B) механической обработке титана, и (C) литые диски титана (Ti = титана, O = кислорода и C = углерода). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Протокол, описанный в настоящем исследовании была разработана для оценки биопленки на титана и циркония материалы для протезирования опор, включая анализ жизнеспособности бактериальных клеток и морфологические характеристики. Для того, чтобы достичь этого, был разработан в situ модель биопленки, состоящий из интраоральные устройство, способное вместить образцы испытания материалов и держать их воздействию динамической устные среды для 48 ч. Устройство было сочтено удобной и легкой для вставки, удаления и очистки священников. Тем не менее он показал незначительное влияние на фонетике и эстетики, была простой и недорогой для изготовления и разрешается легкое восстановление образцов без нарушения структуры биопленки. Кроме того метод допускается сохранение бактериальные клетки и целостности внеклеточного матрикса. Контакт языка с образцами и случайной потери диска во время эксперимента являются ограничения предлагаемой модели. Для того, чтобы свести к минимуму ограничения метода, позиционирования дисков в интраоральные устройство было случайным; Кроме того диски были исправлены с помощью нетоксичных горячего расплава клея, и без потери образца было сообщено.

Вследствие высокой неоднородности бактериальных видов, населяющих устные окружающей среды мощные микроскопии методы необходимы для анализа биоплёнки колонизировать его твердых поверхностей. Multiphoton микроскопии обеспечивает несколько преимуществ над обычными или конфокальная микроскопия анализов, такие присущие трехмерной резолюции, ближней ИК-области спектра возбуждения для превосходной оптической проникновения, снижение Фотообесцвечивание и фотоповреждения при визуализации живых клеток и возможность обеспечения количественной информации33,34. Эти преимущества происходят через высоко Локализованные возбуждения процесса поглощения двух Фотон и снижение влияния рассеяния света в образцах. Таким образом multiphoton микроскопии позволяет визуализации глубоких тканей, минимальная клеток от повреждения и начало хорошо локализованных фотохимии34. Случайная выборка и представитель количество полей должны быть избраны для точного анализа35,36. Multiphoton лазерной сканирующей микроскопии позволили анализ областей 5161.88 x 5161.88 мкм, соответствующий 33.94% от площади всего образца. Конфокальная микроскопия не использовался из-за необходимости большое количество полей для представителя анализа и длительного периода оценки образцов. Кроме того вне фокуса фонового сигнала ограниченное использование микроскопии флуоресцирования. Несмотря на преимущества multiphoton микроскопии только несколько приложений в области микробиологического являются сообщил37,,3839. Среди них является его использование в качестве инструмента манипуляции; например для достижения локализованных абляции, апоптоз/некроза, обесцвечивания или photoactivation хорошо определенный объем биопленки клеток26. Еще одно применение этого метода заключается в оценке эффективности антибактериальных агентов против нескольких биопленки компоненты25,40,41.

В этом исследовании жизнеспособность придерживался бактериальных клеток оценивалась флуоресцентные нуклеиновой кислоты красителями, которые проникают в клетки как функция их целостность мембраны28. SYTO9 флуорофоров и пропидий йодидом были использованы для визуального разграничения между живых и мертвых бактерий. Некоторые ограничения использования SYTO9 и пропидий йодидом сообщается в литературе, например сложности SYTO9 пятно грамотрицательных бактерий с нетронутыми мембраны, потому что он должен пересечь два клеточных мембран в структуре30, 42. Таким образом живые клетки может быть недооценено путем комбинированных пятнать. Кроме того когда SYTO9 не полностью заменены пропидий йодидом, желтый флюоресценции может наблюдаться вместо красного в бактериальных клетках30,42. Еще одним ограничением является снижение SYTO9 сигнала с течением времени. Рекомендуется, что микроскопии анализы проводятся в течение 30 мин после воздействия красители29,30. Это необходимо учитывать фон флуоресценции для расчета интенсивности сигнала, поскольку аутофлюоресценция субстрата и присутствие несвязанных краситель может вмешиваться в результаты30. Тем не менее поскольку эти ограничения также сообщили, это возможно иметь образцы, обработанных в течение указанного срока, а также тщательно выбрать и вычитание фона изображения с помощью программного обеспечения Фиджи.

