Summary
여기, 선물이 세균성 세포 생존 및 형태학 상 특성의 분석을 포함 하 여 치과 보 철물 abutments에 대 한 티타늄 및 지 르 코니 아 재료에 구두 biofilm 형성 평가 하는 프로토콜. 현장에서 모델 관련 강력한 현미경 검사 법 기술 된 구두 biofilm 분석에 사용 됩니다.
Abstract
치과 임 플 란 트 및 보 철 그들의 구성 요소 세균성 식민 및 biofilm 형성 하는 경향이 있다. 제공 하는 낮은 미생물 접착 재료의 사용 정도와 요정 이식 질병의 진행을 줄일 수 있습니다. 보기는 구강 환경 복잡성과 구강 biofilm이, 치아와 치과 재료의 표면에의 한 biofilm 분석 수 있는 현미경 기술 필요. 이 문서에서는 일련의 프로토콜 비교 형태학 및 세포 수준에서 구두 biofilms 분석에 관련 된 방법으로 구두 biofilm 형성 티타늄 및 보 철 abutments에 대 한 세라믹 재료에 대 한 구현. 이 연구에 설명 된 대로 치과 족 abutments에 대 한 티타늄 및 지 르 코니 아 재료에 구두 biofilm 형성 평가를 제자리에 모델 방법론 타당성을 시연 함으로써 48 h biofilm의 만족 스러운 보존을 제공 합니다. Multiphoton 현미경 시험 자료에 형성 된 biofilm의 지역 담당자의 분석을 수 있습니다. 또한, fluorophores의 사용 및 multiphoton 현미경을 사용 하 여 이미지의 처리에는 세균 생존 능력의 분석을 미생물의 아주 이질적인 인구에 있습니다. 전자 현미경 검사 법 생물학 견본의 준비 biofilm, 좋은 해상도, 이미지 및 아무 유물의 구조 보존을 촉진합니다.
Introduction
박테리아 biofilms 복잡 한, 기능적 및 구조적으로 미생물 지역 사회 조직, 세포 외, 생물학적으로 활성 폴리머 매트릭스1,2합성 미생물 종의 다양성에 의해 특징. 생물 비 생물 적인 표면에 세균성 접착 침 glycoproteins1,,34주로 구성 된 인수 박막의 형성에 의해 앞에 있습니다. 미생물 및는 박막 사이의 약한 물리 화학 상호 작용 처음 설립 하 고 세균성 adhesins 인수 박막의 당단백질 수용 체 사이 강한 상호 작용에 의해 따라. 미생물 다양성 형성 multispecies 커뮤니티1,,34, , 이미 연결 된 박테리아의 수용 체에 보조 식민지 개척자의 coaggregation를 통해 점차 증가 5.
구두 microbiota 및 호스트와의 공생 관계의 항상성 구강 건강 유지에 중요 하다. 구두 biofilms 안에 dysbiosis 카 리에 스 그리고 치 주 질환2,5의 개발에 대 한 위험을 증가할 수 있습니다. 임상 연구는 치아 나 치아에 biofilm의 축적과 치은 염 또는 페리-임 플 란 트 mucositis6,7의 개발 원인-효과 관계를 보여 줍니다. 염증 과정의 진행 임 플 란 트8의 필연적인 손실과 peri implantitis 이끌어 낸다.
치과 임 플 란 트 및 보 철 그들의 구성 요소는 세균성 식민 및 biofilm 형성9경향이 있습니다. 화학 성분 및 표면 지형 낮은 미생물 접착을 제공 하는 자료의 사용 정도와 요정 이식 질병9,10의 진행을 줄일 수 있습니다. 티타늄 임 플 란 트;에 대 한 보 철 abutments의 제조에 대 한 자료를 가장 많이 사용 되는 그러나, 세라믹 재료 최근에 도입 되었다 그리고 그들의 미적 속성 및 생체 적합성11,12티타늄 대신 인기를 얻고 있다. 또한 중요 한 것은, 세라믹 재료 미생물, 주로 그들의 표면 거칠기, 습윤, 및 표면 자유 에너지10,13때문에 살 일 걸 요 감소 잠재력 관련 되어 있다.