Высокий вакуум и электрон облучения во время сканирования электронной микроскопии представляют неблагоприятных условий для образцов, содержащих биологический материал. Помимо не проводящих свойств является гидратированных биопленки в своем естественном состоянии, которая вмешивается электрон поколения системы и системы обнаружения, образуя артефакты43. Таким образом образцы, содержащие биологические материалы должны быть готовы для того, чтобы обеспечить сохранение структуры и проведение их электроны43,44. Протокол этапов, с участием фиксации, обезвоживания, сушки и покрытие образцов с токопроводящими были разработаны с уделением особого внимания разведений и время. Фиксация биологического материала была выполнена с альдегида в буфер cacodylate и после фиксации с осмия тетраоксид, чтобы сохранить структуру придерживался биопленки43,45,46. Обезвоживание была достигнута с восходящей серии концентраций этанола, с водой, постепенно заменяются органических растворителей44. Сушка с минимальным искажением биопленки архитектуры была выполнена через критическую точку с последующих замен жидкие CO2 для удаления этанола, а затем преобразование CO2 в газовой фазе, удаление жидкости / Газ интерфейс и ликвидации поверхностное натяжение на образец43,,4445,46. Для обеспечения проводимости электроны, предотвращения или уменьшения ущерба и изображения, артефакты, образцы были покрыты слоем золота или золота/Палладий 10-20 Нм. Кроме того покрытие образцы с тонким слоем металла может уменьшить накопление электрического заряда в образец, улучшить контраст и увеличить изображения резолюции46.

Несмотря на некоторые ограничения модель в situ , описанные в данном исследовании было достаточно для оценки устного биопленки на титана и циркония материалы, сохраняя 48 h биопленки. Использование флуорофоров связанные с работой с образами multiphoton микроскопии позволило анализ жизнеспособности бактериальных клеток в очень гетерогенной популяции микроорганизмов, колонизируя тестовые материалы. Методы, занятых в подготовке биологических образцов способствует структурной сохранение биопленки и допускается приобретение высококачественных изображений для визуализации и морфологическая характеристика колонизации микроорганизмов .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgments

Авторы благодарят Хосе Аугусто Maulin микроскопии многопользовательской лаборатории (школа медицины Рибейран-Прету) за его щедрую помощь с ЭЦП и SEM анализов и Hermano Тейшейра Мачадо за его щедрую техническую помощь в издании видео.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hydrogum 5 Zhermack Dental C302070
Durone IV Dentsply 17130500002
NiCr wire  Morelli 55.01.070
JET auto polymerizing acrylic Clássico
Dental wax  Clássico
Pressure pot  Essencedental
Sandpapers 600 grit NORTON T216
Sandpapers 1200 grit NORTON T401
Sandpapers 2000 grit NORTON T402
Metallographic Polishing Machine Arotec
Isopropyl alcohol SIGMA-ALDRICH W292907
Hot melt adhesive TECSIL PAH M20017
Filmtracer LIVE/DEAD Biofilm Viability Kit Invitrogen L10316
Pipette Tips, 10 µL KASVI K8-10  
Pipette Tips, 1,000 µL KASVI K8-1000B  
24-well plate  KASVI K12-024
Glass Bottom Dish Thermo Scientific 150680
AxioObserver inverted microscope  ZEISS
Chameleon vision ii laser Coherent
Objective EC Plan-Neofluar 40x/1.30 Oil DIC ZEISS 440452-9903-000
SDD sensors - X-Max 20mm² Oxford Instruments
Glutaraldehyde solution SIGMA-ALDRICH G5882
Sodium cacodylate Buffer  SIGMA-ALDRICH 97068 
Osmium tetroxide SIGMA-ALDRICH 201030
Na2HPO4 SIGMA-ALDRICH S9638 Used for preparation of phosphate buffered saline
KH2PO4 SIGMA-ALDRICH P9791 
NaCl MERK 1.06404
Kcl SIGMA-ALDRICH P9333 
Ethanol absolute for analysis EMSURE MERK 1.00983
CPD 030 Critical Point Dryer BAL-TEC
JSM-6610 Series Scanning Electron Microscope JEOL
SCD 050 Sputter Coater BAL-TEC

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Do, T., Devine, D., Marsh, P. D. Oral biofilms: molecular analysis, challenges, and future prospects in dental diagnostics. Clinical, Cosmetic and Investigational Dentistry. 5, 11-19 (2013).
  2. Samaranayake, L., Matsubara, V. H. Normal Oral Flora and the Oral Ecosystem. Dental Clinics of North America. 61 (2), 199-215 (2017).
  3. Larsen, T., Fiehn, N. E. Dental biofilm infections - an update. Acta Pathologica, Microbiologica, et Immunologica Scandinavica. 125 (4), 376-384 (2017).
  4. Marsh, P. D., Do, T., Beighton, D., Devine, D. A. Influence of saliva on the oral microbiota. Periodontology 2000. 70 (1), 80-92 (2016).
  5. Marsh, P. D., Zaura, E. Dental biofilm: ecological interactions in health and disease. Journal of Clinical Periodontology. 44 Suppl 18, S12-S22 (2017).
  6. Zitzmann, N. U., Berglundh, T., Marinello, C. P., Lindhe, J. Experimental peri-implant mucositis in man. Journal of Clinical Periodontology. 28 (6), 517-523 (2001).
  7. Meyer, S., et al. Experimental mucositis and experimental gingivitis in persons aged 70 or over. Clinical and biological responses. Clinical Oral Implants Research. 28 (8), 1005-1012 (2017).
  8. Salvi, G. E., Cosgarea, R., Sculean, A. Prevalence and Mechanisms of Peri-implant Diseases. Journal of Dental Research. 96 (1), 31-37 (2017).
  9. Hahnel, S., Wieser, A., Lang, R., Rosentritt, M. Biofilm formation on the surface of modern implant abutment materials. Clinical Oral Implants Research. 26 (11), 1297-1301 (2015).
  10. Nascimento, C., et al. Bacterial adhesion on the titanium and zirconia abutment surfaces. Clinical Oral Implants Research. 25 (3), 337-343 (2014).
  11. Nakamura, K., Kanno, T., Milleding, P., Ortengren, U. Zirconia as a dental implant abutment material: a systematic review. The International Journal of Prosthodontics. 23 (4), 299-309 (2010).
  12. Scarano, A., Piattelli, M., Caputi, S., Favero, G. A., Piattelli, A. Bacterial adhesion on commercially pure titanium and zirconium oxide disks: an in vivo human study. Journal of Periodontology. 75 (2), 292-296 (2004).
  13. Nascimento, C., et al. Microbiome of titanium and zirconia dental implants abutments. Dental Materials. 32 (1), 93-101 (2016).
  14. Rimondini, L., Cerroni, L., Carrassi, A., Torricelli, P. Bacterial colonization of zirconia ceramic surfaces: an in vitro and in vivo study. The International Journal of Oral & Maxillofacial Implants. 17 (6), 793-798 (2002).
  15. de Avila, E. D., Avila-Campos, M. J., Vergani, C. E., Spolidorio, D. M., Mollo Fde, A. Jr Structural and quantitative analysis of a mature anaerobic biofilm on different implant abutment surfaces. Journal of Prosthetic Dentistry. 115 (4), 428-436 (2016).
  16. de Avila, E. D., et al. Impact of Physical Chemical Characteristics of Abutment Implant Surfaces on Bacteria Adhesion. Journal of Oral Implantology. 42 (2), 153-158 (2016).
  17. de Avila, E. D., et al. Effect of titanium and zirconia dental implant abutments on a cultivable polymicrobial saliva community. Journal of Prosthetic Dentistry. 118 (4), 481-487 (2017).
  18. Lin, N. J. Biofilm over teeth and restorations: What do we need to know? Dental Materials. 33 (6), 667-680 (2017).
  19. Prada-Lopez, I., Quintas, V., Tomas, I. The intraoral device of overlaid disk-holding splints as a new in situ oral biofilm model. Journal of Clinical and Experimental Dentistry. 7 (1), e126-e132 (2015).
  20. Prada-Lopez, I., Quintas, V., Vilaboa, C., Suarez-Quintanilla, D., Tomas, I. Devices for in situ Development of Non-disturbed Oral Biofilm. A Systematic Review. Frontiers in Microbiology. 7, 1055 (2016).
  21. Burgers, R., et al. In vivo and in vitro biofilm formation on two different titanium implant surfaces. Clinical Oral Implants Research. 21 (2), 156-164 (2010).
  22. do Nascimento, C., et al. Oral biofilm formation on the titanium and zirconia substrates. Microscopy Research and Technique. 76 (2), 126-132 (2013).
  23. Al-Ahmad, A., et al. In vivo study of the initial bacterial adhesion on different implant materials. Archives of Oral Biology. 58 (9), 1139-1147 (2013).
  24. Al-Ahmad, A., et al. Bacterial adhesion and biofilm formation on yttria-stabilized, tetragonal zirconia and titanium oral implant materials with low surface roughness - an in situ study. Journal of Medical Microbiology. 65 (7), 596-604 (2016).
  25. Thomsen, H., et al. Delivery of cyclodextrin polymers to bacterial biofilms - An exploratory study using rhodamine labelled cyclodextrins and multiphoton microscopy. International Journal of Pharmaceutics. 531 (2), 650-657 (2017).