생체 외에서 연구 보 철 인접 표면9,14,15,,1617미생물 접착의 이해에 중요 한 발전에 기여 했다. 그러나, 구강, 전단 세력의 존재에 의해 뿐만 아니라 다양 한 온도 산도 및 양분 가용성 특징의 동적 환경이 이다 생체 외에서 실험 프로토콜18, 재현할 수 19. 이 문제를 해결 하려면 대신 advantageously 비보 전 분석10,20, 의 3 차원 구조를 유지 하는 biofilm 형성의 현장에 모델의 사용은 21 , 22 , 23 , 24.
구두 기판에 형성 된 biofilm의 복잡 한 구조의 분석 현미경 검사 법 기술 광학 밀도 문제25표시할 수 있는 사용을 해야 합니다. Multiphoton 레이저 스캔 현미경 biofilm 구조 분석26현대 옵션입니다. 그것은 적외선 파장, 펄스 femtoseconds27에 가까운 조명 소스와 비선형 광학의 사용에 의해 특징입니다. 이 메서드는 autofluorescence 자료 또는 자료 fluorophores, 비선형 광학 신호 제 2 고조파 발생으로 알려진 현상에서 파생 된에 의해 생성 된 이미지 외에 의해 표시의 이미지 수집에 대 한 표시 됩니다. Multiphoton 현미경의 장점 중27여기 빛 강도 의해 발생 하는 최소 세포 손상으로 얻은 좋은 이미지 깊이입니다.
Multiphoton 현미경에 의해 abiotic 표면에 biofilm의 생존 능력 분석, 형광 핵 산의 사용 다른 스펙트럼 특성을 가진 염료 그리고 세균성 세포에 침투 수 용량 필요28. 라이브 하 고 죽은 박테리아28,,2930사이의 시각적 차별화 Fluorophores SYTO9 (그린 형광) 및 propidium 요오드 화물 (레드 형광)를 사용할 수 있습니다. Propidium 요오드 화물 SYTO9는 손상과 손상 된 막으로 세균 세포를 입력 하는 동안 손상 된 멤브레인과만 박테리아 침투. 두 염료 셀 안에 있는 경우, propidium 요오드 화물 핵 산에 대 한 큰 선호도 있으며 배 수량 SYTO9, 그것에 게 빨간28,30을 표시 합니다.
보기는 구강 환경 복잡성과 구강 biofilm이, 치아와 치과 재료의 표면 biofilm 분석 수 있는 현미경 기술 필요. 이 문서에서는 일련의 프로토콜 비교 형태학 및 세포 수준에서 구두 biofilms 분석에 관련 된 방법으로 구두 biofilm 형성 티타늄 및 보 철 abutments에 대 한 세라믹 재료에 대 한 구현.
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Protocol
이 연구는 리 베이 라 오프 레 토의 치과 학교의 기관 검토 위원회에 의해 승인 되었다 그리고 자원 봉사 참가자 서명 동의서 (2011.1.371.583 프로세스).
1. Biofilm 형성에서 제자리에
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참가자의 선택
- 다음 포함 기준에 따라 환자 선택: 완전 한 치열과 구강 질환의 임상 표시 없이 건강 한 개인.
- 다음 제외 기준에 따라 환자 제외: 임신, 수 유, 치과 카 리에 스, 치 주 질환 또는 지난 3 개월 동안, 흡연 자, 또는 치 주 상태에 영향을 미칠 수 있는 조직의 질환에 항생제 치료.
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Intraoral 장치 준비
- Alginate 인상을 통해 상 악 아치를 기록 합니다.
- 유형 IV 돌 돌 가루 100 g을 물 19 mL을 추가 하 여 준비 합니다. 돌 상 악 아치의 모델을 만들 alginate 몰드에 붓으십시오.
- 디자인과 테스트 표본 (티타늄과 세라믹 디스크)를 지원 하기 위해 아크릴 intraoral 장치 조작.
- NiCr 와이어 (0.7 m m에 직경) 교정 플라이어 # 139를 사용 하 여에서 못 벗어난 걸쇠를 조작 하 고 모델에 그들을 배치 합니다. 그들은 루프를 형성 하 위 구치 사이 클램프 위치, 각 와이어의 한쪽 끝을 구 부.
- 치 간 시의 지역에서 루프를 적응. Occlusal에서 연락처의 포인트는 폐색과 방해를 하지 않도록 부드러운 곡률을 삽입 합니다. 아크릴에 보존에 대 한 클램프의 끝에 접어 90 °를 확인 합니다.
- 위 두 번째 어 금 니에 클램프를 맞게 적응 자 궁 경부 3에서 와이어의 곡률 (vestibular) 90 ° 아크릴에 보존에 대 한 클램프의 끝에 배를 (원심) 치아 윤곽.
참고: intraoral 장치에 적절 한 보존/안정성 제공, 보유 clasps 위 구치 원심 부분의 치과 아치의 양쪽에 두 번째 어 금 니 사이 배치 했다.
- 제조업체의 지침에 따라 자체 경화 아크릴 수 지를 조작 하 고 3 m m 두꺼운 시트를 만들기 위해 플라스틱 단계 2 유리 접시 (interposed 두께 3mm 스페이서) 사이 아크릴 수 지를 누릅니다.
- 소자의 디자인에 따라 모델의 경구개 지역에 아크릴 시트를 카 버, 중 합 전에 잉여 아크릴 수 지를 떨어져 트림.
- 공고히 하는 매트릭스에 녹은 왁 스를 놓고 왁 스에 대 한 대기 금속 매트릭스 [10 밀리미터 직경, 2mm 두께 (78.5 m m2의 면적)]를 사용 하 여 왁 스 디스크 조작. 수동으로 아크릴 수 지, 그들의 2는 구치와 두 번째 어 금 니 옆 다른 2 사이 4 왁 스 디스크를 포함 합니다.
- 20 분에 대 한 압축 공기의 미만 20 psi 압력 냄비에 유해 아크릴 수 지를 보자.
- 전기 치과 실험실 핸드 피스와 커터 intraoral 장치를 완료 하 고 연마 고무 폴란드어.
- 위에서 설명한 장비를 사용 하 여 입에 적당 한 적합을 위한 장치를 조정 합니다.
- NiCr 와이어 (0.7 m m에 직경) 교정 플라이어 # 139를 사용 하 여에서 못 벗어난 걸쇠를 조작 하 고 모델에 그들을 배치 합니다. 그들은 루프를 형성 하 위 구치 사이 클램프 위치, 각 와이어의 한쪽 끝을 구 부.
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티타늄과 지 르 코니 아 표본의 준비
참고: 표본 (n = 14) 10 mm 직경에서 및 두께에서 2 m m 이며 78.5 m m2의 면적을가지고.- 감소 하는 abrasiveness의 수냉식된 sandpapers 표본 표면 폴란드어 (600, 1200, 2000 모래), 약 20 분.
참고:는 표본의 연마 0.2 µ m에서 표면 거칠기 표준화를 수행 했다. - 청소 하 고 소독 표본 및 액체 세제와 수돗물, intraoral 장치 다음 이소프로필 알코올 초음파 목욕을 사용 하는 15 분 흡수 성 종이 타 올 그들을 건조.
- 비-독성 핫 멜 트 접착제 (그림 1)의 약 0.1 mL와는 표본 intraoral 구강 장치에 수정.
- 구강에서 견본을 포함 하는 장치를 설치 합니다.
참고: 포함 하는 표본 intraoral 장치 48 h에 대 한 착용 한다. 장치 제거 하 고 환자는 먹고 구강 청소를 수행 하는 동안 버퍼링 하는 인산 염 (PBS)에 저장 되었습니다.
- 감소 하는 abrasiveness의 수냉식된 sandpapers 표본 표면 폴란드어 (600, 1200, 2000 모래), 약 20 분.
2입니다. 세균 생존 능력의 평가
참고: 샘플 크기 n = 10.
- SYTO9의 3 µ L을 추가 하 여 염색 솔루션 준비 (녹색 형광 핵 산 염료)와 3 µ L propidium 요오드 화물 (빨간색 형광 핵 산 염색) 살 균의 1 mL의 증류수.
참고: 빛 으로부터 보호 하는 솔루션을 준비 합니다. - 24-잘 접시에는 견본을 전송 하 고 모든 비 부착 한 세포를 제거 하는 PBS와 함께 그들을 씻어.
- Biofilm 포함 된 견본을 충당 하기 위해 형광 염료 솔루션의 적절 한 볼륨 (1 mL)을 추가 합니다. Disorganize는 biofilm를 하지 않도록 매우 신중 하 게 염료를 추가 합니다.
- 빛 으로부터 보호 하는 실 온에서 20-30 분에 대 한 견본 품 어.
- 부드럽게 biofilm 샘플 어떤 과잉 염료를 제거 하는 멸 균 증류수로 씻는 다.
- 유리 하단 접시에는 견본을 놓고 multiphoton 레이저 현미경 biofilm 분석에 대 한 검색을 수행 합니다.
참고: 세균성 세포 생존 능력 분석 multiphoton 현미경 시스템을 사용 하 여 실행 되었다. Propidium 요오드 화물의 형광 546/680의 여기/방출 파장 필터를 사용 하 여 검색 및 477/600 nm SYTO9에 대 한. 가져온 이미지의 크기는 5.16188 x 5.16188 m m, 각 표본 (78.5 m m2)의 전체 면적의 전체 면적의 33.94 %26.64 m m2 에 해당 했다. 이미지는 1024 x 1024 픽셀의 해상도 샘플의 가장 중앙 부분에서 만들어졌다. 빨강 채널 및 녹색 이미지는 별도로 피지 소프트웨어31를 사용 하 여 분석 되었다. 선택 도구를 사용 하 여 각 셀을 선택한 및 형광의 강도 빼서 이미지 배경 픽셀의 통합된 밀도 통해 측정 했다.
3. 에너지 흩어지는 분광학 (EDS)에 의해 표본 화학 성분의 분석
참고: 샘플 크기 n = 3.
- 각 biofilm 무료 테스트 소재의 3 표본 선택 하 고 전자 빔 전압 10 kV32의 분산 에너지 분석기를 결합 하는 스캐닝 전자 현미경을 사용 하 여 각 시료의 2 가지 영역에서 화학 성분 평가.
4. 전자 현미경 검사 법을 검사 하 여 세균성 Biofilm의 형태소 분석
참고: 샘플 크기 n = 1.
- 2.5%도 0.1 M 나트륨 cacodylate 버퍼, pH 7.0-7.3, 24 h에에서 희석에 표본 immersing 하 여는 biofilm를 해결.
- PBS 버퍼에 샘플을 세척 (pH 7.6 =).
- 1 시간에 1% 오스뮴 tetroxide와 biofilm 접미사
- PBS 버퍼에 샘플을 세척 (pH 7.6 =).
- 탈수 biofilm 샘플 신중 하 게, 에탄올 솔루션 (50%, 70%, 90%, 95%, 및 100%)의 농도 증가 그들을 유지.
참고: 100% 농도에서 에탄올의 3 교류를 수행 합니다. 총 탈수 단계 약 2 시간 걸립니다. - 임계점 건조 기에 견본을 전송 하 고 이산화탄소 (CO2)와 함께 여러 대체는 표본 건조 될 때까지.
- 장치에서 말린된 견본을 제거 하 고 스캐닝 전자 현미경 소유자에 그들을 마운트.
- 스퍼터-코트 120에 대 한 시료의 표면에 금 20 nm 층 s.
- 스캐닝 전자 현미경 실에서 골드 코팅 된 디스크를 삽입 합니다. 각 표본, 가변 압력 하에서 20-30 kV와 650 X 배율12의 5 가지 다른 영역에서 이미지를 가져옵니다.
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Representative Results
후 48 h 제자리에 성장의 biofilm의 식민 밀도 multiphoton 현미경 (시료의 총 스캔된 영역에 관하여 티타늄 및 지 르 코니 아 디스크에 식민지 지역의 비율에 의해이 연구에서 대표 되었다 26.64 mm2)입니다. 그림 2 3 시험된 재료의 표면에 세균성 식민 밀도를 나타냅니다. 캐스팅의 표면에 biofilm의 높은 밀도 관찰 되었다 가공된 티타늄 디스크 (0.0292 µ m2 와 0.0213 µ m2를 각각) 보다 지 르 코니 아 디스크 (0.0099 µ m2; p < 0.05; Kruskal-Wallis 테스트, 뒤에 던의 테스트).
그림 3 은 지 르 코니 아의 표면에 세균성 세포 생존 능력을 보여준다 (그림 3A, 3A', 및 3A "), 티타늄 가공 (그림 3B, 3B', 및 3B"), 그리고 티타늄 (그림 3C, 3 C' , 및 3 C ") 디스크. 이 프로토콜에서 핵 산 염료 propidium 요오드 화물 손상 된 막으로 박테리아에만 침투 그리고, 따라서, 죽은 세포와 관련 된 레드-형광 신호를 방출 한다. SYTO9 그대로 또는 손상 된 막으로 세균 세포를 관통 하 고 라이브 미생물에서 녹색 형광 신호를 방출 한다. 휴대 전화 세균 생존 능력 시험 자료의 모든 그룹 (그림 4)에서 사는 미생물의 우위와 사이 유사 했다. 라이브/죽은 세포 비율 2.10 지 르 코니 아에 대 한, 가공 된 티타늄에 1.95 1.63 캐스트 티타늄에 대 한 했다.
균열, 홈, 또는 모든 재료의 표면에 연마 및 가공 과정에서 생산 하는 마모 결함 관찰 했다, 더 명확 하 게에 가공 및 티타늄 디스크를 캐스팅. 지 르 코니 아 디스크에 큰 분야는 미생물;의 부재와 함께 관찰 했다 cocci, 이십시오, 및 filamentous 박테리아의 주로 구성 된 소규모 다형 미생물 집계 또한 관찰 되었다 (그림 5A 와 5A'). Cocci bacilli의 존재는 가공 된 티타늄 디스크의 표면에 흩어져 했다 (그림 5B 및 5B'). 캐스트 티타늄 견본 표면에 biofilm 같은 모습 행렬에 관련 된 미생물의 식민지를 제시 (그림 5C 및 5 C'). 적은 매트릭스 재료 가공된 티타늄 및 캐스트 티타늄 디스크에 비해 지 르 코니 아 디스크의 표면에 관찰 되었다.
EDS 분석 공개 70.83% 지 르 코니 아의, 산소의 22.84%, 이트륨, 4.52% 및 지 르 코니 아 디스크;에서 하프늄의 1.57% 티타늄의 95.16%, 3.99%의 산소, 그리고 캐스트 티타늄 디스크;에서 탄소의 0.85% 그리고 티타늄의 89.86%, 산소, 7.53%와 가공 된 티타늄 디스크 (그림 6)에서 탄소 2.61%.
그림 1 : Intraoral 장치는 제자리에서 공부. 보유 clasps 세공된 철사로 날조 했다 그리고 티타늄 및 지 르 코니 아 테스트 디스크 (직경, 2mm 두께 10 m m) 아크릴 수 지를 경화 자체에 부분적으로 포함 된 구치와 어 금 니 지역에서 무작위로 배치 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : 는 세균성 세포 밀도의 형광 이미지. 세균성 세포 가공 지 르 코니 아 (A), (B)에 밀도 티타늄의 형광 이미지와 (C) 제자리에서48 h 후 티타늄 디스크 캐스팅입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : 표면 준수 박테리아의 세포 생존 능력. 이러한 패널 박테리아의 세포 생존 능력 (A)의 표면에 붙어 표시 라이브에 지 르 코니 아, (B) 죽은 세균성 세포 가공된 티타늄, 및 (C) 죽은 세균성 세포를 라이브 그리고 라이브 캐스트 티타늄에 세균성 세포 디스크 형광 이미징 그려져입니다. 죽은 세균성 세포는 propidium 요오드 화물 물 (A', B', 그리고 C': 레드-형광 신호). SYTO9 라이브 박테리아는 물 (A ", B", 및 C ": 녹색 형광 신호). A, B및 C 패널 색상 병합 이미지를 표시합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 : Boxplots biofilm의 대표 셀 다른 테스트 자료에 생존. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5 : 스캐닝 전자 현미경 검사 법. 이러한 패널 표시의 스캐닝 전자 현미경 (A, A') (B, B'), 지 르 코니 아 가공 티타늄, 및 (C, C') 파노라마에 가까이 보기, biofilm 티타늄 디스크 후 48 h 현장에서 캐스팅 . 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6 : 원소 분석 에너지 흩어지는 분광학 (EDS) 여. 이러한 패널 표시 (A) 지 르 코니 아 디스크 (Zr 지 르 코니 아, Y = 이트륨, C = O = 탄소, 산소, 그리고 Hf = 하프늄 =); (B) 가공 티타늄, 그리고 (C) 티타늄 디스크 (Ti = 티타늄, O = 산소, 그리고 C = 탄소). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
이 연구에서 설명 하는 프로토콜 세균성 세포 생존 능력 및 형태학 상 특성의 분석을 포함 하 여 보 철 abutments에 대 한 티타늄 및 지 르 코니 아 재료에 biofilm 형성을 평가 하기 위해 개발 되었다. 이 작업을 수행 하기 위해 biofilm 형성의 현장에 모델 intraoral 장치 시험 자료의 샘플 및 48 h에 대 한 동적 구강 환경에 노출 그들을 유지 하는 능력의 구성 설계 되었습니다. 장치는 편안 하 고 쉽게 삽입, 제거 및 청소 자원 봉사에 의해 고려 되었다. 그러나, 그것은 음성학과 미학에 거의 영향을 미치지는 간단 하 고 낮은-비용, 조작 하 고 표본 biofilm 구조의 중단 없이 쉽게 복구를 허용 보여주었다. 또한, 메서드는 세균 세포와 세포 외 매트릭스의 무결성의 보존 허용. 표본와 혀의 접촉 및 실험 기간 동안 디스크의 실수로 손실 제안 된 모델의 제한이 있습니다. 방법의 제한 최소화, intraoral 장치에 있는 디스크의 위치는 무작위로 배포; 또한, 디스크 비 독성 뜨거운 용 해 접착제로 고정 하 고 샘플의 손실 없이 보고 되었다.
때문에 구강 환경에 거주 하는 세균 종의 높은 강력한 현미경 기법은 biofilms 하드 표면 그것의 식민지의 분석에 필요한. Multiphoton 현미경 몇 가지 고유의 3 차원 해상도 등 기존의 또는 confocal 현미경 분석을 통해 우수한 광학 침투, photobleaching의 감소에 대 한 근 적외선 여기 이점 제공 하 고 photodamage 라이브 셀 및 기능 제공 하는 양적 정보33,34을 이미징 하는 경우. 이러한 장점 2 광자 흡수 프로세스의 매우 지역화 된 여기와는 표본에서 산란의 감소 효과 통해 시작 됩니다. 따라서, multiphoton 현미경 깊은 조직 이미징, 최소 세포 손상, 및 잘 된 광화학34의 개시 수 있습니다. 무작위 샘플링 및 분야의 대표적인 수 정확한 분석35,36선출 될 것 이다. Multiphoton 레이저 스캔 현미경 총 표본 영역의 33.94%에 해당 하는 5161.88 µ m x 5161.88의 분야의 분석 허용. Confocal 현미경 검사 법은 대표적인 분석 및 평가 표본의 오랜 기간에 대 한 많은 수의 필드에 대 한 필요 때문 사용 되지 않습니다. 또한, 밖으로의 초점 배경 신호 형광 현미경 검사 법의 사용 제한. Multiphoton 현미경의 장점에도 불구 하 고 미생물 분야에만 약간의 응용은 보고37,,3839. 그들 가운데는 조작 도구;로 사용 예를 들어 지역화 된 절제를 위해 apoptosis 또는 괴 사, 표백, 또는 biofilm의 잘 정의 된 볼륨의 photoactivation 세포26. 이 방법의 또 다른 응용 프로그램 여러 biofilm 구성 요소25,,4041에 대 한 항균 제의 효능을 평가 하는 것입니다.
이 연구에서는 준수 세균성 세포의 생존 그들의 막 무결성28의 기능으로 세포를 침투 하는 형광 핵 산 염료로 평가 되었습니다. SYTO9 fluorophores 및 propidium 요오드 화물 라이브 하 고 죽은 박테리아 사이의 시각적 차별화 사용 되었다. SYTO9 및 propidium 요오드 화물의 사용의 몇 가지 제한 사항이 두 세포 막 구조30에 교차 하 고 있기 때문에 그대로 막으로 그램 음성 박테리아를 얼룩 SYTO9의 어려움 등 문학에 보고 됩니다. 42. 따라서, 라이브 세포 결합 얼룩에 의해 과소평가 될 수 있다. 또한 때 SYTO9 propidium 요오드 화물에 의해 완전히 대체 되지 않습니다, 노란색 형광 세균성 세포30,42에 빨간색 대신 관찰 될 수 있습니다. 또 다른 한계는 시간이 지남에 SYTO9 신호의 감소 이다. 현미경 분석 염료29,30에 노출 후 30 분 이내 수행 되는 것이 좋습니다. 기판의 autofluorescence부터 신호 강도 계산 하기 위해 배경 형광을 고려 하는 데 필요한 고 언바운드 염료의 존재 결과30방해할 수 있습니다. 그럼에도 불구 하 고, 이후 이러한 제한은 잘 보고, 지정된 된 기한 내, 또한 신중 하 게 선택 하 고 빼기 피지 소프트웨어의 도움으로 이미지의 배경으로 처리 하는 샘플을가지고 가능 하다.
전자 현미경 검사 법을 검사 하는 동안 높은 진공 및 전자 방사선 생물학 물자를 포함 하는 샘플에 대 한 불리 한 조건을 나타냅니다. 비 전도성 속성 외에도 자연 상태에서 biofilm는 전자 생성 및 감지 시스템, 유물43형성 방해 하이드레이션 됩니다. 따라서 표본 생물학 물자를 포함 하는 구조의 보전 및 그들의 전자43,44의 전도 위해 준비 되어야 한다. 프로토콜 단계와 관련 된 고정, 탈수, 건조, 고 전도성 물자를 가진 견본의 코팅 희석 및 시간에 특정 관심으로 개발 되었다. 생물 재료의 고정 cacodylate 버퍼에 오스뮴 tetroxide와 후 고정 알데하이드와 준수 biofilm43,,4546의 구조를 보존 하기 위해 수행 되었다. 탈수는44유기 용 매 의해 점차적으로 대체 되 고 물과 에탄올 농도의 상승 시리즈와 함께 달성 했다. 기체, 액체의 제거에 CO2 의 변환 뒤 에탄올 제거, 액체 CO2 의 연속 교체 한계점을 통해 수행한 biofilm 아키텍처의 최소한의 왜곡으로 건조 / 가스 인터페이스, 그리고 표본43,44,,4546에 표면 장력의 제거. 전자의 전도성을 보장 하기 위해, 방지 하거나 피해를 줄이고 이미지 아티팩트는 표본 금 또는 금/팔라듐의 10-20 nm 층으로 코팅 했다. 또한, 코팅 금속의 얇은 층으로 표본 수 표본 내에서 전기 충전 형성을 줄일, 대비, 개선 및 이미지 해상도46증가.
몇 가지 한계에도 불구 하 고이 연구에서 설명 현장에서 모델 티타늄 및 지 르 코니 아 재료, 48 h biofilm 보존에 구두 biofilm 형성의 평가 대 한 적절 한 했다. Fluorophores의 사용 연관 된 이미징 multiphoton 현미경 테스트 자료를 식민지 화 하는 미생물의 아주 이질적인 인구에 세균성 세포 생존 능력의 분석을 허용 하 여. 생물학의 준비에 기술을 고용 샘플 biofilm의 구조 보존을 추진 하 고 높은 품질의 이미지를 시각화에 대 한 수집 및 식민지 미생물의 형태학 특성 허용 .
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
저자 감사 호세 아우 구 스토 Maulin 현미경 다중 사용자 실험실 (의 리 베이 라 오프 레 토 의학의 학교)에서 EDS와 sem의 그의 관대 한 지원에 대 한 분석 및 비디오 판에서 그의 관대 한 기술 지원에 대 한 브라 더 텍사스 마차.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hydrogum 5 | Zhermack Dental | C302070 | |
| Durone IV | Dentsply | 17130500002 | |
| NiCr wire | Morelli | 55.01.070 | |
| JET auto polymerizing acrylic | Clássico | ||
| Dental wax | Clássico | ||
| Pressure pot | Essencedental | ||
| Sandpapers 600 grit | NORTON | T216 | |
| Sandpapers 1200 grit | NORTON | T401 | |
| Sandpapers 2000 grit | NORTON | T402 | |
| Metallographic Polishing Machine | Arotec | ||
| Isopropyl alcohol | SIGMA-ALDRICH | W292907 | |
| Hot melt adhesive | TECSIL | PAH M20017 | |
| Filmtracer LIVE/DEAD Biofilm Viability Kit | Invitrogen | L10316 | |
| Pipette Tips, 10 µL | KASVI | K8-10 | |
| Pipette Tips, 1,000 µL | KASVI | K8-1000B | |
| 24-well plate | KASVI | K12-024 | |
| Glass Bottom Dish | Thermo Scientific | 150680 | |
| AxioObserver inverted microscope | ZEISS | ||
| Chameleon vision ii laser | Coherent | ||
| Objective EC Plan-Neofluar 40x/1.30 Oil DIC | ZEISS | 440452-9903-000 | |
| SDD sensors - X-Max 20mm² | Oxford Instruments | ||
| Glutaraldehyde solution | SIGMA-ALDRICH | G5882 | |
| Sodium cacodylate Buffer | SIGMA-ALDRICH | 97068 | |
| Osmium tetroxide | SIGMA-ALDRICH | 201030 | |
| Na2HPO4 | SIGMA-ALDRICH | S9638 | Used for preparation of phosphate buffered saline |
| KH2PO4 | SIGMA-ALDRICH | P9791 | |
| NaCl | MERK | 1.06404 | |
| Kcl | SIGMA-ALDRICH | P9333 | |
| Ethanol absolute for analysis EMSURE | MERK | 1.00983 | |
| CPD 030 Critical Point Dryer | BAL-TEC | ||
| JSM-6610 Series Scanning Electron Microscope | JEOL | ||
| SCD 050 Sputter Coater | BAL-TEC |
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