  26. Lakins, M. A., Marrison, J. L., O'Toole, P. J., van der Woude, M. W. Exploiting advances in imaging technology to study biofilms by applying multiphoton laser scanning microscopy as an imaging and manipulation tool. Journal of Microscopy. 235 (2), 128-137 (2009).
  27. Zipfel, W. R., Williams, R. M., Webb, W. W. Nonlinear magic: multiphoton microscopy in the biosciences. Nature Biotechnology. 21 (11), 1369-1377 (2003).
  28. Stocks, S. M. Mechanism and use of the commercially available viability stain, BacLight. Cytometry Part A. 61 (2), 189-195 (2004).
  29. Johnson, M. B., Criss, A. K. Fluorescence microscopy methods for determining the viability of bacteria in association with mammalian cells. Journal of Visualized Experiments. (79), e50729 (2013).
  30. Stiefel, P., Schmidt-Emrich, S., Maniura-Weber, K., Ren, Q. Critical aspects of using bacterial cell viability assays with the fluorophores SYTO9 and propidium iodide. BMC Microbiology. 15, 36 (2015).
  31. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  32. Placko, H. E., Mishra, S., Weimer, J. J., Lucas, L. C. Surface characterization of titanium-based implant materials. The International Journal of Oral & Maxillofacial Implants. 15 (3), 355-363 (2000).
  33. So, P. T., Dong, C. Y., Masters, B. R., Berland, K. M. Two-photon excitation fluorescence microscopy. Annual Review of Biomedical Engineering. 2, 399-429 (2000).
  34. Benninger, R. K., Piston, D. W. Two-photon excitation microscopy for the study of living cells and tissues. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 4, Unit 4.11 11-24 (2013).
  35. Gardi, J. E., Nyengaard, J. R., Gundersen, H. J. The proportionator: unbiased stereological estimation using biased automatic image analysis and non-uniform probability proportional to size sampling. Computers in Biology and Medicine. 38 (3), 313-328 (2008).
  36. Melvin, N. R., Poda, D., Sutherland, R. J. A simple and efficient alternative to implementing systematic random sampling in stereological designs without a motorized microscope stage. Journal of Microscopy. 228 (Pt 1), 103-106 (2007).
  37. Neu, T. R., Kuhlicke, U., Lawrence, J. R. Assessment of fluorochromes for two-photon laser scanning microscopy of biofilms. Applied and Environmental Microbiology. 68 (2), 901-909 (2002).
  38. Neu, T. R., Woelfl, S., Lawrence, J. R. Three-dimensional differentiation of photo-autotrophic biofilm constituents by multi-channel laser scanning microscopy (single-photon and two-photon excitation). Journal of Microbiological Methods. 56 (2), 161-172 (2004).
  39. Neu, T. R., Lawrence, J. R. Innovative techniques, sensors, and approaches for imaging biofilms at different scales. Trends in Microbiology. 23 (4), 233-242 (2015).
  40. Lacroix-Gueu, P., Briandet, R., Leveque-Fort, S., Bellon-Fontaine, M. N., Fontaine-Aupart, M. P. In situ measurements of viral particles diffusion inside mucoid biofilms. Comptes Rendus Biologies. 328 (12), 1065-1072 (2005).
  41. Briandet, R., et al. Fluorescence correlation spectroscopy to study diffusion and reaction of bacteriophages inside biofilms. Applied and Environmental Microbiology. 74 (7), 2135-2143 (2008).
  42. Berney, M., Hammes, F., Bosshard, F., Weilenmann, H. U., Egli, T. Assessment and interpretation of bacterial viability by using the LIVE/DEAD BacLight Kit in combination with flow cytometry. Applied and Environmental Microbiology. 73 (10), 3283-3290 (2007).
  43. Bergmans, L., Moisiadis, P., Van Meerbeek, B., Quirynen, M., Lambrechts, P. Microscopic observation of bacteria: review highlighting the use of environmental SEM. International Endodontic Journal. 38 (11), 775-788 (2005).
  44. Hannig, C., Follo, M., Hellwig, E., Al-Ahmad, A. Visualization of adherent micro-organisms using different techniques. Journal of Medical Microbiology. 59 (Pt 1), 1-7 (2010).
  45. Knutton, S. Electron microscopical methods in adhesion. Methods in Enzymology. 253, 145-158 (1995).
  46. Fischer, E. R., Hansen, B. T., Nair, V., Hoyt, F. H., Dorward, D. W. Scanning electron microscopy. Current Protocols in Microbiology. , Chapter 2, Unit 2B.2 (2012).

Tags

Медицина выпуск 136 микробиологии биоплёнки бактерии микробных жизнеспособность микроскопия multiphoton сканирование электронной микроскопии энергии дисперсионных рентгеновской спектроскопии клинической оценки стоматологические материалы циркония титана
Устные биопленки на различных материалах для стоматологических имплантатов
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Silva, T. S. O., Freitas, A. R.,… More

Silva, T. S. O., Freitas, A. R., Pinheiro, M. L. L., do Nascimento, C., Watanabe, E., Albuquerque, R. F. Oral Biofilm Formation on Different Materials for Dental Implants. J. Vis. Exp. (136), e57756, doi:10.3791/57756 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter